CN115850367A - Psma抑制剂的纯化方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种对PSMA抑制剂进行纯化的方法，其中，所述PSMA抑制剂由反应物一和反应物二反应得到，其包括：利用手性流动相对上述由反应物一和反应物二制备的PSMA抑制剂进行纯化。

Description

PSMA抑制剂的纯化方法及其用途

技术领域

本申请属于制药技术领域，具体地，涉及一种PSMA抑制剂的纯化方法。

背景技术

本申请的目的是生产一种诊疗一体的PSMA抑制剂，化学名称为：(((1S)-5-((2S)-2-(4-((trans)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸，

其结构式为：

。

前列腺特异性膜抗原(PSMA)是位于前列腺上皮细胞表面的跨膜蛋白，在正常前列腺以及前列腺增生细胞表面有所表达，在绝大多数前列腺癌细胞中明显上调(100-1000倍)，因此 PSMA 已成为前列腺癌特异性诊断和治疗的重要靶点，是近年研究的热点之一。谷氨酸尿素小分子及其类似物(Glu- urea-R)是叶酸水解酶 I 活性抑制剂，同时能够竞争性抑制 PSMA 的 NAALADase 酶活性，因此能够高效、靶向的与前列腺癌细胞表面的 PSMA相结合，并且通过内化作用进入到前列腺癌细胞内，该内化作用可方便将放射性治疗核素携带进入前列腺癌细胞达到治疗作用。文献已报告了几十种基于 Glu-urea 的显像剂及治疗药物，如：⁶⁸Ga-PSMA-11、¹⁸F-DCFPyL、¹⁸F-PSMA-1007 等。⁶⁸Ga-PSMA-11于2020年获美国FDA批准，表现为快速的体内清除，但PSA水平低于2ng/mL时灵敏度下降；¹⁸F-PSMA1007 和 ¹⁸F-DCFPyL在 PSA 水平低时灵敏度同样不高。 同时由于结构的限制，该类显像剂不能直接用于治疗；而¹⁷⁷Lu-PSMA-617 由于良好的CRPC治疗效果被美国核医学年会评为2019 年年度图像，但其在腺体上的高摄取所致的毒副作用(干燥综合症)，仍是阻碍临床推广应用的主要因素；同时¹⁷⁷Lu-PSMA-617直接用镓-68Ga标记时难以得到商品化供应，同时⁶⁸Ga的beta能量高，图像不及¹⁸F，导致诊断灵敏度下降。

本申请的目标化学物是个准大分子化合物，其制备极为复杂。该化合物含有多个肽键和手性中心，还包括N=N双键的顺反异构体、环己烷的顺反异构体，该目标化合物性质不稳定，颜色为深紫色，其溶解度严重依赖于pH值。该化合物的一般杂质和旋光异构体与其结构类似，造成该化合物极难以纯化。该化合物有机杂质主要含有反应中间体，副产物，手性异构体等，无机杂质主要含有无机盐，包括制备中用到的缚酸剂，纯化步骤中用到的奎尼丁和三乙胺等。

因此有必要开发能够纯化该化合物的方法，为大规模生产提供可能。

发明内容

目前研究人员发现，奎尼丁或奎宁等具有含氮六元桥环的α和β位为手性碳的结构，可以跟PSMA抑制剂及其旋光异构体生成可逆的非对映体复合物， 经过制备色谱柱洗脱分离，再用酸性物质脱盐，可以得到纯净的PSMA抑制剂，

。

本申请在此提供了下述技术方案：

1. 一种对反应料液进行纯化以得到PSMA抑制剂产品的方法，其中，

所述PSMA抑制剂存在于反应物一和反应物二反应得到的反应料液中，

其中反应物一为；

S-2,2',2''-(10-(2-((1-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯] -4-基)氨基)-6-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸；

而反应物二为；

(((S)-1-羧基-5-((S)-2-((反)-4-((2-巯基乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺基)-3-(萘-2-基)丙酰胺基)戊基)氨甲酰)-L-谷氨酸。

反应物一和反应物二发生反应得到的所述PSMA抑制剂为

(((1S)-5-((2S)-2-(4-((反)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸。

所述方法包括：

利用手性流动相和制备型色谱柱的纯化体系对上述由反应物一和反应物二制备的PSMA抑制剂的反应料液进行纯化，所述纯化体系的制备步骤为：

-使用装料溶液对所述制备型色谱柱进行装料；

-使用第一流动相对制备型色谱柱进行柱平衡；

-使由反应物一和反应物二制备的PSMA抑制剂的反应料液通过色谱柱；

-使用第一流动相和第二流动相对所述制备型色谱柱进行梯度洗脱；

-使用酸性溶液对洗脱液进行纳滤处理，以实现脱盐；

-脱盐后得到富含PSMA抑制剂产品的溶液；

-对所述富含PSMA抑制剂的溶液冻干，而后得到PSMA抑制剂产品。

其中第一流动相是手性流动相，其具有含氮六元桥环的手性添加剂，其桥环上的α和β位为手性碳；

其中第二流动相是含有缓冲盐的流动相，其具有磷酸/三乙胺添加剂。

2. 根据项1所述的方法，其中，所述制备型色谱柱中使用的填料为亲水型反相填料。

3.根据项2所述的方法，其中，所述亲水型反相填料为YMC*GEL ODS-AQ-HG，粒径为12nm S-15μm。

4.根据项3所述的方法，其中，使用装料溶液对制备型色谱柱进行的装料步骤包括：

根据该制备型色谱柱的容积，取一重量份的异丙醇、以及2~10重量份的填料，匀浆得到装料溶液；填料优选为2~5份；然后将所述装料溶液摇匀后倒入制备型色谱柱中。

5.根据项4所述的方法，其中，使用第一流动相对所述制备型色谱柱进行柱平衡，其中，

所述柱平衡反应的持续时间为2-5h，优选为4h；

优选所述第一流动相如下配制：根据过柱所需的实际用量，向容器中加入100重量份纯化水，大于2重量份，优选2~6重量份具有含氮六元桥环的手性添加剂，其桥环上的α和β位为手性碳；和5~10重量份乙酸，搅拌均匀；所述具有含氮六元桥环的手性添加剂优选为2~3重量份，所述乙酸优选为5~7重量份；

所述具有含氮六元桥环的手性添加剂优选为奎尼丁。

6.根据项5所述的方法，其中，使用第一和第二流动相进行梯度洗脱的方案为：第一阶段0.5至1小时，仅有第一流动相；第二阶段0.5小时至2.5小时，第一和第二流动相的比例为2.5:1~1.5:1；第三阶段1小时至3.5小时，仅有第二流动相。

其中所述第二流动相如下配制：向容器中加入90~100重量份纯化水，0.05~0.06份三乙胺和0.1至0.2份磷酸，搅拌均匀。

7.根据项6所述的方法，其中，使用酸性溶液对所述洗脱液进行纳滤处理，其中所述酸性物质优选为盐酸；

所述酸性溶液如下进行配制：100~115重量份纯化水和0.2~5重量份的盐酸，优选盐酸为0.2~1.0重量份。

8.如项7所述的纯化方法，其进一步包括在冻干之前使用旋转蒸发仪的对含有产品且经过纳滤的洗脱液进行浓缩的步骤。

9.如项8所述的纯化方法，其中，在所述浓缩步骤中，收集富含PSMA抑制剂产品且经过纳滤的洗脱液，转移至旋转蒸发仪中，于20°C~35°C的外浴温度。

10.如项8或9所述的纯化方法，其进一步包括对浓缩后的产品进行冻干的步骤。

11.如项10所述的纯化方法，其中在所述冻干步骤中，将浓缩残留液通过蠕动泵经0.22μm囊式过滤器依次泵入若干不锈钢冻干盘中，体系冻干至水分残留 ≤400ppm；最后进行收料，得到深紫色固体粉末。

本申请的技术方案实现的有益技术效果：

由于本申请的目标化学物是个准大分子化合物，其制备极为复杂，且成本高昂。使用本申请提供的技术，来自于化学反应步骤的反应中间体、副产物、手性异构体和无机盐、缚酸剂等杂质可以在单一的纯化步骤中一次性去除，成本低廉。具体地，通过所述纯化能够将PSMA抑制剂与其旋光异构体分离，所述PSMA抑制剂的旋光异构体为：

(((1S)-5-((2S)-2-(4-((cis)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7, 10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸，和

(((1R)-5-((2S)-2-(4-((trans)- (2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸。

附图说明

图1本申请的纯化步骤所针对的化学反应流程图。

图2本申请的纯化步骤的制备色谱图；该制备色谱图含有以下组分：组分1(RRT:0.75)为普通杂质，组分2为产品，组分4(RRT:1.05)和组分5(RRT:1.07)为两个旋光异构体，组分3为产品和杂质的混合部分。在制备液相图谱中，如图2。使用特定的手性添加剂的流动相可以将上述旋光异构体，组分4(RRT:1.05)和组分5(RRT:1.07)彻底清除，普通制备型色谱不能有效将旋光异构体清除。

图3本申请中对比例3使用普通流动相纯化后的液相色谱图；使用传统的液相分离方法(本专利使用水/三氟乙酸作为流动相)，对手性异构体组分1(RRT0.75)和组分5(RRT1.07)效果清除效果不明显。注：本液相图谱与图4使用同一种液相分离方法（非制备时的图谱），用于区分使用普通流动相与手性流动相的清除旋光异构体的杂质的能力，不代表图3是使用普通流动相时的“制备色谱图”。

图4本申请中实施例4使用手性流动相纯化后的液相色谱图。使用手性流动相(即在普通流动相中使用特殊的添加剂)可以对特定的杂质具有特定的清除效果，如图，主峰右边的手性杂质已被清除至较低的水平，直至达到合格的标准。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

如本文所用，就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05%，优选低于0.01%。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。

如在本说明书中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”一起使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。

在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本申请内容支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。

贯穿本申请，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。

本申请在提供了一种对PSMA抑制剂进行纯化的方法。

在一个具体实施方式中，提供了一种对反应料液进行纯化以得到PSMA抑制剂产品的方法，其中，

所述PSMA抑制剂存在于反应物一和反应物二反应得到的反应料液中，

其中反应物一为，

S-2,2',2''-(10-(2-((1-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯] -4-基)氨基)-6-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸。

而反应物二为，

(((S)-1-羧基-5-((S)-2-((反)-4-((2-巯基乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺基)-3-(萘-2-基)丙酰胺基)戊基)氨甲酰)-L-谷氨酸；

反应物一和反应物二发生反应得到的所述PSMA抑制剂为；

(((1S)-5-((2S)-2-(4-((反)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸。

所述方法包括：

利用手性流动相和制备型色谱柱的纯化体系对上述由反应物一和反应物二制备的PSMA抑制剂的反应料液进行纯化，所述纯化体系的制备步骤为：

-使用装料溶液对所述制备型色谱柱进行装料；

-使用第一流动相对制备型色谱柱进行柱平衡；

-使由反应物一和反应物二制备的PSMA抑制剂的反应料液通过色谱柱；

-使用第一流动相和第二流动相对所述制备型色谱柱进行梯度洗脱；

-使用酸性溶液对洗脱液进行纳滤处理，以实现脱盐；

-脱盐后得到富含PSMA抑制剂产品的溶液；

-对所述富含PSMA抑制剂的溶液冻干，而后得到PSMA抑制剂产品；

其中第一流动相是手性流动相，其具有含氮六元桥环的手性添加剂，其桥环上的α和β位为手性碳；

其中第二流动相是含有缓冲盐的流动相，其具有磷酸/三乙胺添加剂。

在本说明书的上下文中，PSMA抑制剂特指化学名称为下述的准大分子化合物：(((1S)-5-((2S)-2-(4-((反)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸；该化合物最早由美国健康及人类服务部(NIH)提交化合物及其用途专利，见WO2019/019140。前列腺特异性膜抗原(PSMA)是位于前列腺上皮细胞表面的跨膜蛋白，在正常前列腺以及前列腺增生细胞表面有所表达，在绝大多数前列腺癌细胞中明显上调(100-1000倍)，因此 PSMA 已成为前列腺癌特异性诊断和治疗的重要靶点，是近年研究的热点之一。谷氨酸尿素小分子及其类似物(Glu-urea-R)是叶酸水解酶I活性抑制剂，同时能够竞争性抑制PSMA的NAALADase酶活性，因此能够高效、靶向的与前列腺癌细胞表面的PSMA相结合，并且通过内化作用进入到前列腺癌细胞内，该内化作用可方便将放射性治疗核素携带进入前列腺癌细胞达到治疗作用。基于谷氨酸尿素结构的小分子 PET显像剂在临床诊疗上展现出极大的潜力，文献已报告了几十种基于 Glu-urea 的显像剂及治疗药物，如：68Ga-PSMA-11、18F-DCFPyL、18F-PSMA-1007 等。68Ga-PSMA-11于2020年获美国FDA批准，表现为快速的体内清除，但 PSA 水平低于 2ng/mL 时灵敏度下降；18F-PSMA1007和18F-DCFPyL 在PSA水平低时灵敏度同样不高。同时由于结构的限制，该类显像剂不能直接用于治疗；而177Lu-PSMA-617由于良好的CRPC治疗效果被美国核医学年会评为2019 年年度图像，但其在腺体上的高摄取所致的毒副作用(干燥综合症)，仍是阻碍临床推广应用的主要因素；同时177Lu-PSMA-617直接用镓-68Ga标记时难以得到商品化供应，同时68Ga的beta能量高，图像不及18F，导致诊断灵敏度下降。在本技术领域，实现PSMA抑制剂的低成本生产因此具有重要的医学和经济价值。

本发明提供了以奎尼丁作为手性流动相的添加剂对于PSMA抑制剂的提纯方法；包括PSMA抑制剂的制备方法，色谱柱及手性流动相的配制方法。

本发明的技术方案是：以奎尼丁作为手性流动相添加剂，分离纯化PSMA抑制剂的方法，依次包括以下步骤：步骤一，制备PSMA抑制剂的反应液；步骤二，制备色谱柱，以YMC*GEL ODS-AQ-HG，12nm S-15μm作为填料，用奎尼丁作为手性添加剂的流动相进行洗脱，浓缩后得到PSMA抑制剂的产品。HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途径：间接法和直接法。其中直接法包括手性流动相添加剂法(CMP)和手性固定相法(CSP)，间接法(CDR)又称为非对映体拆分法或柱前手性衍生化法。

间接法(CDR)是手性化合物对映体在分离之前把手性药物对映体混合物在预处理液中进行柱前衍生化，形成一对非对映异构体，非对映体对与固定相之间的键合力如偶极-偶极、电荷转移、氢键、疏水性不等，产生差速迁移而被分离。其优点在于：可采用通用的非手性柱分离；通过衍生化可提高检测灵敏度；分离条件简单；分离效果好。而其缺点在于：要有可被衍生化的基团；要有高光学纯度的手性试剂；对个对映体衍生化率速和平衡常数应一致；衍生化和色谱过程中不能发生消旋化。申请人的化合物不稳定，难以进行衍生化，且为大分子，官能团较多，脱衍生化困难。

手性固定相法(CSP)是将手性试剂化学键合到固定相上制成手性柱，外消旋体中的一个手性物质与手性固定相发生作用，生成不稳定的短暂复合物，而两者在固定相中的保留时间不同，从而达到分离的目的。优点是：能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定；除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂；样品处理步骤简单；制备分离方便，定量分析的可靠性较高；缺点是：样品有时也须作柱前衍生(但不一定是手性衍生化试剂)；对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通HPLC固定相(包括正相和反相)那样广泛。该方法是目前认为非常简单有效，而且应用最为广泛的方法，迄今为止，CSP柱商品已有40多种，但价格大多昂贵，尚未有一种具有类似ODS柱的普遍适用性。手性填料昂贵，无法应用于生产。

制备型色谱的分离方法通常是在分析型色谱的基础上通过选择合适的固定相而不断摸索得到。C18是最为常用的制备型色谱填料。在制备型色谱中，样品组分的容量因子通常在 2.5-20之间。制备型色谱的分离过程是使色谱柱处于过载状态，通过牺牲一定的分离度来获取高纯度样品的最大产率，选择因子和分离度可通过调节流动相的组成以及梯度的斜率进行优化。

手性流动相添加剂法(CMP)是将手性试剂加到LC流动相中，与手性药物生成可逆的非对映体复合物，根据复合物的稳定性，在流动相中的溶解性和与固定相的键合力差异，于非手性固定相上分离对映体。优点是：不需昂贵的手性柱，亦无须进行柱前衍生，手性添加剂可视要求而更换，可变范围较宽，使用比较方便。缺点是：可拆分的化合物范围有限；某些添加剂不够稳定且往往会干扰测验。但是手性流动相很便宜，且可以回收利用。

在再一具体实施方式中提供了一种PSMA抑制剂纯化方法，其中，通过所述纯化能够将PSMA抑制剂与其旋光异构体分离，所述PSMA抑制剂的旋光异构体为：

(((1S)-5-((2S)-2-(4-((cis)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7, 10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸和

(((1R)-5-((2S)-2-(4-((trans)- (2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸。

在又一具体实施方式中，提供了一种PSMA抑制剂纯化方法，其中，所述手性流动相中使用的填料为亲水型反相填料。

根据流动相和固定相相对极性不同，液相色谱分为正相色谱和反相色谱。在本说明书的上下文中，把流动相极性大于固定相极性的情况称为反相色谱。常见地，非极性键合相色谱可作反相色谱，其在现代液相色谱中应用最广泛，现代液相色谱分析工作的70%以上是在非极性键合固定相上进行的。本申请的制备色谱柱属于反相色谱。进一步地，虽然固定相极性相对于流动相较弱，但是固定相仍是亲水性的。在本申请中，所使用的亲水型反相填料为YMC*GEL ODS-AQ-HG，粒径为12nm S-15μm。

在又一具体实施方式中，提供了一种PSMA抑制剂纯化方法，使用装料溶液对制备型色谱柱进行的装料步骤包括：根据该制备型色谱柱的容积，取一重量份的异丙醇、以及2~10重量份的填料，匀浆得到装料溶液；填料优选为2~5份；然后将所述装料溶液摇匀后倒入制备型色谱柱中。

在再一具体实施方式中，提供了PSMA抑制剂纯化方法，使用第一流动相对所述制备型色谱柱进行柱平衡，其中，

所述柱平衡反应的持续时间为2-5h，优选为4h。

所述第一流动相如下配制：根据过柱所需的实际用量，向容器中加入100重量份纯化水，2~6重量份具有含氮六元桥环的手性添加剂，其桥环上的α和β位为手性碳；和5~10重量份乙酸，搅拌均匀；所述具有含氮六元桥环的手性添加剂优选为2~3重量份，所述乙酸优选为5~7重量份；

所述具有含氮六元桥环的手性添加剂优选为奎尼丁。

在又一具体实施方式中，提供了PSMA抑制剂纯化方法，其中，使用第一和第二流动相进行梯度洗脱的方案为：第一阶段0.5至1小时，仅有第一流动相；第二阶段0.5小时至2.5小时，第一和第二流动相的比例为2.5:1~1.5:1；第三阶段1小时至3.5小时，仅有第二流动相；

其中所述第二流动相如下配制：向容器中加入90~100重量份纯化水，0.05~0.06份三乙胺和0.1至0.2份磷酸，搅拌均匀。

在又一具体实施方式中，提供了PSMA抑制剂纯化方法，其中，使用酸性溶液对所述洗脱液进行纳滤处理，其中所述酸性物质优选为盐酸；

所述酸性溶液如下进行配制：100~115重量份纯化水和0.2~5重量份的盐酸，优选盐酸为0.2~1.0重量份。

在一个具体实施方式中，提供了一种PSMA抑制剂纯化方法，其中，其进一步包括在冻干之前使用旋转蒸发仪的对含有产品且经过纳滤的洗脱液进行浓缩的步骤；其中，在所述浓缩步骤中，收集富含PSMA抑制剂产品且经过纳滤的洗脱液，转移至旋转蒸发仪中，于20°C~35°C的外浴温度，使洗脱液的体积适配冻干机。

在又一具体实施方式中，提供了一种PSMA抑制剂纯化方法，其中，其进一步包括冻干步骤；其中在所述冻干步骤中，将浓缩残留液通过蠕动泵经0.22μm囊式过滤器依次泵入若干不锈钢冻干盘中，体系冻干至水分残留 ≤ 400ppm；最后进行收料，得到深紫色固体粉末。

在本说明书的上下文中，“冻干”利用升华的原理使物料脱水的一种干燥技术。物料经快速冻结后，在真空 (低于水的三相点压力)环境下加热。由于本申请目的产物的稳定性较差，因此适合于使用冻干技术在低温下进行精制。

实施例部分

实施例1：制得目标产物粗品溶液

根据已知的技术路线通过反应物一和反应物二制备得到本申请的目标产物粗品溶液。

其中，所述反应物一的化学名称为：

S-2,2',2''-(10-(2-((1-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯] -4-基)氨基)-6-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸；

而反应物二的化学名称为：

(((1S)-5-((2S)-2-(4-((trans)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸；

本申请的待纯化的目标产物(PSMA抑制剂)的化学名称为(((1S)-5-((2S)-2-(4-((trans)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸。

氮气保护下向反应釜中先后加入6kg纯化水，150g磷酸氢二钠，45g氯化钠和100gL-抗坏血酸，搅拌至澄清。向体系中滴加磷酸氢二钠或盐酸调节体系pH=6-9，每次滴加完毕搅拌90min后检测pH。体系液面下通氮气除氧3h，将除氧后体系放入塑料桶中暂存。

氮气保护下，向反应釜中加入2.1kg上述溶液和120g 的反应物一；然后向体系中先后加入2.7kg N,N-二甲基甲酰胺和53g 的反应物二。控温10-35°C，保温反应2h后开始取样检测，2~4h取样检测一次，直至反应物二/目标产物的面积比≤10%。反应液过滤后，得粗品滤液。

该粗品滤液含有以下组分：组分1(RRT:0.75)为普通杂质，组分2为产品，组分4(RRT:1.05)和组分5(RRT:1.07)为两个旋光异构体，组分3为产品和杂质的混合部分。在制备液相图谱中，如图2。使用普通制备型色谱不能有效将旋光异构体组分4(RRT:1.05)和组分5(RRT:1.07)清除。

本申请技术的目的即针对难以去除的手性异构体杂质即图2中的组分4和组分5。其中组分4：(((1S)-5-((2S)-2-(4-((cis)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸(RRT1.05)和组分5：(((1R)-5-((2S)-2-(4-((trans)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸(RRT1.07)。

实施例2：对粗品滤液进行纯化，得到目标产物。

把实施例1得到的粗品滤液用下述方法分步纯化。

1.手性流动相及填料的制备，填料：YMC*GEL ODS-AQ-HG，12nm S-15μm；第一流动相：向釜中加入65kg纯化水，1950g奎尼丁和1950g乙酸，搅拌均匀，得到第一流动相；第二流动相：向釜中加入60kg纯化水，35g三乙胺和120g磷酸，搅拌均匀，得到第二流动相；其中，第一流动相也称“手性流动相”，其中的手性成分是奎尼丁。

2.纯化步骤：取YMC*GEL ODS-AQ-HG，12nm S-15μm填料25kg和异丙醇6kg进行匀浆，得到填料溶液，摇匀后倒入制备柱进行装柱。

确认管路连接无误后，进行输液泵流速精度测试。测试完毕后，使用第一流动相对所述制备型色谱柱进行柱平衡4h；使用第一和第二流动相进行梯度洗脱：第一阶段0.5小时，仅有第一流动相；第二阶段1小时，第一和第二流动相的比例为2.5:1~1.5:1；第三阶段2小时，仅有第二流动相。

将收集到的组分，经过300D的有机膜纳滤，将添加剂等小分子去除，然后送HPLC检测，纯度≥96%，最大杂质≤1.2%为合格组分，氮气保护下，合并暂存。

。

3.浓缩步骤：收集合格组分，转移至旋转蒸发仪中，于外浴温度T≤35°C，P≤-0.09MPa。

4.冻干步骤：进行冻干机参数设置，将产品溶液通过蠕动泵经0.22μm囊式过滤器泵入不锈钢冻干盘中，每盘1kg，最后一盘的量0~1kg，体系冻干至水分残留 ≤400ppm。

5.收料，得到深紫色固体粉末，回收率73.5%。

纯化步骤的实验结果：典型液相色谱图见图4。使用手性流动相(即在普通流动相中使用特殊的添加剂)可以对特定的杂质具有特定的清除效果，主峰（保留时间：16.019min）右边的手性杂质（保留时间：16.605min和保留时间：16.845min）已被清除至较低的水平，直至达到合格的标准。

第一份收集82.5~85.0min：奎尼丁=3.15%；

第二份收集85.0~90.0min：奎尼丁=2.04%；

第三份收集90.0~93.0min：奎尼丁=1.32%；

第四份收集93.0~102.0min：奎尼丁=0.45%，

第五份收集102.0~140.0min：奎尼丁=0.17%。

根据这5个组分冻干产品的奎尼丁检测结果可以得出：结合奎尼丁能力强的目标产物先从柱子上冲出，与奎尼丁结合能力弱的目标产物后冲出。因此产品即组分2在组分4和组分5之前冲出，达到分离的效果。

如图2所示，组分2为目标产物，而组分4(RRT1.05)和组分5(RRT1.07)为目标产物的手性异构体。使用奎尼丁等，作为添加剂的手性流动相，可以和拥有trans-硫代酰胺结构的化合物，即(((1S)-5-((2S)-2-(4-((trans)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸，形成可逆的盐，从而可以将目标产物以盐的形式洗脱出来，再经过盐酸脱盐处理，得到纯化的产物在本实施例中，使用奎尼丁作为手性流动相的添加剂，对手性异构体组分4(RRT1.05)和体组分5((RRT1.07)有特殊的纯化效果。

经过本工艺纯化后的化合物，目标产物具有纯度高、旋光异构体含量低的特点，且工艺稳定，可稳定放大生产，批次125111-01批量放大至160g。根据本本次放大批次的操作，对该纯化工艺又进行了奎尼丁添加量的边界挑战实验（在批次125111-01基础上，将奎尼丁的重量份更改为2重量份和6重量份），包括批号：125111-02（2重量份）和批号：125111-02（6重量份），符合质量标准，检测数据如下：

检验结果

。

对比例.1：产品批号125111-04

填料：YMC*GEL ODS-AQ-HG，12nm S-15μm，负载量1g/100g填料

流动相A：水，(R)-N-甲基-2-苯乙胺

流动相B：乙腈

。

柱层析结果：回收率57.22%

。

对比例2：产品批号125111-05

填料：YMC*GEL ODS-AQ-HG，12nm S-15μm，负载量1g/80g填料

流动相C：水，奎宁

流动相D：甲醇

。

柱层析结果：回收率32.5%

。

对比例3：产品批号125111-06

填料：YMC*GEL ODS-AQ-HG，12nm S-15μm，负载量1g/80g填料

流动相E：水/0.5%三氟乙酸

流动相F：甲醇

。

柱层析结果：回收率46.7%

。

纯化步骤的实验结果：典型液相色谱图见图3。使用传统的液相分离方法(本专利使用水/三氟乙酸作为流动相)，对主峰（保留时间：16.019min）右边的手性杂质（保留时间：16.605min和保留时间：16.845min），杂质在制备液相色谱图中，如图2，为手性异构体组分1(RRT0.75)和组分5(RRT1.07)，已被清除水平较低，不能达到合格的标准。且由于需要多次纯化，纯化后的因此回收率也非常低，分离效果不好。使用手性流动相(即在普通流动相中使用特殊的添加剂)可以对特定的杂质有特定的清除效果，如图4，主峰右边的手性杂质已被清除至较低的水平。

其结果对比如下：

。

从上表可以看出，使用传统分离方法(不使用手性流动相添加剂)时，对手性异构体RRT1.05和异构体RRT1.07的清除效果较小，在使用手性流动相添加剂((R)-N-甲基-2-苯乙胺，奎宁或奎尼丁)后，发现(R)-N-甲基-2-苯乙胺和奎宁对RRT1.07处的异构体杂质有一定的清除效果，尤其是奎宁对RRT1.07处的杂质有显著的清除效果，但二者对RRT1.05处的异构体杂质的清除效果较小，只有奎尼丁能够对手性异构体RRT1.05和RRT1.07同时具有清除效果。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims (15)

1.一种对反应料液进行纯化以得到PSMA抑制剂产品的方法，其中，

所述PSMA抑制剂存在于反应物一和反应物二反应得到的反应料液中，

其中反应物一为

S-2,2',2''-(10-(2-((1-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯] -4-基)氨基)-6-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸；

而反应物二为

(((S)-1-羧基-5-((S)-2-((反)-4-((2-巯基乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺基)-3-(萘-2-基)丙酰胺基)戊基)氨甲酰)-L-谷氨酸；

反应物一和反应物二发生反应得到的所述PSMA抑制剂为

(((1S)-5-((2S)-2-(4-((反)-(2-((1-(3-(((S)-6-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺酸基萘-2-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)胺)-6-氧代-5-(2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰胺基)己基)氨基)-3-氧代丙烷基)-2,5-二氧代吡咯-3-基)硫代)乙酰胺基)甲基)环己烷-1-甲酰胺)-3-(萘-2-基)丙氨基)-1-羧基戊烷基)胺基甲酰)-L-谷氨酸；

所述方法包括：

利用手性流动相和制备型色谱柱的纯化体系对上述由反应物一和反应物二制备的PSMA抑制剂的反应料液进行纯化，所述纯化体系的制备步骤为：

-使用装料溶液对所述制备型色谱柱进行装料；

-使用第一流动相对制备型色谱柱进行柱平衡；

-使由反应物一和反应物二制备的PSMA抑制剂的反应料液通过色谱柱；

-使用第一流动相和第二流动相对所述制备型色谱柱进行梯度洗脱；

-使用酸性溶液对洗脱液进行纳滤处理，以实现脱盐；

-脱盐后得到富含PSMA抑制剂产品的溶液；

-对所述富含PSMA抑制剂的溶液冻干，而后得到PSMA抑制剂产品；

其中第一流动相是手性流动相，其具有含氮六元桥环的手性添加剂，其桥环上的α和β位为手性碳；

其中第二流动相是含有缓冲盐的流动相，其具有磷酸/三乙胺添加剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述制备型色谱柱中使用的填料为亲水型反相填料。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述亲水型反相填料为YMC*GEL ODS-AQ-HG，粒径为12nm S-15μm。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，使用装料溶液对制备型色谱柱进行的装料步骤包括：

根据该制备型色谱柱的容积，取一重量份的异丙醇、以及2~10重量份的填料，匀浆得到装料溶液；然后将所述装料溶液摇匀后倒入制备型色谱柱中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述填料为2~5重量份。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，使用第一流动相对所述制备型色谱柱进行柱平衡，其中，

所述柱平衡反应的持续时间为2-5h；

所述第一流动相如下配制：根据过柱所需的实际用量，向容器中加入100重量份纯化水，大于2重量份的具有含氮六元桥环的手性添加剂，其桥环上的α和β位为手性碳；和5~10重量份乙酸，搅拌均匀。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述柱平衡反应的持续时间为4h；而具有含氮六元桥环的手性添加剂为2~6重量份；所述乙酸为5~7重量份；而所述具有含氮六元桥环的手性添加剂为奎尼丁。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，使用第一和第二流动相进行梯度洗脱的方案为：第一阶段0.5至1小时，仅有第一流动相；第二阶段0.5小时至2.5小时，第一和第二流动相的比例为2.5:1~1.5:1；第三阶段1小时至3.5小时，仅有第二流动相；

其中所述第二流动相如下配制：向容器中加入90~100重量份纯化水，0.05~0.06份三乙胺和0.1至0.2份磷酸，搅拌均匀。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，使用酸性溶液对所述洗脱液进行纳滤处理。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述酸性溶液如下进行配制：100~115重量份纯化水和0.2~5重量份的盐酸。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述盐酸为0.2~1.0重量份。

12.如权利要求9所述的纯化方法，其进一步包括在冻干之前使用旋转蒸发仪的对含有产品且经过纳滤的洗脱液进行浓缩的步骤。

13.如权利要求12所述的纯化方法，其中，在所述浓缩步骤中，收集富含PSMA抑制剂产品且经过纳滤的洗脱液，转移至旋转蒸发仪中，于20°C~35°C的外浴温度。

14.如权利要求12或13所述的纯化方法，其进一步包括对浓缩后的产品进行冻干的步骤。

15.如权利要求14所述的纯化方法，其中在所述冻干步骤中，将浓缩残留液通过蠕动泵经0.22μm囊式过滤器依次泵入若干不锈钢冻干盘中，体系冻干至水分残留 ≤400ppm；最后进行收料，得到深紫色固体粉末。

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