CN115850436A - 白介素2突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了白介素2突变体及其应用，通过对IL‑2与其三个受体的结构分析、通过计算机辅助设计技术进行模建和分子对接，引入至少一个氨基酸突变来改变IL‑2对其不同受体的结合。在构建设计的不同IL‑2的突变体，进行表达纯化和功能分析确认，得到了不与IL‑2Rα受体结合，但基本上不影响与IL‑2Rβ/γ受体复合物结合的突变体。本发明提供的突变体可以更好地激活Teff细胞和NK细胞，而不是像野生型IL‑2一样优先激活有抑制功能的Treg细胞，这种IL‑2的突变体能够在体内较好地发挥抗肿瘤作用。

Description

白介素2突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及白介素2突变体及其应用。
背景技术
白细胞介素-2(IL-2)是趋化因子家族的一种细胞因子,它是第一个被克隆的细胞白介素因子，也是首个被批准用于肿瘤治疗的细胞因子。它是由多细胞来源(主要由活化CD4+T细胞产生)，又具有多向性作用的细胞因子(主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化)；对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖；能活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。
IL-2受体(IL-2R)是由α、β、γ三条链组成的异聚体，即IL-2R由IL-2Rα(CD25)、IL-2Rβ(CD122)、IL-2Rγ(CD132)组成。其中β/γ为下游信号通路激活所必需，α则主要促进二者结合。当IL-2受体α亚基(IL-2RA)单独存在时，其与IL-2的亲和力只有完整的IL-2受体的百分之一，因此IL-2R分为高、中、低亲和力受体(见图1，Rosanne Spolski et al.Nat RevImmunol 2018 Oct；18(10):648-659.)。
调节性T细胞(Treg)表达一个由α，β和γ链组成的三聚体IL-2受体。相比之下，Naive CD8+T细胞(Teff)和自然杀伤(NK)细胞携带二聚体受体，仅由β和γ链构成。由于三聚体受体对IL-2的亲和力比二聚体受体高约100倍，因此在体内IL-2优先结合Treg细胞，Treg是一类具有显著免疫抑制作用的，以表达Foxp3、CD25、CD4为细胞表型特征的T细胞亚群。它能够抑制其它细胞的免疫应答，是自我耐受的主要控制者。通常情况下，它的缺失或者功能异常会导致自身免疫性疾病的发生。效应CD8+T细胞(Teff)和自然杀伤性细胞(NK细胞)有很强的靶细胞杀伤能力。在肿瘤病人中，Treg和Teff的平衡被破坏，Treg比例增加。如果用野生型的IL-2，首先刺激的将是Treg细胞，不利于IL-2发挥抗肿瘤作用。随着基础研究的进展，IL-2对Teff和Treg的激活机制渐渐清晰，越来越多的企业改造IL-2，降低IL-2突变体或衍生物与IL-2Rα低亲和力、同时维持或增加与IL-2Rβ亲和力，使得IL-2的突变体或衍生物能够偏向性的激活Teff和NK细胞，而不是优先激活Treg细胞，这样可以在体内更好的发挥抗肿瘤效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何降低IL-2与IL-2Rα亚基的结合而不影响IL-2与IL-2Rβ/γ亚基的结合，从而提高IL-2的抗肿瘤作用，提供抗肿瘤作用更优的IL-2。
为解决上述技术问题，第一个方面本发明提供IL-2突变体，所述IL-2突变体是基于氨基酸序列是SEQ ID No.1的IL-2进行突变得到的蛋白质，所述IL-2突变体与IL-2Rα的亲和力低于所述IL-2与所述IL-2Rα的亲和力。
进一步地，上述的IL-2突变体中，所述突变为在SEQ ID No.1的第40与第41位之间增加1个氨基酸，所述1个氨基酸选自A或P。
进一步地，上述的IL-2突变体中，所述IL-2突变体为氨基酸是如下任一种的蛋白质：SEQ ID No.5、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.8。
为解决上述技术问题，第二个方面本发明提供与上述的IL-2突变体相关的生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
B1)编码所述IL-2突变体的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的动物细胞系；
B6)产生所述IL-2突变体的宿主细胞。
进一步地，上述的生物材料中，B1)所述的核酸分子的核苷酸序列选自SEQ IDNo.23第7-408位、SEQ ID No.30的第7-411位SEQ ID No.34第7-411、、SEQ ID No.36第7-408位、SEQ ID No.28第7-411位或SEQ ID No.26第7-408中的任一种。。
为解决上述技术问题，第三个方面本发明提供所述IL-2突变体的制备方法，所述方法包括培养上述B4)所述的重组微生物或B5)所述的动物细胞系或B6)所述的宿主细胞获得所述IL-2突变体。
为解决上述技术问题，第四个方面本发明提供上述的IL-2突变体或上述的生物材料在制备治疗疾病的药物或制剂中的应用。
进一步地，上述的应用中，所述疾病选自癌症和病毒感染。
进一步地，所述癌症可选自非小细胞肺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、各种血液肿瘤、胰腺癌、皮肤癌、卵巢癌、头颈部肿瘤骨髓瘤、黑色素瘤等癌症。
进一步地，所述病毒感染包括艾滋病、肝炎病毒等病毒感染。
为解决上述技术问题，第五个方面本发明提供所述的IL-2突变体或所述的生物材料在制备用于刺激个体的免疫系统的组合物中的用途。
为解决上述技术问题，第五个方面本发明提供药物或药物组合物，所述药物或药物组合物含有所述的IL-2突变体。
所述药物或药物组合物可为用于治疗癌症和/或病毒感染的组合物。
本发明中，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的载体。
所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等。
由于野生型的IL-2与IL-2Rα/β/γ亲和力比IL-2Rβ/γ的亲和力高2个数量级左右，野生型的IL-2优先与抑制性的Treg细胞结合，不利于Teff细胞和NK细胞的活化，因此野生型的IL-2抗肿瘤效果有限。
本发明提供了一种降低与IL-2Rα亚基结合，而不影响与IL-2Rβ/γ亚基结合的IL-2的突变体；这样可以更好地激活Teff细胞和NK细胞，而不是像野生型IL-2一样优先激活有抑制功能的Treg细胞，这种IL-2的突变体能够在体内较好地发挥抗肿瘤作用。
附图说明
图1为IL-2的受体3个亚基与IL-2亲和力情况。
图2为IL-2表达载体的质粒图谱示例。
图3为IL-2蛋白在菌体诱导前后的表达示例-1。
图4为IL-2蛋白在菌体诱导前后的表达示例-2
图5为纯化后的IL-2蛋白SDS电泳分析情况示例-1。
图6为纯化后的IL-2蛋白SDS电泳分析情况示例-2。
图7为部分IL-2突变体对CTLL-2的增殖刺激作用比较。
图8为部分IL-2突变体对Mo7e的增殖刺激作用比较。
图9为部分IL-2突变体在荷瘤小鼠模型中药效比较
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中CTLL-2细胞购买于苏州顶点生物医药有限公司，其货号为TCM-C724。下述实施例中，所述Mo7e细胞购买于浙江美森细胞科技有限公司，其货号为：CTCC-001-0368。pET-21a(+)购自(宝赛生物公司，货号为D38)。
本申请通过对IL-2与其三个受体结合的晶体结构的研究，利用计算机辅助设计技术，设计了一系列可能破坏与IL-2Rα而不影响IL-2Rβ/γ结合的IL-2突变体，并通过分子和细胞水平的筛选，得到了一系列符合要求的突变体，具体如下。
实施例1：不同IL-2突变体原核表达质粒构建与表达
根据已知的IL-2与各受体的结构信息(PNAS，2006：103(8)2788-2793)，通过计算机辅助设计，设计出不同的IL-2突变体，并通过密码子优化获得对应的DNA序列(具体序列代号及描述见表1，具体的氨基酸序列和核苷酸序列见表2)，以Aldesleukin编码基因为例，商业合成对应的核苷酸序列(在编码基因的DNA分子的5’端添加NdeI酶切位点，3’添加EcoR1酶切位点)，用NdeI和EcoRI限制性内切酶对核苷酸序列是SEQ ID No.19的DNA分子和pET 21a(+)质粒进行双酶切，将酶切产物用T4连接酶连接后转染到JM109感受态细胞株中，酶切测序验证后得到pET 21a(+)-HL002-00表达质粒，质粒图谱如图2所示。
测序结果表明：pET 21a(+)-HL002-00表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.19第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-00表达氨基酸序列是SEQ No.1的蛋白质(HL002-00或Aldesleukin)。
其他的质粒构建方法参照HL002-00，其区别仅在与将目的编码基因进行对应的替换。
pET 21a(+)-HL002-01表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.20第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-01表达氨基酸序列是SEQ No.2的蛋白质(即HL002-01)。
pET 21a(+)-HL002-02表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.21第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-02表达氨基酸序列是SEQ No.3的蛋白质(即HL002-02)。
pET 21a(+)-HL002-03表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.22第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-03表达氨基酸序列是SEQ No.4的蛋白质(即HL002-03)。
pET 21a(+)-HL002-04表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.23第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-04表达氨基酸序列是SEQ No.5的蛋白质(即HL002-04)。
pET 21a(+)-HL002-05表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.24第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-05表达氨基酸序列是SEQ No.6的蛋白质(即HL002-05)。
pET 21a(+)-HL002-06表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.25第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-06表达氨基酸序列是SEQ No.7的蛋白质(即HL002-06)。
pET 21a(+)-HL002-07表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.26第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-07表达氨基酸序列是SEQ No.8的蛋白质(即HL002-07)。
pET 21a(+)-HL002-08表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.27第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-08表达氨基酸序列是SEQ No.9的蛋白质(即HL002-08)。
pET 21a(+)-HL002-09表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.28第7-411位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-09表达氨基酸序列是SEQ No.10的蛋白质(即HL002-09)。
pET 21a(+)-HL002-10表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.29第7-411位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-10表达氨基酸序列是SEQ No.11的蛋白质(即HL002-10)。
pET 21a(+)-HL002-11表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.30第7-411位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-11表达氨基酸序列是SEQ No.12的蛋白质(即HL002-11)。
pET 21a(+)-HL002-12表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.31第7-411位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-12表达氨基酸序列是SEQ No.13的蛋白质(即HL002-12)。
pET 21a(+)-HL002-13表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.32第7-411位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-13表达氨基酸序列是SEQ No.14的蛋白质(即HL002-13)。
pET 21a(+)-HL002-14表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.33第7-411位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-14表达氨基酸序列是SEQ No.15的蛋白质(即HL002-14)。
pET 21a(+)-HL002-15表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.34第7-411位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-15表达氨基酸序列是SEQ No.16的蛋白质(即HL002-15)。
pET 21a(+)-HL002-16表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.35第7-411位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-16表达氨基酸序列是SEQ No.17的蛋白质(即HL002-16)。
pET 21a(+)-HL002-17表达质粒是用核苷酸序列是SEQ ID No.36第7-408位所示的DNA分子替换pET-21a(+)的NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的片段(NdeI和EcoRI限制性内切酶识别位点之间的小片段)，保持pET-21a(+)的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。pET 21a(+)-HL002-17表达氨基酸序列是SEQ No.18的蛋白质(即HL002-17)。
将不同的突变体质粒转染到BL21(DE3)感受态的细菌中。挑取单克隆，培养过夜，第三天按照1:100接种，培养至OD值为0.6-1.0左右，加入终浓度为1mM的IPTG诱导4小时。SDS-PAGE比较诱导前和诱导后的蛋白情况，初步确定目的蛋白表达情况。图3、图4中显示了部分蛋白表达情况，图3和图4中第一条泳带是蛋白质分子量marker，“-”代表没有诱导，而“+”代表IPTG诱导4个小时后的。图3和图4中中可见诱导后的菌体蛋白中多了一条蛋白(箭头所指)，分子量在10KD与15KD之间，符合IL-2的蛋白质分子量；可见目的蛋白有表达。
表1：IL-2及各IL-2突变体的代号和对应的序列号
代号 突变位点 氨基酸序列号 核苷酸序列号
HL002-00 无 SEQ No.1 SEQ No.19
HL002-01 K43V SEQ No.2 SEQ No.20
HL002-02 Y45A SEQ No.3 SEQ No.21
HL002-03 R38A/F42A SEQ No.4 SEQ No.22
HL002-04 R38A/F42A/Y45A SEQ No.5 SEQ No.23
HL002-05 F42L SEQ No.6 SEQ No.24
HL002-06 E61V SEQ No.7 SEQ No.25
HL002-07 P65L SEQ No.8 SEQ No.26
HL002-08 P65V SEQ No.9 SEQ No.27
HL002-09 41位前加A SEQ No.10 SEQ No.28
HL002-10 41位前加G SEQ No.11 SEQ No.29
HL002-11 41位前加P SEQ No.12 SEQ No.30
HL002-12 41位前加N SEQ No.13 SEQ No.31
HL002-13 65位前加A SEQ No.14 SEQ No.32
HL002-14 65位前加G SEQ No.15 SEQ No.33
HL002-15 65位前加P SEQ No.16 SEQ No.34
HL002-16 65位前加N SEQ No.17 SEQ No.35
HL002-17 R38A/F42A/Y45A/P65V SEQ No.18 SEQ No.36
表2：具体的序列(N端至C端或5’至3’)
Figure BDA0003890728130000071
Figure BDA0003890728130000081
Figure BDA0003890728130000091
Figure BDA0003890728130000101
Figure BDA0003890728130000111
Figure BDA0003890728130000121
实施例2：IL-2突变体蛋白纯化
IL-2突变体蛋白纯化步骤如下：
S1)离心收集菌体，用PBS洗涤两遍之后，用buffer溶液重悬，其中，菌体与buffer溶液的比例为1:50，即1g菌体加50ml buffer溶液后吹打重悬沉淀，超声破碎细菌，10000g离心20分钟离心后收集沉淀得到包涵体。
S2)用buffer溶液重悬包涵体，超声处理包涵体，10000g离心20分钟收集包涵体沉淀，该步骤重复一次。
S1)和S2)中buffer溶液的组成为20mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1M NaCl，0.5％(质量占比)Trition-X-100，2M Urea，其余为水，pH 8.0。
S3)用溶液(含6M GuHCl、2mM EDTA、10mM DTT的100mM Tris-HCl，其余为水，pH8.0)溶解S2)获得的沉淀，其中1g沉淀中添加50ml溶液，室温温和搅拌1h，50℃水浴孵育30min，加注射用水将6M GuHCl浓度稀释至4.8M，离心收集上清，再次加注射用水，将GuHCl浓度稀释至3.5M，醋酸调节至pH 5.0，4℃放置60min，然后离心收集沉淀；
S4)用含20mM NaAc、3.5M GuHCl和5mM DTT，pH5.0的溶液重悬S3)收集的沉淀，洗涤后离心保留沉淀，用溶液(含6M GuHCl的0.1M Tris-Cl，pH 8.0溶液)按质量体积比1:50溶解蛋白液装入透析袋(Viskase，Cat#MD34-3.5，截留分子量3.5KD)，对含4.8M GuHcl、0.1mm CuCl2的0.1M Tris-Cl pH 8.0透析换2次液后，将透析袋转移到含2M GuHCl的0.1MTris-Cl pH 8.0溶液中，4小时后再放到10m M NaAC溶液(pH 4.5)中透析并换液2次以上，分别得到蛋白质HL002-00、HL002-01、HL002-02、HL002-03、HL002-04、HL002-05、HL002-06、HL002-07、HL002-08、HL002-09、HL002-10、HL002-11、HL002-12、HL002-13、HL002-14、HL002-15、HL002-16、HL002-17，检测蛋白质纯度和浓度。图5和图6是SDS-PAGE分析的部分蛋白质纯度结果，从电泳的结果可以看到相关的蛋白纯度达到电泳纯。
实施例3：IL-2突变体与IL-2Rα或者IL-2Rβ/γ亲和力检测
通过表面等离子共振(Biacore T-100)测量IL-2突变体与受体IL-2Rα和IL-2Rβ/γ的亲和力，并与临床使用的IL-2(Aldesleukin)进行比较。
采用氨基偶联法将Human IL2-Rβ&Rγ-Fc Protein(Cat.#ILG-H5254，AcroBiosystems)偶联到CM5芯片上，以pH7.4缓冲液(溶剂为水，溶质为10mM HBS-EP，150mMNaCl，0.05％Tween20和3mM EDTA)为工作缓冲液，分析样品(IL-2突变体与IL2Rβ&Rγ)之间的亲和能力。用缓冲液分别将样品(实施例2纯化得到的HL002-00、HL002-01、HL002-02、HL002-03、HL002-04、HL002-05、HL002-06、HL002-07、HL002-08、HL002-09、HL002-10、HL002-11、HL002-12、HL002-13、HL002-14、HL002-15、HL002-16、HL002-17)稀释成50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM、0.390625nM的蛋白溶液。Human IL2-Rβ&Rγ-Fc(Cat.#ILG-H5254)稀释至10μg/mL溶液，偶联水平200RU左右。采用动力学模式(kinetics)分析亲和力常数(KD)。
采用氨基偶联法将Human IL2-RαProtein,His Tag(Cat.#ILA-H52H9，AcroBiosystems)偶联到CM5芯片(Cat.#BR100530,Cytiva)上，以10mM HBS-EP+150mM NaCl+0.05％Tween20+3mM EDTA、pH7.4的缓冲液为工作缓冲液，分析样品(IL-2突变体与Tag)之间的亲和能力。用缓冲液分别将样品(IL-2及突变体)稀释成50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM、0.390625nM的蛋白溶液。Human IL2-Ra Protein,His Tag(Cat.#ILA-H52H9)稀释至10ug/mL溶液，偶联水平200RU左右。采用动力学模式(kinetics)分析亲和力常数(KD)。
结果见表3，表中KD值越高，说明亲和力(结合能力)越低，NB(No Binding)是基于Biacore的结果判定没有结合。
调节性T细胞(Treg)表达一个由α，β和γ链组成的三聚体IL-2受体。Naive CD8+T细胞(Teff)和自然杀伤(NK)细胞携带二聚体受体，仅由β和γ链构成。因此降低与IL2-Rα结合，可以降低Treg细胞的增殖(Treg有抑制机体抗肿瘤作用)，保持对IL2-Rβ/γ结合能力可以让IL2突变体对Teff和NK细胞增殖能力保持不变。与IL2-Rα低亲和力且维持对IL2-Rβ/γ结合能力从机理上而言对更有利于IL2发挥抗肿瘤作用。
由表3可知，各突变体与IL2-Rβ/γ结合能力与Aldesleukin虽有差异，比如HL002-11，HL002-15，HL002-16，HL002-17的亲和力偏低，但所有的亲和力均与对照在一个数量级范围内。而各突变体与IL2-Rα的亲和力与Aldesleukin都有差异，其中HL002-02和HL002-05对IL2-Rα的亲和力与Aldesleukin基本上没有变化，没有达到预期的效果，而HL002-03、HL002-04、HL002-09、HL002-010、HL002-11、HL002-12、HL002-17的亲和力与Aldesleukin相差在接近3个数量级或者以上，特别是HL002-4、HL002-11和HL002-17，从Biacore上来判断，基本上不与IL2-Rα结合。
表3：亲和力常数(KD)测定结果
代号 突变位点 KD(M)E-8(IL2Rα) KD(M)E-10(IL2Rβ/γ)
HL002-00 Aldesleukin 2.50 2.497
HL002-01 K43V 34.4 3.189
HL002-02 Y45A 6.32 3.637
HL002-03 R38A/F42A 3200 3.144
HL002-04 R38A/F42A/Y45A NB 3.620
HL002-05 F42L 5.46 2.151
HL002-06 E61V 26.2 4.709
HL002-07 P65L 106 2.374
HL002-08 P65V 50.2 7.160
HL002-09 41位前加A 5700 4.182
HL002-10 41位前加G 4200 3.247
HL002-11 41位前加P NB 15.329
HL002-12 41位前加N 1500 4.073
HL002-13 65位前加A 210 8.027
HL002-14 65位前加G 128 6.140
HL002-15 65位前加P 350 20.47
HL002-16 65位前加N 30.8 11.58
HL002-17 R38A/F42A/Y45A/P65V NB 13.14
实施例4：IL-2突变体影响CTLL-2和Mo7e细胞增殖的活性测定
根据文献Mol Cancer Ther(2012)11(6):1279–1288报道，CTLL-2细胞有IL2-Rα/β/γ复合物，类似于Treg细胞；而Mo7e细胞表面只有IL2-β/γ受体而没有IL2-Rα受体，类似于
Figure BDA0003890728130000141
CD8+T细胞和NK细胞。如果IL-2的突变体与IL2-Rα受体的亲和力较弱，那么它刺激CTLL2(Treg细胞)的增殖能力就较弱；而如果IL-2的突变体与IL2-β/γ受体的亲和力与Aldesleukin的亲和力相似，那么它刺激Mo7e(CD8+T和NK细胞)能力相似。根据实施例3中表3的结果，我们选取符合较大程度降低IL2-Rα受体的亲和力和对IL-β/γ受体亲和力降低幅度较小的几个突变体(HL002-04、HL002-07、HL002-09、HL002-11、HL002-15、HL002-17)进行了对CTLL-2和Mo7e细胞增殖活性的分析。
4.1、IL-2突变体影响CTLL-2细胞增殖的活性测定
细胞因子生长依赖性CTLL-2细胞(小鼠T细胞)在添加200IU/ml IL-2(北京四环制药有限公司，国药准字S20040020)和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中在37℃、5.0％CO2下培养到对数期，1000rpm离心5分钟收获细胞，并用磷酸盐缓冲液(Gibco，Cat#10010023)洗涤三次。然后用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中重悬细胞，按照5000个细胞每孔加到96孔细胞培养板上，培养4小时(细胞因子饥饿)后，将用磷酸盐缓冲液梯度稀释的Aldesleukin或突变体样品(100ng/ml、33.33ng/ml、11.11ng/ml、3.70ng/ml、1.23ng/ml、0.46ng/ml、0.14ng/ml、0.046ng/ml、0.015ng/ml、0.0051ng/ml、0.0017ng/ml、0ng/ml)添加到96孔组织培养板的孔中。再培养2天后，添加CCK8(Dojindo，Cat#CK04-500tests)20μl/孔，并在37℃、5.0％CO2下培养2小时。然后在450nm和630nm处读取吸光度，检查细胞生长情况。
结果见图7，图7中纵坐标是450nm和630nm吸光度的差值，横坐标为IL-2突变体浓度的常用对数值(对数的底是10)。结果显示相比于HL002-00(Aldesleukin)，所选的IL-2突变体都降低了刺激CTLL-2细胞的增殖能力，其中HL002-11、HL002-17的刺激CTLL-2的增殖能力最弱，然后是HL002-04、HL002-09、HL002-07、HL002-15。
4.2、IL-2突变体影响Mo7e细胞增殖的活性测定
IL-2突变体刺激Mo7e细胞(巨细胞白血病细系)增殖的试验方法与CTLL-2类似，其区别仅在于：Mo7e细胞是在添加8ng/ml GM-CSF(PeproTech,Cat#300-03-50UG)和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养至对数期，收集并洗涤细胞，然后用不含GM-CSF的RPMI1640培养基重悬细胞，并按照每孔20000个细胞添加到96孔板中，培养4小时后，将用磷酸盐缓冲液梯度稀释的Aldesleukin或突变体样品(浓度分别为500ng/ml、166.67ng/ml、55.56ng/ml、18.52ng/ml、6.17ng/ml、2.06ng/ml、0.69ng/ml、0.23ng/ml、0.076ng/ml、0ng/ml)添加到96孔组织培养板的孔中20000个细胞，并在37℃、5.0％CO2下培养4天。4天后，添加CCK8(Dojindo，Cat#CK04-500tests)20μl/孔，并在37℃、5.0％CO2下培养2小时。然后在450nm和630nm处读数检测细胞生长情况。
结果见图8，图8中纵坐标是450nm和630nm吸光度的差值，横坐标为IL-2突变体浓度的常用对数(对数的底是10)。结果表明：HL002-09刺激Mo7e的活性略优于HL002-00，其余的略弱于HL002-00(Aldesleukin)，其中HL002-04和HL002-15刺激Mo7e细胞增殖活性相对较弱，但是所有分子刺激Mo7e的活性都差别不大。
从图7和图8，可以看出各图中的各突变体主要是影响CTLL-2的增殖，而对Mo7e的细胞增殖基本影响较小。结合表3和文献报道，说明了各突变体主要是影响了IL-2与IL-2Rα/β/γ复合物的结合，而基本上不影响IL-2与IL-2Rβ/γ的结合。对CTLL-2增殖活性最弱的但刺激Mo7e增殖能力最强的突变体从机理上而言有较好的抗肿瘤效果，例如HL002-11、HL002-17和HL002-04效果较好，HL002-09、HL002-15和HL002-07的效果虽然比Aldesleukin要好，但是劣于HL002-11、HL002-17和HL002-04。
实施例5：IL-2突变体在荷瘤小鼠模型中抗肿瘤的效果
淋巴母细胞B淋巴细胞TC-1(#ATCC:CRL-2785)细胞系(由中美冠科保存)，在37℃、5％CO2下，用含有10％胎牛血清(FBS，Sigma)的DMEM培养基中培养。C57BL/6J小鼠(7-9周龄，雌性，体重范围17-23g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下接种1×106TC-1细胞，每天检查肿瘤生长情况，在肿瘤体积在60-100立方毫米的时随机分组给药(实验共分为6组，每组8只荷瘤小鼠)，给药第一天即为day1。实验组通过在无菌0.9％的生理盐水中稀释的重组纯化IL-2蛋白在肿瘤部位注射，最终给药剂量为0.5mg/kg，每周两次，持续4周；对照组接受0.9％生理盐水注射。给药体积按照5μl/g体重，每周两次测量肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2×(a×b2)(其中a表示长径，b表示短径)。
第一组为0.9％的生理盐水对照组，第二组为HL-002-11组，第三组为HL-002-00组(野生型IL-2)；第四组为HL-002-02组；第五组为HL-002-04组，第六组为HL-002-15组。
结果见图9。由图9可知在同样条件下，HL-002-02与HL-002-00(野生型IL-2)的肿瘤抑制效果相似，HL-002-02的突变体并没有改善IL-2的肿瘤抑制效果；HL-002-04HL-002-11和HL-002-15抑制肿瘤效果要优于HL-002-00组，且HL-002-04抑制肿瘤生长效果最佳。
实施例6：IL-2突变体对CD8+T细胞和CD4+T细胞增殖的刺激作用
分别用CD8+T细胞(CD3+，CD8+)和CD4+T细胞(CD3+,CD8+)分离试剂盒从人外周血细胞中分离CD8+T细胞和CD4+T细胞。分离后的细胞在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中在37℃、5.0％ CO2下培养过夜，收集细胞并用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯染色(CFSE)在37℃下孵育15分钟，然后离心洗涤，并用10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬，按照每孔10000个细胞加到预先加入PBS稀释后获得的IL-2突变体溶液的96孔细胞培养板上，IL-2突变体分别为HL-002-00、HL-002-02、HL-002-4、HL-002-11、HL-002-15和HL-002-17溶液。培养3天之后，流式细胞仪分析CFSC阳性的细胞数目，来判断不同的IL-2突变体对不同细胞生长的影响。
CD4+细胞增殖实验中，实验共分为6组，PBS梯度稀释后IL-2突变体HL-002-00、HL-002-02、HL-002-4、HL-002-11、HL-002-15和HL-002-17；浓度梯度分别为100ng/ml、33.33ng/ml、11.11ng/ml、3.70ng/ml、1.23ng/ml、0.46ng/ml、0.14ng/ml、0.046ng/ml、0.015ng/ml、0.0051ng/ml、0ng/ml，实验设置3次重复。并设置每孔加入10μl PBS的阴性对照(即0ng/ml)，每个浓度设置复孔。
CD8+细胞增殖实验中，根据二聚体蛋白类型的不同，实验共分为3组，PBS梯度稀释后IL-2突变体HL-002-00、HL-002-02、HL-002-4、HL-002-11、HL-002-15和HL-002-17；浓度梯度为100ng/ml、33.33ng/ml、11.11ng/ml、3.70ng/ml、1.23ng/ml、0.46ng/ml、0.14ng/ml、0.046ng/ml、0.015ng/ml、0.0051ng/ml、0ng/ml，实验设置3次重复。并设置每孔加入10μlPBS的阴性对照(即0ng/ml)，阴性对照设置复孔。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.IL-2突变体，所述IL-2突变体是基于氨基酸序列为SEQ ID No.1的IL-2进行突变得到的蛋白质，所述IL-2突变体与IL-2Rα的亲和力低于所述IL-2与所述IL-2Rα的亲和力。
2.根据权利要求1所述的IL-2突变体，其特征在于：所述突变为在SEQ ID No.1的第40与第41位之间增加1个氨基酸，所述1个氨基酸选自A或P。
3.根据权利要求1或2所述的IL-2突变体，其特征在于：所述IL-2突变体为氨基酸是如下任一种的蛋白质：SEQ ID No.5、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.10和SEQ ID No.8。
4.与权利要求1-3任一项所述的IL-2突变体相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述任一种：
B1)编码权利要求1至3任一项所述IL-2突变体的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的动物细胞系；
B6)产生权利要求1至3任一项所述IL-2突变体的宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：B1)所述的核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID No.23第7-408位、SEQ ID No.30的第7-411位、SEQ ID No.34第7-411、SEQ IDNo.36第7-408位、SEQ ID No.28第7-411位或SEQ ID No.26第7-408中的任一种。
6.权利要求1-3中任一项所述IL-2突变体的制备方法，所述方法包括培养权利要求4中B4)所述的重组微生物或B5)所述的动物细胞系或B6)所述的宿主细胞获得所述IL-2突变体。
7.权利要求1-3任一项所述的IL-2突变体或权利要求6所述的生物材料在制备治疗疾病的药物或制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述疾病为癌症和/或病毒感染。
9.权利要求1-3中任一项所述的IL-2突变体或权利要求4或5所述的生物材料在制备用于刺激个体的免疫系统的组合物中的用途。
10.药物，其特征在于：所述药物或药物组合物含有权利要求1-3中任一项所述的IL-2突变体。
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