CN115873838A - 一种可缓释营养的固定化微生物颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可缓释营养的固定化微生物颗粒及其制备方法，该可缓释营养的固定化微生物颗粒采用聚乙烯醇和海藻酸钠为载体材料制备凝胶溶液，将高效降解菌株和营养物质与灭过菌的凝胶溶液混合，使用玻璃棒搅拌后得到均匀的混合溶液，在无菌环境下将均匀的混合溶液逐滴滴入交联剂中形成4‑5mm的球形颗粒，即得到一种负载营养尿素的具有缓释功能的固定化微生物颗粒。本发明所述的固定化微生物颗粒自身携带营养，可以保证微生物在营养匮乏的污染水体中大量繁殖，且营养物质不易流失，通过缓释的方式起到连续提供营养的作用，从而高效持久地降解水体中的有机污染物。

Description

一种可缓释营养的固定化微生物颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于环保技术领域，尤其是涉及一种可缓释营养的固定化微生物颗粒及其制备方法。

背景技术

在现代工业废水中，存在很多有毒或难生物降解的有机污染物，使得工业废水难以被高效处理，此类废水若不经处理排入水体中，会危害水生生物的繁殖和生存，废水中的某些有机污染物具有致畸或致癌作用，可在食物链中聚积传输，严重威胁到人类的生命安全。如树脂、医药、木材加工、煤气站等工业生产过程中产生的含酚废水，此类废水含酚量高、COD浓度高，难以使用常规的废水处理方法处理，酚类化合物会抑制微生物活性，难以进行生化处理；另外，还有化工厂、焦化厂等工业生产过程中产生的废水，其中含有苯酚、吡啶、喹啉、硝基苯等有毒难降解的有机污染物，典型代表如焦化废水。焦化废水成分复杂、具有较高的毒性和致癌作用，不同焦化厂的不同生产环节产生的废水污染物成分各不相同，具有碳氮比失衡、焦油含量大、可生化性差等特点；除此之外，还有塑料、制革以及油漆等行业在生产和使用甲醛过程中产生的甲醛废水，其浓度可达到200-7000mg/L。2017年，甲醛被世界卫生组织列为一类致癌物，其致癌性和致畸性严重威胁人类健康，因此，甲醛废水的处理成为了废水处理领域的热点问题。

现有废水处理方法主要有物理法、化学法、生物法或组合方法，其中生物法因其具有成本低、工艺简单等优势成为现在废水处理中常用的技术手段之一。但是这类有毒或难生物降解的废水往往会对微生物产生毒害作用，严重抑制微生物活性；此外，传统的生物法在实际应用过程中易造成微生物流失的现象，处理效率低。利用固定化微生物技术能够将微生物附着在固定化载体上，形成一种微环境，将微生物与水体环境隔离开，屏蔽环境中土著微生物的竞争抑制，降低废水中有毒有害污染物的毒害作用，提高微生物存活率，进而提高污水处理效率。此外，微生物被固定在载体上，不易脱落流失，提高了资源利用率、降低了二次污染的风险。因此，利用固定化微生物技术处理此类有毒或难生物降解废水具有十分重要的研究意义。

难生物降解有机废水主要是指可生化性小于0.2但还需继续处理的废水，在对这类废水进行生化处理时需要一定比例的氮源，如含酚废水、焦化废水、甘薯淀粉废水等COD含量高的废水，而生化脱氮反应时则需要一定比例的碳源，因此在废水处理过程需要补充一定的碳氮源来满足生化处理的要求。传统的外部投加营养物质的方法可以为体系中提供足够的营养，但这种方式会造成资源随水流失的问题，导致利用率不高。因此，为减小环境冲击力的影响，防止补充营养的大量流失，对投加方式提出了多元和缓释的要求。缓释技术最早应用于药物领域，后来在废水处理中提供营养源方面也有所应用，缓释技术可以使得营养物质在一段时间内保持一定的有效浓度，提高资源利用率。本发明通过固定化微生物耦合缓释技术制备可缓释营养的固定化微生物颗粒，其携带的营养物质可以调节废水的碳氮比，强化生物法处理这种碳氮比失衡，难降解废水的处理效果。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种可缓释营养的固定化微生物颗粒及其制备方法，以解决菌株在碳氮比失衡水体中营养匮乏、生物活性受抑制，导致降解效果差的技术问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种可缓释营养的固定化微生物颗粒的制备方法，该方法包括如下步骤：

1)利用聚乙烯醇和海藻酸钠制备凝胶溶液；

2)制备待固定化菌株菌悬液；

3)将步骤2)得到的菌悬液加入至步骤1)制得的凝胶溶液中并搅拌，菌液与凝胶溶液体积比为1:4-1:9；

4)之后加入尿素，使其质量浓度为10％-20％(W/V)，继续搅拌至充分混合，搅拌均匀后静置等待至气泡完全消失；

5)将步骤4)得到的混合液先滴加至饱和硼酸溶液和3％氯化钙溶液的混合溶液中进行一次交联，再将交联后的颗粒转移至硫酸钠溶液中二次交联，最后形成4-5mm的球形颗粒；

6)交联完成后使用无菌水清洗颗粒以洗去表面交联剂，然后将颗粒浸泡在无机盐培养基中并放置于4℃冰箱中备用。

进一步，步骤1)的具体方法为：称取聚乙烯醇、海藻酸钠于烧杯中，搅拌粉末使其混合均匀；之后加入去离子水在80℃水浴中搅拌混合均匀，每90mL凝胶溶液中聚乙烯醇与海藻酸钠的质量分别为8g、2g；然后置于高压灭菌锅中，在121℃条件下湿热灭菌20min，完成后取出冷却至室温。

进一步，步骤2)的具体方法为：将待固定化菌株培养至对数生长期，收集菌体；在无菌条件下，用无菌水清洗3次后悬浮于无菌水中，并调节OD600值为2.7，制得待固定化菌株菌悬液。

进一步，步骤3)和4)的搅拌条件为：在室温下搅拌30-40min。

进一步，步骤5)中，第一次交联条件为：4℃下交联2-4小时，第二次交联条件为：4℃下交联22-24h。

进一步，硫酸钠溶液的浓度为0.5mol/L。。

本发明还提供了一种由上所述的制备方法制备的可缓释营养的固定化微生物颗粒。

本发明还提供了一种如上述所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒的应用，其可应用于高碳氮比或氮缺乏的污染水体中，因其自身携带营养物质，通过缓释的方式起到连续提供营养的作用，从而高效持久地降解水体中有机污染物。

进一步，应用于污水处理之前需进行固定化微生物的驯化。

进一步，驯化的方法为：将固定化微生物颗粒在模拟废水中培养驯化，待底物被降解耗尽后，再次加入适量底物，直至降解效果稳定；其中，模拟废水为在无氮无机盐培养基中加入可被微生物降解利用的特异底物所形成的混合溶液。

进一步，无氮无机盐的组成为：NaCl 1.0g/L；K₂HPO₄ 1.0g/L；KH₂PO₄ 0.5g/L；MgSO₄0.2g/L。

相对于现有技术，本发明所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒及其制备方法具有以下优势：

(1)本发明所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒将尿素作为氮源包埋进载体材料中，固定在颗粒结构中，自身携带氮源，通过缓释的方式起到连续提供营养的作用，可以保证微生物在氮源匮乏的污染水体中大量繁殖，从而协同高效持久地降解水体中的污染物；另外，氮源包埋在颗粒中，稳定释放不易产生二次污染，避免直接投加氮源造成的氮源流失，导致利用率低，资源浪费。

(2)本发明在制备固定化微生物颗粒的过程中，经过先后两次交联，首先利用聚乙烯醇和海藻酸钠作为载体形成交联网络结构，将尿素包裹在内部，抑制尿素的流失与挥发，并且形成的结构可以达到缓释尿素的作用，接着通过硫酸钠和聚乙烯醇中羟基及尿素中氨基这些亲水基的交联作用，减小固化颗粒的溶胀，使结构变得较为致密，有效提升了颗粒的机械强度。而且硫酸盐对微生物的毒性较低，可以较高地保证固定化微生物颗粒的生物活性。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实施例1可缓释营养的固定化微生物颗粒表面扫描电镜图片；

图2为实施例1可缓释营养的固定化微生物颗粒内部扫描电镜图片；

图3为实施例1可缓释营养的固定化Rhodococcus pyridinivorans颗粒处理苯酚、吡啶的4h降解率；

图4为实施例1可缓释营养的固定化Rhodococcus pyridinivorans颗粒连续降解前的外貌图片；

图5为实施例1可缓释营养的固定化Rhodococcus pyridinivorans颗粒连续降解20轮后的外貌图片；

图6为实施例1可缓释营养的固定化Rhodococcus pyridinivorans颗粒连续降解前的内部结构扫描电镜图片；

图7为实施例1可缓释营养的固定化Rhodococcus pyridinivorans颗粒连续降解20轮后的内部结构扫描电镜图片；

图8为实施例1可缓释营养的固定化Rhodococcus pyridinivorans颗粒表面尿素释放过程；

图9为实施例2可缓释营养的固定化Pseudomonas sp.颗粒对苯酚的降解过程；

图10为实施例3可缓释营养的固定化Pseudomonas plecoglossicida颗粒对甲醛的降解过程；

图11为对比例4使用硫酸钠溶液首次交联结果图片；

图12为对比例4硫酸钠和氯化钙混合生成沉淀图片；

图13为对比例5不同菌液与凝胶溶液体积比制备的固化颗粒处理100mg/L苯酚所需时间。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

实施例1：

以一株高效降解苯酚、吡啶的菌株红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)为固定化菌株，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC1.1843。具体操作步骤如下：

1.培养Rhodococcus pyridinivorans菌液

培养基种类及组成：(1)液体LB培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，调节pH为7.0-7.2；(2)固体LB培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂粉20.0，调节pH为7.0-7.2。

划活及培养条件：将菌种Rhodococcus pyridinivorans在无菌条件下，采用划线法将其接种到固体LB培养基平板上划活，置于培养箱中于30℃条件下培养。从平板上挑取一单菌落，接种于100mL液体LB培养基中，置于摇床中于30℃，180rpm条件下培养。

2.制备Rhodococcus pyridinivorans菌悬液：收集培养至对数生长期的Rhodococcus pyridinivorans菌液，在无菌条件下，用无菌水清洗3次后悬浮于无菌水中，并调节OD600(600nm处吸光度)值为2.7，制得高效降解菌株菌悬液。

3.制备凝胶溶液：称取8g聚乙烯醇、2g海藻酸钠于250mL烧杯中，搅拌粉末使其混合均匀，加入去离子水定容至90mL，在80℃水浴中搅拌使其混合均匀，之后置于高压灭菌锅中在121℃条件下湿热灭菌20min，灭菌完成后取出常温下冷却至室温。

4.制备交联剂：

(1)制备饱和硼酸溶液和3％氯化钙溶液的混合溶液：

量取100mL饱和硼酸溶液于烧杯中，加入3g CaCl₂搅拌至溶解；

(2)制备0.5mol/L的硫酸钠溶液：

称取7.1g无水硫酸钠于烧杯中，加入去离子水，搅拌溶解，定容至100mL。

5.制备可缓释营养的固定化微生物颗粒：

吸取10mL Rhodococcus pyridinivorans菌悬液加入至凝胶溶液中，使用玻璃棒在室温下搅拌30min，加入10g尿素，继续在室温下搅拌30min，使凝胶溶液、菌悬液、尿素三者混合均匀，搅拌均匀后静置等待至气泡完全消失。使用注射器吸取混合液滴加至饱和硼酸溶液和3％氯化钙溶液的混合溶液中，在4℃条件下交联2h，再将交联后的颗粒转移至硫酸钠溶液中于4℃下二次交联22h，最后形成4-5mm的球形颗粒；交联完成后使用无菌水清洗颗粒3次以洗去表面交联剂，然后将颗粒浸泡在无机盐培养基中并放置于4℃冰箱中备用。

6、可缓释营养的固定化Rhodococcus pyridinivorans应用效果

无氮无机盐培养基组成：NaCl 1.0g/L；K₂HPO₄ 1.0g/L；KH₂PO₄0.5g/L；MgSO₄ 0.2g/L，pH为7.0。

将实施例1制得的具有缓释尿素功能的固定化Rhodococcus pyridinivorans颗粒置于无机盐培养基中，颗粒按照固液比为10％(W/V)投加，加入50mg/L苯酚驯化，在30℃，180rpm的摇床上培养，苯酚被降解完毕后继续加入50mg/L苯酚驯化，待降解性能稳定后，加入100mg/L苯酚继续重复驯化，待驯化稳定后，将颗粒转移至新鲜的无氮无机盐培养基中，进行连续降解实验。

向培养基中加入苯酚、吡啶母液，使体系中苯酚浓度为100mg/L、吡啶浓度为10mg/L。间隔一定时间后取样监测苯酚、吡啶降解率。

同时，对未包埋尿素的固定化颗粒作相同处理，作为对照。

如图3所示，在反应进行4h后，已基本完成底物降解，降解率达到95％以上。经过连续10轮监测，颗粒降解性能保持稳定，且在连续20轮的降解实验中，可以保持在12h内达到完全降解。并且，在连续降解的过程中，除利用颗粒自身携带的尿素为氮源，无任何外加氮源补充。

固定化菌株Rhodococcus pyridinivorans为红球菌，菌落呈红色，在连续降解的过程中，固定化颗粒逐渐变为红色，微生物在固定化颗粒中随着连续降解培养得以大量生长繁殖。连续降解前后固定化颗粒颜色变化如图4、图5所示。

固定化颗粒经过连续缓释、降解培养，内部结构发生了变化，如图6所示，缓释前颗粒内部结构较为光滑、呈多孔结构，微生物在其中附着。缓释后(图7)，颗粒内部呈现较为规则的结构，孔隙较缓释前数目增多、孔径增大，更有利于微生物附着，且微生物负载量较缓释前增多。

尿素在整个培养降解过程中分为表面释放和内部缓释两个方面。

表面释放主要为在制备过程中吸附在颗粒表面的尿素在培养基中的溶解释放过程，图8为每日培养基中尿素释放量，第一天和第二天的尿素释放量较大，总释放量约为60mg左右，从第三天开始，释放量逐渐减少并趋于稳定。同时，在培养和降解过程中，颗粒内部包埋的尿素为缓释过程，是降解过程中氮源的主要提供途径。对颗粒内部的尿素含量进行同步测定，最初颗粒内部尿素含量约为0.3-0.4mg，在培养第5日时，颗粒内部尿素含量约为0.25-0.3mg，释放量约为16％左右，在培养第20天时，颗粒内部尿素含量约为0.06-0.1mg，20日释放量为70％左右，体现为一个缓释的过程。

实施例2

以一株高效降解苯酚的菌株假单胞菌(Pseudomonas sp.)为固定化菌株，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 10463。固定化过程与实施例1相同。

可缓释营养的固定化Pseudomonas sp.应用效果

无氮无机盐培养基组成：NaCl 1.0g/L；K₂HPO₄ 1.0g/L；KH₂PO₄0.5g/L；MgSO₄ 0.2g/L，pH为7.0。

将实施例2制得的具有缓释尿素功能的固定化Pseudomonas sp.颗粒置于无机盐培养基中，与实施例1驯化过程相同驯化颗粒，待驯化稳定后，将颗粒转移至新鲜的无氮无机盐培养基中，加入苯酚母液，使体系中苯酚浓度为200mg/L，进行连续降解实验，间隔一定时间后取样监测苯酚降解率。同时，对未包埋尿素的固定化颗粒作相同处理，作为对照。

结果如图9所示，反应进行8h后，即可完成全部降解，降解率为100％。后续经过连续10轮监测，颗粒降解性能保持稳定，在连续降解的过程中，除利用颗粒自身携带的尿素为氮源，无任何外加氮源补充。

实施例3

以一株甲醛降解菌假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)为固定化菌株，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 1.16111。固定化过程与实施例1相同。

可缓释营养的固定化Pseudomonas plecoglossicida应用效果

无氮无机盐培养基组成：NaCl 1.0g/L；K₂HPO₄ 1.0g/L；KH₂PO₄0.5g/L；MgSO₄ 0.2g/L，调节pH为9.0。

将实施例3制得的具有缓释尿素功能的固定化Pseudomonas plecoglossicida颗粒置于无机盐培养基中，加入甲醛溶液驯化颗粒，待驯化稳定后，将颗粒转移至新鲜的无氮无机盐培养基中，加入甲醛母液，使体系中甲醛浓度为1g/L，进行连续降解实验，间隔一定时间后取样监测甲醛降解率。同时，对未包埋尿素的固定化颗粒作相同处理，作为对照。

结果如图10所示，反应进行48h后，甲醛降解率可达到83％。后续经过连续10轮监测，颗粒降解性能保持稳定，在连续降解的过程中，除利用颗粒自身携带的尿素为氮源，无任何外加氮源补充。

对比例1添加不同种类氮源

在上述实施例1的基础上，改变包埋氮源为氯化铵、硝酸钠两种氮源，添加量与实施例1相同。

交联完成后同样使用无菌水清洗三遍，以洗去表面交联剂，在清洗过程中发现，以氯化铵为氮源的固定化颗粒逐渐出现透明区域，而以硝酸钠、尿素为氮源的固定化颗粒未出现此种情况。后续将固定化颗粒转移至装有无机盐培养的三角瓶中，置入摇床中于30℃、180r/min条件下培养，每日监测颗粒外观变化，结果如表1所示。

表1不同种类氮源制备固定化颗粒对比

以氯化铵和硝酸钠为包埋氮源的固定化颗粒在培养过程中均出现材料脱落和破碎的情况，而以尿素为包埋氮源的固定化颗粒在培养过程中无明显变化、机械强度更好，尿素更适合作为缓释氮源被利用。

对比例2不同尿素添加量

在上述实施例1的基础上改变尿素的添加量，分别为5g、10g(实施例1)、20g、30g，即尿素含量占比约为5％、10％、20％、30％(W/V)，记录制备过程和培养过程中颗粒的性能变化。

表2不同尿素添加量制备固定化颗粒性能对比

如表2所示，添加不同尿素添加量制备的固定化颗粒的颜色和机械强度等物理性能相同，随着尿素添加量的增加，固定化颗粒的缓释时间增加，固定化颗粒可利用时间便增多。同时，颗粒溶胀性也会随之变化，尿素添加量为5％时，溶胀率在5％-10％之间，尿素添加量在10％-20％之间时，颗粒溶胀性略有差别，溶胀率介于15％-25％之间，而当尿素添加量为30％时，溶胀率可达到30％以上，溶胀率大小对颗粒的机械强度造成影响。综合颗粒的缓释天数和溶胀性，当尿素添加量在10％-20％之间时，固定化颗粒的性能最佳。

对比例3不同交联剂

在上述实施例1的基础上，改变交联剂为饱和硼酸溶液和3％氯化钙溶液的混合溶液，交联总时间与交联条件与实施例1相同。将制备完成的颗粒置于无机盐培养基中进行吸水溶胀实验，10天后取出，称重计算溶胀率并记录颗粒特征。

溶胀率:

W1:浸泡后质量(g)；W0:浸泡前质量(g)

表3不同交联剂制备固定化颗粒溶胀率及特征对比

	溶胀率	机械强度	柔韧性	直径变化
					实施例1	21％	强	强	0-1mm
对比例3	103.6％	较强	弱	2-3mm

如表3所示，仅以饱和硼酸溶液和3％氯化钙溶液的混合溶液为交联剂，制备得到的固定化颗粒比较容易溶胀，颗粒直径变化较大，浸泡10天后溶胀率可达到103.6％，即质量为浸泡前的2倍以上。而实施例1制备的固定化颗粒的溶胀率仅为21％，使用本发明所述的二次交联的方法能够更好地减小颗粒的溶胀，减少颗粒内载体和微生物的流失，从而增强颗粒的机械强度。

对比例4交联剂不同使用顺序

在上述实施例1的基础上改变交联剂使用顺序为首先使用硫酸钠溶液或硫酸钠溶液与3％氯化钙溶液的混合溶液。

结果发现，如图11，将步骤4)制得的溶液滴加至硫酸钠溶液中，出现白色絮状物，无法形成颗粒状物质。考虑到硫酸钠溶液中无Ca²⁺，无法与海藻酸钠交联形成网状结构，于是在硫酸钠溶液中加入3％CaCl₂(W/V)，生成了硫酸钙白色沉淀，无法作为交联剂使用，如图12。所以交联剂使用顺序应为首先使用饱和硼酸溶液和3％氯化钙溶液的混合溶液，再使用硫酸钠溶液进行交联。

对比例5菌液与凝胶溶液不同体积比

在上述实施例1的基础上改变凝胶溶液体积为95ml、90mL、80mL、70mL，对应改变添加菌液体积为5mL、10mL、20mL、30mL，即菌液与凝胶溶液体积比为1:19、1:9(实施例1)、1:4、3:7。将制备完成的颗粒驯化培养，同实施例1。待驯化性能稳定后，转移至新鲜无机盐培养基中，加入苯酚母液，使体系中苯酚浓度为100mg/L，定时取样，监测完全降解所需时间。如图13所示，当菌液与凝胶溶液体积比为1:19时，完全降解100mg/L苯酚约需6小时，菌液与凝胶溶液体积比为1:9时，完全降解100mg/L苯酚仅需4小时，且随着比例的增加，未见明显降解优势。为减少成本投入，选择菌液和凝胶溶液体积最佳比例为1:9，更为满足经济效益。

综上所述，本发明所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒将尿素作为氮源包埋进载体材料中，固定在颗粒结构中，自身携带氮源，通过缓释的方式起到连续提供营养的作用，可以保证微生物在氮源匮乏的污染水体中大量繁殖，从而协同高效持久地降解水体中的污染物；另外，氮源包埋在颗粒中，稳定释放不易产生二次污染，避免直接投加氮源造成的氮源流失，导致利用率低，资源浪费。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可缓释营养的固定化微生物颗粒的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

1)利用聚乙烯醇和海藻酸钠制备凝胶溶液；

2)制备待固定化菌株菌悬液；

3)将步骤2)得到的菌悬液加入至步骤1)制得的凝胶溶液中并搅拌，菌液与凝胶溶液体积比为1:4-1:9；

4)之后加入尿素，使其质量浓度为10％-20％(W/V)，继续搅拌至充分混合，搅拌均匀后静置等待至气泡完全消失；

5)将步骤4)得到的混合液先滴加至饱和硼酸溶液和3％氯化钙溶液的混合溶液中进行一次交联，再将交联后的颗粒转移至硫酸钠溶液中二次交联，形成4-5mm的球形颗粒；

6)交联完成后使用无菌水清洗颗粒以洗去表面交联剂，然后将颗粒浸泡在无机盐培养基中并放置于4℃冰箱中备用。

2.根据权利要求1所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒的制备方法，其特征在于：步骤1)的具体方法为：称取聚乙烯醇、海藻酸钠于烧杯中，搅拌粉末使其混合均匀；之后加入去离子水在80℃水浴中搅拌混合均匀，每90mL凝胶溶液中聚乙烯醇与海藻酸钠的质量分别为8g、2g；然后置于高压灭菌锅中，在121℃条件下湿热灭菌20min，完成后取出冷却至室温。

3.根据权利要求1所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒的制备方法，其特征在于：步骤2)的具体方法为：将待固定化菌株培养至对数生长期，收集菌体；在无菌条件下，用无菌水清洗3次后悬浮于无菌水中，并调节OD600值为2.7，制得待固定化菌株菌悬液。

4.根据权利要求1所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒的制备方法，其特征在于：步骤3)和4)的搅拌条件为：在室温下搅拌30-40min。

5.根据权利要求1所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒的制备方法，其特征在于：步骤5)中，第一次交联条件为：4℃下交联2-4小时，第二次交联条件为：4℃下交联22-24h。

6.根据权利要求1所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒的制备方法，其特征在于：硫酸钠溶液的浓度为0.5mol/L。

7.一种由权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的可缓释营养的固定化微生物颗粒。

8.一种如权利要求7所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒的应用，其特征在于：可应用于高碳氮比或氮缺乏的污染水体中，因其自身携带营养物质，通过缓释的方式起到连续提供营养的作用，从而使被包埋菌株能高效持久地降解水体中有机污染物。

9.一种如权利要求8所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒的应用，其特征在于：应用于污水处理之前需进行固定化微生物的驯化。

10.一种如权利要求9所述的可缓释营养的固定化微生物颗粒的应用，其特征在于：驯化的方法为：将固定化微生物颗粒在模拟废水中培养驯化，待底物被降解耗尽后，再次加入适量底物，直至降解效果稳定；其中，模拟废水为在无氮无机盐培养基中加入可被微生物降解利用的特异底物所形成的混合溶液。

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