CN115873276A

CN115873276A - 一种重组胶原蛋白的高效交联剂、交联重组胶原蛋白凝胶及应用

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Publication number: CN115873276A
Application number: CN202211581821.XA
Authority: CN
Inventors: 肖建喜; 王琪; 刘鹏
Original assignee: Lanzhou Biological Technology Development Co ltd; Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou Biological Technology Development Co ltd; Lanzhou University
Priority date: 2022-12-09
Filing date: 2022-12-09
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种重组胶原蛋白的高效交联剂、交联重组胶原蛋白水凝胶及应用，具体提供了阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)在交联重组蛋白水凝胶中作为交联剂的新用途，所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，本发明所述的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的方法，制备得到的水凝胶具有高生物相容性、良好的机械性能和可注射性能、以及显著增强的抗酶解能力；本发明所述方法简单方便，易于操作，可应用于植入剂、人工皮肤、止血海绵、支架材料、医疗器械等领域，应用前景广阔。

Description

一种重组胶原蛋白的高效交联剂、交联重组胶原蛋白凝胶及应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种重组胶原蛋白的高效交联剂、交联重组胶原蛋白凝胶及应用。

背景技术

作为皮肤中关键的结构蛋白，胶原蛋白的含量随着年龄的增加逐步降低，被认为是皮肤衰老的重要诱因。胶原蛋白植入剂被发现可以有效改善皮肤皱纹，提升皮肤的健康状态，在皮肤医学中的应用越来越广泛。胶原蛋白目前主要通过动物组织提取或基因重组表达来制备。重组胶原蛋白具有质量易控、分子量均一、无病毒传播隐患等优点，因此备受关注。

相比动物提取胶原蛋白，重组胶原蛋白的序列差异很大，一般具有显著改善的水溶性，但是其形成凝胶的能力大幅削弱。因此，化学交联被尝试用来制备重组胶原蛋白水凝胶。中国专利CN114404667A公开了一种采用戊二醛交联重组胶原蛋白的方法；中国专利CN114470333A中公开了一种采用1，4-丁二醇二缩水甘油醚交联重组胶原蛋白的方法。这些专利中戊二醛等交联剂的残留会产生细胞毒性问题，亟需开发高生物相容性、长持久性的交联重组胶原蛋白水凝胶。

在发明人的前期研究中，研制得到了一种用于皮肤光损伤修复的重组胶原蛋白产品(CN113520899B)，所述的重组胶原蛋白对紫外损伤的皮肤具有良好的修复作用。所述重组胶原蛋白具有特别优异的水溶性，其无法自组装形成凝胶。为了制备所述重组胶原蛋白的水凝胶，拓宽其应用范围，发明人在上述重组胶原蛋白中加入戊二醛等交联剂进行交联，发现无法制备重组胶原蛋白水凝胶。

针对上述技术问题，发明人意外的发现了一种重组胶原蛋白的高效交联剂、交联重组胶原蛋白水凝胶及应用。本发明提供了阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)在交联重组蛋白水凝胶中作为交联剂的新用途；本发明所述的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的方法，制备得到的水凝胶具有高生物相容性、良好的机械性能和可注射性能、以及显著增强的抗酶解能力；本发明所述方法简单方便，易于操作，可应用于植入剂、人工皮肤、止血海绵、支架材料、医疗器械等领域。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的首要目的在于提供阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)作为重组胶原蛋白交联剂的应用，所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。具体如下：

GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTG

LAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGE

PGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDG

QNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP。

本发明的第二目的是提供一种重组胶原蛋白的交联方法，用交联剂阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)交联重组胶原蛋白，所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述的交联剂阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)的浓度为0.02％v/v-1％v/v。

优选的，所述的重组胶原蛋白溶解于0.02M PBS缓冲溶液。

优选的，所述的交联剂的反应温度为4-37℃，反应时间为0.1-24hrs。

本发明的第三目的是提供一种重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，将阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)与重组胶原蛋白溶液混合反应，所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明的第四目的是提供通过所述的制备方法制备得到的交联重组胶原蛋白水凝胶。

本发明的第五目的是提供通过所述的制备方法制备得到的交联重组胶原蛋白水凝胶植入剂。

本发明的第六目的是提供所述的交联重组胶原蛋白水凝胶在制备植入剂、人工皮肤、止血海绵、支架材料、医疗器械中的应用。

本发明的有益效果是：①本发明提供了阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)在交联重组蛋白水凝胶中作为交联剂的新用途，所述的THPC可以交联重组胶原蛋白，制备得到良好机械性能的重组胶原蛋白水凝胶；②本发明所述的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的方法，制备得到的重组胶原蛋白凝胶具有显著增强的抗酶解能力，并具有良好的可注射性能；③本发明所述的THPC交联重组胶原蛋白凝胶具有高生物相容性和生物活性，可以显著促进成纤维细胞的增殖；④本发明所述的THPC交联重组胶原蛋白的条件温和，效率高，用量少，交联时间短；⑤本发明所述方法制备的THPC交联重组胶原蛋白凝胶，可用于植入剂、人工皮肤、止血海绵、支架材料、医疗器械等领域，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1本发明实施例1制备的重组胶原蛋白的圆二色谱；

图2THPC不同添加量交联重组胶原蛋水凝胶的流变力学表征图；

注：图2右下角的实物图中，从左到右各组的浓度依次为：blank，0.005％v/v，0.01％v/v，0.02％v/v，0.05％v/v，0.1％v/v，0.2％v/v，0.25％v/v，0.4％v/v，0.5％v/v，0.6％v/v，1％v/v；在流变图中，各组的浓度为blank，0.02％v/v，0.05％v/v，0.1％v/v，0.2％v/v，0.25％v/v，0.4％v/v，0.5％v/v，0.6％v/v，1％v/v；

图3THPC不同温度交联重组胶原蛋白水凝胶的实物图；

图4交联重组胶原蛋白实物对比图；

图5THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的扫描电镜图；

图6THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的推挤力实验图；

图7THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的黏度表征图；

图8THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的酶解实验图；

图9THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的细胞毒性及增殖实验图；

图10THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的活细胞/死细胞染色图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。

应当说明的是，本发明所使用的重组胶原蛋白，公开于发明专利CN113520899B一种用于皮肤光损伤修复的重组胶原蛋白产品。

实施例一、重组胶原蛋白的制备与表征

1.重组胶原蛋白的制备

采用如SEQ ID No.1所示的重组胶原蛋白的氨基酸序列合成重组胶原蛋白；合成编码上述氨基酸序列的核苷酸序列，构建对应的表达质粒，然后通过DNA测序确认质粒成功合成后再将质粒转化为大肠杆菌BL21-DE3菌株，将转化成功的克隆菌株加入甘油后于-80℃保存；最后用IPTG诱导培养微量冻存的重组胶原蛋白表达菌株，并用胰蛋白酶处理后，纯化得到重组胶原蛋白，冻干保存。

2.重组胶原蛋白的圆二色谱表征

将实施例一制备的重组胶原蛋白溶于pH 7.0的PBS缓冲溶液，使其终浓度为1mg/mL。将参数设置为：扫描波长210-260nm，扫描温度4℃，波长步进为0.5nm，平均时间0.5s，用圆二色谱仪对上述重组胶原蛋白溶液进行光谱扫描。

结果如图1所示，实施例一制备的重组胶原蛋白在220nm附近呈现特征性的吸收峰，表明其形成胶原蛋白经典的三螺旋结构。

实施例二、不同添加量THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的制备与表征

1.THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的制备

将冻干的重组胶原蛋白溶解在0.02M PBS缓冲溶液(pH7.4)中，使重组胶原蛋白浓度为10mg/mL，向其中分别加入0.005％v/v-1％v/v的THPC溶液，在室温下交联1h，即得到THPC交联重组胶原蛋白水凝胶。

2.THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的流变力学表征

取实施例二制备的样品，THPC的添加量小于0.02％v/v时，样品呈溶液状态，未形成凝胶；THPC的添加量在0.02％-1％v/v之间时，样品呈水凝胶状态。取添加量为0.02％v/v-1％v/v的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶及重组胶原蛋白，将其置于流变仪的样品台上，固定流变仪的扫描频率，测试凝胶随应变变化的储存模量G’(Pa)及损耗模量G”(Pa)。

实验结果如图2所示，交联前储存模量G’(Pa)及损耗模量G”(Pa)为116Pa和15Pa；随着THPC添加量的增加，THPC交联的重组蛋白水凝胶的储能模量分别为145Pa(0.02％v/v)、249Pa(0.05％v/v)、427Pa(0.1％v/v)、474Pa(0.2％v/v)、527Pa(0.25％v/v)、539Pa(0.4％v/v)、614Pa(0.5％v/v)、615Pa(0.6％v/v)和591Pa(1％v/v)；THPC交联的重组蛋白水凝胶的损耗模量分别为14Pa(0.02％v/v)、23Pa(0.05％v/v)、26Pa(0.1％v/v)、30Pa(0.2％v/v)、33Pa(0.25％v/v)、32Pa(0.4％v/v)、32Pa(0.5％v/v)、30Pa(0.6％v/v)和27Pa(1％v/v)。结果表明，THPC交联成功制备良好机械强度的重组胶原蛋白水凝胶。

对比例一1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联重组胶原蛋白的制备

实施例一制备的重组胶原蛋白，溶解在0.02M PBS缓冲溶液(pH7.4)中，浓度为10mg/mL，向其中加入0.5％v/v的EDC/NHS溶液，25℃交联1h，即得到EDC/NHS交联重组胶原蛋白。

对比例二1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联重组胶原蛋白的制备

实施例一制备的重组胶原蛋白，溶解在0.02M PBS缓冲溶液(pH7.4)中，浓度为10mg/mL，向其中加入0.5％v/v的BDDE溶液，25℃交联1h，BDDE即得到交联重组胶原蛋白。

对比例三戊二醛(GA)交联重组胶原蛋白的制备

实施例一制备的重组胶原蛋白，溶解在0.02M PBS缓冲溶液(pH7.4)中，浓度为10mg/mL，向其中加入0.5％v/v的GA溶液，25℃交联1h，即得到GA交联重组胶原蛋白。

后续实验采用实施例二中0.5％v/v的THPC交联重组胶原蛋白，25℃交联1h，即得到THPC交联重组胶原蛋白水凝胶。

将未交联、对比例一、二、三及实施例二交联重组胶原蛋白的样品进行拍照，如图3所示，EDC/NHS、GA和BDDE交联重组胶原蛋白均未形成水凝胶，而THPC交联重组胶原蛋白制备得到水凝胶。结果表明，THPC是一种高效的重组胶原蛋白交联剂，可以形成重组胶原蛋白水凝胶。

实施例三、不同温度THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的制备

1.4℃交联

实施例一制备的重组胶原蛋白，溶解在0.02M PBS缓冲溶液(pH7.4)中，浓度为10mg/mL，向其中加入0.5％v/v的THPC溶液，4℃交联1h，即得到THPC交联重组胶原蛋白。

2.37℃交联

实施例一制备的重组胶原蛋白，溶解在0.02M PBS缓冲溶液(pH7.4)中，浓度为10mg/mL，向其中加入0.5％v/v的THPC溶液，37℃交联1h，即得到THPC交联重组胶原蛋白。

取分别在4℃、37℃进行THPC交联重组胶原蛋白的样品进行拍照，如图4所示，4℃、37℃均形成水凝胶。结果表明，THPC是一种高效的重组胶原蛋白交联剂，可以在较宽的交联温度范围内形成水凝胶。

实施例四、THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的表征

1.扫描电镜表征

取实施例二制备THPC交联重组胶原蛋白水凝胶样品，将其切片取样，喷金后进行SEM表征。

实验结果如图5所示，THPC交联重组胶原蛋白水凝胶形成均匀分布的三维网状结构，为细胞生长提供有益环境。

2.可注射性能测定

取实施例二制备的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶置于1mL无菌注射器中，将注射器固定在通针仪的样品台上，挤出速度为10mm/min，进行推挤力测试。

实验结果如图6所示，实施例三制备的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的最大的推挤力为2.2N，最小的推挤力为1.1N，平均推挤力为1.5N，表明THPC交联重组胶原蛋白水凝胶具有优异的可注射性能。

3.黏度测定

取实施例二制备的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶及未交联的重组胶原蛋白样品，将其分别置于流变仪的样品台上测试剪切速率为0.001-1000s^-1黏度的变化，实验结果如图7所示，在剪切速率为0.001-1000s^-1范围内，THPC交联重组胶原蛋白水凝胶黏度远高于未交联重组胶原蛋白，良好黏度的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶将保证其植入后不易发生位移，植入效果好。

4.酶解实验测定

取未交联的重组胶原蛋白、实施例二制备的THPC交联胶原蛋白冻干后的样品，分别称取2mg，记录初始干重(约2mg)。配制胶原酶溶于缓冲溶液(TES，1mM CaCl₂，pH 7.4)，胶原酶浓度0.5U/mL，37℃，220rpm下进行酶解实验，酶解一定时间后将样品水洗后离心，将离心后得到的样品冻干后称重，计算酶解率。

AW％＝(Wo-W)/W×100％

其中：AW％：酶解率；Wo：酶解前样品初始重量；W：酶解后样品的重量。

实验结果如图8所示，未交联重组胶原蛋白在第1天的酶解率即达100％；实施例二制备的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶在第1天，第4天，第7天酶解率分别为51.2％、59.1％、63.7％。结果表明，THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的抗酶解能力显著增强。

5.细胞毒性及增殖实验

为了研究重组胶原蛋白、THPC交联重组胶原蛋白的细胞毒性及增殖情况，HFF-1人成纤维细胞在37℃、5％CO₂条件下用含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)双抗的高糖DMEM培养基培养。将重组胶原蛋白、实施例二制备的THPC交联重组胶原蛋白冻干的样品置于DMEM高糖培养液中，37℃浸泡72h制备浸提液。用0.25％(w/w)胰蛋白酶消化细胞，以每孔7000的密度播种于96孔板中，在37℃和5％CO₂中孵育24h，然后取100μL不同样品加入对应样品孔中分别孵育24h，48h，72h后分别加入10μL CCK8，37℃孵育1-3h。基础培养基为空白对照(n＝6)，读取450nm处的OD值。

细胞存活率计算如下:细胞存活率(％)＝(A-C)/(B-C)x 100％。

A：不同样品的OD值；B：阳性对照组OD值；C：空白对照组OD值。

实验结果如图9所示，24h、48h、72h时，重组胶原蛋白的细胞存活率分别为97％、99％、100％，THPC交联重组胶原蛋白的细胞存活率分别为102％、105％、106％。结果表明，THPC交联重组胶原蛋白水凝胶无细胞毒性，具有良好的生物相容性。

6.细胞存活实验

为了研究重组胶原蛋白、THPC交联重组胶原蛋白的细胞存活情况，HFF-1人成纤维细胞在37℃、5％CO₂条件下用含10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素的高糖DMEM培养基培养。将重组胶原蛋白、实施例二THPC交联重组胶原蛋白水凝胶冻干的样品置于DMEM高糖培养液中，37℃浸泡72h浸提液。用0.25％(w/w)胰蛋白酶消化细胞，以每孔40000的密度接种于激光共聚焦培养皿中，在37℃和5％CO₂中孵育24h，然后用取100μL不同样品加入对应样品孔中分别孵育24h，72h后用CA/PI进行染色后用奥林巴斯激光共聚焦拍照。

实验结果如图10所示，成纤维细胞在重组胶原蛋白和THPC交联重组胶原蛋白水凝胶中，24h和72h的存活情况良好。结果表明，THPC交联重组胶原蛋白水凝胶为成纤维细胞提供了良好的生长环境。

综上所述，本发明提供了阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)在交联重组蛋白水凝胶中作为交联剂的新用途，所述的THPC可以交联重组胶原蛋白，制备得到良好机械性能的重组胶原蛋白水凝胶；本发明所述的THPC交联重组胶原蛋白水凝胶的方法，制备得到的重组胶原蛋白凝胶具有显著增强的抗酶解能力，并具有良好的可注射性能；所述的THPC交联重组胶原蛋白凝胶具有高生物相容性和生物活性，可以显著促进成纤维细胞的增殖；本发明所述的THPC交联重组胶原蛋白的条件温和，效率高，用量少，交联时间短；所述方法制备的THPC交联重组胶原蛋白凝胶，可用于植入剂、人工皮肤、止血海绵、支架材料、医疗器械等领域，具有广泛的应用前景。

Claims

1.阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)作为重组胶原蛋白交联剂的应用，其特征在于，所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种重组胶原蛋白的交联方法，其特征在于，用交联剂阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)交联重组胶原蛋白，所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求2所述的交联方法，其特征在于，所述的交联剂阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)的浓度为0.02％v/v-1％v/v。

4.如权利要求2所述的交联方法，其特征在于，所述的重组胶原蛋白溶解于0.02M PBS缓冲溶液。

5.如权利要求2所述的交联方法，其特征在于，所述的交联剂的反应温度为4-37℃，反应时间为0.1-24hrs。

6.一种重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，将阳离子四(羟甲基)氯化磷(THPC)与重组胶原蛋白溶液混合反应，所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

7.通过权利要求6所述的制备方法制备得到的交联重组胶原蛋白水凝胶。

8.通过权利要求6所述的制备方法制备得到的交联重组胶原蛋白水凝胶植入剂。

9.如权利要求7所述的交联重组胶原蛋白水凝胶在制备植入剂、人工皮肤、止血海绵、支架材料、医疗器械中的应用。