CN115884796A - 靶向冠状病毒基因的基因沉默剂及其用途 - Google Patents
靶向冠状病毒基因的基因沉默剂及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了基因沉默剂，其能够沉默体内外冠状病毒(例如SARS‑CoV‑2)基因的表达。出于研究或治疗的目的(例如控制或治疗与冠状病毒感染相关的病症，如COVID‑19)本发明进一步提供了一般的和特定的组合物以及使用该组合物的方法，所述组合物和方法能够用于降低受试者(例如哺乳动物，如人类)的特定的SARS‑CoV‑2蛋白水平或SARS‑CoV‑2滴度。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月18日提交的美国临时申请62/991,580和于2020年10月16日提交的美国临时申请63/092,801的优先权并要求享有该申请的权益，该临时专利申请的完整内容引入本申请当中作为参考。
技术领域
本发明基本上涉及基因沉默剂领域用于靶向冠状病毒(CoV)基因(例如SARS-CoV-2)，以及使用此类基因沉默剂在体内和体外降低冠状病毒蛋白水平或病毒滴度的方法，以及治疗冠状病毒感染(例如COVID-19)的受试者的方法，或预防冠状病毒感染的方法。
发明背景
近年来全球流行的COVID-19属于数量庞大的单链RNA病毒中的一种，单链RNA病毒曾经导致2012年的中东呼吸综合征(MERS)和2003年的严重急性呼吸道综合征(SARS)，这两种疾病都是由动物传染给人类的，这种严重的呼吸道感染需要紧急医疗解决方案(Zhu,N.,2019)。
COVID-19对81％的患者为轻度，总病死率为2-3％。该病的严重程度似乎与年龄有关，处于危险之中的患者老年人居多；80岁以上患者的病死率(CFR)为15％。CFR在那些患有合并症的患者中提高，合并症包含心血管疾病、糖尿病、慢性呼吸道疾病、高血压和癌症。死亡原因是呼吸衰竭，休克或多器官衰竭(Fisher and Heymann,2020)。
目前尚无特异性治疗方法可以在大多数患者体内抑制CoVs复制。基因沉默技术被认为是最有希望的药物开发技术之一，包含ASO(单链反义寡核苷酸)和RNAi(双链干扰RNA)。合理设计的aiRNA，siRNA，ASO或其他靶向基因的基因沉默剂可用于治疗冠状病毒感染。
不对称干扰RNA(aiRNA)是一类双链RNA分子，在RNA干扰(RNAi)通路内发挥作用。aiRNA通过降解转录后的mRNA，阻止翻译，干扰与其具有互补的核苷酸序列的特定基因的表达，(Sun,X,et al2008)。这里强调的是，RNAi可能是一种控制当前COVID-19爆发的有希望的方法。目前，没有针对晚期COVID-19患者的特定的治疗方案。虽然新出现的疫苗应该能够限制SARS-CoV-2病毒的传播，并最终控制COVID-19疾病的公共传播。但对于那些已经患上COVID-19疾病的人来说，防止死亡和降低发病率的迫切的医疗需求尚未得到满足。设计以病毒为靶点的小分子有一个缺点，即需要几年的时间来优化具有能够到达靶点的可接受的生物功能水平的先导分子(Kunisaki,K.M.,2009和Hodgson,J.,2020)。此外，为了开发有效的小分子疗法(如蛋白酶抑制剂/核苷类似物，和疫苗)，研究人员需要了解病毒的结构和功能(Lu,H.,2020)。aiRNAs的使用可以克服上述选项带来的限制，aiRNAs可以针对不可成药靶点(Levanova,A.,2018和Lam,J.K.,2015)，一个额外的优势是我们能够使用先进的生物信息学工具快速、准确地设计基于aiRNA的疗法。因此，迫切地需要一种有效的基因沉默剂(如aiRNAs)，以对抗CoV感染，尤其是对抗SARS-CoV-2感染。
发明概述
本发明提供了基因沉默剂，其已被证明可在体外和体内沉默CoV基因。
在一方面，本发明具体地提供了基因沉默剂，其包含反义链，该反义链包含与CoV的基因，尤其是SARS-CoV-2的PL1、3CL、RdRp(在下文中亦称为POL或P)和核衣壳(Nucleocapsid，N)，之一基本上互补的至少15个或更多个连续的核苷酸，或者由其组成，或者基本上由其组成；更具体而言，该基因沉默剂包含与图1-3提供的靶序列(SEQ ID No.1-210)之一基本上互补的至少15个或更多个连续的核苷酸。该基因沉默剂优选地包含反义链和有义链，每条链具有少于30个核苷酸，例如9-23个核苷酸。
在另一方面，本发明具体地提供了基因沉默剂，其包含反义链；该反义链包含与图1-3提供的反义链序列(SEQ ID No.211-420)中的任何一个相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，或者由其组成，或者基本上由其组成。
在一些实施方案中，所述基因沉默剂优选是双链RNAi剂，其包含反义链和有义链，每条链具有少于30个核苷酸，例如9-23个核苷酸，比如图1-3提供的那些(GHI_N1至GHI_N96，GHI_P97至GHI_P162，aiRNA 3CL_1至28和aiRNA PLPRO_1至20)。所述双链RNAi剂的反义链的3’和/或5’端可以或者具有平末端，或者具有1-5个核苷酸的突出端。
在一方面，本发明提供了双链的基因沉默剂，其包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AACGAUUGCAGCAUUGUUAGC-3’(SEQ ID NO:253)，所述有义链包含5’-AACAAUGCUGCAAUC-3’(SEQ ID NO:463)。本发明还提供了基因沉默剂，其包含的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列在整个长度上至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与前述有义核苷酸序列和反义核苷酸序列相同。
在一方面，本发明提供了基因沉默剂，其中所述基因沉默剂是双链RNAi剂，其包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AACUUUAUCAUUGUAGAUGUC-3’(SEQID NO:365)，所述有义链包含5’-AUCUACAAUGAUAAA-3’(SEQ ID NO:575)。本发明还提供了基因沉默剂，其包含的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列在整个长度上至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与前述有义核苷酸序列和反义核苷酸序列相同。
在一方面，本发明提供了基因沉默剂，其中所述基因沉默剂是双链RNAi剂，其包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AAGCAUUGUUAGCAGGAUUGC-3’(SEQID NO:224)，所述有义链包含5’-AUCCUGCUAACAAUG-3’(SEQ ID NO:434)。本发明还提供了基因沉默剂，其包含的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列在整个长度上至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与前述有义核苷酸序列和反义核苷酸序列相同。
在一方面，本发明提供了基因沉默剂，其中所述基因沉默剂是双链RNAi剂，其包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AACAAUUUGCGGCCAAUGUUU-3’(SEQID NO:240)，所述有义链包含5’-CAUUGGCCGCAAAUU-3’(SEQ ID NO:450)。本发明还提供了基因沉默剂，其包含的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列在整个长度上至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与前述有义核苷酸序列和反义核苷酸序列相同。
在一方面，本发明提供了基因沉默剂，其中所述基因沉默剂是双链RNAi剂，其包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AAUUGUUUGGAGAAAUCAUCC-3’(SEQID NO:245)，所述有义链包含5’-UGAUUUCUCCAAACA-3’(SEQ ID NO:455)。本发明还提供了基因沉默剂，其包含的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列在整个长度上至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与前述有义核苷酸序列和反义核苷酸序列相同。
在一方面，本发明提供了基因沉默剂，其中所述基因沉默剂是双链RNAi剂，其包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AAACCAGCUACUUUAUCAUUG-3’(SEQID NO:366)，所述有义链包含5’-UGAUAAAGUAGCUGG-3’(SEQ ID NO:576)。本发明还提供了基因沉默剂，其包含的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列在整个长度上至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与前述有义核苷酸序列和反义核苷酸序列相同。
在一方面，本发明提供了基因沉默剂，其中所述基因沉默剂是双链RNAi剂，其包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AAAUGUGUCACAAUUACCUUC-3’(SEQID NO:354)，所述有义链包含5’-GGUAAUUGUGACACA-3’(SEQ ID NO:564)。本发明还提供了基因沉默剂，其包含的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列在整个长度上至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与前述有义核苷酸序列和反义核苷酸序列相同。
在一方面，本发明提供了基因沉默剂，其中所述基因沉默剂是双链RNAi剂，其包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AACAGCUGGACAAUCCUUAAG-3’(SEQID NO:357)，所述有义链包含5’-AAGGAUUGUCCAGCU-3’(SEQ ID NO:567)。本发明还提供了基因沉默剂，其包含的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列在整个长度上至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与前述有义核苷酸序列和反义核苷酸序列相同。
上述任何方面提供的基因沉默剂可用于治疗或预防SARS-CoV-2感染，抑制细胞内SARS-CoV-2蛋白的表达，沉默细胞内SARS-CoV-2基因，抑制细胞内SARS-CoV-2的复制，或在体外或体内降低SARS-CoV-2的滴度。
在另一方面，本发明提供了用于治疗与CoV感染(例如COVID-19)相关的病症的药物组合物，其包含本发明提供的任何方面的基因沉默剂和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。在一些实施方案中，该基因沉默剂是双链RNAi剂，其包含反义链和有义链；其中该反义链包含与图1、2和3提供的核苷酸序列(SEQ ID NO:211-420)中的任何一个相差不超过3个核苷酸的至少15个连续的核苷酸。在一些实施方案中，该基因沉默剂是如图1-3提供的双链RNAi剂(GHI_N1至GHI_N96，GHI_P97至GHI_P162，aiRNA3CL_1至28和aiRNAPLPRO_1至20)。在某些实施方案中，该基因沉默剂是双链RNAi剂，选自GHI_N43，GHI_P155，GHI_N14，GHI_N30，GHI_N35，GHI_P156，GHI_P144，GHI_P147，GHI_N31，GHI_N12，GHI_N3，GHI_N93，GHI_N13，GHI_N32，GHI_N29，GHI_N78，GHI_N33，GHI_N36，GHI_N91，GHI_N34，GHI_N20，GHI_N75，GHI_N95，GHI_N46，GHI_N15，GHI_N44，GHI_N96，GHI_N81，GHI_N58，GHI_N84，GHI_N86，GHI_N62，GHI_P157，GHI_P158，GHI_P151，GHI_P148，GHI_P145，GHI_P153，GHI_P150，GHI_P159，GHI_P146，GHI_P149，GHI_P154，GHI_P152，GHI_P160，GHI_P161和GHI_P162。
在另一方面，本发明提供了用于治疗与CoV感染相关的病症(例如COVID-19)的药物组合物，该药物组合物包含两种或者多种本发明提供的任何方面的基因沉默剂和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，其中每种基因沉默剂直接作用于CoV基因的不同片段或不同的CoV基因。
在一些实施方案中，该药物组合物包含两种基因沉默剂和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，其中第一基因沉默剂靶向SARS-CoV-2的核衣壳基因，第二基因沉默剂靶向SARS-CoV-2的RdRp基因。在一些实施方案中，第一基因沉默剂包含反义链，该反义链包含与图1(SEQ ID NO:211-306)提供的反义序列中的任何一个相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，或者由其组成，或者基本上由其组成。在一些实施方案中，该第二基因沉默剂包含反义链，该反义链包含与图2(SEQ ID NO:307-372)提供的反义序列中的任何一个相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，或者由其组成，或者基本上由其组成。在一些实施方案中，该第一基因沉默剂是双链RNAi剂，选自GHI_N1至GHI_N96中的任意一种；该第二基因沉默剂是双链RNAi剂，选自GHI_P97至GHI_P162中的任意一种。
在一些实施方案中，该药物组合物包含两种基因沉默剂和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，其中第一基因沉默剂靶向SARS-CoV-2的核衣壳基因，其包含反义链，该反义链包含与选自由SEQ ID NO:253、224、240和245组成的组的反义链序列之一相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，或者由其组成，或者基本上由其组成；该第二基因沉默剂靶向SARS-CoV-2的RdRp基因，其包含反义链，该反义链包含与选自由SEQ IDNO:365、366、354和357组成的组的反义序列之一相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，或者由其组成，或者基本上由其组成。在一些实施方案中，所述第一基因沉默剂包含反义链，所述反义链包含与反义链序列SEQ ID NO:253相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，或者由其组成，或者基本上由其组成，所述第二基因沉默剂包含反义链，所述反义链包含与反义链序列SEQ ID NO:365相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，或者由其组成，或者基本上由其组成。
在一些实施方案中，所述第一基因沉默剂是双链RNAi剂，选自由：GHI_N43，GHI_N14，GHI_N30，GHI_N35，GHI_N31，GHI_N12，GHI_N3，GHI_N93，GHI_N13，GHI_N32，GHI_N29，GHI_N78，GHI_N33，GHI_N36，GHI_N91，GHI_N34，GHI_N20，GHI_N75，GHI_N95，GHI_N46，GHI_N15，GHI_N44，GHI_N96，GHI_N81，GHI_N58，GHI_N84，GHI_N86和GHI_N62组成的组中的任意一个。在一些实施方案中，所述第二基因沉默剂是双链RNAi剂，选自由：GHI_P155，GHI_P156，GHI_P144，GHI_P147，GHI_P157，GHI_P158，GHI_P151，GHI_P148，GHI_P145，GHI_P153，GHI_P150，GHI_P159，GHI_P146，GHI_P149，GHI_P154，GHI_P152，GHI_P160，GHI_P161和GHI_P162组成的组中的任意一个。
在一个实施方案中，该药物组合物包含两种基因沉默剂，其中第一基因沉默剂是aiRNA分子，所述aiRNA分子包括形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含与核苷酸序列SEQ ID NO:253相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，所述有义链包含与有义链序列SEQ ID NO:463相差不超过3个核苷酸的至少12个或更多个连续的核苷酸；第二基因沉默剂是aiRNA分子，所述aiRNA分子包括形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含与反义链序列SEQ ID NO:365相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，所述有义链包含与有义链序列SEQ ID NO:575相差不超过3个核苷酸的至少12个或更多个连续的核苷酸。
此外，本发明提供的任何方面的基因沉默剂可以仅包含天然存在的核糖核苷酸亚单位，或者可以是合成的包含一个或多个糖或碱基修饰的核糖核苷酸亚单位，所述基因沉默剂包括一个或多个所述修饰的核糖核苷酸亚单位。在一个实施方案中，上述任一方面中提供的基因沉默剂的反义链和/或有义链的至少一个核苷酸为修饰核苷酸。在一个实施方案中，在上述任一方面中提供的基因沉默剂的反义链和/或有义链的几乎所有核苷酸均为修饰核苷酸。该基因沉默剂可以进一步修饰，以便连接到一个或多个被选定用于改善该基因沉默剂的稳定性、分布或细胞摄取的配体、基团或缀合物上。该基因沉默剂可以进一步以独立的形式使用，或者可以是用于本文所述方法的药物组合物的一部分，尤其是配制为递送至肺或鼻腔通道的药物组合物或配制为肠胃外给药的药物组合物。该药物组合物可包含一种或多种基因沉默剂，并且在一些实施方案中，包含两种或多种基因沉默剂，每一种分别直接作用于CoV基因的不同片段或者两种不同的CoV基因。
本发明进一步提供了降低细胞中CoV蛋白(特别是SARS-CoV-2蛋白)水平的方法。本发明进一步提供了治疗或者预防受试者CoV感染(尤其是SARS-CoV-2感染)的方法。此类方法包含将本发明的至少一种(例如，一种，两种或更多)基因沉默剂施用于受试者的步骤。本方法利用涉及RNA干扰的细胞机制来选择性降低细胞中的CoV蛋白水平，并且包括使细胞与本发明的至少一种(例如，一种，两种或更多)抗病毒基因沉默剂接触的步骤。该方法可以直接在细胞上运作或可以通过向哺乳类动物受试者施用本发明的至少一种(例如，一种，两种或更多)基因沉默剂/药物组合物来运作。
在附图和以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书，附图和权利要求书，本发明的其它特征、对象和优点变得显而易见。出于各种目的通过引用的方式将所有被引用的参考文献、专利和专利申请整体并入本申请中。
附图概述
图1示出了SARS-CoV-2基因核衣壳区的合理设计的、选定的靶序列的示例性序列以及每个靶序列的起始核苷酸位点，合理设计的基因沉默剂的反义链，与所设计的反义链对应的不对称干扰RNA(aiRNA)的合理设计的有义链，以及相对表达的体外研究结果。
图2示出了SARS-CoV-2基因RdRp区的合理设计的、选定的靶序列的示例性序列以及每个靶序列的起始核苷酸位点，合理设计的基因沉默剂的反义链，与所设计的反义链对应的不对称干扰RNA(aiRNA)的合理设计的有义链，以及相对表达的体外研究结果。
图3示出了SARS-CoV-2基因组的3CL和PL1基因的合理设计的、选定的靶序列的示例性序列，合理设计的基因沉默剂的反义链，与所设计的反义链对应的不对称干扰RNA(aiRNA)的合理设计的有义链，以及相对表达的体外研究结果。
图4示出了SARS-CoV-2的靶向基因区，例如GenBank登记号#MN908947.3的5123-5929，10052-10988，13468-16237，28374-29530区被选出为基因沉默剂所靶向。
图5示例性地示出了用于筛选基因沉默剂的整个SARS-CoV-2基因组以及靶向的SARS-CoV-2基因组中的RdRp和核衣壳区。
图6示出了具有15mer有义链和21mer反义链的15mer双链aiRNA的示例性的一般结构，在反义链的3’和5’端具有3个核苷酸的突出端。
图7示出了在96孔筛选中以1nM在HeLa细胞中筛选来自SARS-CoV-2N靶向的候选aiRNA(GHI_N1至GHI_N48)的有效aiRNA的结果。Luc/Rluc的比率的计算以模拟转染作为对照。
图8示出了在96孔筛选中以1nM在HeLa细胞中筛选来自SARS-CoV-2N靶向的候选aiRNA(GHI_N49至GHI_N96)的有效aiRNA的结果。Luc/Rluc的比率的计算以模拟转染作为对照。
图9示出了在96孔筛选中以100pM在HeLa细胞中筛选来自SARS-CoV-2N靶向的超级aiRNA的有效aiRNA的结果。Luc/Rluc的比率的计算以模拟转染作为对照。
图10示出了在96孔筛选中以1nM在HeLa细胞中筛选来自SARS-CoV-2RdRp靶向的候选aiRNA(GHI_P97至GHI_P144)的有效aiRNA的结果。Luc/Rluc的比率的计算以模拟转染作为对照。
图11示出了在96孔筛选中以100pM和10pM在HeLa细胞中进一步筛选来自SARS-CoV-2RdRp靶向的aiRNA(GHI_P144至GHI_P162)的有效aiRNA的结果。Luc/Rluc的比率的计算以模拟转染为对照。
图12通过每种受试化合物及其组合的剂量-反应曲线和IC50示出了SARS-Cov-2病毒感染检测结果。将aiRNAs添加到基于细胞的SARS-Cov-2感染系统中，无需转染。
发明详述
定义
除非另有说明，如本文中所使用的单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞及其混合物。
当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过扩展那些数值的上下边界来限定其范围。通常，术语“约”在本文中用于以高于或低于设定值的20％，10％，5％，或1％的变化幅度来限定该数值。在一些实施方案中，术语“约”在本文中用于以高于或低于设定值的10％的变化幅度来限定该数值。在一些实施方案中，术语“约”用于以高于或低于设定值的5％的变化幅度来限定该数值。在一些实施方案中，术语“约”用于以高于或低于设定值的1％的变化幅度来限定该数值。
如本文中所使用的，术语“核苷”是指包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于天然存在的核苷(例如，DNA和RNA中发现的脱氧核糖核苷和核糖核苷)和修饰的核苷。核苷可与磷酸部分连接形成，例如，核苷酸。
如本文中所使用的，术语“核苷酸”是指进一步包含磷酸连接基团的核苷。
如本文中所使用的，术语“基因沉默剂”包含RNAi剂或ASO剂，是未修饰的RNA，修饰的RNA或核苷替代物(surrogate)，所有这些均在文中描述或在RNA合成领域中众所周知。尽管描述了许多修饰的RNA和核苷替代物，但优选的实例包括与未修饰的RNA相比对核酸酶降解作用具有更大抗性的那些。优选的实例包括具有2’糖修饰，包括一个或多个磷酸基或者一个或多个磷酸基类似物的5’-修饰的那些。
如本文中所使用的，术语“RNAi剂”是一种RNA剂，能够下调靶基因(例如CoV)的表达。不希望受到理论的束缚，RNAi剂可以通过多种机制中的一种或多种起作用，包括转录后的靶mRNA切割机制(有时在本领域中称为RNAi)，或转录前的机制或翻译前的机制。在一些实施方案中，RNAi剂是双链(ds)RNAi剂。在一些实施方案中，RNAi剂是反义寡核苷酸。
如本文所使用的，术语“dsRNAi剂”(“双链RNAi剂”的缩写)是一种RNAi剂，其包括一条以上的链，优选两条链，链间杂交可以形成一个双链结构区。本文中的“链”是指连续的核苷酸序列(包括非天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸)。两条或多条链可以是分开的分子，或者每一条链形成分开的分子的一部分；或者它们可以是共价连接的，例如通过连接子(例如聚乙二醇连接子)，以仅形成一个分子。至少一条链包括与靶RNA充分互补的区域。这样的链被称为“反义链”。dsRNAi剂中包含的第二条链被称为“有义链”，该第二条链包含与反义链互补的区域。然而，dsRNAi剂也可以由单个RNA分子形成，其至少部分自互补以形成例如发夹结构或锅柄样结构(panhandle structure)，包含双链结构区。在这种情况下，术语“链”是指RNA分子中与同一RNA分子的另一区互补的一个区。如本文所使用的，“aiRNA剂”或“aiRNA”和“siRNA剂”或“siRNA”是指iRNA剂，例如dsRNAi剂，它足够短以至于它不会在人体细胞中诱导有害的干扰素响应，例如其具有小于30个核苷酸对的双链区。“aiRNA剂”或“aiRNA”具有两条不对称的链，即或者在该剂的反义链的3’和/或5’末端均具有1-5个核苷酸的突出端，或者在反义链的5’末端具有一个平末端且在反义链的3’末端具有一个1-10个核苷酸的突出端。“siRNA剂”或“siRNA”具有基本上对称的两条链，即在该剂的两个3’末端均具有1-5个核苷酸的突出端。在一个优选的实施方案中，dsRNAi剂是aiRNA(不对称干扰RNA)分子。
如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指包含多个连接着的核苷化合物。在某些实施方案中，所述核苷中的一个或多个是被修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(例如在RNA中的)和/或脱氧核糖核苷(例如在DNA中的)。在一些实施方案中，寡核苷酸是单链寡核苷酸。在一些其他实施方案中，寡核苷酸是双链干扰RNA，例如siRNA，aiRNA，shRNA。
如本文中所使用的，术语“修饰的核苷酸”是指具有至少一个经修饰的糖，经修饰的核苷间键和/或经修饰的核碱基的核苷酸。
如本文中所使用的，术语“修饰的核苷”是指具有至少一个经修饰的糖和/或经修饰的核碱基的核苷。
如本文中所使用的，术语“修饰的寡核苷酸”是指包含至少一个经修饰的核苷酸的寡核苷酸。
如本文中所使用的，术语“天然存在的核苷间键”是指3’至5’磷酸二酯键。
如本文中所使用的，术语“经修饰的核苷间键”是指与天然存在的核苷间键的取代或任何改变。例如，硫代磷酸酯键是一种经修饰的核苷间键。
如本文中所使用的，术语“天然糖部分”是指在DNA(2-H)或RNA(2-OH)中发现的糖。
如本文中所使用的，术语“经修饰的糖”是指源于天然糖的取代或改变。例如，2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是一种经修饰的糖。
如本文中所使用的，术语“双环糖”指通过桥接两个非双环原子而修饰的呋喃糖基环。双环糖是一种经修饰的糖。
如本文中所使用的，术语“修饰的核碱基”是指除腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的任何核碱基。例如，5-甲基胞嘧啶是一种经修饰的核碱基。“未修饰的核碱基”是指嘌呤碱基的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基的胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
如本文中所使用的，“调节”，“调控”及其语法上的等同词是指增加或减少(例如沉默)，换句话说，上调或下调。如本文中所使用的，“基因沉默”是指基因表达的减少，可以指靶基因的基因表达减少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类，非人类灵长类，啮齿类动物等，是特定治疗的接受者。典型地，术语“受试者”和“患者”在本文中涉及人类受试者时可互换使用。
如本文中所使用的，诸如“治疗”或者“疗法”或者“处理”或者“缓解”或者“减轻”之类的术语是指(1)诊断的病理病症或紊乱的治愈、减缓、症状减轻和/或进展停止的治疗措施，和(2)预防或减缓靶标病理状况或紊乱的预防性(prophylactic)或防预性(preventative)措施。因此，那些需要治疗的人包括那些已经患有该紊乱的人，那些容易患该紊乱的人，以及那些需要预防该紊乱的人。如果患者显示以下一种或多种情况，则表示根据本发明的方法成功地“治疗”了该受试者：癌细胞的数量减少或完全不存在；肿瘤大小减小；癌细胞浸润到外周器官(包括癌症扩散到软组织和骨骼中)的抑制或不存在；肿瘤转移的抑制或不存在；肿瘤生长的抑制或不存在；与特定癌症相关的一种或多种症状的缓解；发病率和死亡率的降低；和生活质量的提高。
如本文所使用的，当用于生物活性的语境中时，术语“抑制”，“以抑制”及其语法上的等价词是指生物活性的下调，其可能降低或消除靶基因功能，例如病毒蛋白或病毒mRNA的产生。在特定的实施方案中，抑制是指靶基因表达降低约20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。
如本文所使用的，术语“基本上互补的”或“互补的”是指在两个核酸之间的碱基对的双链区的互补性，而不是任何单链区(例如末端的突出端或两个双链区域之间的间隙区)。互补性不需要是完美的；例如，在两个核酸之间可能存在任何数量的碱基对错配。然而，如果错配的数目太大以至于即使在最不严格的杂交条件下也不会发生杂交，则该序列不是基本上互补的序列。当两个序列在本文中被称为“基本上互补”时，意味着这些序列彼此足够互补，可以在选择的反应条件下杂交。足以实现特异性的核酸互补性和杂交严格性的关系是本领域众所周知的。两个基本上互补的链可以是，例如，完全互补的，或可以包含1个至许多个错配，只要杂交条件足以允许例如区分配对序列和非配对序列即可。因此，基本上互补的序列可以指双链区中具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或介于上述任意两数字之间任何数值的碱基对互补性序列。
如本文所使用的，“完全互补”或“100％互补”是指第一核酸的核碱基序列的每个核碱基在第二核酸的第二核碱基序列中具有互补的核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义链，第二核酸是靶核酸。在某些实施方案中，第一核酸是有义链，第二核酸是反义链。
如本文所使用的，“基本上相同”用于涉及第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的比较时，是指除了至多一个、两个或三个核苷酸取代之外(例如，用尿嘧啶代替腺嘌呤)，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列相同。
如本文所使用的，“杂交”是指互补的核酸分子的退火。在一些实施方案中，互补的核酸分子包括有义链和反义链。在一些实施方案中，互补的核酸分子包括反义链和靶核酸。
如本文所使用的，“N基因”是指作为靶基因的CoV基因组的核衣壳区，优选的例子是SARS CoV-2基因组的核衣壳区，即GenBank登记号为#MN908947.3的28374-29530区。核衣壳在冠状蛋白组装中起重要作用。
如本文所使用的，“RdRp基因”，“POL基因”或“P基因”是指作为靶基因的CoV基因组的RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)区，优选的例子是SARS CoV-2基因组的非结构蛋白12(Nsp12)，即GenBank登记号为#MN908947.3的13468-16237区。RdRp在CoV的复制中起重要作用。
如本文所使用的，“3CL基因”是指作为靶基因的CoV基因组的3C样蛋白酶区，优选的例子是SARS CoV-2基因组的3CL区，即GenBank登记号为#MN908947.3的10052-10988区。
如本文所使用的，“PL1基因”是指作为靶基因的CoV基因组的木瓜蛋白酶样1蛋白酶区，优选的例子是SARS CoV-2基因组的PL1区，即GenBank登记号#MN908947.3的5123-5929区。
术语“施用”(“administer”、“administering”、“administration”)在本文中以其最宽泛的含义使用。这些术语是指给受试者引入本文所述的化合物或药用组合物的任何方法，可以包括，例如，全身地、局部地或原位地将所述化合物引入给受试者。因此，由组合物(无论组合物是否包括该化合物)在受试者体内产生的本文公开的化合物包含在这些术语中。当这些术语与“全身的”或“全身地”结合使用时，它们通常指化合物或组合物在体内全身吸收或蓄积在血液中，随后分布在整个身体中。
术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以影响预期结果的本文所述的化合物或药物组合物的量，所述预期结果包括但不限于疾病治疗，如下所示。在一些实施方案中，“治疗有效量”是指能够对以下有效的量：可检测到的杀死或抑制癌细胞的生长或扩散、肿瘤的大小或数量、和/或癌症的水平、阶段、进展和/或严重程度的其他测量。在一些实施方案中，“治疗有效量”是指全身地，局部地或原位施用的量(例如，在受试者中原位产生的化合物的量)。治疗有效量可以根据预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况而变化，例如，受试者的体重和年龄，疾病状况的严重程度，给药方式等，这可以由本领域的普通技术人员容易地确定。该术语还适用于将在靶细胞中诱导特定反应(例如减少细胞迁移)的剂量。具体剂量可以根据以下而变化：例如，特定的药物组合物，受试者及其年龄和现有的健康状况或健康状况的风险，要遵循的剂量方案，疾病的严重程度，是否与其它药剂联合施用，施用时机，被施用的组织，和载有化合物或药物组合物的物理递送系统。
术语“药物组合物”是包含本公开的基因沉默剂的，以适合施用于受试者的形式的制剂。在一个实施方案中，药物组合物为散装剂型或单位剂型。单位剂型是多种形式中的任一种，包括例如，胶囊剂，静脉注射袋，片剂，气雾剂吸入器上的单个泵或小瓶。单位剂量的组合物中活性组分的量是有效量，并根据所涉及的特定治疗而变化。本领域技术人员将理解，有时有必要根据患者的年龄和病症对剂量进行常规改变。剂量也将取决于给药途径。多种途径是可预期的，包括口服，肺，直肠，肠胃外，经皮，皮下，静脉内，肌内，腹膜内，鼻内等。本发明的沉默剂的局部或透皮给药的剂型包括散剂，喷雾剂，软膏剂，糊剂，乳膏剂，洗剂，凝胶剂，溶液剂，贴剂和吸入剂。
SARS-CoV-2和其基因组
SARS-CoV-2是一种SARS样冠状病毒。迄今为止，与SARS-CoV-2最接近的病毒是一种源自菊头蝠(Rhinolophus bat)的病毒，显示出>96％的序列同源性(Fisher andHeymann,2020)。SARS-CoV-2与原始SARS-CoV的同源性仅为79％(Zhou et al,2020)。
SARS冠状病毒的基因组由长度约30kb的单链正义RNA分子组成(Marra et al.,2003)。庞大的SARS-CoV RNA基因组产生8个共3’末端的嵌套亚基因组mRNAs(sg-mRNAs)以有效翻译结构蛋白和辅助蛋白(Masters,2006)。SARS-CoV基因组的5’端的三分之二(的序列)编码由开放阅读框(ORF)1a和1b表达的两个大的复制酶多聚蛋白(replicasepolyproteins)。与其他冠状病毒一样，ORF1a和ORF1b略有重叠，由于ORF1b缺少其自身的翻译起始位点，因此由ORF1b编码的蛋白质只能通过程序性-1核糖体移码与ORF1a一起翻译为融合蛋白(-1PRF；Baranov et al.,2005)。ORF1a和ORF1a/1b融合蛋白被蛋白水解切割成16个成熟的非结构蛋白(nsps)，它们在病毒基因组复制过程中起着至关重要的作用(Masters,2006)。-1PRF被认为是CoV基因组复制必不可少的，因为病毒基因组复制所需的复制酶的关键成分冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)(Xu et al.,2003)是移码后合成的ORF1a/1b蛋白的第一部分。
冠状病毒使用胞内体途径和/或细胞表面非胞内体途径进入宿主细胞。冠状病毒在宿主细胞内部分解并释放核衣壳和病毒RNA到细胞质中，此后ORF1a/b被翻译成多聚蛋白1a(pp1a)和多聚蛋白1ab(pp1ab)，基因组的RNA被复制。(Chan et al.,2015)。然后合成亚基因组的mRNA，并进行翻译以产生结构蛋白和辅助蛋白(van Boheemen,2012)。由核衣壳蛋白和基因组RNA组装而成的螺旋核衣壳，然后与表面蛋白(S)，包膜蛋白(E)和膜蛋白(M)相互作用以形成组装的病毒颗粒(Chan et al.,2015)。病毒颗粒通过胞吐作用释放到细胞外区室(compartment)中，并重复病毒复制周期(Chan et al.,2015)。
基因沉默剂的设计与选择
本发明是基于SARS-Cov-2基因在体外的靶基因沉默表现。基于这些结果，本发明具体地提供了一种基因沉默剂，其可以以单独的形式和作为药物组合物用于治疗病毒感染，特别是CoVs(尤其是SARS-CoV-2感染)。
本发明的基因沉默剂被设计用于靶向CoV基因组(特别是SARS-CoV-2基因)组区，该基因组区是最保守的结构域，以尽最大可能避免在靶位点发生的潜在突变。另外，本发明的基因沉默剂被设计用于抑制CoV生命周期的关键步骤(例如组装和复制)。最近的Covid19病毒研究表明，核衣壳区和RdRp(P)区的突变率比其它区(例如S蛋白)低。在一些实施方案中，本发明的基因沉默剂被设计用于靶向SARS-CoV-2的核衣壳区和RdRp(P)区。
这些设计的基因沉默剂可以是单链寡核苷酸或双链(ds)RNAi剂，其包含反义链，该反义链具有与SARS-CoV-2基因序列基本上互补的至少15个或更多个连续的核苷酸，特别是SARS-CoV-2的PL1、3CL、RdRp和N基因序列，更具体地说，是图1-3中提供的靶序列(SEQ IDNO.1-210)。
本发明提供了基因沉默剂，其包含反义链，所述反义链包含至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的序列，与CoV基因的至少一部分基本上互补(如上述定义的)，尤其是SARS-CoV-2的PL1、3CL、RdRp和N基因。所述基因沉默剂(包括ASO，siRNA和aiRNA)的示例性的反义链包含与图1-3中(SEQ ID NO.211-420)提供的设计的反义链之一相差不超过3个核苷酸的15个或更多个连续的核苷酸。
该基因沉默剂是dsRNAi剂，其包含具有与SARS-CoV-2基因序列基本上互补的至少15个或更多个连续的核苷酸的反义链，和具有与该反义链序列基本上互补的至少12个或更多个连续的核苷酸的有义链。尤其有用的试剂是dsRNAi剂，该剂包含反义链，所述反义链包含与来自SARS-CoV-2的PL1、3CL、RdRp和N基因序列基本上互补的核苷酸序列，或由其组成，或基本上由其组成；更具体地说，与图1-3提供的靶序列基本上互补。
本发明的dsRNAi剂的反义链是基于图1-3中显示的有活性的dsRNAi剂之一，并且包含来自其之一的至少15个或更多个连续的核苷酸。在这些dsRNAi剂中，该剂的反义链可以包含图1-3中提供的整个反义链序列，或由其组成，或基本上由其组成；或者可以包含图1-3中提供的反义链序列的15个或更多个连续的残基以及与靶基因的连续区互补的其它核苷酸。dsRNAi剂可以基于序列信息和图1-3提供的所需特征以及信息而合理设计。例如，dsRNAi剂可以根据图1-3提供的dsRNAi剂的序列以及靶基因的整个编码序列进行设计。
相应地，本发明提供了靶向来自CoV的基因，特别是SARS-CoV-2的PL1、3CL、RdRp和N基因的RNAi剂，其包含有义链和反义链，每个有义链和反义链均包含至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸的序列。示例性的dsRNAi剂包括那些包含来自图1-3中提供的基因沉默剂之一的15个或更多个连续的核苷酸。
在某些实施方案中，所述基因沉默剂的反义链的长度为10至30个核苷酸，换句话说，反义链是10至30个连接着的核碱基。在其他实施方案中，反义链包含由8至100、10至80、10至50、10至30、12至50、12至30、14至30、14至27、15至23、16至23、19至23或21个连接着的核碱基组成的经修饰的寡核苷酸。在这些实施方案中的某些，反义链包含长度上由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，或由上述任意两值定义的范围个连接着的核碱基组成的经修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，所述基因沉默剂的有义链的长度为9至30个核苷酸。换句话说，有义链是9至30个连接着的核碱基。在其他实施方案中，有义链包含由8至100、10至80、10至50、10至30、12至50、12至30、12至20，12至17，14至30、14至20，14至27、15至23、15至16，或15个连接着的核碱基组成的经修饰的寡核苷酸。在这些实施方案中的某些，有义链包含长度上由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，或由上述任意两值定义的范围个连接着的核碱基组成的经修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，所述dsRNAi剂是aiRNA分子。通常，aiRNA试剂包含具有较短的有义链和较长的反义链的短RNA双链体，其中该双链体在反义链的3’和/或5’末端包含突出端。在某些实施方案中，反义链具有1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸的3’突出端和1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸的5’突出端。在另一个实施方案中，反义链具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的3’突出端和5’平末端。在另一个实施方案中，反义链具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的5’突出端和3’平末端。
在某些结构中，aiRNA包含经修饰的核苷酸。与相应的未修饰的aiRNA序列相比，经修饰的aiRNA对降解更具抗性并且不太可能引起免疫应答；同时保留针对靶基因的RNAi活性。此外，此类修饰允许以治疗上可行的aiRNA剂量进行基因沉默，具有非常低的细胞因子诱导，毒性以及与使用未修饰的aiRNA相关的脱靶效应。在一些结构中，经修饰的aiRNA包含至少一个2'-O-甲基(2'OMe)嘌呤或嘧啶核苷酸，例如2'OMe-尿嘧啶，2'OMe-腺嘌呤，2'OMe-鸟嘌呤和/或2'OMe-胞嘧啶核苷酸。在一些结构中，经修饰的aiRNA包含至少一个2'-脱氧-2'-氟核苷酸。经修饰的核苷酸可以存在于aiRNA的一条链(即有义或反义)或两条链。
在某些结构中，各种长度的aiRNA双链体(例如9-23、14-21、15-19、15-21、14-19或14-20个碱基对，更典型地9、10、11、12、13、14、15、15、16、17、18、19、20、21、22或23个碱基对)可以被设计并在反义链的3'和/或5'末端具有突出端。在某些例子中，aiRNA分子的有义链的长度为约9-23、14-21、15-19、15-21、14-19或14-20个核苷酸，更典型地，长度为约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸。在某些其他例子中，aiRNA分子的反义链的长度为约15-50、15-40或15-30个核苷酸，更典型地，长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，或25，或19、20、21、22或23个核苷酸，优选长度为约19-23个核苷酸。
在某些结构中，本发明提供了设计的aiRNA双链体，其包含15mer有义链(ss)和21mer反义链(as)，靶向SARS-CoV-2基因组的四个区，包括核衣壳区(28374-29530)，RdRp(P)区(13468-16237)，3CL区(10052-10988)和PL1区(5123-5929)，尤其靶向核衣壳区和RdRp区。
在一些结构中，5'反义突出端包含一个，两个，三个或更多个非靶向的核苷酸(例如，AA，UU，dTdT等)。在其他结构中，3'反义突出端包含一个，两个，三个或更多个非靶向的核苷酸(例如，AA，dTdT等)。在某些结构中，反义链的5'末端的核苷酸和与5'末端核苷酸相邻的第一核苷酸是“AA”基序，“UU”基序，“CC”基序，“AU”基序，“AC”基序，“UA”基序，“UC”基序，或“CA”基序，或“dTdT”基序。在优选的结构中，反义链的5'末端的核苷酸和与5'末端核苷酸相邻的第一核苷酸包含“AA”基序。在某些结构中，反义链在3'末端的最后一个核苷酸由A，U，G或C核糖核苷酸组成。
在一些结构中，该基因沉默剂分子可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，例如在双链区和/或在单链区。通常，这些修饰包括脱氧核糖核苷，2'OMe核苷酸(例如2'OMe-尿嘧啶核苷酸，2'OMe-腺嘌呤核苷酸，2'OMe-胞嘧啶核苷酸，或2'OMe-鸟嘌呤核苷酸)，2'-氟核苷酸(2'-脱氧-2'-氟核苷酸)，2'-MOE核苷酸，LNA，cEt吗啉和/或硫代磷酸酯(P＝S)，磷酸二酯(P＝O)或硫代磷酸氨基酯核苷间键和/或5'-MeC核苷酸。
在一些结构中，该基因沉默剂可以进一步修饰以使其与一种或多种配体、基团或缀合物相连接，选择这些配体、基团或缀合物以改善该基因沉默剂的稳定性、分布或细胞摄取。这样的基团包括但不限于脂质基团(例如胆固醇基团，胆酸基团)，硫醚(例如beryl-S-三苯甲基硫醇)，巯基胆固醇，脂族链(例如十二烷二醇残基或十一烷基残基)，磷脂(例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基-铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-氢亚磷酸盐)，聚胺链或聚乙二醇链或金刚烷乙酸，棕榈基基团或硬脂胺或己氨基-羰氧基胆固醇基团。在一个实施方案中，配体改变了其连接入的基因沉默剂的分布、靶向或寿命。在优选的实施方案中，与(例如)没有这种配体的种类相比，配体对选定的靶标(例如分子、细胞或细胞类型、区室(如细胞区室或器官区室)、组织、器官或身体的区域)提供增强的亲和力。优选的配体将不参与双链核酸间的双链配对。配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)，低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖，支链淀粉，几丁质，壳聚糖，菊粉，环糊精，N-乙酰半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)，聚L-天冬氨酸，聚L-谷氨酸。合成聚合物的实例可以包括苯乙烯-马来酸酐共聚物，聚(L-丙交酯-co乙交酯)共聚物，二乙烯基醚-马来酸酐共聚物，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚氨酯，聚(2-乙基丙烯酸)，N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺，多赖氨酸(PLL)，精胺，亚精胺，多胺，伪肽-多胺，拟肽多胺，树状多胺，精氨酸，脒，鱼精蛋白，阳离子脂质，阳离子卟啉，聚胺的季盐，或α螺旋肽。在一些结构中，配体、基团或缀合物可以通过本领域技术人员已知的任何连接物缀合到有义链链的3’末端。在一些结构中，配体、基团或缀合物可通过本领域技术人员已知的任何连接物缀合至有义链的5’末端。在一些结构中，配体、基团或缀合物可通过任何此类连接物与反义链的3’末端缀合。在一些结构中，配体、基团或缀合物可通过任何此类连接物与反义链的5’末端结合。
在一些结构中，该反义链和/或有义链包含20-70％的总GC含量。在进一步的实施方案中，GC含量小于50％，或优选30-50％。
合适的aiRNA/siRNA/ASO序列可以使用本领域已知的任何方法被设计，选择，合成和修饰。
a)aiRNA序列的设计和选择
通过基于定制生物信息学的方法生成了先导aiRNA序列并对其进行了排名。通过将在NCBI发现的SARS-CoV-2mRNA转录物序列分成所有可能的19个碱基对的靶序列，生成了所有可能的aiRNA靶序列的列表。然后去除序列差异区，以避免靶向多态性序列。由于高的热力学稳定性，序列中过高的GC含量可能导致解旋困难，而过低的GC含量则可能导致与靶序列的结合削减。因此GC含量过高或过低(分别由>70％或<25％所定义的)的序列被删除了。
(GC含量由靶序列中鸟嘌呤碱基和胞嘧啶碱基的百分比计算得出)。还删除了具有四个或更多连续相同碱基(例如AAAA，TTTT，CCCC，GGGG)的序列，因为它们不太可能正确退火。对其余序列进行筛选，以确定其沉默目的基因(GOI)表达的能力，从最有可能有效的序列开始(以存在与先前发现的高效序列相关的模式决定)。
在某些实施方案中，所述基因沉默剂包含反义链，该反义链由以下组成，基本上由以下组成，或包含以下：与SEQ ID NO:211至420之一的序列至少15个连续的核苷酸相同(相差不超过3个核苷酸)的序列。在某些实施方案中，该反义链由以下组成，基本上由以下组成，或包含以下：与SEQ ID NO:211至420之一的序列至少19个连续的核苷酸相同(相差不超过3个核苷酸)的序列。在某些实施方案中，该反义链包含选自SEQ ID NO:211至420的序列，或基本上由其组成，或由其组成。
b)生成aiRNA分子
通常使用亚磷酰胺方法通过固相化学合成来生成aiRNA(Beaucage et al.,1981)。但是，组成aiRNA分子的单个寡核苷酸可以通过文献中描述的各种寡核苷酸合成技术来合成，包括液相或固相磷酸二酯，磷酸三酯，亚磷酸三酯或H-膦酸酯化学(Reese etal.,2005)。标准寡核苷酸合成利用常见的核酸保护基，例如在5’端的二甲氧基三苯甲基和杂环碱基上的苯甲酰基，异丁酰基或乙酰基。此外，用于体内应用的aiRNA合成通常会结合化学修饰来改善血清稳定性并降低脱靶效应，例如对糖骨架进行2'-O-甲基和2'-氟修饰(Behlke,2009)。计算机控制的自动化寡核苷酸合成仪可用于aiRNA分子的高通量生产(Rayner et al,1998)，例如来自Bioautomation的Mermade系列(Irving,TX)。可以在这些和类似的仪器上以0.2μmol或1.0μmol的规模合成aiRNA，尽管也可以进行更大或更小规模的合成。用于RNA合成，脱保护和纯化的合适试剂可从许多制造商处商购获得。这些方法的标准规程在文献中很容易获得和/或直接从制造商处获得。
候选RNAi剂的评价
筛选SARS-CoV-2 aiRNAs
并非特定信使RNA中的所有序列都是RNA干扰的合适靶标。例如，众所周知，信使RNA分子中的二级结构可以阻止反义链的杂交，这是RNA干扰的重要步骤。专有算法用于指导aiRNA的选择，请参阅“aiRNA序列的设计和选择”部分。随后，在体外实验中验证了aiRNA的有效性。
为了测试aiRNA在体外的有效性，可以将aiRNA递送到表达GOI的细胞中。本领域众所周知的方法可用于递送aiRNA，例如将aiRNA封装在脂质体中随后被细胞吸收。随后，可以通过比较接受空脂质体或非特异性aiRNA(例如，不靶向GOI的aiRNA)的细胞中GOI的表达水平与接受特异性的aiRNA的细胞中的GOI的表达水平来评估特异性的aiRNA抑制GOI的有效性。GOI的表达可以在RNA以及蛋白质水平上使用本领域熟知的技术研究，例如用于RNA的定量PCR，和用于蛋白质的免疫印迹或ELISA。
双链aiRNAs的合成
采用了一种专有算法用来指导从SARS-CoV-2的预测mRNA序列中选择aiRNA。示出了挑选出来的候选aiRNA(参见图1至图3)。候选aiRNA(15mer SS和21mer AS)是使用亚磷酰胺化学法由在Norwood的1Globe Health Institute通过生物自动合成仪合成的。按照标准退火方案制备aiRNA双链体。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确认了aiRNA退火。
为了鉴定可有效抑制SARS CoV-2基因表达的aiRNA，我们在表达萤火虫荧光素酶基因的标准报告载体中亚克隆了相关病毒序列(基于已知的SARS CoV-2基因组；图4和图5)。然后，我们通过将相关的重组载体和每个aiRNA都递送至哺乳动物细胞，然后将已接受特异性aiRNA的细胞中的报告基因(荧光素酶)的表达与对照细胞(模拟转染的细胞)中报告基因的表达进行比较来筛选数百个aiRNA。筛选不同浓度的aiRNA，并选择最有效的aiRNA来测定IC50浓度。图1至图3和图7至图11给出了被筛选的aiRNA的列表和筛选结果。
实施例1:体外筛选沉默哺乳动物细胞中SARS-CoV-2基因表达的所有候选aiRNAs
构建包含合成版本的海肾荧光素酶(hRluc)基因和合成萤火虫荧光素酶(hluc)的双重萤光素酶COVID-19报告基因(DLR)质粒psiCHECK2/PL1、psiCHECK2/3CL、psiCHECK2/RdRp(P)和psiCHECK2/Nucleocapsid(N)用于测试COVID-19 aiRNAs的活性。加入GenBank登记号为MN908947.3的SARS-CoV-2序列区域PL1(5123-5929)、3CL(10052-10988)、RdRp(13468-16237)和N(28374-29530)(见图4)，在两端添加限制性酶切位点，然后化学合成该序列，并将其亚克隆到psiCHECK2双荧光素酶载体中。
HeLa细胞在添加胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养。在Mermade 192寡核苷酸合成仪中化学合成有义aiRNA链和反义aiRNA链。将HeLa细胞以10000个细胞/孔接种到96孔培养板中。24小时后，使用Lipofectamine 2000试剂将这些细胞与报告质粒DNA和各种浓度的COVID-19 aiRNAs(10pM，100pM，1nM)，非特异性siRNA(阴性对照)共转染或模拟转染。转染后24小时，通过双重-Glo荧光素酶测定系统确定每种aiRNA对COVID-19基因表达的影响。筛选结果示于图1至图3。
实施例2：在哺乳动物细胞中体外筛选N靶向的aiRNA(GHI_N1至GHI_N96)和RdRp靶向的aiRNA(GHI_P97至GHI_P162)
双荧光素酶报告基因(DLR)系统的构建
构建了两个DLR报告质粒，包括psiCheck-2/Nucleocapsid(N)和psiCheck-2/RdRp(P)。简而言之，通过Integrated DNA Technologies(IDT)化学合成来自GenBank登记号MN908947.3(SARS-COV-2分离株Wuhan-Hu-1)的靶向区RdRp(13468-16237)和N(28374-29530)，并通过PCR扩增。XhoI和NotI的限制性酶切位点分别添加到正向引物和反向引物中。将PCR扩增的P和N片段克隆到psiCheck-2载体(Promega)中，其中存在两个由独立启动子驱动的萤光素酶基因(萤火虫萤光素酶基因和海肾萤光素酶基因)。靶向片段插入片段被克隆到紧随海肾荧光素酶基因(作为报告基因)之后的区中，而萤火虫荧光素酶基因是内控基因。
细胞培养和转染
在人宫颈癌细胞系HeLa中研究了aiRNAs的抗SARS-CoV-2活性。将细胞在37℃的含有5％CO2的湿润空气中，在补充10％热灭活的胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1X Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Gibco)中培养。
对于96孔，将HeLa细胞接种到100uL不添加抗生素的DMEM培养基中，以在转染时达到70％-80％的汇合度(confluence)。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)在OptiMEM-1减血清培养基(Invitrogen)中共转染报告质粒psiCheck-2/N或psiCheck-2/P和aiRNA-胆固醇缀合物。转染24小时后，使用标准的双重荧光素酶报告试剂盒方案(Promega标准
检测系统)检测每个孔中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光活性。参照未转染aiRNAs的对照计算海肾荧光素酶/萤火虫荧光素酶的发光比。
转染混合物的制备
分别制备转染混合物A和B：25uL的两组分混合物A包含0.2uL的Lipofectamine-2000试剂和剩余体积的OptiMEM培养基。25uL的三组分混合物B包含200ng的报告质粒DNA(N或P)，2.5uL含有单剂量测试浓度的相应的aiRNA-胆固醇结合物的PBS缓冲液以及剩余体积的OptiMEM培养基。将A和B溶液以1：1的比例混合，在室温下温育(incubate)5分钟，然后将50uL得到的转染混合物添加到每个孔中。
筛选结果
图7和图8中示出了所有设计的候选的靶向N的aiRNA(GHI_N1至GHI_N96)在浓度为1nM时的结果。以模拟转染作为对照，计算Luc/Rluc的比率。其中筛选的超级靶向N的aiRNAs以100pM的浓度进一步筛选。结果显示在图9中。此外，选择了最有效的靶向N的aiRNA测定IC50浓度，结果显示在下表1中。
表1最有效的靶向N的aiRNAs的IC50浓度
| DuplexID | IC<sub>50</sub>(pM) |
| GHI_N14 | 2.48 |
| GHI_N30 | 12.21 |
| GHI_N35 | 22.54 |
| GHI_N43 | 5.8 |
图10显示了设计的候选的靶向RdRp的aiRNAs(GHI_P97至GHI_P144)在浓度为1nM时的结果。图11显示了设计的候选的靶向RdRp的aiRNAs(GHI_P144至GHI_P162)在浓度为100pM和10pM时的进一步筛选结果。以模拟转染作为对照，计算Luc/Rluc的比率。此外，选择了最有效的aiRNA来测定IC50浓度，结果显示在下表2中。
表2最有效的靶向RdRp的aiRNAs的IC50浓度
| DuplexID | IC<sub>50</sub>(pM) |
| GHI_P144 | 45.48 |
| GHI_P147 | 51.34 |
| GHI_P155 | 17.08 |
| GHI_P156 | 35.2 |
实施例3：靶向N的aiRNAs(GHI_N35、GHI_N43和GHI_N81)和靶向RdRp的aiRNAs(GHI_P144、GHI_P147、GHI_P155和GHI_P156)在Vero E6细胞中的体外SARS-Cov-2病毒感染实验
材料
在37℃下含5％CO2的增湿空气中，VeroE6细胞保存在补充10％胎牛血清(FBS；Gibco Invitrogen)的Eagle氏最低必需培养基中(EMEM；Gibco Invitrogen)。
临床分离株2019-nCoV(SARS-CoV-2)在VeroE6细胞中繁殖，并通过使用免疫荧光测定50％组织培养感染剂量(TCID50)来测定病毒滴度。所有感染实验均在生物安全3级(BLS-3)实验室进行。
将待测的每种aiRNA化合物或比例1:1的aiRNA N43和aiRNA P155的组合物以1mM的浓度溶解到生理盐水中作为储备溶液。储备溶液稀释制备得到浓度为100μM、33μM、10μM、3.3μM、1μM的五个系列稀释液。
评估方法
将在EMEM(10％FBS)中培养的VeroE6细胞(10，000细胞/孔)接种到96孔板中，并在37℃下含有5％CO2的增湿空气中温育24小时。在每个浓度点采集10μL上述1-100μM稀释液的样品，并将其添加到100μL孔板中，以对细胞进行至少48小时的预处理；1X缓冲液设置为阴性对照。添加后的待测化合物浓度如下：10μM、3.3μM、1μM、333nm、100nm和0。
添加等份的SARS-CoV-2病毒(MOI为0.05)以感染处理的细胞群2小时。然后去除病毒-aiRNA混合物，并用含有aiRNA化合物(浓度与预处理相同)的新鲜培养基进一步培养细胞。温育48小时后，收集细胞上清液并在裂解缓冲液(Takara，9766)中裂解以进行定量分析。
从每个细胞群中收集100μL细胞培养上清液样本后，使用MiniBEST通用RNA提取组件(TaKaRa，9766)分离病毒RNA。病毒RNA在30μL不含核糖核酸酶的水中洗脱。使用带有gDNAEraser的PrimeScript RT试剂盒(Takara RR047A)进行逆转录；qRT-PCR采用TB GreenPremix Ex Taq II(Takara RR820A)在StepOnePlusTM实时PCR系统(Applied Biosystem)上进行。使用GraphPad
根据病毒RNA拷贝数与药物浓度绘制剂量-反应曲线。结果如图12所示。
实施例4：aiRNAs在体外对SARS-COV-2病毒感染和复制的抑制作用
设计的实验组合(GH543)是1:1比例的aiRNA N43化合物和aiRNA P155化合物的组合。该实验评估了该化合物在Vero E6细胞培养中抑制病毒产生的能力。该实验分两步进行，首先在含有不同稀释度的抗病毒物质的培养基中产生病毒，然后在96孔微孔板中通过终点稀释滴定样品的病毒滴度。对实验化合物的八种稀释液进行分析，并通过回归分析确定有效抗病毒浓度。同时测定实验化合物的毒性。
材料和方法
SARS-CoV-2，USA-WA1/2020储存液是通过在非洲绿猴肾上皮细胞系(Vero76)中传代病毒制备的，使用添加2％热灭活胎牛血清(FBS)和50g/mL庆大霉素改良的Eagle氏培养基(MEM)的实验培养基。将aiRNA-1(100μM)和aiRNA-2(100μM)以1:1的比例混合以制备50μMGH543。然后在1xRNAi缓冲液中制备29.1μM溶液。在1x RNAi缓冲液中进行八次连续半对数稀释，然后将10μL的每种制备浓度添加到40μL低血清MEM(OptiMEM)中。将转染剂溶液与上述制备的GH543溶液以1:1的比例(50μL+50μL)混合。该化合物在室温下温育20分钟。然后将每种制备好的稀释液添加到含有186.25μL实验培养基(含80-100％混合的Vero E6细胞)的96孔培养板中的5个孔13.75μL中。板上的最终最高浓度为200nM。
按上述方法制备实验组合(GH543)。混合稀释液在感染SARS-CoV-2之前与细胞一起温育24小时。SARS-CoV-2的制备需达到最低可能的感染复数(MOI为0.001)以在5天内产生>80％的细胞病变效应(CPE)。将蛋白酶抑制剂(M128533)作为阳性对照，并以与实验化合物预处理实验类似的方式进行平行实验进行实验，即起始剂量为100ug/mL的8个半对数系列稀释。培养皿在37℃和5％CO2下温育。
在感染后第3天，收集每种化合物浓度的上清液，并使用标准终点稀释CCID50分析测试病毒滴度，滴度计算使用Reed-Muench(1948)方程(Reed,L.J.,1938)。
表3总结了GH543和阳性对照M128533降低体外SARS-COV-2病毒滴度产量。通过回归分析计算将病毒产量降低1log10所需的化合物浓度(EC90)，表4为计算得到的在无病毒情况下导致50％细胞死亡的实验化合物浓度(CC50)。选择指数SI90通过CC50除以EC90得出。
表3.VYR法体外SARS-COV-2滴度降低测试结果
aGH543VYR的病毒滴度以每0.1毫升CCID50，平均病毒控制滴度前治疗测试为6.3，和后治疗测试为4.7。
bM128533VYR的病毒滴度以每0.1毫升CCID50，平均病毒控制滴度为6.0。
表4.VYR法体外抗SARS-COV-2活性的研究
实验化合物GH543无毒(CC50，>200nM)，对SARS-CoV-2具有活性，并显示出显著的病毒滴度降低(EC90，0.22nM)，尽管剂量-反应不典型，高浓度并不像低浓度那样完全抑制CPE(表4，EC90计算时忽略)。选择指数比率很高(SI90>920)，这是一个很好的指征，表明在体内治疗特定病毒感染时，将成为更有效、更安全的药物。阳性对照化合物M128533的表现如预期。
与阳性对照(EC90＝14nm)相比，GH543显著减少病毒感染和复制(EC90＝0.22nm)，且实验化合物对细胞没有毒性。这项研究提供了其可能成为抑制SARS-CoV-2的工具的证据。
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Claims (35)
1.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含反义链，所述反义链具有至少15个或更多个连续的核苷酸与选自SEQ ID Nos:1至210组成的组的至少一个靶基因基本上互补。
2.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含反义链，所述反义链具有与选自由SEQ ID NO:211至420组成的组的一个核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸。
3.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂是小干扰RNA双链体，包含反义链，所述反义链具有选自由SEQ ID NO:211至420组成的组的至少15个或更多个连续的核苷酸，和与所述反义链基本上互补的有义链，所述有义链和所述反义链形成双链区。
4.权利要求3所述的基因沉默剂，其中所述反义链的长度为15至30个核苷酸，所述有义链的长度为9-29个核苷酸，两个端点值都包括在其中。
5.权利要求3所述的基因沉默剂，其中所述反义链的长度为23个核苷酸，所述有义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸。
6.权利要求3所述的基因沉默剂，其中所述反义链的长度为21个核苷酸，所述有义链的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸。
7.权利要求3所述的基因沉默剂，其中所述反义链的长度为19个核苷酸，所述有义链的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸。
8.权利要求3至7所述的基因沉默剂，其中所述反义链的3'和/或5'末端具有突出端，其中3'和/或5'末端的所述突出端的长度为1、2、3、4、5或6个核苷酸。
9.权利要求3至7所述的基因沉默剂，其中所述反义链的3'末端具有突出端，并且具有5'平末端，其中3'末端的所述突出端的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。
10.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂是小干扰RNA双链体，包含反义链和有义链，所述反义链具有与选自由SEQ ID NO:211至420组成的组的序列基本上相同的核苷酸；所述有义链具有与SEQ ID NO:421至630组成的组中列出的相应序列基本上相同的核苷酸；所述有义链和反义链形成双链区。
11.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AACGAUUGCAGCAUUGUUAGC-3’(SEQ ID NO:253)，并且所述有义链包含5’-AACAAUGCUGCAAUC-3’(SEQ ID NO:463)。
12.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AACUUUAUCAUUGUAGAUGUC-3’(SEQ ID NO:365)，并且所述有义链包含5’-AUCUACAAUGAUAAA-3’(SEQ ID NO:575)。
13.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AAGCAUUGUUAGCAGGAUUGC-3’(SEQ ID NO:224)，并且所述有义链包含5’-AUCCUGCUAACAAUG-3’(SEQ ID NO:434)。
14.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AACAAUUUGCGGCCAAUGUUU-3’(SEQ ID NO:240)，并且所述有义链包含5’-CAUUGGCCGCAAAUU-3’(SEQ ID NO:450)。
15.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AAUUGUUUGGAGAAAUCAUCC-3’(SEQ ID NO:245)，并且所述有义链包含5’-UGAUUUCUCCAAACA-3’(SEQ ID NO:455)。
16.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AAACCAGCUACUUUAUCAUUG-3’(SEQ ID NO:366)，并且所述有义链包含5’-UGAUAAAGUAGCUGG-3’(SEQ ID NO:576)。
17.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AAAUGUGUCACAAUUACCUUC-3’(SEQ ID NO:354)，并且所述有义链包含5’-GGUAAUUGUGACACA-3’(SEQ ID NO:564)。
18.一种用于治疗COVID-19的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含形成双链区的反义链和有义链，其中所述反义链包含5’-AACAGCUGGACAAUCCUUAAG-3’(SEQ ID NO:357)，并且所述有义链包含5’-AAGGAUUGUCCAGCU-3’(SEQ ID NO:567)。
19.权利要求1至18任一项所述的基因沉默剂，其中所述反义链和/或所述有义链的至少一个核苷酸是经修饰的核苷酸。
20.权利要求1至18任一项所述的基因沉默剂，其中所述反义链和所述有义链中的至少一个与配体缀合，所述配体包括脂质基团，例如胆固醇基团。
21.权利要求1至20任一项所述的基因沉默剂，其中所述基因沉默剂能够降低受试者细胞中的SARS-CoV-2蛋白，SARS-CoV-2mRNA或SARS-CoV-2滴度的水平。
22.一种用于治疗COVID-19相关的病症的药物组合物，其包含权利要求1至21任一项所述的基因沉默剂，和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
23.一种用于治疗COVID-19相关的病症的药物组合物，其包含两种或更多种权利要求1至21任一项所述的基因沉默剂，和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，其中所述基因沉默剂直接作用于一个CoV基因的多个不同的片段或多个不同的CoV基因。
24.一种用于治疗COVID-19相关的病症的药物组合物，其包含两种或更多种权利要求1至21任一项所述的基因沉默剂，和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，其中第一基因沉默剂靶向SARS-CoV-2的核衣壳基因，所述第一基因沉默剂包含与图1(SEQ ID NO:211-306)提供的反义链序列之一相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，或由其组成，或基本上由其组成；其中第二基因沉默剂靶向SARS-CoV-2的RdRp基因，所述第二基因沉默剂包含与图2(SEQ ID NO:307-372)提供的反义链序列之一相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸，或由其组成，或基本上由其组成。
25.一种用于治疗COVID-19相关的病症的药物组合物，其包含两种基因沉默剂和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，其中第一基因沉默剂靶向SARS-CoV-2的核衣壳基因，所述第一基因沉默剂选自GHI_N1至GHI_N96中的任意一种；其中第二基因沉默剂靶向SARS-CoV-2的RdRp基因，所述第二基因沉默剂选自GHI_P97至GHI_P162中的任意一种。
26.权利要求25所述的药物组合物，其中所述第一基因沉默剂选自由GHI_N43、GHI_N14、GHI_N30和GHI_N35组成的组。
27.权利要求25所述的药物组合物，其中所述第二基因沉默剂选自由GHI_P155、GHI_P156、GHI_P144和GHI_P147组成的组。
28.一种用于治疗与COVID-19相关的病症的药物组合物，其包含两种基因沉默剂和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，其中第一基因沉默剂是权利要求11所述的基因沉默剂，第二基因沉默剂是权利要求12所述的基因沉默剂。
29.一种降低受试者细胞中SARS-CoV-2蛋白水平的方法，包含向所述受试者施用基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含反义链，所述反义链具有与选自由SEQ ID NO:1至210组成的组的靶基因基本上互补的至少15个或更多个连续的核苷酸。
30.一种降低受试者细胞中SARS-CoV-2蛋白水平的方法，包含向所述受试者施用基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含反义链，所述反义链具有与选自由SEQ ID NO:211至420组成的组的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸。
31.一种治疗或预防受试者SARS-CoV-2感染的方法，包含向所述受试者施用基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含反义链，所述反义链具有与选自SEQ ID NO:1至210的靶基因基本上互补的至少15个或更多个连续的核苷酸。
32.一种治疗或预防受试者SARS-CoV-2感染的方法，包含向所述受试者施用基因沉默剂，其中所述基因沉默剂包含反义链，所述反义链具有与选自由SEQ ID NO:211至420组成的组的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个或更多个连续的核苷酸。
33.一种治疗或预防受试者SARS-CoV-2感染的方法，包含向所述受试者施用权利要求1至21任一项所述的基因沉默剂和权利要求23至28任一项所述的药物组合物。
34.权利要求29至33任一项所述的方法，其中所述基因沉默剂经鼻内施用于受试者。
35.权利要求29至33任一项所述的方法，其中所述基因沉默剂通过吸入或雾化施用于受试者。
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