CN115852496A - 用于dna文库制备的标签组、标签引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请提供了用于DNA文库制备标签组、接头及试剂盒。其中，标签组为如式1所示核苷酸序列组成。通过对于用于区分各样本的标签序列进行了针对性设计，改良了标签序列筛选规则，优化了标签接头的可靠性和易用性，并进行了大量详尽的实际建库测序分析确认，使包括标签序列接其能够能好地满足DNBSEQ T7测序平台的真实建库上机需求。

Description

用于DNA文库制备的标签组、标签引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及高通量测序文库构建领域，具体而言，涉及用于DNA文库制备的标签组、接头及试剂盒。

背景技术

华大智造基因测序仪采用先进的DNBSEQTM测序核心技术，通过仪器气液系统先将DNA纳米球(DNA nanoball,DNB)泵入到规则阵列芯片(Patterned Array)并加以固定，然后泵入测序模板及测序试剂。所有跟DNB相关的测序技术都属于DNBSEQTM。DNBSEQTM测序技术主要包括:DNA单链环化和DNB制备，规则阵列芯片(Patterned Array)，DNB加载，cPAS(combinatorial Probe Anchor Synthesis联合探针锚定聚合测序法),双端测序技术，以及配合的流体和光学检测技术和碱基识别算法等。cPAS已经广泛地应用于BGISEQ—500，BGISEQ—50，MGISEQ—200，MGISEQ—2000以及DNBSEQ—T7等测序平台。

对于DNBSEQ T7测序平台，单张芯片即有1.5T(1500G)左右的数据量产出；而实际上机pooling时，对于常规的单个测序文库需求数据量在10G以内甚至更少的情况，在大规模平行测序过程中需要大量稳定的标签以区分实际需要多样本文库混合在同一芯片上机的需求。

实际的DNBSEQ T7上机使用中至少需要数百种不同标签组类型，以应对1.5T数据量下可能日常频繁出现的几百个文库同时上机的情况。同时由于测序平台特性，测序碱基的不平衡会影响信号的收集，使得芯片上信号出现覆盖现象，严重可影响测序数据的准确性。因此需要对标签及标签接头的序列种类进行大规模的适应性设计，并评估其易用性并进行设计改善。

发明内容

本发明的主要目的在于通过对于用于区分各样本的标签序列进行了针对性设计，改良了标签序列筛选规则，提升了标签接头在实际DNA建库过程中的可靠性、易用性和平衡性，

具体来说，本申请涉及如下技术方案：

1.用于DNA文库制备的标签组，其特征在于，

所述每个标签组中含有x个标签组成，x＝4n，n取任意非零的自然数；

所述标签序列为一段寡核苷酸序列；

所述标签组内标签序列为如式1所示核苷酸序列，

式1：(N_x)_a＝5'—N_x1N_x2N_x3…N_xa—3'；

其中，N选自A、T、G、C四种碱基核苷酸中的任意一种，(N₁)_a～(N_x)_a为一组内的所有标签序列，每条序列为a个碱基组成的核苷酸序列，a为标签序列长度，a取大于等于6的自然数；

所述标签组中，组内N_11～～N_x1、N_12～～N_x2、…、N_1a～～N_xa序列中A碱基占25％，G碱基占25％；

所述每条标签序列中不含有连续3个以上相同的碱基。

2.根据项1所述的标签组，其特征在于，

所述每个标签组中含有四条标签序列，即x＝4；

所述标签组序列为如式1-1～式1-4所示核苷酸序列；

式1-1：(N₁) _a＝5'—N₁₁N₁₂N₁₃…N_1a—3'

式1-2：(N₂) _a＝5'—N₂₁N₂₂N₂₃…N_2a—3'

式1-3：(N₃) _a＝5'—N₃₁N₃₂N₃₃…N_3a—3'

式1-4：(N₄) _a＝5'—N₄₁N₄₂N₄₃…N_4a—3'

其中，(N₁)_a～(N₄)_a为一组内的四条标签序列；

所述标签组中，组内N_11～～N₄₁、N_12～～N₄₂、…、N_1a～～N_4a序列中A碱基占25％，G碱基占25％。

3.根据项1所述的标签组，其特征在于，每个所述标签序列不含有与文库构建和/或基因测序过程中使用的任何引物和/或标签序列本身内部序列间互补和/或反向互补结合的6个以上连续的碱基。

4.根据项1所述的标签组，其特征在于，所述标签组中的任意标签序列两两之间的汉明距离大于等于3。

5.据项1所述的标签组，其特征在于，所述标签序列的长度a为8～20bp，优选为10bp。

6.DNA标签文库，其特征在于使用权利要求1中所述的标签序列构建。

7.用于基因测序的接头，其特征在于，所述的接头的序列中含有权利要求1中所述的标签序列；

优选地，每个所述接头序列中不含有与文库构建和/或基因测序过程中使用的任何引物和/或接头序列本身内部互补和/或反向互补结合的6个以上连续的碱基。

8.根据项7所述的标签接头，其特征在于，所述接头序列还包括第一接头部分和第二接头部分，所述标签序列分别与第一接头部分和第二接头部分连接；

优选地，所述接头包括3’端接头和/或5’端接头；

所述3’端接头的正向序列，标签序列上游为第一接头部分，与待测序列连接，下游为第二接头部分，与测序芯片连接序列；

所述5’端接头的反向序列标签序列下游为第一接头部分带有T碱基粘性末端的序列，与待测序列连接，上游为第二接头部分序列；

优选地，所述的3’端标签接头的正向序列中，所述第一接头部分的序列为：AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(SEQ ID No:1)；

所述第二接头部分的序列为：CAACTCCTTGGCTCACA(SEQ ID No:2)。

9.一种标签组的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤A:使用A、T、C、G四种碱基随机生成阈值范围内长度相同的备选标签序列池，每四条标签序列混合为一标签组；

步骤B:筛选去除所述标签组中包括1条或以上的不符合权利要求1中所述标签组序列的整组序列。

10.用于DNA文库制备的试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求1～5中任一项所述的标签组和/或权利要求7～8中任一项所述的接头。

优选地，其还包括：基因组DNA打断试剂、末端修复试剂、接头连接试剂、扩增试剂；

优选地，所述扩增试剂包括PCR引物，其中正向引物与所述3’端所述接头的正向序列互补。

发明的效果

为通过对对标签及标签接头的序列种类进行大规模的新设计为高数据量的基因测序过程提供了大量的可用的标签序列及标签接头，同时区分各样本的标签序列进行了针对性设计，提高了标签组的选择范围和组合应用的灵活性，改良了标签序列筛选规则，针对性的提升了标签序列在实际建库过程中的可靠性、易用性及平衡性。

附图说明

图1所示为MGI通用的DNA文库制备流程。

图2～图4为N、M、I组实验上机芯片结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

术语解释：

MGI：深圳华大智造科技股份有限公司，本说明中简称华大、华大智造；

DNBSEQ—T7测序平台：华大智造公司高通量测序平台型号，本说明中简称T7；

标签：用于区分不同样本文库的标志序列，位于接头结构中。

标签接头：为一段已知的短核苷酸序列，其中包括标签序列，用于链接未知的目标测序片段与测序平台

汉明距离：表示两个(相同长度)字对应位不同的数量，我们以d(x,y)表示两个字x,y之间的汉明距离。具体到本发明就是相同长度寡核苷酸序列之间不同的碱基数量。

本发明提供了用于DNA文库制备的标签组，用于DNA文库制备的标签组，每个标签组中含有x个标签组成，x＝4n，n取任意非零的自然数；每条标签序列为一段寡核苷酸序列，标签组内标签的序列符合通式式1：

式1：(Nx)a＝5'—Nx1Nx2Nx3…Nxa—3'。

其中，N为选自A、T、G、C四种碱基核苷酸中的任意一种碱基核苷酸，(N1)a～(Nx)a为代表一组内的所有标签序列，每条序列由a个碱基核苷酸序列组成，a为每个标签序列长度，a取大于等于6的自然数，同组内每条标签的长度相同。

每个标签组中，组内各条标签序列的对应碱基位N11～～Nx1、N12～～Nx2、…、N1a～～Nxa序列中A碱基占25％，G碱基占25％，且每条标签序列中不含有连续3个以上相同的碱基。

优选的是每个标签组含有4条标签序列组成，即x＝4；此时每个标签组的序列即为式1-1～式1-4所示：

式1-1：(N1) a＝5'—N11N12N13…N1a—3'

式1-2：(N2) a＝5'—N21N22N23…N2a—3'

式1-3：(N3) a＝5'—N31N32N33…N3a—3'

式1-4：(N4) a＝5'—N41N42N43…N4a—3'

其中，(N1)a～(N4)a为一组内的四条标签序列；标签组中，组内各条标签序列的对应碱基位N11～～N41、N12～～N42、…、N1a～～N4a序列中A碱基占25％，G碱基占25％。

作为优选，标签组中每条标签序列不含有与文库构建和/或基因测序过程中使用的任何引物和/或标签序列本身内部序列间互补和/或反向互补结合的6个以上连续的碱基；优选地任意标签序列两两之间的汉明距离大于等于3。

优选地，标签组中标签长度长度大于等于6bp，优选为8～20bp，在一具体实施例中为10bp。

本发明还涉及一种DNA标签文库，该文库使用上述所涉及的标签构建。

本发明还设计基因测序使用的接头，测序接头序列中还有上述标签序列；

优选地，每个所述接头序列中不含有与文库构建和/或基因测序过程中使用的任何引物和/或接头序列本身内部互补和/或反向互补结合的6个以上连续的碱基。

在一优选中，接头序列还包括第一接头部分和第二接头部分，所述标签序列分别与第一接头部分和第二接头部分连接；优选地，接头包括3’端接头和/或5’端接头；3’端接头的正向序列，标签序列上游为第一接头部分，与待测序列连接，下游为第二接头部分，与测序芯片连接序列；5’端接头的反向序列标签序列下游为第一接头部分带有T碱基粘性末端的序列，与待测序列连接，上游为第二接头部分序列；

在一具体实施例中，3’端标签接头的正向序列中，第一接头部分的序列为：AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA；第二接头部分的序列为：CAACTCCTTGGCTCACA。

本发明涉及标签组的制备方法，包括一下步骤：

步骤A：使用A、T、C、G四种碱基随机生成阈值范围内长度相同的备选标签序列池，池内每四条标签序列混合为一标签组；

步骤B：筛选去除标签组中不满足涉及原则序列。

新标签序列设计原则：

对于用于区分各样本的标签接头序列进行了针对性设计，使用ATCG四种碱基随机生成长度相等的备选标签序列，同时使用以下设计逻辑对于备选序列进行筛选；长度大于等于6bp，优选为8～20bp，在一具体实施例中为10bp。

原则1：10位长度，每四个一组混合每一位置碱基平衡

原则2：相互间汉明距离大于等于3

原则3：不存在3位或更多连续碱基

原则4：不存在6位及以上碱基可与文库构建、基因测序过程引物和/或自身内部序列互补和/或反向互补结合

原则5：当为10位标签序列实际合成时，相邻的接头结构序列，仍符合原则4

筛选时对于不符合条件的序列，将其连同其所在的一组共四个标签序列，一并删除不保留。

本发明还包括用于DNA文库制备的试剂盒，其中含有前述任一项所述的标签组和/或任一项接头。

优选地，试剂盒中还包括其还包括：基因组DNA打断试剂、末端修复试剂、接头连接试剂、扩增试剂；

更优选地，所述扩增试剂包括PCR引物，其中正向引物与3’端接头的正向序列互补。

试剂：

序列：

本发明试剂套装包括华大MGI测序平台DNA文库构建的各完整步骤试剂：基因组DNA打断、末端修复、3’加A、加标签接头、PCR扩增、环化步骤。可使用此整套试剂，以0.5～400ng基因组DNA起始，构建可供华大智造MGI DNBSEQ T7高通量测序平台进行上机的DNA小片段文库。

1、基因组DNA打断

本步骤包括与超声打断、酶切打断两种方式以及相适应的对应试剂。

若进行超声打断，则将0.5～400ng起始基因组DNA，补充TE buffer至体积80μL，使用Bioruptor超声打断仪(15s+30s)*6循环打断程序。其后进行磁珠筛选得到片段范围约在200～600bp的片段化DNA。

向上一步产物中加入48μL DNA Clean beads，吹打混匀10次。室温孵育5min，上磁力架5min，吸取128μL上清至新管，弃磁珠。向上清管中加入16μLDNA Clean Beads，吹打混匀10次。将磁珠管室温孵育5min，上磁力架5min。保持磁珠管在磁力架上，保留磁珠，丢弃上清。向磁珠管中加入200μL 80％酒精。静置30s，保留磁珠，丢弃上清。再向磁珠管中加入200μL 80％酒精。静置30s，保留磁珠，丢弃上清。使用10μL移液器吸弃磁珠管中残留酒精，晾干磁珠。将磁珠管移下磁力架，向管中加入31μL EB Buffer，吹打混匀10次。室温放置5min，置于磁力架(约2min)，吸取上清30μL转移至新管。取1μL定量，然后取定量50ng，若不足则全部取用，并将体积补至29μL进行末端修复/3’加A步骤。

2、末端修复/3’加A步骤

本步骤包括与超声打断、酶切打断两种方式产物相适应的对应试剂。

若进行酶切打断，则将0.5～400ng起始基因组DNA，补水至体积25μL，进行末端修复/3’加A步骤。如下表：

组分	超声打断	酶切打断
			起始DNA	29μL	25μL
10×FD buffer	4μL	4μL
			10×N5 buffer	4μL	4μL
End repair mix	2μL	2μL
			A—tailing mix	2μL	2μL
Enhancer	2μL	2μL
			Fragmentase	—	1μL
总体积	43μL	40μL

按上表配制反应Mix后，在PCR仪上运行反应程序：37℃10Min，75℃20min，4℃∞。

若为超声打断产物，则直接进行下一步加标签接头步骤。

若为酶切打断产物，则进行磁珠筛选步骤：

向上一步产物中加入40μL EB Buffer补至总体积80μl，然后加入48μL安诺纯化磁珠，吹打混匀10次。室温孵育5min，上磁力架5min,吸取128μL上清至新管，弃磁珠。向上清管中加入16μL DNA Clean Beads，吹打混匀10次。将磁珠管室温孵育5min，上磁力架5min。保持磁珠管在磁力架上，保留磁珠，丢弃上清。向磁珠管中加入200μL 80％酒精。静置30s，保留磁珠，弃丢上清。再向磁珠管中加入200μL 80％酒精。静置30s，保留磁珠，弃丢上清。使用10μL移液器吸弃磁珠管中残留酒精，晾干磁珠。将磁珠管移下磁力架，向管中加入45μL EBBuffer，吹打混匀10次。室温放置5min，置于磁力架(约2min)，吸取上清44μL转移至新管。取1μL定量，然后取定量50ng并将体积补至43μL进行加接头，若不足则全部取用。

接头序列1(含所设计的标签序列，位于10位的NNNNNNNNNN区域)：/5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAANNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA

接头序列2(公共序列)：

TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT

接头序列合成后，退火并稀释至10pmol/μL进行使用。如下表：

成份	体积/μl
		末修加A产物	43
Adapter(10pmol/μL)	5
		Rapid ligation buffer	50
DNA Ligase	2
		Total	100

按上表配制反应Mix后，在PCR仪上运行反应程序：20℃30Min，4℃∞

反应结束后使用80μL磁珠纯化，溶于17μL Elution Buffer进行下一步骤PCR扩增。

3、PCR扩增步骤

成份	体积/μl
		DNA	17
HiFi Mix	25
		primer 1	4
primer 2	4
		Total	50

按上表配制反应Mix后，在PCR仪上运行反应程序：

95℃3min；(98℃20s，60℃15s，72℃30s)X cycles；72℃10min；4℃Hold(热盖105℃)

对于不同的基因组DNA样本起始量和打断方式，确定PCR扩增反应循环10次。

反应结束后使用45μL磁珠纯化，溶于22μL Elution Buffer，即为最终MGI结构双链dsDNA文库，定量后进行后续上机测序。

实施例

使用传代培养的NA12878标准细胞系，提取基因组DNA作为模板材料，使用本说明的建库试剂套装体系，构建480个标准品文库，并在DNBSEQ T7测序平台上机测序分析，观察所建文库的具体分析指标，以证明本建库试剂套装体系的可用性和稳定性。

所构建的480个标准品文库，每个文库使用一种标签标签接头，对每种标签标签的可用性和稳定性进行分组对比：

N组：本发明新设计的24种标签标签接头，编号为N1～N24

M组：华大智造官方24组标签标签接头，编号为M1～M24

I组：采用官方通用的Illumina文库

每个文库均使用同一份NA12878基因组DNA起始，超声打断后各取50ng进行文库构建实验流程，建库完成后，每4个一组混合进行环化，每8个环化产物(即32个单文库)混合进行DNB制备，最终混合pooling进行上机，使用一整张DNBSEQ T7芯片进行测序，所得测序数据进行拆分、过滤、分析，观察各文库数据的分析情况。

对比三张MGI—T7上机芯片，其中：

芯片1：E100008005，上机文库本发明标签全部为使用本专利设计的本发明标签序列

芯片2：E100005956，上机文库本发明标签全部为MGI官方本发明标签序列

芯片3：E199911387，上机文库本发明标签全部为Illumina文库App—A转化在MGI—T7上机，本发明标签序列即为未经过碱基平衡设计的IlluminaIndex序列

芯片1上机结果见图2

TotalTeads(M)	5148.95
		Q30(％)	92.99
SplitRate(％)	98.19

芯片2上机结果见图3

TotalTeads(M)	4961.33
		Q30(％)	92.75
SplitRate(％)	97.37

芯片3上机结果见图4

TotalTeads(M)	4471.98
		Q30(％)	87.85
SplitRate(％)	91.43

结果分析：

根据实际3张芯片上机结果，可见，

芯片1(本发明标签)总产出5148.95M，Q30比例92.99％，拆分率98.19％；

芯片2(MGI官方本发明标签)总产出4961.33M，Q30比例92.75％，拆分率97.37％；

芯片3(Illumina不平衡Index)总产出4471.98M，Q30比例87.85％，拆分率91.43％。

明显可见碱基平衡的本发明标签序列，特别是本发明设计的本发明标签，当整张芯片上全部文库均使用时，在芯片数据量产出量合质量、拆分率方面具有可观优势。

特别是本发明标签序列直接影响的301—310测序循环，该部分的过滤前Q30比例分别为芯片1在82～85％左右，芯片2在80～82％左右，芯片3在75～80％左右，反映出本发明设计的本发明标签在测序时的性能优势。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.用于DNA文库制备的标签组，其特征在于，

所述每个标签组中含有x个标签组成，x＝4n，n取任意非零的自然数；

所述标签序列为一段寡核苷酸序列；

所述标签组内标签序列为如式1所示核苷酸序列，

式1：(N_x)_a＝5'—N_x1N_x2N_x3…N_xa—3'；

其中，N选自A、T、G、C四种碱基核苷酸中的任意一种，(N₁)_a～(N_x)_a为一组内的所有标签序列，每条序列为a个碱基组成的核苷酸序列，a为标签序列长度，a取大于等于6的自然数；

所述标签组中，组内N_11～～N_x1、N_12～～N_x2、…、N_1a～～N_xa序列中A碱基占25％，G碱基占25％；

所述每条标签序列中不含有连续3个以上相同的碱基。

2.根据权利要求1所述的标签组，其特征在于，

所述每个标签组中含有四条标签序列，即x＝4；

所述标签组序列为如式1-1～式1-4所示核苷酸序列；

式1-1：(N₁) _a＝5'—N₁₁N₁₂N₁₃…N_1a—3'

式1-2：(N₂) _a＝5'—N₂₁N₂₂N₂₃…N_2a—3'

式1-3：(N₃) _a＝5'—N₃₁N₃₂N₃₃…N_3a—3'

式1-4：(N₄) _a＝5'—N₄₁N₄₂N₄₃…N_4a—3'

其中，(N₁)_a～(N₄)_a为一组内的四条标签序列；

所述标签组中，组内N_11～～N₄₁、N_12～～N₄₂、…、N_1a～～N_4a序列中A碱基占25％，G碱基占25％。

3.根据权利要求1所述的标签组，其特征在于，每个所述标签序列不含有与文库构建和/或基因测序过程中使用的任何引物和/或标签序列本身内部序列间互补和/或反向互补结合的6个以上连续的碱基。

4.根据权利要求1所述的标签组，其特征在于，所述标签组中的任意标签序列两两之间的汉明距离大于等于3。

5.据权利要求1所述的标签组，其特征在于，所述标签序列的长度a为8～20bp，优选为10bp。

6.DNA标签文库，其特征在于使用权利要求1中所述的标签序列构建。

7.用于基因测序的接头，其特征在于，所述的接头的序列中含有权利要求1中所述的标签序列；

优选地，每个所述接头序列中不含有与文库构建和/或基因测序过程中使用的任何引物和/或接头序列本身内部互补和/或反向互补结合的6个以上连续的碱基。

8.根据权利要求7所述的标签接头，其特征在于，所述接头序列还包括第一接头部分和第二接头部分，所述标签序列分别与第一接头部分和第二接头部分连接；

优选地，所述接头包括3’端接头和/或5’端接头；

所述3’端接头的正向序列，标签序列上游为第一接头部分，与待测序列连接，下游为第二接头部分，与测序芯片连接序列；

所述5’端接头的反向序列标签序列下游为第一接头部分带有T碱基粘性末端的序列，与待测序列连接，上游为第二接头部分序列；

优选地，所述的3’端标签接头的正向序列中，所述第一接头部分的序列为：AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA；

所述第二接头部分的序列为：CAACTCCTTGGCTCACA。

9.一种标签组的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤A:使用A、T、C、G四种碱基随机生成阈值范围内长度相同的备选标签序列池，每四条标签序列混合为一标签组；

步骤B:筛选去除所述标签组中包括1条或以上的不符合权利要求1中所述标签组序列的整组序列。

10.用于DNA文库制备的试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求1～5中任一项所述的标签组和/或权利要求7～8中任一项所述的接头。

优选地，其还包括：基因组DNA打断试剂、末端修复试剂、接头连接试剂、扩增试剂；

优选地，所述扩增试剂包括PCR引物，其中正向引物与所述3’端所述接头的正向序列互补。

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