CN115845124B - 一种水凝胶敷料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水凝胶敷料及其制备方法与应用，所述制备方法包括以下步骤：S1：分别配制壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液、TPA水溶液、交联剂溶液；所述TPA水溶液的溶质为N¹‑(4‑硼苄基)‑N³‑(4‑硼苯基)‑N¹，N¹，N³，N³‑四甲基‑1，3‑二胺；S2：将所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液与所述TPA水溶液进行混合，搅拌均匀后获得混合液A；S3：向所述混合液A中加入所述交联剂溶液，搅拌均匀后获得混合液B；S4：静置所述混合液B，获得所述水凝胶敷料。本发明能够增加水凝胶孔的数目和孔径，能够提高吸水率，从而促进细胞的增殖和黏附；在促进创伤修复的同时抑制瘢痕形成，对皮肤的创伤愈合提供技术支持。

Description

一种水凝胶敷料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，特别涉及一种水凝胶敷料及其制备方法与应用。

背景技术

皮肤是生物体最大的器官，大致可分为表皮和真皮以及皮下组织，约占全身体重的16％，是人体与外界环境接触的第一道屏障，能阻止微生物的入侵，同时它还对体液内环境的调控、体温调节、免疫监控和自身愈合起着重要作用，还能有效防止体内各种营养物质、电解质和水分等的流失。

但人类在社会活动的过程中，皮肤不可避免地受到创伤，这就会造成新陈代谢紊乱、免疫失调及电解质平衡失调等一系列危害健康的病理变化，严重情况下会导致人体休克甚至危及生命。创伤愈合是一个复杂的过程，面临着一系列恶劣的环境，包括大量的渗出液堆积、氧化应激、过长的炎症阶段、成纤维细胞向瘢痕成纤维细胞转化等，这些恶劣的环境会阻碍创伤修复和再生的过程并影响创伤修复的质量。据报道，低的伤口愈合速率以及成纤维细胞向瘢痕成纤维细胞转化会并引起纤维化瘢痕的形成。过度的皮肤瘢痕增生不仅会导致皮肤组织功能的丧失、而且使运动受到限制，甚至导致严重的心理疾病。

虽然目前在促进伤口愈合及减少瘢痕形成方面已经有了许多的研究，并开发了各种类型的医用伤口护理产品，但在促进创伤修复和抑制创面瘢痕形成方面仍然具有很大的局限性。因此，急需开发出一种既能促进创伤修复，又能抑制创面瘢痕形成的新型功能化敷料。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提供一种水凝胶敷料及其制备方法与应用，能够在加速创伤修复的同时抑制创面瘢痕形成。

本发明的技术方案如下：

一方面，提供一种水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

S1：分别配制壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液、TPA水溶液、交联剂溶液；所述TPA水溶液的溶质为N¹-(4-硼苄基)-N³-(4-硼苯基)-N¹，N¹，N³，N³-四甲基-1，3-二胺；

S2：将所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液与所述TPA水溶液进行混合，搅拌均匀后获得混合液A；

S3：向所述混合液A中加入所述交联剂溶液，搅拌均匀后获得混合液B；

S4：静置所述混合液B，获得所述水凝胶敷料。

作为优选，步骤S1中，配制所述交联剂溶液时，采用的交联剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、戊二醛、京尼平中的任意一种或多种。

作为优选，步骤S1中，所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液的浓度为0.01-0.1g/ml，所述TPA水溶液的浓度为0.001-1g/ml；

作为优选，步骤S2中，所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液与所述TPA水溶液的体积比为1:1-36:1；

作为优选，步骤S3中，混合液A与所述交联剂溶液的体积比为1:1-15:1。

作为优选，步骤S1中，所述TPA水溶液的溶质通过以下步骤制备而成：

S11：将N，N，N'，N'-四甲基-1,3-丙二胺与4-(溴甲基)苯硼酸在有机溶剂中进行溶解混合，获得混合液A'；

S12：将所述混合液A'在60-80℃条件下搅拌16-24h，然后与四氢呋喃进行混合，获得混合液B'；

S13：将所述混合液B'在0-8℃条件下静置30-90min，然后进行离心、洗涤、干燥，获得所述N¹-(4-硼苄基)-N³-(4-硼苯基)-N¹，N¹，N³，N³-四甲基-1，3-二胺。

作为优选，步骤S11中，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、丁酮、甲苯中的任意一种或多种；步骤S12中，与四氢呋喃进行混合时，所述混合液A'与所述四氢呋喃的体积比为1:20-1:10，所述四氢呋喃的温度与步骤S13静置时的温度相同；步骤S13中，进行洗涤时，采用四氢呋喃进行洗涤；进行干燥时，在真空条件下进行干燥。

作为优选，步骤S4中，静置所述混合液B时，在25-37℃条件下静置15-24h。

作为优选，还包括对所述水凝胶敷料进行改性，提高所述水凝胶敷料的生物相容性的步骤。

作为优选，对所述水凝胶敷料进行改性具体包括以下步骤：

S5：将所述水凝胶敷料在多巴胺溶液中浸泡4-8h，然后采用去离子水对所述水凝胶敷料进行多次浸泡，直至浸泡的去离子水变为澄清；

S6：去除步骤S5中的澄清液体，随后加入RGD水溶液，浸泡8-12h后去除液体，得到改性后的水凝胶敷料；所述RGD水溶液的溶质为RGD序列；所述RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成。

作为优选，步骤S5中，采用去离子水对所述水凝胶敷料进行浸泡时，每次浸泡8-12h。

另一方面，还提供一种上述任意一项所述的水凝胶敷料的制备方法制备而成的水凝胶敷料，以及所述水凝胶敷料在皮肤创伤修复和抑制瘢痕形成中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明能够快速地促进创伤的愈合并减少创面瘢痕的形成，能够为皮肤创伤的治疗提供技术支持。

(2)本发明在加入TPA后能够增加水凝胶孔的数目和孔径，能够提高吸水率，能够促进细胞的增殖和黏附。

(3)本发明在加入TPA后能够抑制氧化应激，抑制炎症，改善创伤愈合的微环境，抑制成纤维细胞向瘢痕成纤维细胞转化。

(4)本发明制备工艺简易，生产条件简单，容易实现产业化，符合市场需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料的形貌图及孔径统计图；

图2为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料在24h后的吸水率统计图；

图3为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料对H₂O₂的清除率统计图；

图4为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料对羟基自由基的清除率统计图；

图5为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料对超氧阴离子的清除率统计图；

图6为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料促细胞增殖、黏附、铺展图；

图7为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料减少炎症反应效果图；

图8为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料抑制瘢痕相关基因的表达统计图；

图9为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料促进大鼠伤口愈合过程的代表性图以及不同时间点愈合分数统计图；

图10为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料处理伤口后第7d和14d的H&E染色图以及表面层厚度统计图；

图11为一个具体实施例不同TPA含量的水凝胶敷料处理伤口后第14天的免疫荧光染色图以及Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的面积统计图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的技术特征可以相互结合。需要指出的是，除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本发明公开使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。

一方面，如图1所示，本发明提供一种水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

S1：分别配制壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液、TPA水溶液、交联剂溶液；所述TPA水溶液的溶质为N¹-(4-硼苄基)-N³-(4-硼苯基)-N¹，N¹，N³，N³-四甲基-1，3-二胺。

在一个具体的实施例中，配制所述交联剂溶液时，采用的交联剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、戊二醛、京尼平中的任意一种或多种。

S2：将所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液与所述TPA水溶液进行混合，搅拌均匀后获得混合液A。

S3：向所述混合液A中加入所述交联剂溶液，搅拌均匀后获得混合液B。

S4：静置所述混合液B，获得所述水凝胶敷料。

在一个具体的实施例中，步骤S1中，所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液的浓度为0.01-0.1g/ml，所述TPA水溶液的浓度为0.001-1g/ml；步骤S2中，所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液与所述TPA水溶液的体积比为1:1-36:1；步骤S3中，混合液A与所述交联剂溶液的体积比为1:1-15:1；步骤S4中，静置所述混合液B时，在25-37℃条件下静置15-24h。

在一个具体的实施例中，如图1所示，所述TPA水溶液的溶质通过以下步骤制备而成：

S11：将N，N，N'，N'-四甲基-1,3-丙二胺与4-(溴甲基)苯硼酸在有机溶剂中进行溶解混合，获得混合液A'；

S12：将所述混合液A'在60-80℃条件下搅拌16-24h，然后与四氢呋喃进行混合，获得混合液B'；

S13：将所述混合液B'在0-8℃条件下静置30-90min，然后进行离心、洗涤、干燥，获得所述N¹-(4-硼苄基)-N³-(4-硼苯基)-N¹，N¹，N³，N³-四甲基-1，3-二胺。

在一个具体的实施例中，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、丁酮、甲苯中的任意一种或多种；步骤S12中，与四氢呋喃进行混合时，所述混合液A'与所述四氢呋喃的体积比为1:20-1:10，所述四氢呋喃的温度与步骤S13静置时的温度相同；步骤S13中，进行洗涤时，采用四氢呋喃进行洗涤；进行干燥时，在真空条件下进行干燥。

需要说明的是，上述实施例仅为TPA的一个优选制备方法，本领域技术人员在已知TPA的结构式情况下，可采用其他制备方法制备所述TPA。

在一个具体的实施例中，本发明所述水凝胶敷料的制备方法还包括对所述水凝胶敷料进行改性，提高所述水凝胶敷料的生物相容性的步骤。

在一个具体的实施例中，对所述水凝胶敷料进行改性具体包括以下步骤：

S5：将所述水凝胶敷料在多巴胺溶液中浸泡4-8h，然后采用去离子水对所述水凝胶敷料进行多次浸泡，直至浸泡的去离子水变为澄清；

S6：去除步骤S5中的澄清液体，随后加入RGD水溶液，浸泡8-12h后去除液体，得到改性后的水凝胶敷料；所述RGD水溶液的溶质为RGD序列；所述RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成。

在一个具体的实施例中，所述多巴胺溶液的浓度为5mg/ml，所述RGD水溶液的浓度为100μg/ml，采用去离子水对所述水凝胶敷料进行浸泡时，每次浸泡8-12h。

另一方面，本发明还提供一种上述任意一项所述的水凝胶敷料的制备方法制备而成的水凝胶敷料，以及所述水凝胶敷料在皮肤创伤修复和抑制瘢痕形成中的应用。

实施例1

一种水凝胶敷料，通过以下步骤制备而成：

(1)将0.1gN，N，N'，N'-四甲基-1,3-丙二胺和0.5g4-(溴甲基)苯硼酸溶解在10ml二甲基甲酰胺中并混合在一起。在60℃下搅拌16h后，将混合物倒入100ml4℃的四氢呋喃中，静置30min后，在4℃条件下以1000r的转速离心10min，并分别用20ml4℃的四氢呋喃进行三次洗涤。在真空下干燥过夜后，获得纯的TPA(0.3g)；

(2)准确称量0.02g羧甲基壳聚糖，加入0.9mL去离子水溶解，然后加入0.1mL0.1g/mL的TPA水溶液，搅拌均匀，得到混合液A；

(3)在混合液A中加入0.1mL0.01g/mL的京尼平水溶液，并搅拌均匀，得到混合液B；

(4)把混合液B放置在37℃环境中，15h后形成水凝胶；

(5)将5mg/mL的多巴胺溶液加到步骤(4)所得水凝胶的表面，浸泡4.5h，随后加入去离子水浸泡，每12h更换一次去离子水，直至液体变为澄清；

(6)吸走步骤(5)中的澄清液体，随后加入100μg/mL的RGD水溶液，浸泡过夜，随后吸走液体，制得所述水凝胶敷料，记为CT1。

实施例2

与实施例1不同的是，本实施例步骤(2)中加入的TPA水溶液浓度为0.2g/mL，制得水凝胶敷料记为CT2。

实施例3

与实施例1不同的是，本实施例步骤(2)中加入的TPA水溶液浓度为0.3g/mL，制得水凝胶敷料记为CT3。

实施例4

与实施例1不同的是，本实施例步骤(2)中加入的TPA水溶液浓度为0.4g/mL，制得水凝胶敷料记为CT4。

实施例5

与实施例1不同的是，本实施例步骤(1)采用的有机溶剂为丁酮，所述混合液A'与所述四氢呋喃的体积比为1:20，所述四氢呋喃的温度为0℃。

实施例6

与实施例1不同的是，本实施例步骤(1)采用的有机溶剂为甲苯，所述混合液A'与所述四氢呋喃的体积比为1:15，所述四氢呋喃的温度为8℃。

实施例7

与实施例1不同的是，本实施例无需步骤(1)，步骤(2)中的TPA水溶液直接采用购买的TPA药剂配制而成。

实施例8

与实施例1不同的是，本实施例步骤(2)中羧甲基壳聚糖配制的浓度为0.01g/ml。

实施例9

与实施例1不同的是，本实施例步骤(2)中羧甲基壳聚糖配制的浓度为0.1g/ml，所述TPA水溶液的浓度为1g/ml。

实施例10

与实施例1不同的是，本实施例步骤(2)中羧甲基壳聚糖配制的浓度为0.1g/ml，所述TPA水溶液的浓度为0.001g/ml。

实施例11

与实施例1不同的是，本实施例步骤(2)中称量的是壳聚糖，配制的浓度为0.02g/ml，所述TPA水溶液的浓度为0.001g/ml。

实施例12

与实施例1不同的是，本实施例步骤(2)中称量的是壳聚糖，配制的浓度为0.02g/ml，所述TPA水溶液的浓度为1g/ml。

实施例13

与实施例1不同的是，本实施例步骤(4)静置混合液B时，在25℃环境中静置20h。

需要说明的是，除了上述实施例外，本发明还通过单因素变量、正交试验等方法，在本发明上述各限定条件下(端点及中间值)均成功制备得到了既能促进创伤修复，又能抑制创面瘢痕形成的水凝胶敷料。

对比例1

与实施例1不同的是，本对比例步骤(2)中未加入TPA水溶液并用等体积的去离子水进行替代，即TPA水溶液浓度为0g/mL，制得水凝胶敷料记为CT0。

试验例1：不同TPA接枝浓度的水凝胶敷料的形貌表征

将本发明各实施例及对比例制备得到的水凝胶敷料利用冷冻干燥机干燥24h后，对其表面进行喷金处理，随后使用场发射扫描电子显微镜(SEM)观察水凝胶的形貌，其中部分结果如图1所示。从图1可以看出，本发明的水凝胶敷料在加入TPA后孔的数目变多，孔径也有所增大。本发明得到的多孔网状结构的水凝胶敷料能够促进氧和营养物质的交换，有利于细胞粘附、增殖和迁移到水凝胶中，将其应用在伤口修复领域具有高应用价值。

试验例2：不同TPA接枝浓度的水凝胶敷料的吸水率表征

将本发明各实施例及对比例制备得到的水凝胶敷料制成直径为15mm、高度为1.7mm的圆柱体，随后称量其质量为W₀，然后把制得的圆柱体放入PBS中充分浸泡，24后取出，去除表面水分后称其质量为W_y，根据公式吸水率(％)＝(W_y-W₀)/W₀×100计各算组样品的吸水率，结果如图2所示。从图2可以看出，与纯的壳聚糖水凝胶相比，TPA的加入提高了水凝胶的吸水率。理想的敷料应该具有优良的吸水率来吸收伤口渗出物，所以本发明的水凝胶敷料在渗出液较多的伤口修复领域具有高应用价值。

试验例3：不同TPA接枝浓度的水凝胶敷料的H₂O₂清除率表征

将本发明各实施例及对比例制备得到的水凝胶敷料与5mMH₂O₂混合1小时后，使用过氧化氢检测试剂盒(购自南京建成)检测剩余H₂O₂的浓度并计算各组H₂O₂清除率。结果如图3所示。从图3可以看出，与纯的壳聚糖水凝胶敷料相比，TPA的加入提高了水凝胶敷料的H₂O₂清除率，并且水凝胶敷料的H₂O₂清除率表现出TPA浓度依赖性增加。

试验例4：不同TPA接枝浓度的水凝胶敷料的羟基自由基清除率表征

根据产生羟基自由基的经典芬顿反应，将H₂O₂(5mM)和FeCl₂·4H₂O(0.2mg/ml)混合在一起，用以产生羟基自由基，记为溶液A。向各个5mL离心管中均加入1mL亚甲蓝水溶液(50μg/mL)，10分钟后记录各反应液在666nm波长处的吸光值。其中，无本发明所述水凝胶敷料和溶液A的反应液的吸光值记为A₀，只加入溶液A的反应液的吸光值记为A₁，同时加入本发明所述水凝胶敷料和溶液A的反应液的吸光值记为A₂，根据羟基自由基清除率(S·OH)计算公式S·OH＝(A₂-A₁)/(A₀-A₁)×100％计算羟基自由基清除率，结果如图4所示。从图4可以看出，与纯的壳聚糖水凝胶敷料相比，TPA的加入提高了水凝胶敷料的羟基自由基清除率，并且水凝胶敷料的羟基自由基清除率表现出TPA浓度依赖性增加。

试验例5：不同TPA接枝浓度的水凝胶敷料的超氧阴离子清除率表征

将本发明各实施例及对比例制备得到的水凝胶敷料放置于5mL离心管中，然后加入3mLTris-HCl缓冲液(PH＝8.2)，随后加入50μl邻苯三酚(6mM)，15min后记录各管反应液在320nm处的吸光值。其中加有Tris-HCl缓冲液和邻苯三酚的反应液的吸光值记为A₀，加有Tris-HCl缓冲液、邻苯三酚和水凝胶敷料的反应液的吸光值记为A₁。根据超氧阴离子清除率(SO₂ ^-)计算公式SO₂ ^-＝(A₀-A₁)/A₀×100％计算超氧阴离子清除率，结果如图5所示。从图5可以看出，与纯的壳聚糖水凝胶敷料相比，TPA的加入提高了水凝胶敷料的超氧阴离子清除率，并且水凝胶敷料的超氧阴离子清除率表现出TPA浓度依赖性增加。其中，CT4水凝胶敷料清除超氧阴离子效果最好，比纯的壳聚糖水凝胶敷料增加了20％左右。

试验例6：不同TPA接枝浓度的水凝胶敷料的细胞增殖、粘附实验

按本发明在48孔板里制备水凝胶敷料，然后将生长状态良好的L929细胞以1x10⁴每孔的细胞密度接种到水凝胶表面。然后用含10％胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5％CO₂的培养箱中培养3、5、7天后分别用CCK-8检测细胞的增殖情况，并在第二天用二乙酸荧光素(FDA)染色细胞后在倒置荧光显微镜下观察细胞的形貌，结果如图6所示。

其中，图6a为使用CCK-8测试L929细胞在材料上培养3、5、7天增殖情况的测试结果，从图6a中可以看出，只有纯壳聚糖水凝胶组的OD值较前一个时间点没有明显的变化，而所有含有TPA的水凝胶组的OD值较前一个时间点都有增加，说明壳聚糖水凝胶中引入TPA提高了水凝胶的生物相容性，并且TPA含量越多，水凝胶促细胞增殖能力越强。

图6b为L929细胞接种于水凝胶材料表面培养2天的FDA染色结果。从图6b可以看出，纯壳聚糖水凝胶组的细胞只有少数为正常的梭形，大部分为圆形，而随着水凝胶中加入TPA后，梭形细胞变得更多，细胞总体上变得更密，说明TPA的引入不仅可以加速细胞的增殖，也能促进细胞铺展和粘附。

试验例7：不同TPA接枝浓度的水凝胶敷料减少炎症反应实验

在本试验中，将生长状态良好的RAW264.7细胞与脂多糖(LPS，100ng/ml)培养12h后，使用水凝胶处理细胞3d，然后用PBS溶液分离细胞，并在4％多聚甲醛中固定15min。用小鼠CD16/32抗体(购自伊莱瑞特)阻断后，再用CD11c抗体在4℃黑暗中染色30分钟。随后用流式细胞仪分析评估和分析样品，结果如图7a所示。此外，将生长状态良好的RAW264.7细胞与脂多糖(LPS，100ng/ml)培养12h后，使用水凝胶处理细胞3d，再用Trizol试剂提取细胞总的RNA，用以分析抗炎基因IL-1RA和IL-10的表达水平，结果如图7b所示。

从图7a可以看出，CT0水凝胶并不能抑制巨噬细胞向M1型极化，但是加入了TPA后，CT4水凝胶能够显著降低M1型巨噬细胞的百分比。此外，图7b结果表明，与CT0水凝胶相比，CT4水凝胶更能提高抗炎基因IL-1RA和IL-10的表达水平。以上结果均表明本发明的水凝胶敷料能够减少炎症反应。

试验例8：不同TPA接枝浓度的水凝胶敷料抑制瘢痕基因表达实验

首先提取按本发明制备的水凝胶敷料的浸提液，然后与0.8mMH₂O₂共培养L929细胞7天后，再用Trizol试剂提取细胞总的RNA。使用EvoM-MLV反转录预混型试剂盒(购自艾科瑞)，按照制造商的说明书去除gDNA并合成cDNA，然后使用GreenProTaqHS预混型qPCR试剂盒(购自艾科瑞)，根据说明书的程序检测瘢痕相关基因的表达水平，结果如图8所示。从图8可以看出，与纯的壳聚糖水凝胶相比，高TPA含量(CT4)水凝胶组的Engrailed-1、TGF-β1和MMP-2三个瘢痕相关基因的表达均要低，说明TPA的加入能够抑制瘢痕的形成。

试验例9：不同TPA接枝浓度的水凝胶敷料加速体内动物创伤愈合并减少瘢痕形成实验

对SD大鼠腹腔注射10％(W/V)水合氯醛溶液麻醉后进行背部剃毛处理，然后在背部建立尺寸为10×10mm的全层切除皮肤方形伤口模型。随后将本发明各实施例及对比例制备得到的水凝胶敷料置于伤口部位，同时设置对照组、纱布组，其中对照组不加任何的处理。然后用Tegadermfilm(USA)固定敷料，并每2天更换一次敷料。在第0、2、4、7、11、14天的时候用数码相机对伤口进行拍照，然后用ImageJ软件计算伤口的面积，结果如图9所示。皮肤组织样本在4％的多聚甲醛中保存并用石蜡包埋，用以制备病理切片。对样品进行苏木精和伊红(H&E)染色以及免疫荧光染色后，在光学显微镜和荧光显微镜下观察组织学图像，结果如图10和图11所示。

其中，图9a和图9b分别为创面愈合过程中不同时间点的皮肤创面图片及创面愈合率。从图9可以看出，CT4水凝胶组在整个治疗期间创面愈合速度最快。第7天，CT4水凝胶组创面愈合面积最大(76％)，其次为CT1水凝胶组(67％)、纱布组(47％)、CT0水凝胶组(46％)和对照组(20％)。治疗14天后，CT4水凝胶组的创面愈合率达到的95±0.54％，显著高于纱布组(75％)以及CT0水凝胶组。

图10a和图10b分别为不同TPA含量的水凝胶敷料处理伤口后第7d和14d的H&E染色图以及表面层厚度统计图。从图10a可以看出，CT4水凝胶处理伤口后的第14天，伤口组织出现血管，并且出现了毛囊、皮脂腺等只有在成熟皮肤中才出现的皮肤附属物，说明CT4水凝胶不仅能加速伤口的愈合，也能提高伤口愈合的质量。从图10b可以看出，不管是在第7天还是第14天，CT4组的新生表皮层厚度都是最低。因为增厚的表皮层往往与增生性瘢痕的形成有关，所以CT4能够最好地减少伤口组织瘢痕的形成。

图11a和图11b分别为不同TPA含量的水凝胶敷料处理伤口后第14d对伤口组织进行Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫荧光染色图以及Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的面积统计图。从图11a和图11b中可以看出，CT4水凝胶处理伤口后，伤口组织的Ⅰ型胶原减少，Ⅲ型胶原增加，Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原的比值降低，最接近正常皮肤，而CT0水凝胶组中Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原的比值远高于正常皮肤，说明TPA的加入能够抑制伤口愈合后期伤口瘢痕的形成，即本发明的水凝胶敷料在抑制瘢痕领域具有很好的应用前景。

综上所述，本发明通过加入TPA，利用TPA与壳聚糖及其衍生物等的共同作用使水凝胶敷料具有一定的吸水能力，用以吸收创面堆积的大量渗出液；具有抑制氧化应激的能力，用以维持伤口微环境中活性氧动态平衡；具有抑制炎症的能力，用以缩短炎症阶段，加速创伤愈合；具有抑制成纤维细胞向瘢痕成纤维细胞转化的能力，用以抑制创面瘢痕的形成；综上使本发明能够在快速促进创伤的愈合的同时减少创面瘢痕的形成。与现有技术相比，本发明具有显著的进步。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：分别配制壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液、TPA水溶液、交联剂溶液；所述TPA水溶液的溶质为N¹-(4-硼苄基)-N³-(4-硼苯基)-N¹，N¹，N³，N³-四甲基-1，3-二胺；所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液的浓度为0.01-0.1g/ml，所述TPA水溶液的浓度为0.001-1g/ml；

S2：将所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液与所述TPA水溶液进行混合，搅拌均匀后获得混合液A；所述壳聚糖或壳聚糖及其衍生物的溶液与所述TPA水溶液的体积比为1:1-36:1；

S3：向所述混合液A中加入所述交联剂溶液，搅拌均匀后获得混合液B；混合液A与所述交联剂溶液的体积比为1:1-15:1；

S4：静置所述混合液B，获得所述水凝胶敷料。

2.根据权利要求1所述的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤S1中，配制所述交联剂溶液时，采用的交联剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、戊二醛、京尼平中的任意一种或多种。

3.根据权利要求1所述的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述TPA水溶液的溶质通过以下步骤制备而成：

S11：将N，N，N'，N'-四甲基-1,3-丙二胺与4-（溴甲基）苯硼酸在有机溶剂中进行溶解混合，获得混合液A'；

S12：将所述混合液A'在60-80℃条件下搅拌16-24h，然后与四氢呋喃进行混合，获得混合液B'；

S13：将所述混合液B'在0-8℃条件下静置30-90min，然后进行离心、洗涤、干燥，获得所述N¹-(4-硼苄基)-N³-(4-硼苯基)-N¹，N¹，N³，N³-四甲基-1，3-二胺。

4.根据权利要求3所述的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤S11中，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、丁酮、甲苯中的任意一种或多种；步骤S12中，与四氢呋喃进行混合时，所述混合液A'与所述四氢呋喃的体积比为1:20-1:10，所述四氢呋喃的温度与步骤S13静置时的温度相同；步骤S13中，进行洗涤时，采用四氢呋喃进行洗涤；进行干燥时，在真空条件下进行干燥。

5.根据权利要求1所述的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤S4中，静置所述混合液B时，在25-37℃条件下静置15-24h。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，还包括对所述水凝胶敷料进行改性，提高所述水凝胶敷料的生物相容性的步骤。

7.根据权利要求6所述的水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，对所述水凝胶敷料进行改性具体包括以下步骤：

S5：将所述水凝胶敷料在多巴胺溶液中浸泡4-8h，然后采用去离子水对所述水凝胶敷料进行多次浸泡，直至浸泡的去离子水变为澄清；

S6：去除步骤S5中的澄清液体，随后加入RGD水溶液，浸泡8-12h后去除液体，得到改性后的水凝胶敷料；所述RGD水溶液的溶质为RGD序列；所述RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成。

8.如权利要求1-7中任意一项所述的水凝胶敷料的制备方法制备而成的水凝胶敷料。