CN115876674A - 一种光电检测方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种光电检测方法，包括：混合全血样本和第一试剂获得第一样本，混合第一样本和第二试剂获得第二样本；对第一样本进行明场成像，对全血样本中的红细胞进行检测；对第一样本进行荧光成像，对全血样本中的血小板进行检测；对第二样本进行荧光成像和第一暗场成像，对全血样本中的白细胞进行检测；第一暗场显微图像为暗场光源与物镜同轴设置所成的显微图像；采用第一波长的光源对第二样本进行吸光度检测，采用第二波长的光源对第二样本进行吸光度检测，以对全血样本中的血红蛋白进行检测。血液样本预处理操作简单，可在床旁即时对血液成分进行全面检测。本发明还提出一种用于实现上述方法的检测装置，体积小，移动性好。

Description

一种光电检测方法和装置

技术领域

本发明涉及血液成分检测技术领域，尤其涉及一种光电检测方法和装置。

背景技术

血液成分检测项目主要包括红细胞检测、白细胞检测、血小板检测和血红蛋白检测，血液成分检测是重要的临床医学指标。目前光电检测方法主要为库尔特电阻抗计数法和流式细胞计数法，用于实现库尔特电阻抗计数法和流式细胞计数法的设备具有自动化程度高的优点，广泛应用于医院检验科或中心实验室，但存在设备体积较大(一般长宽400×300mm以上，高在500mm以上，重量在15～20公斤)，移动性差，需经常进行维护保养的问题，对于基层医疗和小型诊所的使用经济性较差。

近年来床旁即时检测技术(POCT)飞速发展，POCT血液成分检测技术将是对现有大型自动化血液成分检测设备的有力补充，对于基层医疗和特殊环境医疗诊治具有重要意义。目前，POCT在血液细胞检测领域主要有：①基于梯度密度离心的全血细胞检测，以QBC血细胞分析计数方法和设备为典型代表；②基于显微成像原理的血液细胞检测，如Hemocue的白细胞计数仪和白细胞分类计数仪，康尚WBC-1白细胞计数仪等。然而在QBC血细胞分析计数方法和设备中，血液样本预处理操作复杂，并且检测准确度和精密度欠佳；在Hemocue和康尚的白细胞计数仪中，只能针对白细胞进行检测。

为此，亟需一种POCT光电检测方法和设备，血液样本预处理操作简单，能够实现血液成分的全面检测，并且检测准确度和精密度高。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于上述技术中存在的问题，本发明至少从一定程度上进行解决。为此，本发明的一个目的在于提出一种光电检测方法，该方法的血液样本预处理操作简单，可在床旁即时对血液成分进行全面检测。

本发明的第二个目的在于提出一种用于实现上述光电检测方法的检测装置，体积小，移动性好。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一方面，本发明提供一种光电检测方法，包括以下步骤：

将全血样本与第一试剂混合均匀获得第一样本；将第一样本与第二试剂混合均匀获得第二样本；第一试剂包含抗凝剂、稀释液和染色剂，第二试剂包括裂解剂；

检测时，包括如下操作：

对第一样本进行明场成像，获得红细胞的显微图像，根据红细胞的显微图像，对全血样本中的红细胞进行检测；对第一样本进行荧光成像，获得血小板的显微图像，根据血小板的显微图像，对全血样本中的血小板进行检测；

对第二样本进行荧光成像，获得白细胞的荧光显微图像；对第二样本进行第一暗场成像，获得第一暗场显微图像，根据白细胞的荧光显微图像和第一暗场显微图像，对全血样本中的白细胞进行检测；第一暗场显微图像为暗场光源与物镜同轴设置所成的显微图像；

采用第一波长的光源对第二样本进行吸光度检测，获得吸光度I；采用第二波长的光源对第二样本进行吸光度检测，获得吸光度Ⅱ；根据吸光度I和吸光度Ⅱ，对全血样本中的血红蛋白进行检测。

可选地，抗凝剂为乙二胺四乙酸EDTA、肝素、草酸钠中的一种或几种的混合物；稀释液为生理盐水、磷酸盐缓冲液PBS、纯净水中的一种或几种的混合物；染色剂为超绿荧光染料GelGreen、碘化丙啶PI、恶唑黄YP1中的一种或几种的混合物，裂解剂为季铵盐、曲拉通、吐温80中的一种或几种的混合物。

可选地，将第一样本填充在厚度为20-40μm的透明腔室内进行明场成像和荧光成像；将第二样本填充在厚度为100-150μm的透明腔室内进行荧光成像和暗场成像；将第二样本填充在厚度为0.5-1.0mm的透明腔室内进行吸光度检测。

可选地，对第一样本进行明场成像和/或荧光成像的物镜数值孔径NA为0.2～0.4；对第二样本进行荧光成像和/或第一暗场成像的物镜数值孔径NA为0.08～0.2。

可选地，光电检测方法还包括：对第二样本进行第二暗场成像，获得第二暗场显微图像；第二暗场显微图像为第二暗场光源的光轴相对物镜轴线偏转50°～70°所成的显微图像；根据对第二样本的荧光显微图像、第一暗场显微图像和第二暗场显微图像，对全血样本中的白细胞进行检测。

第二方面，本发明提供一种光电检测装置，包括载物台、第一检测单元、第二检测单元和第三检测单元；

载物台用于放置待检测样本；

第一检测单元包括明场照明组件、第一荧光照明组件和用于待检测样本成像的第一成像组件；所述明场照明组件与载物台和第一成像组件中的第一物镜依次同轴设置，用于照射待检测样本，透过样本的光在第一成像组件中形成明场成像；第一荧光照明组件与第一物镜和载物台依次同轴设置，或者与第一物镜的轴线成第一设定角度的夹角，用于照射待检测样本，激发样本产生的荧光在第一成像组件中形成第一荧光成像。

第二检测单元包括第一暗场照明组件、第二荧光照明组件和用于待检测样本成像的第二成像组件。第一暗场照明组件与载物台和第二成像组件中的第二物镜依次同轴设置，用于照射待检测样本，样本产生的散射光在第二成像组件中形成第一暗场成像；第二荧光照明组件与第二物镜的轴线成第二设定角度的夹角，用于照射待检测样本，激发样本产生的荧光在第二成像组件中形成第二荧光成像。

第三检测单元，用于对待检测样品进行吸光度检测。

可选地，第一荧光照明组件与第一物镜和载物台依次同轴设置，载物台位于第一物镜的物方焦面上。

第一成像照明组件包括第一物镜、分光片、第一滤光片和第一图像传感器；分光片位于第一荧光照明组件与第一物镜之间并与第一物镜同轴设置，分光片相对第一物镜轴线偏转设置，分光片允许从上至下的第一荧光照明组件发出的光通过，反射从下至上穿过第一物镜的光；第一滤光片和第一图像传感器位于分光片的左侧或右侧，第一图像传感器位于第一物镜的像方焦面上，第一滤光片位于第一物镜与第一图像传感器之间的光路上，用于阻断第一荧光照明组件发出的光。

可选地，第二成像组件包括同轴依次设置的第二物镜、光阑片、第三滤光片和第二图像传感器。

第二图像传感器位于第二物镜的像方焦面上，载物台位于第二物镜的物方焦面上；光阑片位于第二物镜与第二图像传感器之间，并且光阑片位于第二物镜的一个焦面上，位于光阑片中心的遮光片用于阻断被第二物镜聚焦的第一暗场照明组件发出的光；第三滤光片位于第二物镜与第二图像传感器之间的光路上，用于阻断第二荧光照明组件发出的光。

可选地，光电检测装置还包括第二暗场照明组件，第二暗场照明组件位于载物台远离第二物镜的一侧并与第二物镜的轴线成50°～70°的夹角，用于照射待检测样本，样本产生的散射光在第二成像组件中形成第二暗场成像。

可选地，光电检测装置还包括人机交互单元、中央处理单元和运动模块，人机交互单元、运动模块、第一检测单元、第二检测单元和第三检测单元均与中央处理单元连接；

人机交互单元，用于用户输入信息和显示血液成分检测结果；

运动模块，用于作为载物台搭载血液成分检测片并控制血液成分检测片移动；

中央处理单元，用于根据用户输入的信息控制运动模块、第一检测单元、第二检测单元和第三检测单元工作，实现血液成分检测。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

1、本发明提出的光电检测方法，只需对全血样本进行两次处理，即可获得用于满足血液各成分检测要求的第一样本和第二样本，血液样本预处理操作简单。进而选择第一样本进行明场成像，实现对全血样本中红细胞的检测，选择第一样本进行荧光成像，实现对全血样本中血小板的检测，选择第二样本进行荧光成像和第一暗场成像，实现对全血样本中白细胞的检测，选择第二样本进行吸光度检测，实现对全血样本中血红蛋白的检测，从而实现血液成分的全面检测。此外，本发明光电检测方法基于显微成像原理和差分吸收原理(即吸光度检测)实现，可在床旁即时检测。

2、本发明提出的光电检测装置，第一检测单元可用于对第一样本进行明场成像，以实现对全血样本中红细胞的检测，以及用于对第一样本进行第一荧光成像，以实现对全血样本中血小板的检测。第二检测单元中，通过将第一暗场照明组件与载物台和第二成像组件中的第二物镜依次同轴设置，可用于对第二样本进行第一暗场成像，并且通过第二荧光照明组件，可用于对第二样本进行第二荧光成像，进而实现对全血样本中白细胞的检测。第三检测单元可用于对第二样品进行吸光度检测，实现对全血样本中血红蛋白的检测。从而本发明的光电检测装置能够实现对白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白的检测，并且结构简单、体积小、移动性好、成本低。

附图说明

本发明借助于以下附图进行描述：

图1是根据本发明实施例2的光电检测装置中第一检测单元、第二检测单元和第三检测单元的光学结构示意图；

图2是根据本发明实施例2的血液成分检测片的结构示意图；

图3是根据本发明实施例2的光电检测装置的结构示意图；

图4是根据本发明实施例3的血小板显微图像，图像中亮点为血小板；

图5是根据本发明实施例3的红细胞显微图像，图像中圆形目标物为红细胞；

图6是根据本发明实施例3的白细胞的荧光显微图像，图像中亮点为白细胞；

图7是根据本发明实施例3的白细胞的第一暗场图像，图像中亮点为白细胞；

图8是根据本发明实施例3的白细胞的第二暗场图像，图像中亮点为白细胞。

【附图标记说明】

1：第一检测单元；

11：第一物镜；12：第一滤光片；13：第一图像传感器；14：分光片；15：明场照明光源；16：第一聚焦透镜；17：第一荧光照明光源；18：第二聚焦透镜；19：第二滤光片；

2：第二检测单元；

20：第二物镜；21：光阑片；22：第三滤光片；23：第二图像传感器；24：第一暗场照明光源；25：第三聚焦透镜；26：第二荧光照明光源；27：第四聚焦透镜；28：第四滤光片；29：第二暗场照明光源；30：第五聚焦透镜；

3：第三检测单元；

31：第一光源；32：第二光源；33：第六聚焦透镜；34：光电探测器；

4：血液成分检测片；

41：第一腔体；42：第二腔体；43：第三腔体；

5：人机交互单元；

6：中央处理单元；

7：运动模块；

71：检测片支架。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。本文所提及的“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等方位名词以图2和3的定向为参照，其中，左右方向为检测片的长度方向，前后方向为检测片的宽度方向，上下方向为检测片的厚度方向。

实施例1

本实施例提出一种光电检测方法，该光电检测方法包括以下步骤：

步骤S1、配制第一试剂和第二试剂；第一试剂包括抗凝剂、稀释液和染色剂，第二试剂包括裂解剂和稀释液。

具体地，抗凝剂为乙二胺四乙酸EDTA、肝素、草酸钠中的一种或几种的混合物，稀释液为生理盐水、磷酸盐缓冲液PBS、纯净水中的一种或几种的混合物，染色剂为超绿荧光染料GelGreen、碘化丙啶PI、恶唑黄YP1中的一种或几种的混合物，裂解剂为季铵盐、曲拉通、吐温80中的一种或几种的混合物。

优选地，将45～55ng抗凝剂、130～150μL稀释液和0.4～0.6μg染色剂混合，获得第一试剂。进一步优选地，将50ng抗凝剂、140μL稀释液和0.5μg染色剂混合，获得第一试剂。

优选地，将1.8～2.3mg裂解剂和8～12μL稀释液混合，获得第二试剂。进一步优选地，将2mg裂解剂和10μL稀释液混合，获得第二试剂。

步骤S2、将全血样本添加到第一试剂中，混合均匀获得第一样本；对第一样本进行明场成像，获得红细胞的显微图像，根据红细胞的显微图像，对全血样本中的红细胞进行检测；对第一样本进行荧光成像，获得血小板的显微图像，根据血小板的显微图像，对全血样本中的血小板进行检测。

优选地，吸取10μL全血样本加到第一试剂中，第一试剂的体积为100-200μL，混匀后获得第一样本。

具体地，将第一样本填充在厚度为20-40μm的透明腔室内进行明场成像和荧光成像。由于红细胞和血小板数量较多，体积较小，需高分辨率成像，将第一样本填充在厚度为20-40μm的透明腔室内进行明场成像和荧光成像，使第一样本以很薄的液厚铺展开，能够避免高浓度细胞的堆叠，进而计数精度提高，满足红细胞和血小板的检测要求。

具体地，对第一样本进行明场成像和/或荧光成像的物镜数值孔径NA为0.2～0.4。优选地，对第一样本进行明场成像和/或荧光成像的物镜数值孔径NA为0.22～0.27。血小板荧光信号弱，数值孔径小于0.2无法清晰成像，数值孔径大于0.4将导致成像景深减小，导致图像模糊。

具体地，根据红细胞的显微图像，对全血样本中的红细胞进行检测，包括：对红细胞的显微图像进行细胞计数，获得红细胞数量N_rbc；根据光学系统的放大率，获得红细胞显微图像对应物方的面积S_rbc；根据红细胞数量和红细胞显微图像对应物方的面积，计算红细胞的浓度RBC。公式表示如下：

RBC＝N_rbc/S_rbc/d₁，其中，d₁为红细胞显微图像对应物方的厚度。

具体地，根据血小板的显微图像，对全血样本中的血小板进行检测，包括：对血小板的显微图像进行细胞计数，获得血小板数量N_plt；根据光学系统的放大率，获得血小板显微图像对应物方的面积S_plt；根据血小板数量和血小板显微图像对应物方的面积，计算血小板的浓度PLT。公式表示如下：

PLT＝N_plt/S_plt/d₂，其中，d₂为血小板显微图像对应物方的厚度。

步骤S3、将第一样本添加到第二试剂中，混合均匀获得第二样本；对第二样本进行荧光成像，获得白细胞的荧光显微图像，对第二样本进行第一暗场成像，获得第一暗场显微图像，根据白细胞的荧光显微图像和第一暗场显微图像，对全血样本中的白细胞进行检测。第一暗场显微图像为暗场光源与物镜同轴设置所成的显微图像。

优选地，取50～100μL第一样本加到第二试剂中，第二试剂的体积为10-20μL，混匀后获得第二样本。

通过将第一暗场显微图像设置为暗场光源与物镜同轴设置所成的显微图像，以根据第二样本中白细胞发出的小角度散射光(小于5°的散射光)形成第一暗场显微图像，利于白细胞的类型区分。

具体地，将第二样本填充在厚度为100-150μm的透明腔室内进行荧光成像和暗场成像。由于白细胞体积大，但是其数量仅为红细胞的千分之一左右，可低分辨率、宽视野成像，将第二样本填充在厚度为100-150μm的透明腔室内进行荧光成像和暗场成像，能够避免高浓度白细胞堆叠的同时，提高单位面积内白细胞数量，计数精度满足检测要求的同时，计数检测效率提高。

白细胞荧光显微图像中的亮点均为白细胞发出的荧光。第一暗场显微图像中的亮点包含白细胞发出的小角度散射光，也包含第二样本中白细胞以外其他物质发出的干扰散射光。因此，对荧光显微图像进行细胞计数，能够获得白细胞总数量。荧光显微图像中的亮点与第一暗场显微图像中表示白细胞的亮点是一一对应的，因此，可根据从荧光显微图像提取到的荧光信号特征和从第一暗场显微图像提取到的与荧光信号特征对应的散射光信号特征，区分不同类型白细胞(包括粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)。

具体地，根据荧光显微图像和第一暗场显微图像，对全血样本中的白细胞进行检测，包括：对荧光显微图像进行细胞计数，获得白细胞总数量N_wbc；根据从荧光显微图像提取到的荧光信号特征和从第一暗场显微图像提取到的与荧光信号特征对应的散射光信号特征，区分不同类型白细胞(包括粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)，并对不同类型白细胞进行计数；将各个类型白细胞的数量与白细胞总数量相比，获得各个类型白细胞的数量占比；根据光学系统的放大率，获得白细胞显微图像对应物方的面积S_wbc；根据白细胞总数量和白细胞显微图像对应物方的面积，计算白细胞的浓度WBC；根据白细胞浓度和各个类型白细胞的数量占比，计算各个类型白细胞的浓度。公式表示如下：

WBC＝N_wbc/S_wbc/d₃

Grans＝WBC*P_G

Lym＝WBC*P_L

Mono＝WBC*P_M

其中，d₃为红细胞显微图像对应物方的厚度，P_G为粒细胞的数量占比，P_L为淋巴细胞的数量占比，P_M为单核细胞的数量占比，Grans为粒细胞的浓度，Lym为淋巴细胞的浓度，Mono为单核细胞的浓度。如此，实现对白细胞的分类计数。

进一步地，步骤S3还包括：对第二样本进行第二暗场成像，获得第二暗场显微图像，根据荧光显微图像、第一暗场显微图像和第二暗场显微图像，对全血样本中的白细胞进行检测；第二暗场显微图像为第二暗场光源的光轴(光源发出光的中心轴线)相对物镜轴线偏转50°～70°所成的显微图像。

通过对第二样本进行第二暗场成像，能够获得根据第二样本中白细胞发出的大角度散射光(大于50°的散射光)形成的第二暗场显微图像，第二暗场显微图像中的亮点(包含白细胞发出的大角度散射光)能够反映白细胞的形状结构，进而根据第二暗场显微图像，结合荧光显微图像和第一暗场显微图像对全血样本中的白细胞进行检测，使不同类型白细胞区分更准确，进而提高不同类型白细胞的计数准确率，提高样本适应性。

具体地，根据荧光显微图像、第一暗场显微图像和第二暗场显微图像，对全血样本中的白细胞进行检测，包括：对荧光显微图像进行细胞计数，获得白细胞总数量N_wbc；根据从荧光显微图像提取到的荧光信号特征、从第一暗场显微图像提取到的与荧光信号特征对应的散射光信号特征和从第二暗场显微图像提取到的与荧光信号特征对应的散射光信号特征，区分不同类型白细胞(包括粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)，并对不同类型白细胞进行计数；将各个类型白细胞的数量与白细胞总数量相比，获得各个类型白细胞的数量占比；根据光学系统的放大率，获得白细胞显微图像对应物方的面积S_wbc；根据白细胞总数量和白细胞显微图像对应物方的面积，计算白细胞的浓度WBC；根据白细胞浓度和各个类型白细胞的数量占比，计算各个类型白细胞的浓度。

具体地，对第二样本进行荧光成像和/或第一暗场成像和/或第二暗场成像的物镜数值孔径NA为0.08～0.2。数值孔径小于0.08，荧光成像亮度偏低；数值孔径大于0.2，导致成像景深减小，图像模糊。优选地，对第二样本进行荧光成像和/或第一暗场成像和/或第二暗场成像的物镜数值孔径NA为0.1～0.15。

步骤S4、采用第一波长的光源对第二样本进行吸光度检测，获得吸光度I；采用第二波长的光源对第二样本进行吸光度检测，获得吸光度Ⅱ；根据吸光度I和吸光度Ⅱ，对全血样本中的血红蛋白进行检测。

具体地，第一波长为450-550nm，第二波长为700-1000nm。具体第一波长和第二波长的选定，根据血红蛋白的差分吸收特性进行选定。

优选地，将第二样本填充在厚度为0.5-1.0mm的透明腔室内进行吸光度检测。

具体地，根据吸光度I和吸光度Ⅱ，对全血样本中的血红蛋白进行检测，包括：

HGB＝k*(A1-A2)

其中，HGB为血红蛋白浓度，k为比例系数，A1为吸光度I，A2为吸光度Ⅱ。

综上，本发明提出的光电检测方法，只需对全血样本进行两次处理，即可获得用于满足血液各成分检测要求的第一样本和第二样本，血液样本预处理操作简单。进而选择第一样本进行明场成像，实现对全血样本中红细胞的检测，选择第一样本进行荧光成像，实现对全血样本中血小板的检测，选择第二样本进行荧光成像和第一暗场成像，实现对全血样本中白细胞的检测，选择第二样本进行吸光度检测，实现对全血样本中血红蛋白的检测，从而实现血液成分的全面检测。此外，本发明光电检测方法基于显微成像原理和差分吸收原理(即吸光度检测)实现，可在床旁即时检测。

实施例2

本实施例提供一种用于实现实施例1所述光电检测方法的检测装置，能够实现对白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白的检测，具有结构简单、体积小、移动性好、成本低的特点。

为使本发明提出的光电检测装置更加明显易懂，下面结合附图做进一步详细说明。

如图1所示，本发明提出的光电检测装置，包括载物台、第一检测单元1、第二检测单元2和第三检测单元3。

其中，载物台用于放置待检测样本。在本实施例中，待检测样本为薄层第一样本和/或第二样本。

第一检测单元1包括明场照明组件、第一荧光照明组件和用于待检测样本成像的第一成像组件。

明场照明组件，与载物台和第一成像组件中的第一物镜11依次同轴设置，用于照射待检测样本，透过样本的光在第一成像组件中形成明场成像。

第一荧光照明组件，与第一物镜11和载物台依次同轴设置，或者与第一物镜11的轴线成第一设定角度的夹角，用于照射待检测样本，激发样本产生的荧光在第一成像组件中形成第一荧光成像。

第二检测单元2包括第一暗场照明组件、第二荧光照明组件和用于待检测样本成像的第二成像组件。

第一暗场照明组件，与载物台和第二成像组件中的第二物镜20依次同轴设置，用于照射待检测样本，样本产生的散射光在第二成像组件中形成第一暗场成像。

第二荧光照明组件，与第二物镜20的轴线成第二设定角度的夹角，用于照射待检测样本，激发样本产生的荧光在第二成像组件中形成第二荧光成像。

第三检测单元3，用于对待检测样品进行吸光度检测。

如此设置的光电检测装置，第一检测单元1可用于对第一样本进行明场成像，以实现对全血样本中红细胞的检测，以及用于对第一样本进行第一荧光成像，以实现对全血样本中血小板的检测。第二检测单元2中，通过将第一暗场照明组件与载物台和第二成像组件中的第二物镜20依次同轴设置，可用于对第二样本进行第一暗场成像，并且通过第二荧光照明组件，可用于对第二样本进行第二荧光成像，进而实现对全血样本中白细胞的检测。第三检测单元3可用于对第二样品进行吸光度检测，实现对全血样本中血红蛋白的检测。从而本发明的光电检测装置能够实现对白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白的检测，并且结构简单、体积小、移动性好、成本低。在工厂中制作出的本发明的光电检测装置的长宽高在25cm以内，重量在3公斤以内。

优选地，第一成像照明组件包括第一物镜11、第一滤光片12和第一图像传感器13，第一图像传感器13位于第一物镜11的像方焦面上，载物台位于第一物镜11的物方焦面上，第一滤光片12位于第一物镜11与第一图像传感器13之间的光路上，用于阻断第一荧光照明组件发出的光。如此设置的第一成像照明组件，能够形成明场成像和第一荧光成像，形成第一荧光成像的过程为：第一荧光照明组件发出的光照射在待检测样本上，激发样本产生荧光，并且样本在第一荧光照明组件照射下经透射或反射产生信号光，荧光和信号光穿过第一物镜11来到第一滤光片12，第一滤光片12阻断信号光(即第一荧光照明组件发出的光)，只允许荧光打到第一图像传感器13上，以形成第一荧光成像。

优选地，在本实施例中，第一荧光照明组件与第一物镜11和载物台依次同轴设置；第一成像组件还包括分光片14，分光片14位于第一荧光照明组件与第一物镜11之间并与第一物镜11同轴设置，分光片14相对第一物镜11轴线偏转设置，第一滤光片12和第一图像传感器13位于分光片14的左侧或右侧；分光片14允许第一荧光照明组件发出的从上至下的光通过，反射从下至上穿过第一物镜11的光。如此设置，第一荧光成像的原理为：第一荧光照明组件发出的光依次穿过分光片14和第一物镜11打到样本上，激发样本产生荧光，并且样本在第一荧光照明组件照射下经反射产生信号光，荧光和信号光穿过第一物镜11打到分光片14上，经分光片14反射后经过第一滤光片12，在第一图像传感器13形成第一荧光成像。明场成像的原理为：明场照明组件发出的光依次穿过样本和第一物镜11打到分光片14上，经分光片14反射后穿过第一滤光片12，在第一图像传感器13形成明场成像。通过设置分光片14，实现第一荧光照明组件与第一物镜11和载物台的同轴设置，形成的第一荧光成像显像更清晰，分辨率更高。

具体地，作为一个示例，分光片14相对第一物镜11轴线偏转45°设置。如此，能够90°反射从下至上穿过第一物镜11的光，方便第一滤光片12和第一图像传感器13的布置，使结构紧凑。

当然，将第一荧光照明组件与第一物镜11和载物台依次同轴设置，并在第一成像组件中设置分光片14，能够实现明场成像和第一荧光成像仅仅是优选；可以想见，取消分光片14的设置，第一荧光照明组件位于载物台远离第一物镜11的一侧并与第一物镜11的轴线成第一设定角度的夹角，第一滤光片12和第一图像传感器13均与第一物镜11同轴设置，同样能够实现明场成像和第一荧光成像。此时，第一荧光成像的原理为：第一荧光照明组件发出的光打到样本上，激发样本产生荧光，并且样本在第一荧光照明组件照射下经透射产生信号光，荧光和信号光依次经过第一物镜11和第一滤光片12，在第一图像传感器13形成第一荧光成像。明场成像的原理为：明场照明组件发出的光依次穿过样本、第一物镜11和第一滤光片12，在第一图像传感器13形成明场成像。优选地，第一设定角度在20°以内。

进一步地，明场照明组件包括同轴依次设置的明场照明光源15和第一聚焦透镜16，用于将明场照明光源15发出的光聚焦在载物板上。进一步地，明场照明光源15为LED型光源，明场照明光源15发出的光中心波长为530nm-630nm。

进一步地，第一荧光照明组件包括同轴依次设置的第一荧光照明光源17、第二聚焦透镜18和第二滤光片19，第二滤光片19透射光谱范围与第一荧光照明光源17发出光的波长相匹配，用于将第一荧光照明光源17发出的光经第一物镜11聚焦在载物板上。进一步地，第一荧光照明光源17为LED型光源，第二滤光片19为带通滤光片，第一荧光照明光源17发出的光中心波长为450-480nm。

进一步地，第一物镜11的数值孔径NA为0.2～0.4，第一物镜11的光学放大倍率大于3x～6x。优选地，第一物镜11的数值孔径NA为0.22～0.27，第一物镜11的光学放大倍率大于4x～6x。

优选地，第二成像组件包括同轴依次设置的第二物镜20、光阑片21、第三滤光片22和第二图像传感器23；第二图像传感器23位于第二物镜20的像方焦面上，载物台位于第二物镜20的物方焦面上；光阑片21位于第二物镜20与第二图像传感器23之间，并且光阑片21位于第二物镜20的一个焦面上，位于光阑片21中心的遮光片用于阻断被第二物镜20聚焦的第一暗场照明组件发出的光；第三滤光片22位于第二物镜20与第二图像传感器23之间的光路上，用于阻断第二荧光照明组件发出的光。如此设置的第二成像照明组件，能够形成第一暗场成像和第二荧光成像，形成第一暗场成像的过程为：第一暗场照明组件发出的光照射在待检测样本上，样本产生小角度散射光(小于5°的散射光)，并且样本在第一暗场照明组件照射下经透射产生信号光，信号光经第二物镜20聚焦在光阑片21的遮光片上，阻断信号光(即第一暗场照明组件发出的光)，小角度散射光穿过第二物镜20、光阑片21和第三滤光片22打到第二图像传感器23上，以形成第一暗场成像。形成第二荧光成像的过程为：第二荧光照明组件发出的光照射在待检测样本上，激发样本产生荧光，并且样本在第二荧光照明组件照射下经透射或反射产生信号光，荧光和信号光穿过第二物镜20和光阑片21来到第三滤光片22，第一滤光片12阻断信号光(即第二荧光照明组件发出的光)，只允许荧光打到第二图像传感器23上，以形成第二荧光成像。

进一步地，在本实施例中，位于光阑片21中心的遮光片为直径0.8mm-1.2mm的圆形，第一暗场光源发出的光经第二物镜20聚焦后形成的聚焦光的直径小于0.5mm。

优选地，在本实施例中，第二荧光照明组件位于载物台远离第二物镜20的一侧并与第二物镜20的轴线成第二设定角度的夹角。进一步优选地，第二设定角度为15°～30°。

进一步地，第一暗场照明组件包括同轴依次设置的第一暗场照明光源24和第三聚焦透镜25，第一暗场照明光源24位于第三聚焦透镜25的后焦点处，用于将第一暗场照明光源24发出的光聚焦在载物板上。进一步地，第一暗场照明光源24为LED型光源，第一暗场照明光源24发出的光中心波长为600-660nm。

进一步地，第二荧光照明组件包括同轴依次设置的第二荧光照明光源26、第四聚焦透镜27和第四滤光片28，第二荧光照明光源26位于第四聚焦透镜27的后焦点处，用于将第二荧光照明光源26发出的光聚焦在载物板上；第四滤光片28透射光谱范围与第二荧光照明光源26发出的光的波长相匹配。进一步地，第二荧光照明光源26为LED型光源，第四滤光片28为带通滤光片，第二荧光照明光源26发出的光中心波长为450-480nm。

优选地，第二检测单元2还包括第二暗场照明组件，第二暗场照明组件位于载物台远离第二物镜20的一侧并与第二物镜20的轴线成50°～70°的夹角，用于照射待检测样本，样本产生的散射光在第二成像组件中形成第二暗场成像。第二检测单元2中，通过设置第二暗场照明组件，可用于对第二样本进行第二暗场成像，进而利于不同类型白细胞区分更准确，提高不同类型白细胞的计数准确率，提高样本适应性。形成第二暗场成像的过程为：第二暗场照明组件发出的光照射在待检测样本上，样本产生大角度散射光(小于50°的散射光)，并且样本在第二暗场照明组件照射下经透射产生信号光，信号光不会进入第二物镜20中，大角度散射光穿过第二物镜20、光阑片21和第三滤光片22打到第二图像传感器23上，以形成第二暗场成像。

进一步地，第二暗场照明组件包括同轴依次设置的第二暗场照明光源29和第五聚焦透镜30，第二暗场照明光源29位于第五聚焦透镜30的后焦点处，用于将第二暗场照明光源29发出的光聚焦在载物板上。进一步地，第二暗场照明光源29为LED型光源，第二暗场照明光源29发出的光中心波长为600-660nm。

进一步地，在本实施例中，第二荧光照明组件和第二暗场照明组件均位于第一暗场照明组件的一侧设置。

进一步地，第二物镜20的数值孔径NA为0.08～0.2，第二物镜20的光学放大倍率为1x～3x。优选地，第二物镜20的数值孔径NA为0.1～0.15。

具体地，第三检测单元3包括吸光检测照明组件和光电探测器34，吸光检测照明组件与载物台和光电探测器34依次同轴设置，吸光检测照明组件发出第一波长光或第二波长光照射待检测样本，透过样本的光进入光电探测器34检测吸光度。

进一步地，吸光检测照明组件包括同轴依次设置的吸光检测照明光源和第六聚焦透镜33，吸光检测照明光源包括并排设置的用于发出第一波长光的第一光源31和用于发出第二波长光的第二光源32，吸光检测照明光源位于第六聚焦透镜33的焦平面上，用于将第一光源31或第二光源32发出的光聚焦在载物板上。进一步地，第一光源31和第二光源32均为LED型光源，第一光源31发出的光中心波长为520-540nm，第二光源32发出的光中心波长为800-900nm，第一光源31和第二光源32之间的距离小于1mm。

优选地，如图2所示，光电检测装置还包括血液成分检测片4，血液成分检测片4内部形成有3个平行于检测片的腔体，分别为第一腔体41、第二腔体42和第三腔体43；第一腔体41的厚度为0.5-1.0mm，第二腔体42的厚度为100-150μm，第三腔体43的厚度为20-40μm；每一个腔体均具有连通检测片外界的加样口和排气口，所有的加样口和所有的排气口位于检测片的同一面上；第三腔体43与第二腔体42不连通，第三腔体43与第一腔体41不连通。

如此设置的血液成分检测片4，第三腔体43用于注入第一样本，第三腔体43的厚度为20-40μm，该厚度可以最大限度的铺展检测样本，能够避免第一样本中高浓度红细胞和血小板堆叠，进而第一检测单元1对第三腔体43内的第一样本进行成像，能够实现红细胞和血小板的检测。第二腔体42用于注入第二样本，第二腔体42的厚度为100-150μm，该厚度可以铺展检测样本并在避免高浓度白细胞堆叠的同时，提高单位面积内白细胞数量，提高计数检测效率，进而第二检测单元2对第二腔体42内的第二样本进行成像，能够实现白细胞的检测；第一腔体41用于注入第二样本，第一腔体41的厚度为0.5-1.0mm，该厚度有利于提高吸光度信号，能够提高样本对光的吸收率，进而第三检测单元3对第一腔体41内的第二样本进行吸光度检测，能够实现血红蛋白的检测。由此可见，通过设置以上血液成分检测片4，在一个检测片中即可完成白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白的检测，无需针对不同检测项目更换不同检测片。

优选地，如图3所示，光电检测装置还包括人机交互单元5、中央处理单元6和运动模块7，人机交互单元5、运动模块7、第一检测单元1、第二检测单元2和第三检测单元3均与中央处理单元6连接；人机交互单元5，用于用户输入信息和显示血液成分检测结果；运动模块7，用于作为载物台搭载血液成分检测片4并控制血液成分检测片4移动；中央处理单元6，用于根据用户输入的信息控制运动模块7、第一检测单元1、第二检测单元2和第三检测单元3工作，实现血液成分检测。如此，实现自动化血液成分检测。

进一步地，运动模块7上固定安装有用于可拆卸安装血液成分检测片4的检测片支架71。具体地，检测片支架71上设置有与血液成分检测片4外形相匹配的限位槽，在限位槽左右两侧设置有用于压紧血液成分检测片4的弹性压片，限位槽与血液成分检测片4检测区(“检测区”即检测片上分布第一腔体41、第二腔体42和第三腔体43的区域)相对应的位置处为镂空结构。

进一步优选地，检测片为矩形，第二腔体42沿检测片的长度方向延伸，第三腔体43与第二腔体42平行设置，第三腔体43的第一端端面与第二腔体42的第一端端面相平齐，第三腔体43的第二端端面与第二腔体42的第二端端面相平齐，第一腔体41位于第二腔体42的第一端端侧；运动模块7为直线运动模块7，检测片搭载在运动模块7上后，第二腔体42的延伸方向与运动模块7的直线运动路径同向，第一检测单元1位于第三腔体43的运动路径上，第二检测单元2位于第二腔体42的运动路径上，第三检测单元3位于第一腔体41的运动路径上。如此，运动模块7只需进行直线运动，便可实现检测片中各样本的检测，自动化控制简单，结构简单。

实施例3

采用实施例2所述光电检测装置进行血液成分检测的过程为：

(1)将第一样本注入检测片的第三腔体43中，将第二样本注入检测片的第二腔体42和第一腔体41中，获得注入样本的检测片。

(2)将注入样本的检测片安装在检测片支架71上后，人机交互单位接收用户输入的检测指令。

(3)中央控制单元根据用户输入的检测指令，控制运动单元直线运动以带动检测片移动。

(4)运动单元带动检测片直线移动至第三腔体43的第一样本位于第一检测单元1的检测位置后，进行①中央控制单元控制开启明场照明光源15，获取第一图像传感器13的图像数据，之后再关闭明场照明光源15；②中央控制单元控制开启第一荧光照明光源17，获取第一图像传感器13的图像数据，之后再关闭第一荧光照明光源17。然后，中央控制单元控制运动单元直线移动2-3mm，重复①和②的步骤，该过程如此反复执行6-10次，完成对第三腔体43中第一样本的数据获取(如图4所示，为获取的血小板显微图像，如图5所示，为获取的红细胞显微图像)，并同步进行图像处理，获得血小板和红细胞的计数检测结果。其中①和②的步骤顺序可任意调整。

(5)运动单元带动检测片直线移动至第二腔体42的第二样本位于第二检测单元2的检测位置后，进行③中央控制单元控制开启第二荧光光源，获取第二图像传感器23的图像数据，之后再关闭第二荧光光源；④中央控制单元控制开启第一暗场光源，获取第二图像传感器23的图像数据，之后再关闭第一暗场光源；⑤中央控制单元控制开启第二暗场光源，获取第二图像传感器23的图像数据，之后再关闭第二暗场光源。然后，中央控制单元控制运动单元直线移动3-5mm，重复③④⑤的步骤，该过程如此反复执行6-10次，完成对第二腔体42中第二样本的数据获取(如图6所示，为获取的白细胞的荧光显微图像，如图7所示，为获取的白细胞的第一暗场图像，如图8所示，为获取的白细胞的第二暗场图像)，并同步进行图像处理，获得白细胞总数计数和分类计数检测结果。其中③④⑤的步骤顺序可任意调整。

(6)运动单元带动检测片直线移动至第一腔体41的第二样本位于第三检测单元3的检测位置后，进行⑥中央控制单元控制开启第一光源31，获取光电探测器34的信号值P1，之后再关闭第一光源31；⑦中央控制单元控制开启第二光源32，获取光电探测器34的信号值P2，之后再关闭第二光源32。根据P1和P2计算样本的吸光度A1和吸光度A2，并计算血红蛋白浓度值。其中⑥⑦的步骤顺序可任意调整。

需要理解的是，以上对本发明的具体实施例进行的描述只是为了说明本发明的技术路线和特点，其目的在于让本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，但本发明并不限于上述特定实施方式。凡是在本发明权利要求的范围内做出的各种变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种光电检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

将全血样本与第一试剂混合均匀获得第一样本；将第一样本与第二试剂混合均匀获得第二样本；

检测时，包括如下操作：

对第一样本进行明场成像，获得红细胞的显微图像，根据红细胞的显微图像，对全血样本中的红细胞进行检测；对第一样本进行荧光成像，获得血小板的显微图像，根据血小板的显微图像，对全血样本中的血小板进行检测；

对第二样本进行荧光成像，获得白细胞的荧光显微图像，对第二样本进行第一暗场成像，获得第一暗场显微图像，根据白细胞的荧光显微图像和第一暗场显微图像，对全血样本中的白细胞进行检测；第一暗场显微图像为暗场光源与物镜同轴设置所成的显微图像；

采用第一波长的光源对第二样本进行吸光度检测，获得吸光度I；采用第二波长的光源对第二样本进行吸光度检测，获得吸光度Ⅱ；根据吸光度I和吸光度Ⅱ，对全血样本中的血红蛋白进行检测；

第一试剂包含抗凝剂、稀释液和染色剂，第二试剂包括裂解剂。

2.根据权利要求1所述的光电检测方法，其特征在于，

抗凝剂为乙二胺四乙酸EDTA、肝素、草酸钠中的一种或几种的混合物；稀释液为生理盐水、磷酸盐缓冲液PBS、纯净水中的一种或几种的混合物；染色剂为超绿荧光染料GelGreen、碘化丙啶PI、恶唑黄YP1中的一种或几种的混合物，裂解剂为季铵盐、曲拉通、吐温80中的一种或几种的混合物。

3.根据权利要求1所述的光电检测方法，其特征在于，

将第一样本填充在厚度为20-40μm的透明腔室内进行明场成像和荧光成像；将第二样本填充在厚度为100-150μm的透明腔室内进行荧光成像和暗场成像；将第二样本填充在厚度为0.5-1.0mm的透明腔室内进行吸光度检测。

4.根据权利要求1所述的光电检测方法，其特征在于，

对第一样本进行明场成像和/或荧光成像的物镜数值孔径NA为0.2～0.4；对第二样本进行荧光成像和/或第一暗场成像的物镜数值孔径NA为0.08～0.2。

5.根据权利要求1所述的光电检测方法，其特征在于，还包括：

对第二样本进行第二暗场成像，获得第二暗场显微图像；第二暗场显微图像为第二暗场光源的光轴相对物镜轴线偏转50°～70°所成的显微图像；

根据对第二样本的荧光显微图像、第一暗场显微图像和第二暗场显微图像，对全血样本中的白细胞进行检测。

6.一种光电检测装置，其特征在于，

包括载物台、第一检测单元(1)、第二检测单元(2)和第三检测单元(3)；

载物台用于放置待检测样本；

第一检测单元(1)包括明场照明组件、第一荧光照明组件和用于待检测样本成像的第一成像组件；明场照明组件，与载物台和第一成像组件中的第一物镜(11)依次同轴设置，用于照射待检测样本，透过样本的光在第一成像组件中形成明场成像；第一荧光照明组件，与第一物镜(11)和载物台依次同轴设置，或者与第一物镜(11)的轴线成第一设定角度的夹角，用于照射待检测样本，激发样本产生的荧光在第一成像组件中形成第一荧光成像；

第二检测单元(2)包括第一暗场照明组件、第二荧光照明组件和用于待检测样本成像的第二成像组件；第一暗场照明组件，与载物台和第二成像组件中的第二物镜(20)依次同轴设置，用于照射待检测样本，样本产生的散射光在第二成像组件中形成第一暗场成像；第二荧光照明组件，与第二物镜(20)的轴线成第二设定角度的夹角，用于照射待检测样本，激发样本产生的荧光在第二成像组件中形成第二荧光成像；

第三检测单元(3)，用于对待检测样品进行吸光度检测。

7.根据权利要求6所述的光电检测装置，其特征在于，

第一荧光照明组件与第一物镜(11)和载物台依次同轴设置，载物台位于第一物镜(11)的物方焦面上；

第一成像照明组件包括第一物镜(11)、分光片(14)、第一滤光片(12)和第一图像传感器(13)；分光片(14)位于第一荧光照明组件与第一物镜(11)之间并与第一物镜(11)同轴设置，分光片(14)相对第一物镜(11)轴线偏转设置，分光片(14)允许从上至下的第一荧光照明组件发出的光通过，反射从下至上穿过第一物镜(11)的光；第一滤光片(12)和第一图像传感器(13)位于分光片(14)的左侧或右侧，第一图像传感器(13)位于第一物镜(11)的像方焦面上，第一滤光片(12)位于第一物镜(11)与第一图像传感器(13)之间的光路上，用于阻断第一荧光照明组件发出的光。

8.根据权利要求6所述的光电检测装置，其特征在于，

第二成像组件包括同轴依次设置的第二物镜(20)、光阑片(21)、第三滤光片(22)和第二图像传感器(23)；

第二图像传感器(23)位于第二物镜(20)的像方焦面上，载物台位于第二物镜(20)的物方焦面上；

光阑片(21)位于第二物镜(20)与第二图像传感器(23)之间，并且光阑片(21)位于第二物镜(20)的一个焦面上，位于光阑片(21)中心的遮光片用于阻断被第二物镜(20)聚焦的第一暗场照明组件发出的光；

第三滤光片(22)位于第二物镜(20)与第二图像传感器(23)之间的光路上，用于阻断第二荧光照明组件发出的光。

9.根据权利要求6所述的光电检测装置，其特征在于，还包括第二暗场照明组件，

第二暗场照明组件位于载物台远离第二物镜(20)的一侧并与第二物镜(20)的轴线成50°～70°的夹角，用于照射待检测样本，样本产生的散射光在第二成像组件中形成第二暗场成像。

10.根据权利要求6所述的光电检测装置，其特征在于，还包括人机交互单元(5)、中央处理单元(6)和运动模块(7)，人机交互单元(5)、运动模块(7)、第一检测单元(1)、第二检测单元(2)和第三检测单元(3)均与中央处理单元(6)连接；

人机交互单元(5)，用于用户输入信息和显示血液成分检测结果；

运动模块(7)，用于作为载物台搭载血液成分检测片并控制血液成分检测片移动；

中央处理单元(6)，用于根据用户输入的信息控制运动模块(7)、第一检测单元(1)、第二检测单元(2)和第三检测单元(3)工作，实现血液成分检测。

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