CN115887472B - 甘露特钠在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开甘露特钠在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。本发明研究显示，甘露特钠具有良好的抗肺纤维化作用，能制备由肺纤维化所引发的疾病的治疗药物；甘露特钠能明显降低肺纤维化小鼠的肺实变，显著改善肺纤维化小鼠的肺组织病理学评分以及胶原纤维沉积，其中包括I型胶原蛋白(COL1A1)水平显著下降，能显著降低肺纤维化小鼠的肺组织羟脯氨酸含量。同时，甘露特钠具有较好的安全性，其毒副作用小，可代替吡非尼酮和尼达尼布在治疗肺纤维化疾病中的应用，为肺纤维化疾病的治疗提供更多有效药物和治疗方法。

Description

甘露特钠在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及甘露特钠在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。

背景技术

肺纤维化是多种原因导致的，以成纤维细胞增殖、大量细胞外基质沉积、肺组织结构破坏为特征的间质性肺疾病的终末期肺脏改变。肺纤维化是多种间质性肺疾病的终末期肺脏表现之一，可以导致间质性肺疾病的病因，就是肺纤维化的病因。特发性肺纤维化(IPF)，即隐源性纤维性肺泡炎(CFA)，是一种原因不明的慢性进行性纤维化间质性肺炎(ILDS)，病变局限于肺部，属于普通型间质性肺炎(UIP)的一种特殊类型，其特征是呼吸困难和肺功能进行性恶化。该病好发于中老年人，发病率随着年龄的增长而增加，以50岁以上男性多见。IPF发病具有隐匿性，主要症状为进行性劳力性呼吸困难、咳嗽，查体常见吸气末双肺中下部Velcro啰音，部分患者见杵状指。当患者初步确诊为UIP时，临床医生为进一步明确诊断为IPF，主要依据是：(1)排除其他已知原因的间质性肺疾病，如药物中毒、家庭或职业环境暴露和胶原血管疾病等；(2)肺功能检查结果异常，包括限制性通气障碍(肺活量减少，FEV1/FVC增加)和/或肺泡弥散功能障碍(休息或运动时肺泡-动脉血氧压差增加或肺对CO的扩散能力减少)；(3)常规胸片或高分辨率计算机断层扫描(HRCT)提示：双肺基底呈网状磨玻璃样改变。特发性肺纤维化的患者从确诊开始，平均生存期在3.2～5年，生存期中位数为28.2个月，五年生存率为30～50％，预后较乳腺癌、结肠癌、子宫颈癌差，而且一旦发生急性恶化，死亡率为50％，因此IPF又被称为“不是癌症的癌症”。当前全球人口老龄化的趋势正在加快，超过10亿人超过60岁，而且这个数字正在稳步增加，特别是发展中国，而IPF作为一种老龄化疾病，无疑给患者和家属的身心、家庭和社会经济带来巨大的负担。

目前，临床上还没有找到可以治愈IPF的方法。除了肺移植之外，近年来被批准用于临床治疗的两种抗纤维化药物——吡非尼酮和尼达尼布，虽然能够减缓疾病进展，但它们都不能改善患者的肺功能以及生活质量，且尼达尼布还具有一定的副作用，可能会在服用药物之后引起恶心、呕吐等症状，有时还会引起皮肤出现过敏，并且两种药物都存在耐受性的问题。因此寻找一种可替代吡非尼酮和尼达尼布的有效药物迫在眉睫。

发明内容

本发明提供甘露特钠在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。

本发明的目的是提供甘露特钠的新应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供甘露特钠的新应用：对肺纤维化具有较好的治疗作用，甘露特钠(GV971)是以海洋褐藻提取物为原料制备获得的低分子酸性寡糖化合物，是靶向脑—肠轴的阿尔茨海默症治疗药物。本发明通过博来霉素诱导建立肺纤维化小鼠模型，研究显示甘露特钠具有良好的抗肺纤维化作用，体内实验结果证实甘露特钠能明显降低肺纤维化小鼠的肺实变，显著改善肺纤维化小鼠的肺组织病理学评分以及胶原纤维沉积，其中包括I型胶原蛋白(COL1A1)水平显著下降，同时显著降低肺纤维化小鼠的肺组织羟脯氨酸含量，具有良好的生物安全性和低毒副作用，可代替吡非尼酮和尼达尼布在治疗肺纤维化疾病中的应用。

本发明提供甘露特钠在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。所述肺纤维化疾病具体指以肺纤维化病变为主要表现形式的疾病。

进一步地，所述肺纤维化疾病为间质性肺病。

更进一步地，所述间质性肺病为特发性肺纤维化。

进一步地，甘露特钠在制备降低胶原纤维和胶原蛋白沉积药物中的应用。

优选地，所述胶原蛋白指I型胶原蛋白。

进一步地，甘露特钠在制备降低肺组织羟脯氨酸含量药物中的应用。

本发明提供甘露特钠在制备抗肺纤维化的药物中的应用。

特别地，肺纤维化还能引发多种疾病(并发症)，而本发明显示甘露特钠对肺纤维化具有较好的治疗作用，所以，及时抗肺纤维化，能有效避免由肺纤维化引发的多种疾病，如：肺心病，甚至心力衰竭、肺部感染，呼吸衰竭、肺大疱、自发性气胸、肺动脉高压等。

本发明还提供甘露特钠在制备缓解肺纤维化进程的药物中的应用。

进一步地，所述缓解指降低由肺纤维化引起的肺实变。

进一步地，所述缓解指减轻胶原纤维增生。

优选地，上述药物的剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂或注射剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供甘露特钠在制备治疗肺纤维化药物中的新应用，本发明研究显示甘露特钠对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的具有显著的治疗作用。甘露特钠能够有良好的抗肺纤维化作用，体内实验结果证实甘露特钠明显降低肺纤维化小鼠的肺实变，显著改善肺纤维化小鼠的肺组织病理学评分以及胶原纤维沉积，其中包括I型胶原蛋白(COL1A1)水平显著下降，同时显著降低肺纤维化小鼠的肺组织羟脯氨酸含量。同时，甘露特钠具有较好的安全性，其毒副作用小，可代替吡非尼酮和尼达尼布在治疗肺纤维化疾病中的应用，为肺纤维化的治疗提供更多有效药物和治疗方法。

附图说明

图1为甘露特钠作用后肺纤维化小鼠肺Micro-CT成像图。

图2为甘露特钠作用后肺纤维化小鼠肺组织H&E染色图。

图3为甘露特钠作用后肺纤维化小鼠肺组织Masson染色图。

图4为甘露特钠作用后肺纤维化小鼠肺组织COL1A1的IHC染色图。

图5为甘露特钠作用后肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量图。

图中的定量结果以均数±标准差(SD)表示；所有数据均采用GraphPad Prism8.0(GraphPad Software,San Diego,USA)进行统计学分析；组间差异采用单因素分析方差分析(ANOVA)；所有柱状图均由GraphPad Prism 8.0绘制；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，P<0.05具有统计学意义。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1肺纤维化小鼠模型建立

本实施例采用C57BL/6J小鼠(购自于北京维通利华实验动物有限公司)，随机将小鼠进行分组并饲养，统一饲养34天，分5组：

(1)正常对照组(Saline组，n＝12)：在第7天给予生理盐水经气管插管滴注小鼠双肺，其余时间皆正常饮食。

(2)甘露特钠组(GV971组，n＝5)：第1天开始根据体重给予GV971100mg/kg灌胃，一直给药直至最后一天，总共34天，其余时间皆正常饮食。

(3)博来霉素建模组(BLM组，n＝20)：在第7天给予博来霉素2.0mg/kg经气管插管滴注小鼠双肺(单次给药)，其余时间皆正常饮食。

(4)甘露特钠给药7天后博来霉素建模组(BLM+GV971组，n＝20)：第1天开始根据体重给予GV971 100mg/kg灌胃，第7天给予博来霉素经气管插管滴注小鼠双肺(单次给药)，GV971给药总共34天，其余时间皆正常饮食。

(5)博来霉素建模后正常菌群移植组(BLM+FMT组，n＝12)：第7天给予博来霉素经气管插管滴注小鼠双肺，建模第3天后开始给予正常对照组小鼠的新鲜粪菌溶液灌胃及每隔3天给予换笼处理，总共给予24天，其余时间皆正常饮食。

实施例2甘露特钠的作用

采用实施例1中构建的各组小鼠，在小鼠博来霉素建模一周时，在BLM组和BLM+GV971组中随机挑选6只小鼠(每组3只)进行小动物CT扫描，观察肺部情况；在小鼠博来霉素建模第28天后，将各组的小鼠进行安乐死，取肺组织、血清以及肠组织，将肺组织进行常规石蜡切片，通过H&E染色观察小鼠肺组织病理改变情况，同时进行Ashcroft评分。

小鼠博来霉素建模一周后BLM组和BLM+GV971组小鼠肺组织的Micro-CT成像图如图1所示，各取右主支气管分叉处进行比对，可见BLM组小鼠的肺部出现大片炎症浸润的肺实变状态，而BLM+GV971组小鼠未见明显肺部改变，说明甘露特钠能够有效改善由肺纤维化引起的肺实变。

在小鼠博来霉素建模28天后，甘露特钠作用后H&E染色结果如图2A所示，从图中可以看出Saline组小鼠的气道及肺泡结构完整清晰，支气管壁与肺泡壁未见明显增厚，肺间质未见炎性细胞浸润及纤维细胞增生，气道上皮细胞排列规则，但图示肺泡有破裂融合的情况，考虑与取材时进行肺泡灌洗有关；BLM组小鼠肺组织结构被严重破坏，形成完全致密的纤维性闭塞及蜂窝状改变，肺泡腔大量塌陷，支气管壁与肺泡壁明显增厚、破损甚至脱落，肺间质有大量炎性细胞浸润；BLM+GV971组和BLM+FMT组支气管壁与肺泡壁见轻中度增厚，气道上皮细胞排列稍紊乱，肺间质有少量炎性细胞浸润，与BLM组相比，纤维化得到不同程度的减轻。

根据肺纤维化Ashcroft评分标准，对每张小鼠肺组织病理切片进行积分，结果如图2B所示。结果显示BLM组的评分最高，与Saline组相比有显著性差异(****P＜0.0001)，BLM+GV971组和BLM+FMT组的评分均较BLM组有不同程度的下降，其中BLM+GV971组与BLM组比较有显著性差异(*P＜0.05)，BLM+FMT组与BLM组相比，评分无统计学意义。

实施例3小鼠肺组织胶原纤维沉积情况

将实施例2中处理后的小鼠肺组织通过Masson染色观察小鼠肺组织胶原纤维沉积情况，采用Orbit Image Analysis软件对Masson染色的肺组织切片进行全图扫描AI分析。在该软件上，通过数次手动作图训练获得AI模板。将纤维化区域设定为蓝色部分，正常组织设定为绿色部分，背景设定为紫色部分。该软件可以通过AI智能分析计算出被设定区域的大小，得到胶原染色的半定量分析。

再通过IHC染色观察小鼠肺组织纤维蛋白表达情况，纤维蛋白是细胞外基质的主要组成部分，肺纤维化时，细胞外基质过度沉积，其中I型胶原蛋白(COL1A1)的合成速度快于原本在肺中含量更多的III型胶原蛋白(COL1A3)，而I型胶原蛋白相对较硬，若I型胶原蛋白的沉积失去控制就会导致组织变硬，从而导致肺纤维化。

在甘露特钠作用后，各组小鼠肺组织的Masson染色结果如图3A所示，从图中可以看出Saline组和GV971组血管壁及支气管壁周围可见少许蓝色胶原纤维沉积，肺泡间隔未见明显胶原纤维增生；BLM组可见血管壁及支气管壁周围有大量蓝色胶原沉积，肺泡塌陷，形成红蓝相间的肺间质-胶原纤维致密组织，蓝色胶原沉积面积较对照组明显增加，而BLM+GV971组及BLM+FMT组较BLM组有不同程度的改善。

胶原染色的半定量结果如图3B和图3C所示，通过计算发现，BLM组较对照组的胶原纤维沉积明显增多(***P＜0.001)，BLM+GV971组和BLM+FMT组的胶原相对面积较BLM组均有不同程度减少，其中BLM+GV971组与BLM组相比有显著性差异(*P＜0.05)，而BLM+FMT组与BLM组差异无统计学意义。

在甘露特钠作用后，各组小鼠肺组织COL1A1的IHC染色结果如图4A所示，从图中可以看出，BLM组中可见COL1A1在支气管壁、血管壁上皮细胞胞浆中高度表达(棕黄色为阳性)，肺间质中中低度表达。在BLM+GV971组和BLM+FMT组中可见COL1A1表达较BLM组有所减少，Saline组中未见明显表达。

通过随机各选取3张小鼠肺切片的200×局部图在Image J软件上统计显示，如图4B所示，在BLM组中，COL1A1的表达较对照组明显升高(****P＜0.0001)，而BLM+GV971组和BLM+FMT组相对BLM组有不同程度减少，均有显著统计学差异(*P＜0.05)。

实施例4小鼠肺组织羟脯氨酸变化情况

羟脯氨酸是胶原所特有的氨基酸，约占胶原氨基酸总量的13％，测定组织中羟脯氨酸总含量是评价纤维化严重程度最常用的方法之一。通过碱水解法检测肺组织羟脯氨酸含量。

在小鼠博来霉素建模28天后，各组小鼠的肺组织羟脯氨酸含量如图5所示，Saline组与GV971组小鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)含量未见明显差异，BLM组肺组织HYP含量与Saline组对比明显升高(***P＜0.001)，BLM+GV971组和BLM+FMT组较BLM组相比有不同程度下降，均有统计学意义(*P＜0.05)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.甘露特钠在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肺纤维化疾病为间质性肺病。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述间质性肺病为特发性肺纤维化。

4.根据权利要求1～3任一所述应用，其特征在于，甘露特钠能降低胶原蛋白沉积。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述胶原蛋白指I型胶原蛋白。

6.根据权利要求1～3任一所述应用，其特征在于，甘露特钠能降低肺组织羟脯氨酸含量。

7.根据权利要求1～3任一所述应用，其特征在于，甘露特钠能减轻胶原纤维增生。