CN115886041B - 一种基于水芹水培生长的生物抑藻剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于水芹水培生长的生物抑藻剂及其应用，涉及生物技术和水污染治理技术领域。本发明提供了一种基于水芹水培生长的生物质在生物抑藻中的应用。发明人研究发现水芹种植阶段在幼苗期、繁殖期和成熟期均能产生多种化感物质，其中幼苗期水芹产生的化感物质显著多于繁殖期和成熟期。本发明提供的水芹幼苗生物抑藻剂含有多种化感物质，特别是酚酸类化感物质和脂肪酸类化感物质，能够高效发挥生物抑藻的功效。同时，本发明将用于生物修复的水芹用作生物抑藻剂，解决了因食用安全风险而无法资源化利用的生物修复后水芹的去向问题。所述水芹幼苗生物抑藻剂没有毒性，属于绿色、环保的抑藻技术。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和水污染治理技术领域，具体涉及一种基于水芹水培生长的生物抑藻剂及其应用。
背景技术
富营养化水体中蓝藻的爆发和生长形成的有害藻华会降低水生生态系统生物多样性，破坏生态平衡，还会污染饮用水，危害人类安全与健康。目前，已开发的抑制和处理富营养化水体蓝藻形成和爆发的措施，主要有超声波处理、底泥疏浚等的物理方法；化学杀藻剂、絮凝剂、氧化剂等的化学方法。虽然这些技术在一定条件下能够有效控制藻华，但往往面临着成本高、操作复杂，且容易造成二次污染等缺点和局限性。相比较而言，生物控藻方法由于生态安全性以及成本较低等优势受到广泛关注。
水芹(Oenanthejavanica(Blume)DC)是东亚国家种植的多年生水生植物，是我国普遍栽培的一种蔬菜，具有很高的营养价值和药用功能。同时，水芹具有生长速度快、一年多茬、营养吸收和繁殖能力强、季节适应性好、易于收获管理等特征，被认为是我国富营养化水体植物修复的理想材料。然而，水芹在生物修复后通常存在一定的食用安全性风险。同时，水生植物的季节性枯萎和凋落又会引起水环境的二次污染，故生物生态修复后的水生植物的去向问题是一直以来行业亟待解决的问题和研究热点。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于水芹水培生长的生物质在生物抑藻中的应用，所述基于水芹水培生长的生物质能够高效抑制富营养化水体中蓝藻生长和繁殖，且操作简单、能够综合利用资源、避免二次污染。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种基于水芹水培生长的生物质在生物抑藻中的应用。
本发明提供了一种生物抑藻剂，包括水芹幼苗种植水生物质抑藻剂和/或水芹幼苗植株生物质抑藻剂。
优选的，所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂的制备方法包括以下步骤：
将水芹幼苗种植于水中进行培养，得到水芹幼苗种植水；
将所述水芹幼苗种植水进行过滤，得到水芹幼苗种植水生物质抑藻剂。
优选的，所述水芹幼苗的生物量与水的体积比为(50～200)g：(250～1000)mL；
所述培养的时间为3～14d；所述培养的温度为10℃～32℃；所述培养的光照条件为1000～4200lx；所述培养的光暗比为(12～14)h：(14～10)h。
优选的，按质量百分比计，所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂包括以下组分化感物质：
硬脂酸≥60.00％、苯甲酸≥4.00％、壬二酸≥2.00％、咖啡酸≥1.40％和水杨酸≥1.20％。
优选的，所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂包括水芹幼苗叶、茎和根中的一种或两种以上；
所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂的制备方法包括：将水芹幼苗植株干燥后进行粉碎，得到水芹幼苗植株生物质抑藻剂。
优选的，所述干燥包括第一干燥阶段和第二干燥阶段；
所述第一干燥阶段的温度为96℃～120℃，时间为20～40min；
所述第二干燥阶段的温度为60℃～85℃，时间为48～96h。
优选的，按质量比计，所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂包括脂肪酸类化感物质和酚酸类化感物质：
所述脂肪酸类化感物质包括：棕榈酸≥700.00μg/g、亚麻酸≥450.00μg/g、硬脂酸≥400.00μg/g和亚油酸≥350.00μg/g；
所述酚酸类化感物质包括：咖啡酸≥35.00μg/g、阿魏酸≥15.00μg/g、香草酸≥4.00μg/g和没食子酸≥3.00μg/g。
本发明还提供了一种上述技术方案所述生物抑藻剂的使用方法，包括：
将所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂按比例添加到蓝藻水体中；
所述比例为水芹幼苗种植水生物质抑藻剂与蓝藻水体的体积比优选为(0.5～1)：(4～10)。
本发明还提供了一种上述技术方案所述生物抑藻剂的使用方法，包括：
将所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂洒到蓝藻水体进行使用；
所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂的用量为30～200g/L。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种基于水芹水培生长的生物质在生物抑藻中的应用。水芹是一种多年生水生植物，具有生长速度快、四季常绿、一年多茬等特点，生物量大，能在富营养化水体中大量吸收营养盐，对蓝藻的生长繁殖造成营养限制，同时能释放大量化感物质进入水体，直接对蓝藻生长产生抑制作用。发明人研究发现水芹种植阶段在幼苗期、繁殖期和成熟期均能产生多种化感物质，其中幼苗期水芹产生的化感物质显著多于繁殖期和成熟期。本发明提供的基于水芹水培生长的生物抑藻剂在生物抑藻中的应用，所述基于水芹水培生长的生物质中含有多种化感物质，特别是酚酸类化感物质，能够高效发挥生物抑藻的功效。实施例结果表明：本发明提供的基于水芹水培生长的生物质能够高效抑制水体中铜绿微囊藻等蓝藻的发生。
进一步地，本发明利用水芹幼苗生长释放至种植水中的化感物质和/或水芹幼苗所含化感物质制备生物抑藻剂，解决了因具有安全风险而无法资源化利用的生物修复后水芹的去向问题。
具体实施方式
本发明提供了一种基于水芹水培生长的生物质在生物抑藻中的应用。
在本发明中，所述基于水芹水培生长的生物质优选包括水芹幼苗种植水生物质抑藻剂和/或水芹幼苗植株生物质抑藻剂。在本发明中所述藻的种类优选为铜绿微囊藻。
发明人研究发现水芹种植阶段在幼苗期、繁殖期和成熟期均能产生多种化感物质，包括至少8种酚酸类物质，其中苯甲酸、水杨酸和阿魏酸三种酚酸类物质含量较高，这三种化感物质主要在叶中合成，然后运输到根部并分泌至水环境中。金陵1号水芹可释放至种植水中的化感物质共含有33种，包括苯甲酸、阿魏酸、水杨酸等15种酚酸，硬脂酸、肉豆蔻酸、癸酸等9种脂肪酸以及9种萜类物质。其中，化感物质在幼苗期水芹种植水中相对含量最高，显著高于繁殖期和成熟期，说明幼苗期水芹体内合成和释放至种植水中的化感物质相对较多。同时发明人还发现，幼苗期水芹的叶、根和茎中均含有硬脂酸、棕榈酸、油酸等9种脂肪酸类和苯甲酸、水杨酸、阿魏酸等8种酚酸类化感物质，其中叶中含量最高，显著高于根和茎。本发明提供的基于水芹水培生长的生物质在生物抑藻中的应用，所述生物质含有多种化感物质，特别是酚酸类化感物质，能够高效发挥生物抑藻的功效。
本发明提供了一种生物抑藻剂，包括水芹幼苗种植水生物质抑藻剂和/或水芹幼苗植株生物质抑藻剂。
在本发明中，所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂具体为水芹幼苗生长释放至种植水的化感物质抑藻剂。在本发明中，所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂的制备方法优选包括以下步骤：将水芹幼苗种植于水中进行培养，得到水芹幼苗种植水；将所述水芹幼苗种植水进行过滤，得到水芹幼苗种植水生物质抑藻剂。
在本发明中，所述水芹幼苗优选为生长良好，无损伤的幼苗，进一步优选为根系相对发达的幼苗。所述水芹幼苗优选为适宜条件生长的水芹幼苗，更优选为春季或秋季生长的水芹幼苗，可以为进行过富营养化水体修复的适宜条件生长的水芹幼苗，也可以为没有用于富营养化水体修复的经适宜系统条件生长的水芹幼苗。在本发明中，所述幼苗的生长时间优选为10～30d，进一步优选为10～25d，更优选为15d。在本发明中，所述幼苗的株高优选为20～30cm，更优选为25cm。本发明对幼苗的来源没有特殊限定，采用常规培养的幼苗均可。本发明实施例中的水芹幼苗来自于江苏省宿迁市渔樵专业合作社富营养化水体中。所述水芹种类优选为金陵1号水芹。本发明使用富营养化水体中的水芹幼苗作为抑藻剂的来源，不仅能高效发挥抑藻的功效，还解决了因食用安全风险而无法资源化利用的生物修复后水芹的去向问题。
本发明将水芹幼苗种植于水中之前，优选对水芹幼苗进行清洗。本发明所述清洗优选先用自来水进行冲洗，再用无菌水进行洗涤。在用无菌水进行洗涤时，本发明优选对水芹幼苗洗涤三次。本发明对水芹幼苗进行清洗主要是除去水芹幼苗表面的污渍。本发明对所述洗涤的方式没有特殊限定，采用本领域常规的幼苗洗涤方式即可。
在本发明中，将水芹幼苗种植于水中进行培养时，所述水芹幼苗的生物量与水的体积比优选为(50～200)g：(250～1000)mL，进一步优选为(80～150)g：(400～800)mL，更优选为100g:500mL。本发明所述水优选为纯水，本发明对纯水的来源没有特殊限制，采用常规纯水均可。本发明所述培养的时间优选为3～14d，更优选为7d。在本发明中，所述培养时的温度优选为10℃～32℃，进一步优选为25～30℃，更优选为25℃；所述培养的光照条件优选为1000～4200lx，进一步优选为2800～4000lx，更优选为4000lx；所述培养的光暗比优选为(12～14)h：(14～10)h，进一步优选为(12～14)：(12～10)，更优选为14h：10h。本发明提供的水芹幼苗的培养条件适宜水芹幼苗生长。所述培养时间能够使水芹幼苗产生充足的化感物质，从而发挥生物抑藻的作用。
得到水芹幼苗种植水后，本发明优选将所述水芹幼苗种植水进行过滤，得到水芹幼苗种植水生物质抑藻剂。本发明所述过滤优选包括三次过滤，分别依次为第一次过滤，第二次过滤和第三次过滤。在本发明中，所述第一过滤优选采用三层无菌纱布进行过滤；所述第二次过滤优选采用0.45μm的水系滤膜进行过滤；所述第三次过滤优选采用0.22μm的水系滤膜进行过滤。在本发明中，所述第一次过滤主要是去除植物残体和杂质等；所述第二次过滤和第三次过滤主要是去除微生物。本发明经过所述三次过滤，得到水芹幼苗种植水生物质抑藻剂。
按质量百分比计，本发明上述技术方案所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂优选包括以下组分化感物质：硬脂酸≥60.00％、苯甲酸≥4.00％、壬二酸≥2.00％、咖啡酸≥1.40％和水杨酸≥1.20％。
按质量百分比计，本发明提供的水芹幼苗种植水生物质抑藻剂优选包括硬脂酸≥60.00％，进一步优选为60.00％～70.00％，更优选为65.00％。
按质量百分比计，本发明提供的水芹幼苗种植水生物质抑藻剂优选包括苯甲酸≥4.00％，进一步优选为4.00％～8.00％，更优选为6.00％。
按质量百分比计，本发明提供的水芹幼苗种植水生物质抑藻剂优选包括壬二酸≥2.00％，进一步优选为2.00％～4.00％，更优选为3.00％。
按质量百分比计，本发明提供的水芹幼苗种植水生物质抑藻剂优选包括咖啡酸≥1.40％，进一步优选为1.40％～3％，更优选为2.20％。
按质量百分比计，本发明提供的水芹幼苗种植水生物质抑藻剂优选包括水杨酸≥1.20％，进一步优选为1.20％～2.40％，更优选为1.80％。
在本发明中，所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂中的化感物质优选采用代谢组学方法进行检测。
本发明还提供了一种上述技术方案所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂的使用方法。在本发明中，所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂使用时优选按比例加入蓝藻水体中发挥生物抑藻的功效。在本发明中，所述水芹幼苗种植水生物质抑藻剂与蓝藻水体的体积比优选为(0.5～1)：(4～10)，进一步优选为1：(4～8)，更进一步优选为1：(4～6)，更优选为1:4。在本发明中，当水芹种植水抑藻剂与水的体积比为1:8时，能显著抑制铜绿微囊藻生长，且藻细胞呈现为亚健康的黄色；当所述水芹种植水抑藻剂与水的体积比为1:4时，铜绿微囊藻培养液中细胞密度明显下降，甚至死亡。
在本发明中，所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括水芹幼苗叶、茎和根中的一种或两种以上；更优选为同时包括水芹幼苗叶、茎和根。在本发明中，当同时包括水芹幼苗叶、茎和根时，所述水芹幼苗叶、茎和根干物质的质量比优选为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(1～3)，更优选为1:1:2。在本发明中，所述水芹幼苗叶、茎和根的质量比主要是根据幼苗期水芹叶、茎和根三器官所占整株干物质进行的设定，以提高资源化利用效率。
在本发明中，所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂的制备方法优选包括：将水芹幼苗植株干燥后进行粉碎，得到水芹幼苗植株生物质抑藻剂。
在本发明中，所述水芹幼苗优选为在状态良好的水芹幼苗，更优选为老嫩适中的幼苗。所述水芹幼苗优选为适宜条件生长的水芹幼苗，更优选为春季或秋季生长的水芹幼苗，可以为进行过富营养化水体修复的适宜条件生长的水芹幼苗，也可以为没有用于富营养化水体修复的经适宜系统案件生长的水芹幼苗。所述幼苗的生长时间优选为10～30d，进一步优选为10～25d，更优选为25d。所述幼苗的株高优选为20～30cm，更优选为25cm。本发明对幼苗的来源没有特殊限定，采用常规培养的幼苗均可。本发明实施例中的水芹幼苗来自于江苏省宿迁市渔樵专业合作社富营养化水体中。所述水芹种类优选为金陵1号水芹。本发明使用富营养化水体中的水芹幼苗作为抑藻剂的来源，不仅能高效发挥抑藻的功效，还解决了因食用安全风险而无法资源化利用的生物修复后水芹的去向问题。
将水芹幼苗植株进行干燥前，本发明优选对所述幼苗进行清洗。本发明所述清洗优选先用清水清洗后，再用无菌水冲洗。所述无菌水冲洗的次数优选为3次。本发明对叶片进行清洗时优选对叶片正反面分别进行清洗。本发明对叶片进行清洗主要是去除叶片表面的污渍。
清洗完成后，本发明优选将所述幼苗植株进行干燥。在本发明中，所述水芹幼苗植株干燥优选为将水芹幼苗的叶、茎和根分别进行干燥。在本发明中，所述干燥优选将幼苗叶、茎和根分别装入牛皮袋中进行干燥。本发明所述干燥优选包括第一干燥阶段和第二干燥阶段。在本发明中，所述第一干燥阶段的温度优选为96℃～120℃，更优选为105℃；所述第一干燥阶段的时间优选为20～40min，进一步优选为25～35min，更优选为30min。所述第二干燥阶段的温度优选为60℃～85℃，更优选为70℃；所述第二干燥阶段的时间优选为48～96h，进一步优选为48～72h，更优选为48h。在本发明中，所述第一干燥阶段的作用主要是将水芹不同器官进行杀青，钝化水芹叶中酶的活性，抑制多酚类化合物的酶促氧化，从而最大程度上保留组织器官中的酚酸类化感物质。所述第二干燥阶段主要是蒸干组织器官中的水分，同时防止酚酸类物质在高温条件下的分解。本发明所述干燥优选在烘箱内进行。
本发明将水芹幼苗叶、茎和根干燥后进行粉碎。在本发明中，所述粉碎的细度优选为30～300目，更优选为100目。本发明所述粉碎的方式优选为超细磨样机或研磨。当所述粉碎采用磨样机进行时，所述磨样机粉碎的转速优选为10000～25000r/m，更优选为20000r/m；所述粉碎的时间优选为0.5～1min，更优选为1min；所述磨样机优选为实验室磨样设备或粉碎机。本发明将水芹幼苗叶、茎和根粉粹后，分别得到幼苗叶、茎和根粗粉末。得到幼苗叶、茎和根粗粉末后，本发明优选将所述幼苗叶、茎和根粗粉末进行过筛。本发明所述过筛的孔径优选为50～200目，进一步优选为80～150目，更优选为100目。本发明通过过筛主要是去除大颗粒木质素和纤维等组分，分别获得幼苗水芹不同器官叶、茎和根细粉末。根据幼苗期水芹叶、茎和根三器官所占整株干物质比例，将幼苗叶、茎和根的细粉末进行混合。在本发明中，所述混合的比例优选为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(1～3)，更优选为1:1:2。本发明将幼苗叶、茎和根的细粉末混合后获得水芹幼苗植株生物质抑藻剂。在本发明中，将幼苗叶、茎和根分别进行粉碎后进行混合，分开操作和量化配置以防生长于不同水芹个体性差异，导致水芹幼苗植株生物质抑藻剂的效果产生差异。
按质量比计，本发明上述技术方案所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括脂肪酸类化感物质和酚酸类化感物质：
所述脂肪酸类化感物质包括：棕榈酸≥700.00μg/g、亚麻酸≥450.00μg/g、硬脂酸≥400.00μg/g和亚油酸≥350.00μg/g；
所述酚酸类化感物质包括：咖啡酸≥35.00μg/g、阿魏酸≥15.00μg/g、香草酸≥4.00μg/g和没食子酸≥3.00μg/g。
按质量比计，本发明提供的水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括棕榈酸≥700.00μg/g，进一步优选为700.00～800.00μg/g，更优选为778.74μg/g。
按质量比计，本发明提供的水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括亚麻酸≥450.00μg/g，进一步优选为450.00～500.00μg/g，更优选为490.67μg/g。
按质量比计，本发明提供的水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括硬脂酸≥400.00μg/g，进一步优选为400.00～420.00μg/g，更优选为408.57μg/g。
按质量比计，本发明提供的水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括亚油酸≥350.00μg/g，进一步优选为350.00～380.00μg/g，更优选为370.33μg/g。
按质量比计，本发明提供的水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括咖啡酸≥35.00μg/g，进一步优选35.00～40.00μg/g，更优选为39.47μg/g。
按质量比计，本发明提供的水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括阿魏酸≥15.00μg/g，进一步优选为15.00～20.00μg/g，更优选为17.18μg/g。
按质量比计，本发明提供的水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括香草酸≥4.00μg/g，进一步优选为4.00～6.00μg/g，更优选为4.96μg/g。
按质量比计，本发明提供的水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选包括没食子酸≥3.00μg/g，进一步优选为3.00～4.00μg/g，更优选为3.27μg/g。
在本发明中，所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂中的化感物质优选采用代谢组学方法进行检测。
本发明还提供了一种上述技术方案所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂的使用方法。在本发明中，所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂优选洒到蓝藻水华水体中进行使用。在本发明中，所述蓝藻水体中水芹幼苗植株生物质抑藻剂的用量优选为30～200g/L，进一步优选为50～200g/L，更进一步优选为100～200g/L，更优选为150～200g/L，最优选为200g/L。
本发明所采用材料为对富营养化水体进行生物修复后的金陵1号水芹，通过开发生物抑藻剂解决了因食用安全风险而无法资源化利用的生物修复后水芹的去向问题。
本发明所使用材料，具有四季常绿、生物量大、生存能力强等特点，是一种良好的生物抑藻剂开发材料。
本发明采用材料金陵1号水芹既可以开发为种植水抑藻剂，也可以将水芹幼苗植株开发为生物抑藻剂，成本较低，抑藻效果较好。
本发明所制备生物抑藻剂不会对环境造成二次污染，同时对水体中其他生物没有毒性，是一种绿色、环保的抑藻技术。
本发明发现幼苗期水芹种植水中化感物质相对含量高于繁殖期和成熟期，直接性的选用相应生长时期的水芹或水芹器官作为抑藻剂开发材料，最大化的提高抑藻剂开发效率。
本发明研究确定水芹幼苗种植水以及水芹幼苗植株中具体化感物质的种类及相对含量或含量，有助于生物抑藻剂的开发以及对抑藻效果和机理的解释。
本发明生物抑藻剂可克服单一化感物质在实际应用中的抑藻效果不稳定、见效慢等问题。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的基于水芹水培生长的生物抑藻剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种生物抑藻剂，具体为水芹幼苗种植水生物质抑藻剂，制备方法步骤如下：
水芹以生态浮床形式种植于江苏省宿迁市渔樵专业合作社富营养化水体中。水质参数为：总氮(TN)含量≥70.00mg·L-1，铵态氮(NH4+-N)含量≥25.00mg·L-1，亚硝酸盐态氮(NO2--N)含量≥1.50mg·L-1，总磷(TP)含量≥200.00mg·L-1，化学需氧量(COD)≥150.00mg·L-1。
(1)植株挑选：在春季或秋季，挑选生长良好、无损伤、根系相对发达，生长10～25d、株高20～30cm的幼苗期水芹。
(2)洗涤：将包括根在内的整个幼苗期水芹植株，先用自来水冲洗，后用无菌水反复洗涤三次。
(3)培养：将生物量为100g洗涤干净的幼苗期水芹植株种植于500mL纯水中，放置于光照培养架上，培养条件为：温度25℃，光照条件4000lx，光暗比14h/10h，培养周期为7d。
(4)过滤：培养7d后，将水芹植株取出，先用三层无菌纱布过滤水芹种植水，去除植物残体、杂质等，再先后用0.45μm和0.22μm的水系滤膜过滤种植水，去除微生物等，得到水芹幼苗种植水生物质抑藻剂。
通过代谢组学方法检测上述水芹种植水抑藻剂中的化感物质，具体方法参见参考文献(李丽等，连作西洋参根际土壤化感物质筛选及化感效应分析.西北农业学报,2022,31(08):1046-1057.)。所述水芹种植水抑藻剂中包括硬脂酸65.00wt.％、苯甲酸6.00wt.％、壬二酸3.00wt.％、咖啡酸2.20wt.％，水杨酸1.80wt.％。此种植水生物抑藻剂的优势在于：源于绿色植物有机体、获取简单便捷、成分混合均匀、具水溶性和流动性，添加至富营养化水体，既能有效抑制蓝藻生长和大面积繁殖，也不会因局部浓度过高而对水体其他生物造成严重影响。
对比例1
与实施例1制备方法相同，区别在于，选择成熟期水芹植株进行种植水抑藻剂的原料，其中水芹生长天数为45d，植株高为75cm左右。
通过代谢组学方法，检测方法检测上述种植水抑藻剂中的化感物质，具体方法参见参考文献(李丽等，连作西洋参根际土壤化感物质筛选及化感效应分析.西北农业学报,2022,31(08):1046-1057.)。所述水芹种植水抑藻剂中具体为硬脂酸55.00wt.％、苯甲酸3.20wt.％、壬二酸2.00wt.％、咖啡酸1.46wt.％、水杨酸1.75wt.％。
对比例2
与实施例1制备方法相同，区别在于，选择繁殖期水芹植株进行种植水抑藻剂的原料，其中水芹生长天数为65d，植株高为85cm左右。
通过代谢组学方法检测上述种植水抑藻剂中的化感物质，具体方法参见参考文献(李丽等，连作西洋参根际土壤化感物质筛选及化感效应分析.西北农业学报,2022,31(08):1046-1057.)。所述水芹种植水抑藻剂中具体为硬脂酸58.00wt.％、苯甲酸2.80wt.％、壬二酸1.80wt.％、咖啡酸1.46wt.％、水杨酸1.63wt.％。
实施例2
一种生物抑藻剂，具体为水芹幼苗植株生物质抑藻剂，制备方法步骤如下：
水芹以生态浮床形式种植于江苏省宿迁市渔樵专业合作社富营养化水体中。水质参数为：总氮(TN)含量≥70.00mg·L-1，铵态氮(NH4+-N)含量≥25.00mg·L-1，亚硝酸盐态氮(NO2--N)含量≥1.50mg·L-1，总磷(TP)含量≥200.00mg·L-1，化学需氧量(COD)≥150.00mg·L-1。
(1)叶片挑选：在春季或秋季时，挑选在上述富营养化水体中生长10～25d、株高20～30cm、状态良好的幼苗期水芹。
(2)洗涤：将水芹幼苗进行清洗至表面无污垢，再用无菌水冲洗三次。
(3)烘干：将清洗干净的水芹植株叶、茎和根摘开，分别装入牛皮信封袋中，放入烘箱105℃杀青30min，后70℃烘干48h。
(4)研磨：将烘干后的水芹叶、茎和根分别用实验室超细磨样机粉碎1min，粉碎时转速为20000r/m，获得幼苗叶、茎和根粗粉末。
(5)过筛：将粉碎后的幼苗叶、茎和根粗粉末过100目筛，去除叶片纤维等，得到水芹幼苗叶、茎和根细粉末。
(6)混合：将叶、茎和根细粉末按重量比1:1:2混合均匀，按照每5g装包，获得水芹幼苗植株生物质抑藻剂。
通过代谢组学方法检测上述水芹幼苗植株生物质抑藻剂中的化感物质，具体方法参见参考文献(李丽等，连作西洋参根际土壤化感物质筛选及化感效应分析.西北农业学报,2022,31(08):1046-1057.)。所述水芹幼苗叶片抑藻剂中脂肪酸类化感物质种类和相对含量为：棕榈酸778.74μg/g、亚麻酸490.67μg/g、硬脂酸408.57μg/g和亚油酸370.33μg/g；
酚酸类化感物质种类和相对含量为：咖啡酸39.47μg/g、阿魏酸17.18μg/g、香草酸4.96μg/g和没食子酸3.27μg/g。此幼苗期叶片制备生物质抑藻剂的优势在于：源于绿色植物有机体、获取简单便捷、脂肪酸类和芬酸类化感物质非常丰富、所需剂量少、抑藻效果好，同时易于降解，既不会对水体产生二次污染，也不会对水体其他生物造成负面影响。
对比例3
与实施例2制备方法相同，区别在于，选择成熟期水芹根、茎、叶为生物质抑藻剂的原料，其中水芹生长天数为45d，植株高为75cm。
通过代谢组学方法检测上述种植水抑藻剂中的化感物质，具体方法参见参考文献(李丽等，连作西洋参根际土壤化感物质筛选及化感效应分析.西北农业学报,2022,31(08):1046-1057.)。所述水芹幼苗叶片抑藻剂中脂肪酸类化感物质种类和相对含量为：棕榈酸528.13μg/g、亚麻酸365.12μg/g、硬脂酸296.84μg/g和亚油酸217.18μg/g；
酚酸类化感物质种类和相对含量为：咖啡酸35.25μg/g、阿魏酸15.10μg/g、香草酸3.16μg/g和没食子酸2.91μg/g。
对比例4
与实施例2制备方法相同，区别在于，选择繁殖期水芹植株根、茎、叶为生物质抑藻剂的原料，其中水芹生长天数为65d，植株高为85cm。
通过代谢组学方法检测上述种植水抑藻剂中的化感物质，具体方法参见参考文献(李丽等，连作西洋参根际土壤化感物质筛选及化感效应分析.西北农业学报,2022,31(08):1046-1057.)。所述水芹幼苗叶片抑藻剂中脂肪酸类化感物质种类和相对含量为：棕榈酸583.10μg/g、亚麻酸312.21μg/g、硬脂酸256.32μg/g和亚油酸236.58μg/g；
酚酸类化感物质种类和相对含量为：咖啡酸29.34μg/g、阿魏酸11.90μg/g、香草酸1.98μg/g和没食子酸2.20μg/g。
应用例1
分别采用实施例1制备得到的水芹幼苗种植水生物质抑藻剂和对比例1与对比例2分别得到的水芹种植水抑藻剂进行抑藻效果验证试验。
1)藻种来源
铜绿微囊藻是水华蓝藻的典型代表，是最为常见的有毒蓝藻。本发明所用的铜绿微囊藻购自中国科学院水生生物淡水藻种库，编号为FACHB-524。
2)藻种培养条件
供试藻种采用pH(7.0±0.1)的BG-11液体培养基培养，培养条件为：光照度4000lx、光照时间12h·d-1、温度25(2±1)℃；每天摇动培养瓶2次，每7～10d转接1次。
3)铜绿微囊藻培养液中添加不同种类和比例的种植水抑藻剂，验证不同比例和不同种类抑藻剂的效果。
首先，将实施例1和对比例1与对比例2制备的抑藻剂分别以1:4，1:6，1:8和1:10的质量比添加到铜绿微囊藻生长液养BG-11培养基中，细胞密度为2×107cells/mL。每试验三组重复，设置12组试验，无种植水的培养物作为对照组。每组试验中铜绿微囊藻培养采用1000mL锥形瓶，培养体积为500mL。培养条件均为：温度25℃、光照为4000lx、光暗比为12h:12h。每天摇动每个锥形瓶3次，并随机改变位置以减少光线对藻类生长的影响。试验进行第7天时检测各实验组和对照组铜绿微囊藻细胞密度，并计算藻密度抑制率。
藻密度抑制率计算及方法。
生长抑制率(IR)计算公式为IR＝(1-N/N0)×100％。
式中，N为处理组铜绿微囊藻细胞密度(以OD680表示)，N0为同期对照组的铜绿微囊藻细胞密度。实施例1和对比例1以及对比例2制备的抑藻剂的抑藻率如表1所示。
表1.实施例1和对比例1以及对比例2制备的抑藻剂的抑藻率
由表1可得，实施例1制备得到的水芹种植水抑藻剂以1:8的体积比加入细胞密度为2×107个/mL的铜绿微囊藻培养液中，能明显抑制铜绿微囊藻生长，第7天时抑藻率达到58.26％，达到了半致死率效果，且藻细胞呈现为亚健康的黄色；而对比例1和对比例2制备的种植水抑藻剂在此体积比下应用，第7天时抑藻率分别为31.39％和39.13％，虽然也可抑制铜绿微囊藻生长，但效果显著低于实施例1。
当以1:6的体积比加入铜绿微囊藻培养液中时，第7天时抑藻率高达76.81％，细胞密度显著下降，少量存活的藻细胞从正常的墨绿色转变为黄色，大量死亡的藻细胞沉淀于瓶底；而对比例1和对比例2制备的种植水抑藻剂在此体积比下应用，第7天时抑藻率分别为51.03％和59.08％，对铜绿微囊藻生长具有抑制效应，但抑藻率显著低于实施例1。
当以1:4的体积比加入铜绿微囊藻培养液中时，第7天时抑藻率达到94.49％，且细胞呈絮状沉降到底部，说明铜绿微囊藻无法在该浓度中存活，基本阻止了藻细胞的生长发育；而对比例1和对比例2制备的种植水抑藻剂在此体积比下应用，第7天时抑藻率分别为70.51％和75.04％，也显著抑制了蓝藻得生长发育，但没能阻止细胞生长。
当以1:10的体积比加入铜绿微囊藻培养液中时，第7天时抑藻率达到42.05％，也显著高于对比例1和2的21.01％和20.88％。以上应用例效果说明，不同发育阶段水芹种植水中的化感物质均抑制铜绿微囊藻生长，但幼苗期种植水的抑制效果最为显著，且可有效阻止藻细胞的生长发育。
综上，本发明提供的幼苗期种植水抑藻剂，其抑藻效果显著优于水芹繁殖期和成熟期种植水相应制剂。此种植水源于绿色植物有机体、获取简单便捷、成分混合均匀、具水溶性和流动性，既能有效抑制蓝藻生长和大面积繁殖，也不会因局部浓度过高而对水体其他生物造成严重影响。
应用例2
分别采用实施例2制备得到的水芹幼苗植株生物质抑藻剂和对比例3与对比例4分别得到的水芹植株生物质抑藻剂进行抑藻效果验证试验。
1)藻种来源如上
铜绿微囊藻购自中国科学院水生生物淡水藻种库，编号为FACHB-524。
2)藻种培养条件如上
3)铜绿微囊藻培养液中添加不同种类和比例的水芹植株生物质抑藻剂，验证不同比例和不同种类抑藻剂的效果。
首先，将实施例2和对比例3与对比例4制备的生物质抑藻剂分别以30g/L，50g/L，100g/L，150g/L和200g/L四个浓度梯度添加到500mL对数期铜绿微囊藻培养液中，轻轻晃动混合均匀，初始藻细胞浓度均为2.8×107cells/mL。
每试验三组重复，设置15组试验。无生物质抑藻剂添加的培养物作为对照组。随后，开展为期7天的培养，培养条件也如应用例1所述。试验进行第7天时检测各实验组和对照组铜绿微囊藻细胞密度，并计算藻密度抑制率。
藻密度抑制率计算及方法同上。
实施例2水芹幼苗植株生物质抑藻剂和对比例3以及对比例4制备的抑藻剂的抑藻率如表2所示。
表2实施例2和对比例3以及对比例4制备的抑藻剂的抑藻率
由表2可得，实施例2制备得到的水芹生物质抑藻剂以浓度为30g/L加入初始细胞浓度均为2.8×107cells/mL铜绿微囊藻培养液中，幼苗期抑藻剂能明显抑制铜绿微囊藻生长，第7天的抑藻率达到51.83％，达到了半致死率效果，且藻细胞呈现为亚健康的黄色；而在对比例3和对比例4制备的成熟期和繁殖期水芹抑藻剂处理组中，第7天的抑藻率分别为28.87％和22.22％，虽然也可抑制铜绿微囊藻生长，但效果显著低于实施例1。
当实施例2制备的水芹生物质抑藻剂以浓度为50g/L加入同浓度铜绿微囊藻培养液中时，第7天时幼苗期抑藻剂的抑藻率高达63.89％，蓝藻细胞密度明显下降，且有死亡细胞沉淀于瓶底；而对比例3和对比例4制备的成熟期和繁殖期水芹抑藻剂处理组中，第7天的抑藻率分别为48.06％和41.67％，虽然有效抑制了铜绿微囊藻生长，但抑藻率显著低于实施例2。
实施例2制备的水芹生物质抑藻剂以浓度为100g/L加入同浓度铜绿微囊藻培养液中时，第7天幼苗期抑藻剂的抑藻率高达83.73％，显著抑制铜绿微囊的生长发育，导致大量藻细胞死亡，且沉淀于瓶底；而对比例3和对比例4制备的成熟期和繁殖期水芹生物质抑藻剂处理组中，两者在第7天的抑藻率分别为60.78％和57.52％，说明水芹成熟期和繁殖期生物质抑藻剂添加浓度达到100g/L，均可达到了半致死抑藻率，但水芹幼苗期抑藻剂在浓度为30g/L时，就能达到半致死抑藻效果。
当实施例2制备到的水芹生物质抑藻剂投放浓度为150g/L时，第7天时幼苗期生物质抑藻剂的抑藻率为89.31％，而成熟期和繁殖期生物质抑藻剂的抑藻率分别为72.47％和70.66％，幼苗期的抑藻效果也显著高于成熟期和繁殖期。
当实施例2制备到的水芹生物质抑藻剂投放浓度为200g/L时，第7天时幼苗期生物质抑藻剂基本阻止了蓝藻细胞的额生长，抑藻率高达98.47％，说明铜绿微囊藻无法在该浓度中存活，完全阻止了水华蓝藻的生长与繁殖；而成熟期和繁殖期生物质抑藻剂的抑藻率分别为83.44％和81.50％，也有效抑制了蓝藻生长。
由此可见，本发明提供的水芹生物质抑藻剂能够显著抑制水华蓝藻铜绿微囊藻的生长与繁殖。整体上看，随着不同发育阶段的生物质抑藻剂添加浓度的增加，抑制效果呈显著上升趋势。但是，同一浓度的生物质抑藻剂，幼苗期抑藻剂的抑藻效果显著优于成熟期和繁殖期。
应用例3
分别采用实施例2制备得到的水芹幼苗叶片抑藻剂和对比例3与对比例4分别得到的水芹种植水抑藻剂进行抑藻效果验证试验。
1)藻种来源如上
铜绿微囊藻是水华蓝藻的典型代表，是最为常见的有毒蓝藻。本发明所用的铜绿微囊藻购自中国科学院水生生物淡水藻种库，编号为FACHB-524。
2)藻种培养条件如上
3)铜绿微囊藻培养液中添加不同种类和比例的水芹植株生物质抑藻剂，验证不同比例和不同种类抑藻剂的效果。
首先，将实施例2和对比例3与对比例4制备的生物质抑藻剂分别以30g/L，50g/L，100g/L，150g/L和200g/L四个浓度梯度添加到500mL对数期铜绿微囊藻培养液中，轻轻晃动混合均匀，初始藻细胞浓度均为5.6×107cells/mL。
每试验三组重复，设置12组试验。无生物质抑藻剂添加的培养物作为对照组。随后，开展为期7七天的培养，培养条件也如应用例1所述。试验进行第7天时检测各实验组和对照组铜绿微囊藻细胞密度，并计算藻密度抑制率。
藻密度抑制率计算及方法同上。
实施例2和对比例3以及对比例4制备的抑藻剂的抑藻率如表3所示。
表3实施例2和对比例3以及对比例4制备的抑藻剂的抑藻率
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由表3可得，实施例2制备得到的水芹生物质抑藻剂以浓度为30g/L加入初始细胞浓度为5.6×107cells/mL铜绿微囊藻中，幼苗期抑藻剂能明显抑制铜绿微囊藻生长，第7天的抑藻率达到50.83％，达到半致死率效果；而对比例3和对比例4制备的成熟期和繁殖期水芹抑藻剂处理组中，第7天的抑藻率分别为21.12％和19.20％，抑藻效果显著低于实施例2。
当实施例2制备的水芹生物质抑藻剂以浓度为50g/L加入同浓度铜绿微囊藻中，第7天时幼苗期抑藻剂抑藻率达60.17％，抑制蓝藻生长，且导致部分细胞死亡；而对比例3和对比例4制备的成熟期和繁殖期水芹抑藻剂处理组中，第7天的抑藻率分别为39.91％和35.26％，抑藻率显著低于实施例2。
实施例2制备的水芹生物质抑藻剂以浓度为100g/L加入同浓度铜绿微囊藻培养液中，第7天幼苗期抑藻剂的抑藻率高达80.62％，显著抑制铜绿微囊的生长的同时，导致大量藻细胞死亡；而对比例3和对比例4制备的成熟期和繁殖期水芹生物质抑藻剂处理组中，在第7天的抑藻率分别为49.71％和46.52％，显著低于实施例2。
当实施例2制备的水芹生物质抑藻剂投放浓度为150g/L时，第7天时幼苗期生物质抑藻剂的抑藻率为89.92％，而成熟期和繁殖期生物质抑藻剂的抑藻率分别为55.85％和55.48％，说明水芹成熟期和繁殖期生物质抑藻剂添加浓度达到150g/L左右时，两者才可达到半致死抑藻率效果，但水芹幼苗期抑藻剂在浓度为50g/L时，抑藻率已达到60.17％。
当实施例2制备的水芹生物质抑藻剂投放浓度为200g/L时，第7天时幼苗期生物质抑藻剂基本阻止了蓝藻细胞的生长，抑藻率高达98.81％，说明幼苗期抑藻剂在此浓度下高效阻止了水华蓝藻的生长与繁殖，铜绿微囊藻在该浓度中根本无法存活，基本死亡；而成熟期和繁殖期生物质抑藻剂的抑藻率分别为65.48％和62.39％，也有效抑制了蓝藻生长，但未能高效阻止蓝藻生长。
综合应用例2和3，本发明提供的水芹生物质抑藻剂能够显著抑制水华蓝藻铜绿微囊藻的生长与繁殖。整体上看，随着不同发育阶段的生物质抑藻剂添加浓度的增加，抑制效果呈显著上升趋势。但是，同一浓度的生物质抑藻剂，幼苗期抑藻剂的抑藻效果显著优于成熟期和繁殖期。在实际应用中，当幼苗期生物质抑藻剂投放浓度为30g/L时，对不同浓度蓝藻的抑制率均高于50％，达到半致死效应，所需剂量少、抑藻效果强，且源于绿色有机体、易于降解，不会对环境产生二次污染。同时，本发明所提供的幼苗期生物质抑藻剂，将幼苗期叶、茎和根细粉末按其在生长植株中干物质所占比1:1:2混合，大大提高幼苗期水芹整株的资源化利用率，应用前景广阔。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (2)
1.一种生物抑藻剂，其特征在于，所述生物抑藻剂为水芹幼苗植株生物质抑藻剂；
所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂由水芹幼苗叶、茎和根3个主要器官组成；
所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂将叶、茎和根细粉末按重量比1:1:2混合均匀得到；
所述幼苗的生长时间为10～25d；所述幼苗的株高为20～30cm；
所述水芹种类为金陵1号水芹；
所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂的制备方法包括：将水芹幼苗植株干燥后进行粉碎，得到水芹幼苗植株生物质抑藻剂；
所述干燥包括第一干燥阶段和第二干燥阶段；
所述第一干燥阶段的温度为105℃，时间为30min；
所述第二干燥阶段的温度为70℃，时间为48h；
所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂包括脂肪酸类化感物质和酚酸类化感物质：
脂肪酸类化感物质种类和相对含量为：棕榈酸778.74μg/g、亚麻酸490.67μg/g、硬脂酸408.57μg/g和亚油酸370.33μg/g；
酚酸类化感物质种类和相对含量为：咖啡酸39.47μg/g、阿魏酸17.18μg/g、香草酸4.96μg/g和没食子酸3.27μg/g。
2.权利要求1所述生物抑藻剂的使用方法，其特征在于，包括：
将所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂洒到蓝藻水体进行使用；
所述水芹幼苗植株生物质抑藻剂的用量为30～200g/L。
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