CN115868494B - 一种含有细胞穿透肽的香稻增香剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有细胞穿透肽的香稻增香剂及其制备方法和应用，涉及水稻栽培技术领域，包括纳米脂质体和水，所述纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂、表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5‑氨基乙酰丙酸和γ‑氨基丁酸；合成卵磷脂是由二油酰基磷脂酰乙醇胺‑聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物和/或1‑棕榈酰基‑2‑油酰基磷脂酰胆碱组成。本发明还公开了香稻增香剂的制备方法和应用方法，利用了全新的聚合制备方法，制备更简便，提高了香稻增香剂纳米脂质体的稳定性；制备过程无需添加有机溶剂，对环境友好，使用该香稻增香剂进行人工喷雾或飞防喷施时，对香稻的增香增产效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及水稻栽培技术领域，特别涉及一种含有细胞穿透肽的香稻增香剂及其制备方法和应用。
背景技术
纳米脂质体是一种人工制造的纳米囊泡，囊泡的膜层与细胞膜的结构相似，均为磷脂双分子层结构。根据囊泡膜层的数量分为只有一层膜的单室脂质体和拥有多层膜，且层层包裹结构的多室脂质体。囊泡的内核为水，可以容纳亲水分子；膜层(磷脂双分子层)内部为疏水区域，可以容纳疏水分子；膜层(磷脂双分子层)表面为双亲区域，可以容纳双亲分子。如果将纳米脂质体的粒径控制在30-150nm，则这种纳米脂质体的结构与粒径，与细胞分泌的外泌体的结构与粒径极其相似，可以与外泌体共用生物体内的运输途径，将纳米脂质体包裹的物质高效、快速地输送到生物体内的各处；还可以利用外泌体的跨膜机制将纳米脂质体包裹的物质运输到细胞内，进一步提高包裹物质的运输效率和速度。但是，目前制造纳米脂质体的方法较为复杂，还需要用到有机溶剂，对环境不友好，且对存放条件要求高，一般需要低温冷链保存，因此，不可能将原有纳米脂质体的制备技术用于农业产品的生产。
细胞穿透肽是一类功能性多肽，一般含有5-50个氨基酸残基。其中精氨酸的含量较高，一般在20％～100％之间。因此，细胞穿透肽一般带正电，能够与带负电的细胞膜通过静电吸附，进而与膜上的蛋白相互作用，诱导细胞的胞吞与胞饮作用，协助与之相连的外源物质进入。将带负电荷的纳米脂质体与带正电荷的细胞穿透肽进行混合，二者通过静电吸附形成一体，能够提高纳米脂质体通过胞吞与胞饮作用进入细胞的速度。
香稻的主要香味物质为2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)，其具有独特的香味，能够促进食欲。2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的合成起始物为鸟氨酸、脯氨酸和谷氨酸。通过喷施鸟氨酸、脯氨酸和谷氨酸、锌肥、γ-氨基丁酸和5-氨基乙酰丙酸均能提高2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)在稻米中的合成量。但是，在施用锌肥、γ-氨基丁酸和5-氨基乙酰丙酸等外加增香物质时，由于外加增香物质本身水溶性较强，而水稻处于破口期或齐穗期，叶片及穗粒的表面蜡质层较厚，导致鸟氨酸、脯氨酸、谷氨酸、锌肥、γ-氨基丁酸和5-氨基乙酰丙酸的吸收率极低，只有极少部分能进入植物体内，绝大部分残留在环境中，造成巨大浪费和环境污染。
目前，市场中的香稻增香剂只是将鸟氨酸、脯氨酸、谷氨酸、锌肥、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸或相关类似物等原料简单混合，制成粉剂销售，使用不方便，伴有粉尘污染，对操作人员不安全；某些增香剂还含有对人体有害的成分(例如氯化锌)；原料用量大、利用率低，不能无人机施用，容易出现肥害等弊端，主要是锌肥用量过高，造成的叶片灼伤。
综上所述，开发一款含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体制剂，使其能够包裹增香物质，快速进入植物体内，进而快速进入细胞内发挥作用，从而提高增香与增产效果，同时兼具对使用者安全，对环境友好，将具有广阔的市场前景。
发明内容
针对以上现有技术的不足和现存的问题，本发明提供了一种含有细胞穿透肽的香稻增香剂及其制备方法和应用，利用纳米脂质体的特殊结构，以及脂质体包裹技术，将锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸等水溶性物质包裹在纳米脂质体的水性内核中，在细胞穿透肽的协同配合下，可以轻松进入植物体细胞内发挥作用，极大地提高了增香增产的效果，减少环境污染。具体通过以下技术实现。
一种含有细胞穿透肽的香稻增香剂，其特征在于，包括纳米脂质体和水，所述纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂、表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，且质量比为(4-8):(2-4):(0.05-0.15):(0.2-0.8):(10-30):(10-20):(5-10):(5-10)；所述水的质量为表面活性剂的5-20倍；
所述合成卵磷脂是由二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(DOPE-mPEO-nPPO)和/或1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱组成；所述二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(DOPE-mPEO-nPPO)中，聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(mPEO-nPPO)的分子量为2000-5000。
上述合成卵磷脂中，二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(DOPE-mPEO-nPPO)可以通过化学合成的方式在聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物的末端引入羧基，再通过与二油酰基磷脂酰乙醇胺中的氨基形成肽键的方式获得，上述合成方法为有机化学的基本合成技术；具体可以参见《有机化学：结构与功能》(《Organic Chemistry:Structure and Function》，ISBN 978-7-122-36263-6，(美)彼得·C.福尔哈特、(美)尼尔·E.肖尔著，戴立信等译，化学工业出版社，2020.7，第923-924、1301页)，也可以找供应商采购获得；1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱可以通过阿拉丁购买获得；
优选地，所述纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂、表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，且质量比为6:3:0.1:0.5:20:15:7.5:7.5，所述水的质量为表面活性剂的13.5倍。
优选地，所述表面活性剂为吐温-80、司盘-80、脂肪醇聚氧乙烯醚，聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物中的至少一种。
优选地，所述锌肥为硫酸锌、柠檬酸锌、EDTA螯合锌中的至少一种。
更优选地，所述锌肥为硫酸锌、柠檬酸锌和EDTA螯合锌，且质量比为(1-3):(1-3):(1-3)。
本发明所使用的细胞穿透肽，为本领域可以在市面上购买到的商品，只要能够实现细胞穿透肽的基本功能，就能够用于本申请中。
本发明还提供了一种上述含有细胞穿透肽的香稻增香剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、称取合成卵磷脂、表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸和水；
S2、40-60℃下，在水中边搅拌(慢速搅拌，例如24-36r/min)边加入表面活性剂和合成卵磷脂；通入纯CO2至环境正压为0.11-0.13MPa，升温至95℃，均质(常规均质方法，例如2500-2900r/min)直至混合液呈成半透明状，停止通入纯CO2和均质；
S3、按10-15℃/s的速度将混合液降温至45-50℃，在恒温条件下，边搅拌(慢速搅拌，例如24-36r/min)边加入偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐，再继续恒温搅拌8-12h；
上述降温过程，可以使用电动薄膜泵将反应釜中的液体以1L/min的速度泵入板式热交换器中，保证液体的降温速度为10℃/s以上。只要能够达到快速降温目的的方法都可以用于本发明中。
S4、在搅拌条件下冷却混合液至室温，依次加入锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，继续搅拌直至完全溶解；最后加入细胞穿透肽，继续搅拌100-120min，得到含有细胞穿透肽的香稻增香剂。
优选地，上述含有细胞穿透肽的香稻增香剂的制备方法中，步骤S3为按15℃/s的速度将混合液降温至50℃，在恒温条件下，边搅拌边加入偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐，再继续恒温搅拌12h。
本发明所提供的含有细胞穿透肽的香稻增香剂，不需要使用超高压均质机或微射流均质机等昂贵设备，通过通入纯净CO2气体，使混合液中充满微小气泡，气泡产生的疏水区域使合成卵磷脂能够整齐的排列在气泡的界面上，在表面活性剂以及均质、搅拌操作的协助下，能够快速形成纳米级的脂质体；随后通过急速降温的方式(95℃急速降至50℃)，表面活性剂(例如聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、吐温-80等)与二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(DOPE-mPEO-nPPO)中所含的聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物分子通过氢键相互作用，塑形成磷脂双分子层的外部骨架。更重要的是，在偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐的催化作用下，合成卵磷脂中的油酰基上的双键被打开，分子间相互键合形成磷脂双分子层的内部骨架。由此，纳米脂质体形成了包含内部和外部的双重骨架，使含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体结构稳定性极佳，对温度和pH值的变化不敏感。
本发明所使用的细胞穿透肽(CPPs)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1-5的任一项所示，也可以是这几种氨基酸序列的组合。
本发明还提供了一种上述含有细胞穿透肽的香稻增香剂的应用，具体可应用于农业领域，作为香稻增香、增产的专用制剂。
进一步地，上述含有细胞穿透肽的香稻增香剂在作为香稻增香和增产的制剂时，可采用喷雾(例如采用常规的人工喷雾)或飞防(例如采用普通农用飞机或新式无人机)的方式施用香稻增香剂。
更进一步地，上述香稻增香剂在采用喷雾的方式时，在香稻的破口期和齐穗期按照1:(300-600)的体积比兑水制成香稻增香剂工作液，每次分别按15-30L/亩喷施香稻增香剂工作液；
或者在齐穗期按照1:(150-300)的体积比兑水制成香稻增香剂工作液，按15-30L/亩喷施香稻增香剂工作液。
更进一步地，上述香稻增香剂在采用飞防的方式时，在香稻的破口期和齐穗期按照1:(20-40)的体积比兑水制成香稻增香剂工作液，每次分别按1-2L/亩喷施香稻增香剂工作液；
或者在齐穗期按照1:(10-20)的体积比兑水制成香稻增香剂工作液，按1-2L/亩一次性喷施香稻增香剂工作液。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
1、本发明利用合成卵磷脂、表面活性剂以及偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐的相互作用下，在纳米脂质体的内部和外部形成两层骨架结构，纳米脂质体的结构稳定性极佳，对温度和pH值的变化不敏感，显著延长了香稻增香剂的使用有效期；
2、本发明提供的香稻增香剂，不需要使用有机溶剂作为合成卵磷脂的溶剂，消除了有机溶剂的环境污染；不含有有毒的氯化锌，对生产人员和使用者安全；喷雾或飞防时不产生肥害，对水稻更安全；
3、本发明提供的含有细胞穿透肽的香稻增香剂在喷施后，所含有的锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸在喷施后30min完全吸收，因此即使喷施后30min下雨，也对增香和增产效果无影响，利用率高，施用时间更灵活，施用窗口期多；相较传统增香剂需要施用后24h不下雨，具有重大优势；相较不含有细胞穿透肽及纳米脂质体的增香剂，增香效果提高了3-5倍；
4、本发明提供的含有细胞穿透肽的香稻增香剂，可以进行飞防施用，降低了人工成本；减少了在香稻破口期或齐穗期人工喷施时踩压水稻造成的额外减产损失。
附图说明
图1为实施例1制备的香稻增香剂经过磷钨酸负染后的透射电镜图片；
图2为实施例1制备的香稻增香剂通过激光动态光散射方法测得粒径分布情况；
图3为对比例2制备的香稻增香剂通过激光动态光散射方法测得粒径分布情况；
图4为对比例8制备的香稻增香剂通过激光动态光散射方法测得粒径分布情况。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例和对比例所提供的香稻增香剂，如果未做特殊说明，均按照以下默认的方法制备而成：
S1、称取合成卵磷脂、表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸和水；
S2、在反应釜中加入水，加热至50℃，36r/min边搅拌边加入表面活性剂和合成卵磷脂；从反应釜底部通入纯CO2，调节排气阀使反应釜内维持微正压为0.11-0.13MPa，升温至95℃，2900r/min均质直至反应釜内的混合液呈成澄清半透明状，停止通入纯CO2和停止均质；
S3、使用板式换热器，按15℃/s的速度将反应釜中的混合液急速降温至50℃，在恒温条件下，36r/min边搅拌边加入偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐，再继续恒温搅拌12h，关闭恒温系统待用；
S4、在36r/min搅拌条件下冷却混合液至室温，依次加入锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，继续搅拌直至所有物料完全溶解；最后加入细胞穿透肽，继续搅拌100min，得到含有细胞穿透肽的香稻增香剂。
以下实施例和对比例在制备香稻增香剂时，如果未做特殊说明，所使用的合成卵磷脂均按照以下默认方法制备而成：可以通过化学合成的方式在聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物的末端引入羧基，再通过与二油酰基磷脂酰乙醇胺中的氨基形成肽键的方式获得，上述合成方法为有机化学的基本合成技术；具体可以参见《有机化学：结构与功能》(《OrganicChemistry:Structure and Function》，ISBN 978-7-122-36263-6，(美)彼得·C.福尔哈特、(美)尼尔·E.肖尔著，戴立信等译，化学工业出版社，2020.7，第923-924、1301页)；1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱可以通过阿拉丁购买获得。
以下实施例和对比例中，所使用的细胞穿透肽采购自生工生物工程(上海)股份有限公司，氨基酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，按照质量比3:1混合使用；表面活性剂选用吐温-80和和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物，采购自优索公司，按照质量比2：1混合使用；偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐采购自都莱公司。
实施例1
本实施例提供的香稻增香剂，包括纳米脂质体和水；纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂60g、表面活性剂30g、细胞穿透肽1g、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐5g、锌肥200g、脯氨酸150g、5-氨基乙酰丙酸75g和γ-氨基丁酸75g，即质量比为6:3:0.1:0.5:20:15:7.5:7.5；水的用量为404g，约为表面活性剂质量的13.46倍。锌肥由质量比为1:3:1的硫酸锌、柠檬酸锌、EDTA螯合锌组成。
对本实施例制备的香稻增香剂进行电镜检测：将香稻增香剂滴加到透射电镜的铜网上，滴加1滴1％的磷钨酸。室温干燥后进行检测。检测的结果如图1所示，制备的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体粒径约100nm，颗粒周围有一圈黑色阴影，与脂质体的结构特征一致。
实施例2
本实施例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的唯一区别在于，纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂40g、表面活性剂40g、细胞穿透肽0.5g、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐8g、锌肥100g、脯氨酸200g、5-氨基乙酰丙酸50g和γ-氨基丁酸100g，即质量比为4:4:0.05:0.8:10:20:5:10；水的用量为461.5g，约为表面活性剂质量的11.54倍。锌肥与实施例1相同，均由质量比1:3:1的硫酸锌、柠檬酸锌、EDTA螯合锌组成。
实施例3
本实施例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的唯一区别在于，纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂80g、表面活性剂20g、细胞穿透肽1.5g、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐2g、锌肥300g、脯氨酸100g、5-氨基乙酰丙酸100g和γ-氨基丁酸50g，即质量比为8:2:0.15:0.2:30:10:10:5；水的用量为346.5g，为表面活性剂质量的17.325倍。锌肥由质量比为3:1:3的硫酸锌、柠檬酸锌、EDTA螯合锌组成。
对比例1
本对比例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的区别在于，将其纳米脂质体的原料，以及增香剂制备方法中的合成卵磷脂，替换成大豆卵磷脂。其他技术内容与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的区别在于，在其纳米脂质体的原料，以及增香剂制备方法中，不含有细胞穿透肽，略微增加水的用量；即纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂60g、表面活性剂30g、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐5g、锌肥200g、脯氨酸150g、5-氨基乙酰丙酸75g和γ-氨基丁酸75g，水的用量为405g。
本对比例提供的香稻增香剂的制备方法中，步骤S1无需称取细胞穿透肽；步骤S4具体为：在搅拌条件下冷却混合液至室温，依次加入锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，继续搅拌直至所有物料完全溶解；继续搅拌100min，得到含有细胞穿透肽的香稻增香剂。其他步骤与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的区别在于，在其纳米脂质体的原料，以及增香剂制备方法中，使用过硫酸铵水溶液(质量分数10％)和N,N,N',N'-四甲基乙二胺代替偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐；即纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂60g、表面活性剂30g、过硫酸铵溶液(质量分数10％)3g、N,N,N',N'-四甲基乙二胺0.3g、锌肥200g、脯氨酸150g、5-氨基乙酰丙酸75g和γ-氨基丁酸75g，水的用量为405.7g。
本对比例提供的香稻增香剂的制备方法中，步骤S1无需称取偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐，称取过硫酸铵水溶液(质量分数10％)和N,N,N',N'-四甲基乙二胺；步骤S3具体为：使用板式换热器，按15℃/s的速度将反应釜中的混合液急速降温至50℃，在恒温条件下，36r/min边搅拌边加入过硫酸铵水溶液(质量分数10％)和N,N,N',N'-四甲基乙二胺，再继续恒温搅拌12h，关闭恒温系统待用。其他步骤与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的区别在于，在其纳米脂质体的原料，以及增香剂制备方法中，未使用偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐进行催化聚合。即纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂60g、表面活性剂30g、细胞穿透肽1g、锌肥200g、脯氨酸150g、5-氨基乙酰丙酸75g和γ-氨基丁酸75g，水的用量为409g。
本对比例提供的香稻增香剂的制备方法中，步骤S1无需称取偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐；步骤S3具体为：使用板式换热器，按10℃/s的速度将反应釜中的混合液急速降温至50℃，继续恒温搅拌12h，关闭恒温系统待用。其他步骤与实施例1相同。
对比例5
本对比例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的区别在于，在其纳米脂质体的原料，以及增香剂制备方法中，用氯化锌替代硫酸锌、柠檬酸锌和EDTA螯合锌。即纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂60g、表面活性剂30g、细胞穿透肽1g、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐5g、氯化锌200g、脯氨酸150g、5-氨基乙酰丙酸75g和γ-氨基丁酸75g。制备方法与实施例1相同。
对比例6
本对比例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的区别在于，在其纳米脂质体的原料，以及增香剂制备方法中，只使用γ-氨基丁酸，不使用5-氨基乙酰丙酸。即纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂60g、表面活性剂30g、细胞穿透肽1g、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐5g、氯化锌200g、脯氨酸150g、γ-氨基丁酸150g。制备方法与实施例1相同。
对比例7
本对比例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的区别在于，在其纳米脂质体的原料，以及增香剂制备方法中，只使用5-氨基乙酰丙酸，不使用γ-氨基丁酸。即纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂60g、表面活性剂30g、细胞穿透肽1g、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐5g、氯化锌200g、脯氨酸150g、5-氨基乙酰丙酸150g。制备方法与实施例1相同。
对比例8
本对比例提供的香稻增香剂，其原料和制备方法与实施例1基本相同，与实施例1的区别在于，采用乙醇注入法制备，具体步骤为：
(1)称取合成卵磷脂60g、表面活性剂30g、细胞穿透肽1g、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐5g、锌肥200g、脯氨酸150g、5-氨基乙酰丙酸75g和γ-氨基丁酸75g，水404g，备用；锌肥由质量比为1:3:1的硫酸锌、柠檬酸锌、EDTA螯合锌组成；
(2)将合成卵磷脂溶于500g无水乙醇中，制成第一混合液；
(3)于反应釜中加入水，加热到50℃，开启搅拌(36r/min)，将表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸依次加入到反应釜中，直至完全溶解；
(4)反应釜持续搅拌的情况下，使用蠕动泵将步骤(2)制备的第一混合液以0.1mL/s的速度注入反应釜，当乙醇完全挥发回收后，停止搅拌；
(5)使用超高压均质机，设置均质压力1800bar，将反应釜中的液体均质5遍，得到乙醇注入法制作的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体。
对比例9
本对比例提供的香稻增香剂，与实施例1的区别在于，未使用细胞穿透肽，不制备成纳米脂质体的形式，具体制备方法为：
S1、称取锌肥200g、脯氨酸150g、5-氨基乙酰丙酸75g和γ-氨基丁酸75g和水500g；锌肥由质量比为1:3:1的硫酸锌、柠檬酸锌、EDTA螯合锌组成；
S2、在反应釜中加入去离子水，加热至50℃，36r/min边搅拌边加入锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，继续搅拌直至所有物料完全溶解；最后加入细胞穿透肽，继续搅拌100min，得到不含有细胞穿透肽和纳米脂质体的香稻增香剂。
应用例1：对实施例1，对比例2和对比例8的香稻增香剂的粒径检测
取实施例1、对比例2和对比例8制备的香稻增香剂各1mL，使用Malvern的Nano-ZS纳米粒度及Zeta电位分析仪测定其平均粒径。
实施例1的检测结果如图2所示，制备的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体的平均粒径为107.2nm，PdI值为0.108，表明制备的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体均一度好，质量较高。
对比例2的检测结果如图3所示，制备的不含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体的平均粒径为104.2nm，PdI值为0.094，表明制备的不含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体均一度好，质量较高。
对比例8的检测结果如图4所示，使用乙醇注入法制备的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体的平均粒径为357.2nm，PdI值为0.327，表明乙醇注入法制备的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体均一度不好，质量不高。
结合实施例1与对比例2的检测结果表明，含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体比不含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体的平均粒径增大了3nm，表明细胞穿透肽是以无规则卷曲的形式，通过静电引力吸附在脂质体表面，未形成特定的二级结构。
结合实施例1与对比例8的检测结果表明，常规的乙醇注入法制备的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体平均粒径从107.2nm显著增大到357.2nm，表明常规的乙醇注入法工艺不适合制备含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体。因为，当其粒径大于150nm时，无法共用植物体内外泌体的运输途径和跨膜途径将锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸运输到细胞内，提高其增香和增产效果。同时，乙醇注入法制备的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体的PdI数值0.327大于0.2，表明该方法制备的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体的粒径分布较宽，无法保持长期稳定，不具备商业价值。
综上，实施例1和对比例2的制备方法均能制备出粒径均一香稻增香纳米脂质体，且实施例1的平均粒径为107nm，可以共用植物体内外泌体的运输途径和跨膜途径将锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸快速高效地运输到细胞体内，提高其增香和增产效果。同时，含有的细胞穿透肽能够进一步地提高其跨膜速率，将增香和增产效果提升更多。
应用例2：香稻增香剂稳定性测定
将实施例1-3及对比例1-8制备的香稻增香剂分别测试常温稳定性(25℃，90d)、高温稳定性(54℃，14d)、低温稳定性(4℃，14d)和pH稳定性。pH稳定性是将含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体分别与pH值为3的HCl溶液或pH值为10的NaOH溶液，按重量比1:100混合；在25℃静置4h后观察。结果如下表1所示。
表1香稻增香剂稳定性测试结果
| 制备方法 | 常温 | 高温 | 低温 | pH值＝3 | pH值＝10 |
| 实施例1 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 |
| 实施例2 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 |
| 实施例3 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 |
| 对比例1 | 沉淀 | 沉淀 | 沉淀 | 沉淀 | 沉淀 |
| 对比例2 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 |
| 对比例3 | 凝胶沉淀 | 凝胶沉淀 | 澄清 | 澄清 | 澄清 |
| 对比例4 | 沉淀 | 沉淀 | 澄清 | 澄清 | 澄清 |
| 对比例5 | 絮凝 | 絮凝 | 澄清 | 澄清 | 絮凝 |
| 对比例6 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 |
| 对比例7 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 |
| 对比例8 | 沉淀 | 沉淀 | 沉淀 | 沉淀 | 沉淀 |
表1的结果表明，实施例1-3制得的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体在常温、高温、低温及pH值为3(酸性)和pH值为10(碱性)条件下均稳定。
对比例1制备的香稻增香剂在各个条件下均不稳定，其原因在于：使用常规的大豆卵磷脂替代合成卵磷脂，故表面活性剂聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物只能与吐温-80通过氢键相互作用，不能塑形成磷脂双分子层的外部骨架。在无外部骨架的帮助下，形成的纳米脂质体在后续的聚合过程中容易破裂，稳定性差。
对比例2制备的香稻增香剂在各个条件下均稳定；细胞穿透肽的加入与否，不影响香稻增香剂的稳定性。
对比例3制备的香稻增香剂在常温和高温条件下不稳定，短时间的酸碱处理对其稳定性无影响；其原因在于：过硫酸铵的半衰期约为偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐的50-100倍，故反应不能及时停止，造成过度反应，使体系凝胶化，最终产生沉淀；低温能够延缓凝胶的进程，故在低温下稳定。
对比例4制备的香稻增香剂在常温和高温条件下不稳定，短时间的酸碱处理对其稳定性无影响；其原因在于：未进行聚合反应，没有形成磷脂双分子层的内部骨架，稳定性不高，故其在常温和高温条件下不稳定；低温条件下对稳定性的要求降低，故能够较为稳定存在。
对比例5制备的香稻增香剂在常温、高温、碱性条件下不稳定，其原因在于：氯化锌在上述条件下容易水解，而实施例1-3中的柠檬酸锌和EDTA锌中的柠檬酸及EDTA均能抑制锌的水解。
对比例6、7制备的香稻增香剂在各个条件下均稳定，替换5-氨基乙酰丙酸或γ-氨基丁酸，不影响其稳定性。
对比例8制备的香稻增香剂，由于使用常规的乙醇注入法，制得的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体粒径分布范围宽，即使在脂质体最适宜的低温条件下(4℃，14d)也出现沉淀，无法维持稳定均一的体系，没有商业价值。
综合来看，实施例1-3制备方法制备出的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体在各个条件下均能维持体系的均一稳定，制备的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体能够满足农业制剂产品要求的高低温贮藏稳定的要求，具有商业价值。
应用例3：实施例1-3及对比例2、6、7、9制备的增香剂对水稻增香和增产效果及安全性评价
以香稻稻花香-2号为供试品种，在水稻齐穗期喷施实施例1-3及对比例2、6、7、9制备的增香剂。对比例1、3-5、8制备的香稻增香剂无法在常温下稳定，故无法进行田间试验。
量取各个处理每亩所需的增香剂，具体用量见下表2中的使用量(本产品的密度为1160g/L)，按照每亩兑水1.5L，使用无人机喷施1亩，或按照每亩兑水30L，使用人工喷雾1亩，各处理组间间隔15m。同时设置清水对照。在喷施后3d，观察是否对水稻有肥害，评价其安全性。
当水稻成熟后，每个试验大区使用5点取样法，收割1m2的水稻，计算亩产量，评价增产效果，并将米脱壳，使用气相色谱-质谱联用仪，测定稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量，评价增香效果。使用统计软件，对香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量和亩产量分别进行完全随机单因素统计分析。表2中不同小写字母表示在5％水平上存在显著性差异，结果如下表2所示。
表2水稻增香剂的增香和增产效果及安全性评价结果
1、香稻增香效果分析：
实施例1-3制备的增香剂与清水对照相比，香米中的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量存在显著性差异，表明含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体能够显著提高香米中的香味物质，具有增香的作用。
实施例1-3与对比例2(不含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体)制备的增香剂对比，香米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量存在显著性差异，表明细胞穿透肽在提高香米中香味物质的过程中具有显著作用，在香稻增香纳米脂质体外吸附细胞穿透肽，能够显著提高香稻增香纳米脂质体的增香效果。
实施例1-3与对比例6、7(单独使用γ-氨基丁酸或5-氨基乙酰丙酸)制备的增香剂相比，香米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量存在显著性差异，表明5-氨基乙酰丙酸与γ-氨基丁酸联合使用，比单独使用γ-氨基丁酸或5-氨基乙酰丙酸的增香效果更好，具有显著性差异。
实施例1-3与对比例9制备的增香剂(施用量100mL/亩)相比，香米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量存在显著性差异，表明纳米脂质体的特殊结构形式、细胞穿透肽在运输锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸进入细胞的过程中，起到了协同增效的作用，在锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸施用量相同的前提下，能够显著提高香米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量，增香效果更好。
实施例1-3与对比例9制备的增香剂(施用量400mL/亩)相比，香米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量也存在显著性差异。表明相较于提高锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸的施用量，通过含有细胞穿透肽的纳米脂质体提高了锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸在植物吸收、体内运输和跨膜中的效率对香稻增香更为有效。
基于上述香稻增香效果的分析结果，表明纳米脂质体与细胞穿透肽在香稻增香中发挥重要作用。本发明提供的含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体，提高了锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸在植物吸收、体内运输和跨膜中的效率对香稻增香更为有效。
2、香稻增产效果分析
实施例1-3制备的增香剂与清水对照对比，前者的香稻产量与后者存在显著性差异，表明含有细胞穿透肽的香稻增香纳米脂质体能够显著提高香稻的产量，具有增产的作用。
实施例1-3制备的增香剂与对比例2相比，香稻产量上存在显著性差异，表明细胞穿透肽在提高香稻产量的过程中具有显著作用，在香稻增香纳米脂质体外吸附细胞穿透肽，能够显著提高香稻增香纳米脂质体的增产效果。
实施例1-3制备的增香剂与对比例6、7相比，香稻产量上存在显著性差异，表明5-氨基乙酰丙酸与γ-氨基丁酸联用，比单独使用γ-氨基丁酸或5-氨基乙酰丙酸增产效果更好，具有显著性差异。
实施例1-3制备的增香剂与对比例9(施用量100mL/亩)相比，香稻产量上存在显著性差异，纳米脂质体与细胞穿透肽在运输锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸进入细胞的过程中，起到了协同增效作用，在锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸施用量相同的前提下，能够显著提高增产效果。
实施例1-3与对比例9制备的增香剂(施用量400mL/亩)相比，香稻产量上存在显著性差异。表明相较于提高锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸的施用量，通过含有细胞穿透肽的纳米脂质体提高了锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸在植物吸收、体内运输和跨膜中的效率对香稻增产更为有效。
综合上述香稻增产效果的分析，相较于提高锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸的施用量，本发明提供的纳米脂质体特殊结构与细胞穿透肽在香稻增产中能发挥重要作用，显著提高锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸在植物吸收、体内运输和跨膜中的效率，对香稻增产更为有效。
3、安全性分析
采用实施例1-3及对比例2、6、7的方法制备的香稻增香剂，对香稻叶片不存在灼伤现象，在使用无人机喷施时，对香稻安全。对比例9方法制备的香稻增香剂在低施用量(施用量100mL/亩)使用无人机喷雾时，对水稻安全。当增加稻增香剂施用量(施用量400mL/亩)使用无人机喷雾时，出现了叶片灼伤的现象。说明通过增加香稻增香剂的施用量，来提高增香增产的效果是不安全的。
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种含有细胞穿透肽的香稻增香剂，其特征在于，包括纳米脂质体和水，所述纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂、表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，且质量比为(4-8):(2-4):(0.05-0.15):(0.2-0.8):(10-30):(10-20):(5-10):(5-10)；所述水的质量为表面活性剂的5-20倍；
所述合成卵磷脂是二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物；所述二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物中，聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物的分子量为2000-5000；所述锌肥为硫酸锌、柠檬酸锌和EDTA螯合锌，且质量比为(1-3):(1-3):(1-3)；所述细胞穿透肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-5的任一项所示；
所述含有细胞穿透肽的香稻增香剂的制备方法包括以下步骤：
S1、称取合成卵磷脂、表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸和水；
S2、40-60℃下，在水中边搅拌边加入表面活性剂和合成卵磷脂；通入纯CO2至环境正压为0.11-0.13MPa，升温至95℃，均质直至混合液呈成半透明状，停止通入纯CO2和均质；
S3、按10-15℃/s的速度将混合液降温至45-50℃，在恒温条件下，边搅拌边加入偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐，再继续恒温搅拌8-12h；
S4、在搅拌条件下冷却混合液至室温，依次加入锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，继续搅拌直至完全溶解；最后加入细胞穿透肽，继续搅拌100-120min，得到含有细胞穿透肽的香稻增香剂。
2.根据权利要求1所述的含有细胞穿透肽的香稻增香剂，其特征在于，所述纳米脂质体的原料包括合成卵磷脂、表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，且质量比为6:3:0.1:0.5:20:15:7.5:7.5，所述水的质量为表面活性剂的13.5倍。
3.根据权利要求1所述的含有细胞穿透肽的香稻增香剂，其特征在于，所述表面活性剂为吐温-80、司盘-80、脂肪醇聚氧乙烯醚，聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物中的至少一种。
4.一种权利要求1-3任一项所述的含有细胞穿透肽的香稻增香剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、称取合成卵磷脂、表面活性剂、细胞穿透肽、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐、锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸和水；
S2、40-60℃下，在水中边搅拌边加入表面活性剂和合成卵磷脂；通入纯CO2至环境正压为0.11-0.13MPa，升温至95℃，均质直至混合液呈成半透明状，停止通入纯CO2和均质；
S3、按10-15℃/s的速度将混合液降温至45-50℃，在恒温条件下，边搅拌边加入偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐，再继续恒温搅拌8-12h；
S4、在搅拌条件下冷却混合液至室温，依次加入锌肥、脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸和γ-氨基丁酸，继续搅拌直至完全溶解；最后加入细胞穿透肽，继续搅拌100-120min，得到含有细胞穿透肽的香稻增香剂。
5.根据权利要求4所述的含有细胞穿透肽的香稻增香剂的制备方法，其特征在于，步骤S3为按15℃/s的速度将混合液降温至50℃，在恒温条件下，边搅拌边加入偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐，再继续恒温搅拌12h。
6.一种权利要求1所述的含有细胞穿透肽的香稻增香剂的应用，其特征在于，应用于香稻增香和增产时，采用喷雾或飞防的方式施用香稻增香剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用喷雾的方式时，在香稻的破口期和齐穗期按照1:(300-600)的体积比兑水制成香稻增香剂工作液，每次分别按15-30L/亩喷施香稻增香剂工作液；
或者在齐穗期按照1:(150-300)的体积比兑水制成香稻增香剂工作液，按15-30L/亩一次性喷施香稻增香剂工作液。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用飞防的方式时，在香稻的破口期和齐穗期按照1:(20-40)的体积比兑水制成香稻增香剂工作液，每次分别按1-2L/亩喷施香稻增香剂工作液；
或者在齐穗期按照1:(10-20)的体积比兑水制成香稻增香剂工作液，按1-2L/亩一次性喷施香稻增香剂工作液。
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