CN115877020A - 一种直接化学发光的tt3测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种直接化学发光的TT3测定试剂盒及其制备方法，其中，一种直接化学发光的TT3测定试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、磁珠溶液及化学发光激发液，所述试剂R1为化学发光标记物标记的T3‑BSA，所述试剂R2为生物素标记的三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体，所述磁珠溶液为链霉亲和素磁珠溶液。采用本发明的TT3测定试剂盒进行TT3的检测具有较高的灵敏度和特异性，获得检测结果的准确性更高、时间更短、操作更方便。

Description

一种直接化学发光的TT3测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及试剂盒制备领域，具体涉及一种直接化学发光的TT3测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

总三碘甲状腺原氨酸(TT3)，血清中TT3浓度的改变，表示甲状腺功能的异常；妊娠合并甲状腺功能亢进，妊娠期甲状腺功能亢进，老年人甲状腺功能亢进症，妊娠合并甲亢，贫血，肝硬化，甲状腺功能减退，老年甲状腺功能减退症，下丘脑综合征，妊娠合并甲状腺功能减退等疾病会引起TT3指标异常。因此，临床上采用TT3指标来进行甲状腺功能检查。

中国专利申请CN 102435755A中已经公开了TT3的检测方法采用磁微粒分离酶联免疫检测技术，其是以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。其中的抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，因此，具有反应快速、彻底的优势。但采用上述检测方法在线性范围内相关系数r、最低检出限、实测值与理论值的效价之比、重复实验的变异系数、热加速稳定性、长期稳定性等检测性能上需要进一步提高的必要。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于，如何进一步提高TT3检测结果的灵敏度和准确度，从而提供灵敏度和准确度更好的一种直接化学发光的TT3测定试剂盒及其制备方法。

一种直接化学发光的TT3测定试剂盒，包括：试剂R1、试剂R2、磁珠溶液及化学发光激发液，所述试剂R1为化学发光标记物标记的T3-BSA(三碘甲状腺原氨酸连接牛血清白蛋白复合物)，所述试剂R2为生物素标记的三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体，所述磁珠溶液为链霉亲和素磁珠溶液。

所述化学发光标记物标记的T3-BSA中，T3-BSA与化学发光标记物的摩尔比是1：(3～20)，优选为1：13。

所述化学发光标记物为吖啶酯。

所述生物素标记的三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体中，三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体与生物素的摩尔比是1：(4～20)，优选为1：4。

所述化学发光激发液包括A液和B液，其中A液为硝酸和过氧化氢混合溶液，B液为氢氧化钠溶液。

所述链霉亲和素磁珠溶液中磁珠的浓度(质量/体积)是0.01～1mg/mL，优选为0.2mg/mL；

和/或，所述链霉亲和素磁珠的粒径为0.05～3μm，优选为3μm。

所述TT3测定试剂盒中还包括校准品，所述校准品包括浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL和8ng/mL的三碘甲状腺原氨酸溶液。

所述TT3测定试剂盒中还包括质控品、清洗液、解离剂。

一种直接化学发光的TT3测定试剂盒的制备方法，包括试剂R1的制备方法；

所述试剂R1的制备过程为：将T3-BSA与化学发光标记物在R1标记缓冲液中连接，R1标记缓冲液为PBS，在避光条件下标记反应，结束后经封闭、纯化、收集获得。

具体的，取T3-BSA，用R1标记缓冲液稀释，加入吖啶酯溶液立即用数显涡旋混匀仪混匀，混匀时间优选为0.3min～3min，混匀速率为15r/min，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上70r/min避光混匀反应，反应时间优选为1～2h，加入50μL吖啶酯封闭液，立即用移液器吹打混匀10次，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上70r/min避光混匀封闭，封闭时间优选为30min～60min，取出透析袋，用洁净无尘纸拭去纯化水，用透析夹将透析袋底端夹紧，将封闭后的溶液转移至透析袋中，用透析夹将透析袋顶端夹紧，袋内溶液上方应留出一段空气。将整个透析装置放入盛有800mL的R1透析缓冲液的烧杯中，于2℃～8℃层析柜中搅拌透析，搅拌转速250～300r/min。每2小时更换一次透析缓冲液，第一次过夜透析前需至少换液2次，换液次数优选为10～15次，取出透析装置，用洁净无尘纸尽量拭去表面所有水分，打开透析夹，收集透析袋内的标记溶液，测量体积，再加入等体积甘油，吹打混匀后避光-20℃保存。

所述的T3-BSA的质量：化学发光标记物溶液的体积优选为100μg:5μL；所述的化学发光标记物溶液的浓度优选为4mM/mL；所述的R1标记缓冲液为0.02M PBS，pH优选为8.0；所述的吖啶酯封闭液优选为赖氨酸，质量分数优选为15％；所述的R1透析缓冲液为0.025MTris-HCl、50mM NaCl、0.5mM EDTA-2Na，pH为8.0。制备得到的化学发光标记物标记的T3-BSA中，T3-BSA与化学发光标记物的摩尔比是1：(3～20)。

本发明还包括链霉亲和素磁珠溶液的制备方法和/或试剂R2的制备方法；

所述链霉亲和素磁珠溶液的制备过程包括：

将链霉亲和素磁珠原液混匀至磁珠分散均匀无凝集，将磁珠原液与磁珠稀释液混合获得重悬磁珠，混匀后获得链霉亲和素磁珠溶液；

所述的磁珠原液的浓度优选为100mg/mL，磁珠原液和磁珠稀释液的体积比优选为500；所述的磁珠稀释液为0.02M PBS，2.5％蔗糖，1％BSA，0.1％吐温-20，0.1％Proclin300，pH7.2。

所述试剂R2的制备过程包括：

取三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体，与生物素溶液在R2标记缓冲液中连接，进行混合，在避光条件下标记反应，结束后经纯化、收集获得；

具体的，取T3抗体，加入R2标记缓冲液，加入生物素溶液立即用数显涡旋混匀仪混匀，混匀时间优选为0.3min～3min，混匀速率为15r/min，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上70r/min避光混匀反应，反应时间优选为1～2h，取出透析袋，用洁净无尘纸拭去纯化水，用透析夹将透析袋底端夹紧，将混匀后的抗体溶液转移至透析袋中，用透析夹将透析袋顶端夹紧，袋内溶液上方应留出一段空气。将整个透析装置放入盛有800mL的R2透析缓冲液的烧杯中，于2℃～8℃层析柜中搅拌透析，搅拌转速250～300r/min。每2小时更换一次透析缓冲液，换液次数优选为3～6次，取出透析装置，用洁净无尘纸尽量拭去表面所有水分，打开透析夹，收集透析袋内的标记溶液，测量体积，再加入等体积甘油，吹打混匀后避光-20℃保存。

所述的T3抗体的质量：生物素溶液的体积优选为200μg：3μL；所述的生物素溶液的浓度为1mg/mL；所述的R2标记缓冲液为0.04M CB，pH优选为9.6；所述的R2透析缓冲液为0.2M PBS，pH为6.5。制备得到的所述生物素标记的三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体中，三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体与生物素的摩尔比是1：(4～20)。

本发明的一种直接化学发光的TT3测定试剂盒用于检测总三碘甲状腺原氨酸(TT3)时，利用全自动化学发光免疫分析仪对含三碘甲状腺原氨酸校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件，然后根据需求测试临床样本，根据样本的发光值(RLU)计算总三碘甲状腺原氨酸的浓度。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种直接化学发光的TT3测定试剂盒，使用链霉亲和素磁珠-生物素标记三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体-化学发光标记物标记的三碘甲状腺原氨酸体系，采用链霉亲和素磁珠与生物素标记的三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强；同时，选择化学发光标记物为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料由激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。采用本发明的TT3测定试剂盒进行TT3的检测具有较高的灵敏度和特异性，获得检测结果的准确性更高、时间更短、操作更方便。

2.本发明提供的试剂盒可以与全自动化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度和准确度。

3.本发明提供的试剂盒其抗原、抗体的结合是在相似的液体条件下进行，相比传统的检测方法，反应过程更简洁、反应迅速灵敏、线性范围更宽以及特异性更好。

4.本发明提供的试剂盒的制备方法中，由于化学发光标记物标记的是小分子的三碘甲状腺原氨酸，因此会存在无法标记成功的问题，本发明中使用通过化学合成的T3-BSA，然后再与发光标记物结合，进而实现了将化学发光标记物标记在小分子三碘甲状腺原氨酸上的目的，实现了本发明中试剂盒的制备。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的一种直接化学发光的TT3测定试剂盒的标准曲线图。

图2是本发明的一种直接化学发光的TT3测定试剂盒与市售试剂盒的检测结果对比图。

具体实施方式

实施例1

一种直接化学发光的TT3测定试剂盒的制备过程，包括：

(1)链霉亲和素磁珠溶液的制备工艺：将链霉亲和素磁珠原液(厂家：JSRLifeScience，货号：MS300/Streptavidin，浓度：100mg/mL)置于血液混匀仪上，70r/min混匀至磁珠分散均匀无凝集，取499mL磁珠稀释液加入到润洗后的玻璃瓶中，加入1mL混匀后的磁珠原液重悬磁珠，放入生化培养箱中25℃，在血液混匀仪上70r/min混匀30min，放于2℃～8℃冰箱内保存。磁珠稀释液配方：0.02M PBS(磷酸盐缓冲液)，2.5％蔗糖，1％BSA(牛血清白蛋白)，0.1％吐温-20，0.1％Proclin300，pH7.2。

(2)吖啶酯标记的三碘甲状腺原氨酸的制备工艺：取0.1mg T3-BSA(上海汉尊生物科技有限公司，货号：HT-014561)，用R1标记缓冲液稀释至0.5mg/mL，加入5μL吖啶酯溶液(浓度4mM/mL)立即用数显涡旋混匀仪混匀20秒，混匀速率为15r/min，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上70r/min避光混匀反应1h，加入50μL吖啶酯封闭液(质量分数为15％的赖氨酸)，立即用移液器吹打混匀10次，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上70r/min避光混匀封闭30min。取出透析袋，用洁净无尘纸拭去纯化水，用透析夹将透析袋底端夹紧，将封闭后的溶液转移至透析袋中，用透析夹将透析袋顶端夹紧，袋内溶液上方应留出一段空气。将整个透析装置放入盛有800mL的R1透析缓冲液的烧杯中，于6℃层析柜中搅拌透析，搅拌转速280r/min。每2小时更换一次R1透析缓冲液，第一次过夜透析前需至少换液2次，换液次数为10次，取出透析装置，用洁净无尘纸尽量拭去表面所有水分，打开透析夹，收集透析袋内的标记溶液，测量体积，再加入等体积甘油，吹打混匀后避光-20℃保存。经过检测，本实施例制备得到的所述化学发光标记物标记的T3-BSA中，T3-BSA与化学发光标记物的摩尔比是1：13。

所述的R1透析缓冲液组成为0.025M Tris-HCl、50mM NaCl、0.5mM EDTA-2Na，pH为8.0。

(3)生物素标记三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体的制备工艺：取0.1mg T3抗体，用R2标记缓冲液稀释至1mg/mL，加入生物素溶液(浓度1mg/mL)立即用数显涡旋混匀仪混匀0.3min，混匀速率为15r/min，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上70r/min避光混匀反应1h，取出透析袋，用洁净无尘纸拭去纯化水，用透析夹将透析袋底端夹紧，将混匀后的抗体溶液转移至透析袋中，用透析夹将透析袋顶端夹紧，袋内溶液上方应留出一段空气。将整个透析装置放入盛有800mL的R2透析缓冲液的烧杯中，于2℃～8℃层析柜中搅拌透析，搅拌转速250～300r/min。每2小时更换一次R2透析缓冲液，换液次数优选为3次，取出透析装置，用洁净无尘纸尽量拭去表面所有水分，打开透析夹，收集透析袋内的标记溶液，测量体积，再加入等体积甘油，吹打混匀后避光-20℃保存。经过检测，本实施例制备得到的所述生物素标记的三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体中，三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体与生物素的摩尔比是1：4。

所述的R2标记缓冲液为0.04M CB(碳酸缓冲液)，pH为9.6；所述的R2透析缓冲液为0.2M PBS，pH为6.5。

实验例：

以全自动化学发光免疫分析仪为检测仪器，方法采用竞争法，即仪器依次加入25ul的样本，25ul的解离剂，反应一分钟后再依次加入50ul的试剂R2，50ul的试剂R1和链霉亲和素磁珠。反应15分钟后，仪器使用清洗液进行清洗，再将反应复合物送入暗室，依次加入化学发光激发液A液和化学发光激发液B液同时检测发光值(RLU)。仪器根据发光值(RLU)自动计算出样本中TT3浓度。

其中，解离剂的有效成分为1.5％水杨酸钠，其他成分为0.02M PB、3％NaCl、0.01mM EDTA-2Na，pH为6.8。清洗液的组成为0.05MPB，0.1％Tween-20，0.1％PC300，pH7.2～7.4。

采用上述检测过程，对本发明实施例1的试剂盒的性能进行评价，具体评价如下：

(1)线性范围：将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样本必须接近线性范围下限，对每一浓度的样本均重复检测3次，计算平均值，将平均值和理论浓度用最小二乘法进行直线拟合，计算线性相关系数r，结果详见表1。

表1线性范围的测定结果

通过上述表1的结果可知，本发明的试剂盒的线性范围为：0.1～8ng/mL，相关系数r为0.9955。

(2)最低检出限：重复测定零浓度校准品20次，得到20次测定结果的发光值(RLU)，计算其平均值M和标准差SD，得出M-2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M-2SD所对应的RLU值代入上述方程中，计算得出对应的浓度，即为最低检出限。检验结果如下表2所示。

表格1最低检出限的测定结果

通过上述表2的结果可知，本发明的试剂盒的最低检出限低于0.1ng/mL，可以达到0.06ng/mL。

(3)准确度：检测浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL和8ng/mL6个浓度的三碘甲状腺原氨酸国家标准品，实测值与理论值的效价之比应在0.900-1.100之间，检验结果如下表3所示。

表3准确度测定结果

通过表3数据可知，本发明试剂盒检测得到的实测值与理论值的效价之比在0.900-1.100之间。

(4)重复性：用高低浓度的样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式(Ⅰ)得出变异系数CV结果。

CV＝SD/M×100％ (Ⅰ)

式中：CV：变异系数

M：10次测量结果的平均值

SD：10次测量结果的标准差；

检测结果如下表4所示。

表4本试剂盒的重复性测定结果

	低值	高值
			检测次数1	1.013	1.977
检测次数2	0.96	2.031
			检测次数3	0.975	2.056
检测次数4	0.962	2.081
			检测次数5	1.023	1.952
检测次数6	0.966	1.938
			检测次数7	0.977	1.988
检测次数8	0.993	1.979
			检测次数9	1.025	1.942
检测次数10	0.965	2.069
			CV	2.6％	2.7％

通过上述表4结果可知，本试剂盒的变异系数CV均明显小于8％，也小于5％，甚至可以达到3％以下。

(5)特异性：检测浓度为500ng/mL的总甲状腺素(TT4)，50ng/mL的反三碘甲状腺原氨酸(rT3)。检测结果如下表5。

表5本试剂盒的特异性检测结果

通过表5的结果表明，本试剂盒检测高浓度TT4和rT3样本交叉反应不高于2ng/mL。

(6)热加速稳定性：将试剂盒置于37℃加速破坏的环境，在第3天，第7天和第14天分别取出，检测校准品发光值。检测结果详见表6。

表6本试剂盒的热加速稳定性检测结果

通过表6可知，本试剂盒在37℃加速破坏14天，发光值降幅依然在10％以内。

(7)长期稳定性：将试剂盒置于4℃保存，在第3个月，第7个月，第12个月和第13个月分别取出检测校准品发光值。检测结果如下表7所示。

表7本试剂盒的长期稳定性检测结果

通过表7的结果可知，本试剂盒在4℃中保存13个月，发光值降幅在10％以内。

(8)相关性验证：取200份血清，比较本试剂盒与英国西门子医学诊断产品有限公司的总三碘甲状腺原氨酸(TT3)检测试剂盒检测结果的相关性，结果如图2所示。

在图2中，横坐标为英国西门子医学诊断产品有限公司试剂盒的检测结果，纵坐标为本试剂盒的检测结果，相关系数R2＝0.9952，回归线方程为y＝0.9661x+0.0554。由图2可知，本试剂盒检测结果与本行业知名公司产品检测结果相比，无明显差异。

本发明中线性范围内相关系数r均达到0.995以上、最低检出限达到0.1ng/mL以上、实测值与理论值的效价之比在0.900-1.100之间、重复实验的变异系数CV均明显小于8％、检测高浓度TT4和rT3样本交叉反应不高于2ng/mL、相同热加速稳定性下发光值降幅在10％以内、4℃中保存13个月发光值降幅在10％以内，效果显著。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种直接化学发光的TT3测定试剂盒，其特征在于，包括：试剂R1、试剂R2、磁珠溶液及化学发光激发液，所述试剂R1为化学发光标记物标记的T3-BSA，所述试剂R2为生物素标记的三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体，所述磁珠溶液为链霉亲和素磁珠溶液。

2.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物标记的T3-BSA中，T3-BSA与化学发光标记物的摩尔比是1：(3～20)。

3.根据权利要求1或2所述的测定试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为吖啶酯。

4.根据权利要求1-3任一项所述的测定试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体中，三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体与生物素的摩尔比是1：(4～20)。

5.根据权利要求1-4任一项所述的测定试剂盒，其特征在于，所述化学发光激发液包括A液和B液，其中A液为硝酸和过氧化氢混合溶液，B液为氢氧化钠溶液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的测定试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁珠溶液中磁珠的浓度是0.01～1mg/mL；

和/或，所述链霉亲和素磁珠的粒径为0.05～3μm。

7.根据权利要求1-6任一项所述的测定试剂盒，其特征在于，所述TT3测定试剂盒中还包括校准品，所述校准品包括浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL和8ng/mL的三碘甲状腺原氨酸溶液。

8.根据权利要求1-7任一项所述的测定试剂盒，其特征在于，所述TT3客户案号

测定试剂盒中还包括质控品、清洗液、解离剂。

9.权利要求1-8任一项所述的一种直接化学发光的TT3测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括试剂R1的制备方法；

所述试剂R1的制备过程为：将T3-BSA在R1标记缓冲液中与化学发光标记物连接，R1标记缓冲液为PBS，在避光条件下标记反应，结束后经封闭、纯化、收集获得。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括链霉亲和素磁珠溶液的制备方法和/或试剂R2的制备方法；

所述链霉亲和素磁珠溶液的制备过程包括：

将链霉亲和素磁珠原液混匀至磁珠分散均匀无凝集，将链霉亲和素磁珠原液与磁珠稀释液混合获得链霉亲和素磁珠溶液；

所述试剂R2的制备过程包括：

取三碘甲状腺原氨酸单克隆抗体，与生物素溶液在R2标记缓冲液中连接，进行混合，在避光条件下标记反应，结束后经纯化、收集获得。

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