CN115844953B - 一种制备猪心血丹参饮片的炮制工艺和快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，利用创新性的发现颜色和饮片截面直径与猪心血丹参饮片质量之间的内在关系，采用色度仪和直径实时检测来反馈性的控制具体炮制工艺参数，得到了普适性强、易于实施的猪心血丹参饮片的炮制工艺。所述炮制工艺克服了工业生产中干燥设备普遍存在温度误差、环境湿度不同、内部空气流动情况不同、研究和生产设备差异等因素的影响，能够省略从实验室到工业生产所必须的中试实验，自动适应各种不同的生产条件和环境，能够准确的控制猪心血丹参饮片的质量。进一步地，利用所述检测方法还能够快速准确的定量反应饮片内部的有效成分含量。
Description
技术领域
本发明属于猪心血丹参中药饮片的炮制工艺技术领域，具体涉及一种以采用色度仪实时检测来反馈性的控制具体炮制工艺参数的猪心血丹参饮片炮制方法。
背景技术
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge．的干燥根及根茎，苦，微寒。归心、肝经。有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈[1]的功效。现代研究指出，丹参的活性成分主要包括丹参酮IIA为代表的二萜类化合物，以及丹酚酸B为代表的酚酸类化合物，另外也包括三萜类、黄酮类、内酯类、多糖等成分。
猪心血丹参为江苏常州孟河医派传承数百年的特色临方炮制品种，临床常用于治疗脑缺血引起的心神不宁、心悸怔忡及痰迷心窍等症。历代医家认为猪心血为养心药之向导，能增强丹参入脑补血安神之功。并且猪心血拌丹参已经收载于《上海市中药饮片炮制规范》2018年版中丹参项下，其炮制方法为“取丹参用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽，干燥。每100g丹参，用鲜猪心3只取血，加黄酒30g混匀”，其性状为“外表皮暗棕红色，切面放射状排列的菊花纹呈淡棕黄色，附着有暗褐色凝固物，微具腥气”。丹参由猪心血炮制后，皮部变为由棕红色变为暗棕红色，断面由灰黄色变为淡棕黄色，颜色性状特征变化明显，同时猪心血丹参的内在指标也发生了相应的变化。现代研究表明，丹参脂溶性和水溶性成分均能与血浆蛋白相互作用形成复合物，且脂溶性成分引入氨基酸或短肽后使其成为盐类，能很大程度上增加其溶解性，从而提高了药物的功效，并降低其不良反应。研究证实小分子活性肽能被人体小肠直接吸收进入血液循环而在体内产生生物学效应，因而水溶性丹酚酸类成分与肽类结合则有助于提高其吸收入血入脑的浓度。现有技术“UPLC-Q-TOF /MS 分析孟河医派特色猪心血丹参炮制前后化学成分的变化”记载了猪心血炮制丹参后，共有25 种化学成分峰面积发生显着变化，其中丹参水溶性成分原儿茶醛，丹酚酸C，F，G 和脂溶性成分丹参醛，丹参二醇A，丹参酮Ⅰ和氨基酸类成分L-苯丙氨酸峰面积显著增高。
现有技术“孟河医派特色炮制猪心血丹参及其他炮制品对大鼠脑缺血保护及PI3K/AKT 信号通路的影响”记载了比较孟河医派特色炮制猪心血丹参及其他炮制品抗脑缺血作用差异的研究实验，结果认为：神经功能评分、TTC 染色和TUNEL 细胞凋亡结果均显示，与模型组比较，孟河医派特色炮制猪心血丹参及其他炮制品均能显著抑制脑缺血大鼠神经行为学评分、脑梗塞体积及神经细胞凋亡指数（P<0.01），且抑制顺序为猪心血丹参组>酒丹参组>猪血丹参组>丹参生品组。Western 印迹结果显示，孟河医派临方特色炮制猪心血丹参能显著促进p-PI3K/t-PI3K，p-AKT/t-AKT 和Bcl-2/Bax 蛋白比值水平（P<0.05，P<0.01），显著抑制活化胱天蛋白酶3 和活化胱天蛋白酶9 蛋白水平（P<0.01），且均比丹参生品及其他炮制品调控更显著。
但是，从上述《上海市中药饮片炮制规范》2018年版的猪心血拌丹参的炮制工艺可知，其猪心血的用量和干燥的程度均是模糊不清的。来自于不同猪个体的猪心中猪心血的存留量是不同的，通常会有较大变化。而干燥的程度也没有明确的指标，仅依赖于炮制一线操作人员的个人经验，同时也受具体含水量、设备、环境、温度、湿度等多种因素的影响，不同批次和不同厂家之间干燥程度均存在一定的差异。这种炮制上的差异也在一定程度上影响了猪心血丹参饮片的质量同一性，进而影响临床疗效。
现有技术CN110693943A公开了一种星点设计－效应面法优化猪心血拌丹参最佳炮制工艺，包括以下步骤，S1、丹参酮IIA的测定；S2、丹酚酸B含量的测定：重复S10-S12步骤，别以质量溶度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得到得丹酚酸B的回归方程为Y=346.72X－0.8957，r=0.9999；S3、猪心血拌丹参的制备：取从鲜猪心中取出的猪心血适量，加入适量黄酒与生丹参饮片拌匀，闷润至猪心血以及黄酒吸尽后，放入烘箱内烘干即可；S4、星点设计与效应面分析；S5、综合分析以及用Design Expert软件计算，得到猪心血拌丹参的最佳炮制工艺为32%黄酒，24%猪血，烘干温度61℃。但是，首先，上述优化得到的炮制工艺如用量和温度等工艺参数仅仅适应于该文献中进行实验时使用的特定设备、特定环境和特定批次药材，当设备和环境和药材批次等因素变化时，优选得到的工艺参数显然也不同；其次，上述优选过程，需要使用高效液相色谱等含量测定方法，需要的时间长，方法成本高，不能用于生产的实时控制；最后，上述工艺中同样没有给出干燥时间等参数，而事实上干燥时间是影响猪心血拌丹参饮片的重要工艺参数。
质量是中药产业的重中之重，保障产品质量则需要科学合理的质量标准。目前中药的药典标准、炮制火候、等级划分、鉴定评价中涉及外观颜色时，大多采用简单的颜色描述进行定性，较依赖于主观，或受外界光线影响较大。色度学是研究人的颜色视觉规律、颜色测量的理论和技术的一门学科，分光光度测色仪是一种常用的颜色测量仪器，可见光光谱利用窄带滤色镜(滤光片式)或衍射光栅(分散式)分为非常窄细的光谱间隔并进行测量。广泛应用于食品、纺织、环境、材料等专业，近年来也有诸多借此技术研究至中药领域的研究，将“辨状论质”这种传统经验鉴别客观化、标准化，进行中药不同基原、炮制方法、真伪优劣的鉴别。
目前，对于丹参原药材，存在一些依据颜色判断丹参药材质量的研究。例如，通常认为丹参原药材“其根皮丹而肉紫者佳”。但是这种认知是粗浅地和主观地，无法量化，也难以应用于工业化生产。
现有技术“基于分光测色仪探析中药质量”中记载了使用CM3600d 测量丹参，认为药材粉末Δa* 及Δb* 值与隐丹参酮、丹参酮Ⅰ呈显著正相关，ΔL* 与丹参酮Ⅰ含量显著负相关，此外，实验也表明，Δa* 值越大总丹参酮含量越高，证实了“色红者佳”的说法。
现有技术“基于丹参药材内在质量与外观色泽相关性分析探索传统鉴定经验“色红者佳”的科学性”记载了一种探究丹参药材指标成分及浸出物含量与外观色泽的相关性的研究，结果认为丹参中有效成分含量越高，浸出物含量越高，a* ( 红绿分量值) 越大，外观红色越深，药材质量越好; 有效成分含量越低，浸出物含量越低，a* 越小，外观红色越浅，药材质量越差，验证了传统鉴别经验“色红者佳”的科学性。但是，上述现有技术中仅仅注意到a*值与药材质量的相关性，不涉及L*和b*参数的利用，并不能全面的反应丹参中水溶性酚酸类成分等有效成分的含量和水分含量。
现有技术“丹参药材粉末色泽与有效成分含量的相关性”记载了色泽指标Δa*及Δb*与水溶性成分丹参酚酸含量及脂溶性成分（隐丹参酮、丹参酮Ⅰ）间呈显著正相关（P<0.05），其中相关系数最高的为丹参酮Ⅰ与Δa*和Δb*指标，分别为0.811（P<0.01）及0.778（P<0.01）；脂溶性成分总含量与Δa*显著正相关（P<0.01）；明度ΔL*与丹参酮Ⅰ含量显著负相关（P<0.05），与其它有效成分含量相关性不明显。但是，上述现有技术中，认为水溶性成分丹参酚酸含量也与Δa*及Δb*相关，并认为L*与丹参酮Ⅰ含量显著负相关，然而事实上丹参酚酸等无明显的颜色，如丹参酚酸B为白色结晶，通常不适宜用Δa*（反映绿红色）及Δb*（反映蓝黄色）来表示。
现有技术“陕产丹参产地加工与饮片炮制一体化技术研究”记载了丹酚酸B的含量随着干燥时间的延长快速下降，如烘干3小时时，丹酚酸B含量为12.51%，而烘干7小时时，丹酚酸B含量降低为9.19%。可见，在炮制过程中实时监测丹酚酸的含量是非常必要的。对于调整炮制工艺参数，保障饮片质量，丹酚酸的含量应当是重要指标。
然而，现有技术“丹参形态、品质特征的高通量解析及其关联性分析”记载了“以丹酚酸类成分：丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸、丹参素钠作为分析指标，不同等级间样品同样无法实现聚类”和“研究结果表明单以主根中上部直径作为定级参数无法体现丹参活性成分差异”，即认为直径与丹参酚酸类等有效成分之间不存在相关性。但是，发明人经过研究发现，上述认知是有误的，丹参药材直径是药材等级分级的重要参数，事实上不同的直径一定程度上能够反映药材质量的不同。
综上可知，现有技术中的研究均是基于丹参原药材进行的，由于猪心血本身具有鲜艳的红色，在使用猪心血炮制丹参后得到的饮片颜色相对于原药材发生了较大的变化，猪血红蛋白遮盖在丹参饮片表面，是否还能够使用相关的颜色指标衡量猪心血丹参的质量是未知的。也就是说，在猪心血丹参的炮制技术领域尚没有依据饮片的颜色进行工艺控制的方法，更没有猪心血丹参饮片颜色与其内在质量之间是否存在关联和/或存在何种关联的记载。并且，现有技术中通过色度值评价丹参产品内在质量的方法存在较多的错漏之处，评价指标也相对较少，如缺少对饮片的水分和水溶性丹酚酸的含量进行评价的指标，尚不能有效用于对猪心血丹参饮片炮制的工艺控制。本领域亟待开发一种能够快速实时、多指标、全方面的检测猪心血丹参饮片的内在质量，并用于猪心血丹参饮片炮制的工艺控制的方法。
本发明针对目前猪心血丹参炮制及成品饮片颜色标准较依赖于主观，质控指标检测较繁琐的特点，引入分光测色技术对颜色值进行客观量化，同时引入饮片的截面直径作为相关指标，制定相关标准，并筛选与内控指标显著性相关的性状指标，建立预测能力良好的线性方程，综合多项指标建立了控制猪心血丹参炮制工艺参数的方法。所述方法被运用于猪心血丹参炮制过程控制以及成品饮片的质量控制，预测方程可靠，可对猪心血丹参饮片质量进行稳定、快速测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，利用发明人研究发现的色度指标和/或饮片截面直径等参数与猪心血丹参饮片内在质量的关系，全面地、实时地、准确地进行工艺控制，从而获得受设备、环境、操作人员影响小，普适性强的猪心血丹参饮片的炮制工艺。其控制过程具体为测量猪心血丹参饮片色值、粉末色值与横截面直径，带入建立的线性方程对猪心血丹参酚酸类、丹参酮类成分含量与含水量进行快速测定。
本申请的饮片色值、粉末色值与横截面直径测定方法，能够快速、准确获得猪心血丹参酚酸类、丹参酮类成分含量与含水量的情况，适用于炮制工艺实时控制。克服了现有技术中使用高效液相色谱法等含量测定方法进行丹参中丹参酮类等有效成分含量测定时，成本高、周期长、对检测环境的要求高，不适宜于炮制工艺的实时控制等的缺陷。
同时，本申请能够通过饮片色值、粉末色值与横截面直径测定方法，全面的反映获得猪心血丹参酚酸类、丹参酮类成分含量与含水量的情况。一是克服了现有技术中仅仅能够通过色度值等表示丹参酮类成分含量的技术缺陷。二是通过增加横截面直径作为丹参酚酸类含量预测的指标之一。三是克服了现有技术中没有饮片含水量快速测定方法的缺陷，找到了快速检测饮片中含水量的方法，从而能够实现对炮制干燥工艺的实时控制。
在本发明中，所述色度学/色度值策略是借助现代色度机器用于颜色分析，以数字值为特征反应中药材表面色泽的一种方法。其中，L*代表亮度，L = 0 与100分别为黑色和白色，a* 代表红－绿色轴，a负值与正值分别代表绿色与红色，b* 代表黄-蓝色轴，b负值与正值分别代表蓝色与黄色，三度色彩空间与人眼感觉的色彩具有高度相似性。
具体地，本发明提供一种制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，其特征在于：将生丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽；其中每100 g生丹参饮片，用鲜猪心血27～33g，加黄酒30 g；取吸收了鲜猪心血和黄酒的生丹参饮片，取适量饮片用游标卡尺测定饮片平均截面直径R，再使用分光测色仪测定样品饮片及粉末的L*、a*、b*值；通过丹参的横截面直径、饮片或粉末的L*计算猪心血丹参酚酸类含量总和；通过饮片或粉末a*值计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；通过饮片或粉末L*值计算猪心血丹参水分值；随后放入45～55℃烘箱中加热干燥，实时或间隔适当时间测量L*、a*、b*和R值，并计算丹参酚酸类含量总和、丹参丹参酮类含量总和和水分值，控制加热时间，使猪心血丹参饮片中丹参酮类含量总和升高15%以上，和酚酸类含量总和下降在10%以内和饮片水分含量低于10%，停止加热，取出饮片，即得猪心血丹参饮片。
进一步地，所述的制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，其特征在于：将丹参的横截面直径和粉末L*带入x1和x2，由回归方程Y%=16.454+0.122x1-0.261x2，或将丹参的横截面直径和饮片L*带入x1和x2，由回归方程Y%=21.382+0.124x1-0.402x2，可计算猪心血丹参酚酸类含量总和；将粉末a*值带入x，由回归方程Y%=-0.459+0.080x，或饮片a*值带入x，由回归方程Y%=0.078+0.131x，可计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；将粉末L*值带入x，由回归方程Y%=16.994-0.119x，或饮片L*值带入x，由回归方程Y%=19.1-0.179x，计算猪心血丹参水分值。
由于现有炮制工艺中“用鲜猪心3只取血”的猪心血用量不明确，本申请发明人通过测量每只鲜猪心的平均心血量、是否能够被丹参闷润吸尽以及猪心血量对丹参饮片炮制前后化学成分变化的影响。另外，由于烘干温度和烘干时间等炮制参数能够显著的影响猪心血丹参饮片的质量，而烘干温度相对容易提前确定，本申请发明人也通过测量烘干温度对丹参饮片炮制前后化学成分变化的影响出人意料地发现，鲜猪心血27～33 g是优选的用量，烘干温度45～55℃是优选的温度。
更优选的，所述每100 g生丹参饮片，用鲜猪心血29～31 g，加黄酒30 g。
更优选的，所述每100 g生丹参饮片，用鲜猪心血30 g，加黄酒30 g。
更优选的，烘干温度是47～53℃。
更优选的，烘干温度是50℃。
优选的，所述猪心血丹参按照以下步骤炮制制得：取生丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽；50℃烘干；每100 g丹参，用鲜猪心血30 g，加黄酒30 g；取吸收了鲜猪心血和黄酒的生丹参饮片，使用分光测色仪测定样品饮片或粉末的L*、a*、b*值，，并用游标卡尺测定饮片平均截面直径R；将丹参的横截面直径和粉末L*带入x1和x2，由回归方程Y%=16.454+0.122x1-0.261x2，或将丹参的横截面直径和饮片L*带入x1和x2，由回归方程Y%=21.382+0.124x1-0.402x2，可计算猪心血丹参酚酸类含量总和；将粉末a*值带入x，由回归方程Y%=-0.459+0.080x，或饮片a*值带入x，由回归方程Y%=0.078+0.131x，可计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；将粉末L*值带入x，由回归方程Y%=16.994-0.119x，或饮片L*值带入x，由回归方程Y%=19.1-0.179x，计算猪心血丹参水分值，随后放入50℃烘箱中加热干燥，实时或间隔适当时间测量L*、a*、b*值和饮片平均截面直径R，控制加热时间，使猪心血丹参饮片中丹参酮类含量总和升高15%以上，和酚酸类含量总和下降在10%以内和饮片水分含量低于10%，停止加热，取出饮片，即得猪心血丹参饮片。
本发明目的还在于提供一种猪心血丹参的快速检测方法，其能够快速、准确、全面的获得猪心血丹参酚酸类、丹参酮类成分含量与含水量。
进一步地，所述猪心血丹参的快速检测方法，其特征在于，与内在指标显著相关的性状特征指标包括粉末颜色值及饮片横截面直径。
本发明所述猪心血丹参的快速检测方法，其特征在于，性状特征指标的测定方法为：粉末颜色值：混合均匀样品粉末，过药典3号筛，取适量平整铺于样品皿底部，不留明显透光空隙，每批取样3次，每次平行测定3次，记录颜色值并计算平均值，作为样品饮片L*、a*、b*值。饮片颜色值：每批样品以四分法取10片饮片，以表皮面和横截面分别覆盖样品测试口，每片饮片各测定3次，共记录6次颜色值， 并计算平均值，（同权利要求5），作为样品饮片L*、a*、b*值。横截面直径：每批样品以四分法取40片饮片，用游标卡尺测定直径，记录数据后分析。
本发明猪心血丹参的快速检测方法，其特征在于，检测指标包括猪心血丹参丹酚酸类含量总和（丹酚酸B、丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸）、丹参酮类含量总和（二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA）、水分值。
本发明中一种猪心血丹参的快速检测方法，其特征为:将丹参的横截面直径和粉末L*带入x1和x2，由回归方程Y%=16.454+0.122x1-0.261x2，或将丹参的横截面直径和饮片L*带入x1和x2，由回归方程Y%=21.382+0.124x1-0.402x2，可计算猪心血丹参酚酸类含量总和；将粉末a*值带入x，由回归方程Y%=-0.459+0.080x，或饮片a*值带入x，由回归方程Y%=0.078+0.131x，可计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；将粉末L*值带入x，由回归方程Y%=16.994-0.119x，或饮片L*值带入x，由回归方程Y%=19.1-0.179x，计算猪心血丹参水分值。
有益效果
本发明对猪心血丹参颜色值制定的标准，范围设定合理，建立的以性状指标检测质量指标的线性方程，经实验验证预测能力良好。发明运用于猪心血丹参炮制过程控制以及成品饮片的质量控制，预测能力可靠，可对猪心血丹参饮片质量进行稳定、快速测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，不是对本技术方案的限制。
本发明中的生物材料来源如下：
丹参饮片购自道地产区及主产区，猪心血来自南京大厂欣乐肉类食品中心定点屠宰厂，黄酒（14% vol）来自绍兴金宇酒业有限公司。
实施例1猪心存血量考察
随机取30只新鲜猪心，及时剖开倒出里面的血液，用量筒对血量进行测定。具体数值见下表。对数据进行Shapiro-Wilk正态性检验，符合正态分布(P＞0.05)，分析可知每只猪心的存血量平均值为10 ml，以90%的标准设定每只猪心的存血量为9～11 ml，及现有炮制工艺中“用鲜猪心3只取血”的范围为27～33 ml。
表1猪心存血量测定结果
实施例2猪心血丹参炮制温度考察
取丹参，按每100 g丹参，用鲜猪心血30 g，加黄酒30 g，混匀，使之吸尽，分别在40、45、50、65、60、70℃烘干至水分低于10%，后取出放凉，打粉。以丹参酮类含量总和及酚酸类含量总和这两个指标进行分析。具体见下表。
表2猪心血丹参样品来源信息
分析可知猪心血丹参中酚酸类含量随烘干温度的升高而降低，在60℃及更高温度条件下烘干，下降幅度超过了10%；而丹参酮类含量随烘干温度的升高而升高，40℃时升高幅度高于15%，在50℃及更高温度条件下上升幅度减缓，综合考虑烘干时长及指标成分含量变化趋势，最终选择45～55℃为猪心血丹参炮制烘干温度，且50℃为最佳。
实施例3猪心血丹参的炮制
取丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽，50 ℃烘干。每100 g丹参，用鲜猪心血30 g，加黄酒30 g。丹参来源如表3所示。
表3猪心血丹参样品来源信息
实施例4猪心血丹参酚酸类成分含量测定方法
供试品溶液制备：取本品粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50mL，密塞，称定重量，加热回流提取30 min，密塞放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液配制：精确称取各对照品适量，加入80%甲醇配置成分别含丹参素钠10.00 μg/ml、迷迭香酸10.87 μg/ml、紫草酸21.14 μg/ml、丹酚酸B251.64 μg/ml的混合对照品溶液。
色谱条件：色谱柱为汉邦C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；；流动相为乙腈-0.05%磷酸水；梯队洗脱：0～15min，10%～20%乙腈；15～35 min，20%～25%乙腈；35～40min，25%～30%乙腈；体积流量1.0 ml/min；检测波长 286 nm；柱温 35℃；进样体积10μl。
方法学：线性：精密吸取对照品溶液5、10、20、40、80 μl进样，在上述色谱条件下测定，以对照品溶液进样量为横坐标（x），相对峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，结果见表，表明各成分在各自范围内呈良好的线性关系。
表4猪心血丹参酚酸类成分标准曲线及线性范围结果
精密度：制备1份供试品溶液，按色谱条件，连续进样6次。计算丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的峰面积RSD均小于3%，具体数据见表，表明仪器精密度良好。
重复性：制备6份供试品溶液，按照色谱条件进样测定。分别计算每份供试品中丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的质量分数，RSD均小于3%，具体数据见表，表明方法重复性良好。
稳定性：制备1份供试品溶液，按照色谱条件条件，分别于制样后0、2、4、8、12、24 h进样测定。计算丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的峰面积RSD均小于3%，具体数据见表，表明样品24小时内稳定性良好。
加样回收率：制备1份供试品溶液，精密量取6份各0.5mL，分别按1:1精密加入与供试品含量等量的对照品溶液。按照色谱条件进样测定。计算丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的回收率分别为100.79%、94.18%、99.31%、97.58%，RSD均小于3%，具体数据见表。
表5猪心血丹参酚酸类成分方法学结果
含量测定结果：按照建立的色谱条件测定15批猪心血丹参中丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。具体结果见表6。
表6猪心血丹参酚酸类含量测定结果
实施例5猪心血丹参丹参酮类成分含量测定方法
供试品溶液制备：取本品粉末（过三号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50ml，密塞，称定重量，超声提取30min，密塞放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，既得。
对照品溶液配制：精确称取各对照品适量，加入甲醇配置成分别含二氢丹参酮I5.15μg/ml、隐丹参酮10.00μg/ml、丹参酮I 15.00μg/ml、丹参酮IIA10.00 μg/ml的混合对照品溶液。
色谱条件：色谱柱为汉邦C18(150mm×4.6 mm，5μm)；流动相为乙腈-0.02%磷酸水；梯队洗脱：0～15min，61%乙腈；15～20min，61%～90%乙腈；20～21min，90%～61%乙腈，21～25min，61%乙腈；体积流量1.0ml/min；检测波长270nm；柱温25℃；进样体积10μl。
方法学：线性：精密吸取对照品溶液5、10、20、40、80 μl进样，在色谱条件下测定，以对照品溶液进样量为横坐标（x），相对峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，结果见表7，表明各成分在各自范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
表7猪心血丹参丹参酮类成分标准曲线及线性范围结果
精密度：制备1份供试品溶液，按色谱条件，连续进样6 次。计算二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的峰面积RSD 均小于3%，表明仪器精密度良好。
重复性：制备6份供试品溶液，按照色谱条件进样测定。分别计算每份供试品中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的质量分数，RSD 均小于3%，表明方法重复性良好。
稳定性：制备1份供试品溶液，按照色谱条件，分别于制样后0、2、4、8、12、24 h进样测定。计算二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的峰面积RSD均小于3%，表明样品24小时内稳定性良好。
加样回收率：制备1份供试品溶液，精密量取6份各0.5 ml，分别按1:1精密加入与供试品含量等量的对照品溶液。按照色谱条件进样测定。计算二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的回收率分别为101.73%、107.13%、104.72%、103.36%，RSD均小于3%。
表8猪心血丹参丹参酮类成分方法学结果
含量测定结果：按照建立的色谱条件测定15批猪心血丹参中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的含量。具体结果见表9。
表9猪心血丹参丹参酮类含量测定结果
实施例6猪心血丹参水分测定方法
参照《中国药典》2020 年版一部中丹参项下方法，以水分测定法（通则0832），测定样品中水分值。
表10猪心血丹参含量测定结果
Table 5 Content results of Salvia miltiorrhiza processed by porcinecardiac blood
实施例7猪心血丹参性状特征测定
粉末色值测定条件及的方法：实验采用CM-5型分光测色仪，测定光源为D65,视角设置为10°，测量波长范围360～740 mm。表皮及横截面采用SCI模式（镜面反射光与漫反射），测量直径3 mm；粉末采用SCE模式（漫反射），测量直径30 m，测量在校正后进行。混合均匀样品粉末（过三号筛），取适量平整铺于样品皿底部，不留明显透光空隙，每批取样3次，每次平行测定3次，记录颜色值并计算平均值，作为样品饮片L*、a*、b*值。
饮片色值测定条件及的方法：每批样品以四分法取10片饮片，每批样品以四分法取10片饮片，以表皮面和横截面分别覆盖样品测试口，每片饮片各测定3次，共记录6次颜色值， 并计算平均值，（同权利要求5），作为样品饮片L*、a*、b*值。
横截面直径测定方法：实验按照《中国药典》2020 年版四部中规定的药材和饮片取样法（通则0211），采用四分法取样，并考察了取样数目，在保证数据代表性且减少重复操作的前提下，最终每批样品以四分法取40片饮片，用游标卡尺测定直径，记录数据后分析。
方法学：精密度：按照上述方法取1份猪心血丹参饮片及粉末，分别连续测定6次，记录L*、a*、b*值及横截面直径，计算RSD＜3%，具体数值见表，表明仪器精密度良好。
重复性：按照上述方法取6份猪心血丹参饮片及粉末，按照方法进行测定，记录L*、a*、b*值及横截面直径，计算RSD＜3%，具体数值见表，表明方法重复性良好。
稳定性：按照上述方法取1份猪心血丹参饮片及粉末，按照方法，分别于0、2、4、6、8、10、12 h测定，记录L*、a*、b*值及横截面直径，计算RSD＜3%，具体数值见表，表明方法稳定性良好，且测定时间由8:00至20:00，同时说明外界光强度对测色结果影响较小。
表11猪心血丹参方法学结果
采用SPSS 26.0对各组内饮片表皮、横截面色泽及横截面直径数据进行Shapiro-Wilk正态性检验,按照P＞0.05检测标准，数据符合正态分布。因此，均以平均值作为的各指标标准值，并通过公式计算建立各组猪心血丹参标准色差值E*ab。具体结果见表12。
表12猪心血丹参性状评价结果
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实施例8猪心血丹参外观成分相关性及回归分析
采用SPSS 26.0软件对猪心血丹参外观指标与各活性成分含量进行双变量两两相关性分析，因为各指标符合正态分布，采用pearson相关性分析，并进一步以猪心血丹参外观指标为自变量，以内在质量指标为因变量进行回归分析。将一批次未参与建模的猪心血丹参各指标带入所建方程进行验证，以性状特征值预测内在成分值，并计算相对误差，结果如表13所示，内在品质指标可被良好预测（相对误差＜5%）。
表13猪心血丹参性状特征与内在品质的回归分析
实施例9(饮片直接测量)
制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，将生丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽；其中每100 g生丹参饮片，用鲜猪心血30g，加黄酒30 g；取吸收了鲜猪心血和黄酒的生丹参饮片，取适量饮片用游标卡尺测定饮片平均截面直径R，再使用分光测色仪测定样品饮片的L*、a*、b*值；通过丹参的横截面直径和饮片L*值计算猪心血丹参酚酸类含量总和；通过饮片a*值计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；通过饮片L*值计算猪心血丹参水分值；随后放入50℃烘箱中加热干燥，实时或间隔适当时间测量L*、a*、b*和R值，并计算丹参酚酸类含量总和、丹参丹参酮类含量总和和水分值，控制加热时间，使猪心血丹参饮片中丹参酮类含量总和升高15%以上，和酚酸类含量总和下降在10%以内和饮片水分含量低于10%，停止加热，取出饮片，即得猪心血丹参饮片，具体数据见下表。
表14猪心血丹参性状特征与内在品质的预测分析（50℃）
实施例10(饮片直接测量)
制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，将生丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽；其中每100 g生丹参饮片，用鲜猪心血27g，加黄酒30 g；取吸收了鲜猪心血和黄酒的生丹参饮片，取适量饮片用游标卡尺测定饮片平均截面直径R，再使用分光测色仪测定样品饮片的L*、a*、b*值；通过丹参的横截面直径和饮片L*值计算猪心血丹参酚酸类含量总和；通过饮片a*值计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；通过饮片L*值计算猪心血丹参水分值；随后放入45℃烘箱中加热干燥，实时或间隔适当时间测量L*、a*、b*和R值，并计算丹参酚酸类含量总和、丹参丹参酮类含量总和和水分值，控制加热时间，使猪心血丹参饮片中丹参酮类含量总和升高15%以上，和酚酸类含量总和下降在10%以内和饮片水分含量低于10%，停止加热，取出饮片，即得猪心血丹参饮片。
表15猪心血丹参性状特征与内在品质的预测分析（45℃）
实施例11(饮片直接测量)
制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，将生丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽；其中每100g生丹参饮片，用鲜猪心血33g，加黄酒30g；取吸收了鲜猪心血和黄酒的生丹参饮片，取适量饮片用游标卡尺测定饮片平均截面直径R，再使用分光测色仪测定样品饮片的L*、a*、b*值；通过丹参的横截面直径和饮片L*值计算猪心血丹参酚酸类含量总和；通过饮片a*值计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；通过饮片L*值计算猪心血丹参水分值；随后放入55℃烘箱中加热干燥，实时或间隔适当时间测量L*、a*、b*和R值，并计算丹参酚酸类含量总和、丹参丹参酮类含量总和和水分值，控制加热时间，使猪心血丹参饮片中丹参酮类含量总和升高15%以上，和酚酸类含量总和下降在10%以内和饮片水分含量低于10%，停止加热，取出饮片，即得猪心血丹参饮片。
表16猪心血丹参性状特征与内在品质的预测分析（55℃）
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实施例12(粉末测量)
制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，将生丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽；其中每100g生丹参饮片，用鲜猪心血33g，加黄酒30g；取吸收了鲜猪心血和黄酒的生丹参饮片，取适量饮片用游标卡尺测定饮片平均截面直径R，再将饮片打碎，使能过药典3号筛，使用分光测色仪测定样品饮片粉末的L*、a*、b*值；通过丹参的横截面直径和粉末L*值计算猪心血丹参酚酸类含量总和；通过饮片a*值计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；通过饮片L*值计算猪心血丹参水分值；随后放入50℃烘箱中加热干燥，实时或间隔适当时间测量L*、a*、b*和R值，并计算丹参酚酸类含量总和、丹参丹参酮类含量总和和水分值，控制加热时间，使猪心血丹参饮片中丹参酮类含量总和升高15%以上，和酚酸类含量总和下降在10%以内和饮片水分含量低于10%，停止加热，取出饮片，即得猪心血丹参饮片。
表17猪心血丹参性状特征与内在品质的预测分析（50℃）
实施例13(粉末测量)
制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，将生丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽；其中每100g生丹参饮片，用鲜猪心血30g，加黄酒30g；取吸收了鲜猪心血和黄酒的生丹参饮片，取适量饮片用游标卡尺测定饮片平均截面直径R，再将饮片打碎，使能过药典3号筛，使用分光测色仪测定样品饮片粉末的L*、a*、b*值；通过丹参的横截面直径和粉末L*值计算猪心血丹参酚酸类含量总和；通过饮片a*值计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；通过饮片L*值计算猪心血丹参水分值；随后放入45℃烘箱中加热干燥，实时或间隔适当时间测量L*、a*、b*和R值，并计算丹参酚酸类含量总和、丹参丹参酮类含量总和和水分值，控制加热时间，使猪心血丹参饮片中丹参酮类含量总和升高15%以上，和酚酸类含量总和下降在10%以内和饮片水分含量低于10%，停止加热，取出饮片，即得猪心血丹参饮片。
表18猪心血丹参性状特征与内在品质的预测分析（45℃）
实施例14(粉末测量)
制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，将生丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽；其中每100g生丹参饮片，用鲜猪心血30g，加黄酒30g；取吸收了鲜猪心血和黄酒的生丹参饮片，取适量饮片用游标卡尺测定饮片平均截面直径R，再将饮片打碎，使能过药典3号筛，使用分光测色仪测定样品饮片粉末的L*、a*、b*值；通过丹参的横截面直径和粉末L*值计算猪心血丹参酚酸类含量总和；通过饮片a*值计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；通过饮片L*值计算猪心血丹参水分值；随后放入55℃烘箱中加热干燥，实时或间隔适当时间测量L*、a*、b*和R值，并计算丹参酚酸类含量总和、丹参丹参酮类含量总和和水分值，控制加热时间，使猪心血丹参饮片中丹参酮类含量总和升高15%以上，和酚酸类含量总和下降在10%以内和饮片水分含量低于10%，停止加热，取出饮片，即得猪心血丹参饮片。
表19猪心血丹参性状特征与内在品质的预测分析（55℃）
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Claims (4)
1.一种制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，其特征在于：将生丹参饮片用鲜猪心血、黄酒混合液拌匀，使之吸尽；其中每100g生丹参饮片，用鲜猪心血27～33g，加黄酒30g；取吸收了鲜猪心血和黄酒的生丹参饮片，取适量饮片用游标卡尺测定饮片平均截面直径R，再使用分光测色仪测定样品饮片或粉末的L*、a*、b*值，其中，L*代表亮度，L＝0与100分别为黑色和白色，a*代表红－绿色轴，a负值与正值分别代表绿色与红色，b*代表黄-蓝色轴，b负值与正值分别代表蓝色与黄色；通过丹参的横截面直径R和饮片或粉末L*值计算猪心血丹参酚酸类含量总和；通过饮片或粉末a*值计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；通过饮片或粉末L*值计算猪心血丹参水分值；随后放入45～55℃烘箱中加热干燥，实时或间隔适当时间测量L*、a*、b*和R值，并计算丹参酚酸类含量总和、丹参丹参酮类含量总和和水分值，控制加热时间，使猪心血丹参饮片中丹参酮类含量总和升高15％以上，和酚酸类含量总和下降在10％以内和饮片水分含量低于10％，停止加热，取出饮片，即得猪心血丹参饮片；其中，将丹参的横截面直径和粉末L*带入x1和x2，由回归方程Y％＝16.454+0.122x1-0.261x2，或将丹参的横截面直径和饮片L*带入x1和x2，由回归方程Y％＝21.382+0.124x1-0.402x2，可计算猪心血丹参酚酸类含量总和；将粉末a*值带入x，由回归方程Y％＝-0.459+0.080x，或饮片a*值带入x，由回归方程Y％＝0.078+0.131x，可计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；将粉末L*值带入x，由回归方程Y％＝16.994-0.119x，或饮片L*值带入x，由回归方程Y％＝19.1-0.179x，计算猪心血丹参水分值。
2.根据权利要求1所述的制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，其特征在于：所述每100g生丹参饮片，用鲜猪心血29～31g，加黄酒30g；烘干温度是47～53℃。
3.根据权利要求1所述的制备猪心血丹参饮片的炮制工艺，其特征在于：所述每100g生丹参饮片，用鲜猪心血30g，加黄酒30g；烘干温度是50℃。
4.一种猪心血丹参的快速检测方法，其特征在于，测定与内在指标显著相关的性状特征指标，包括粉末颜色值、饮片颜色值及饮片横截面直径；其中粉末颜色值：混合均匀样品粉末，过药典3号筛，取适量平整铺于样品皿底部，不留明显透光空隙，每批取样3次，每次平行测定3次，记录颜色值并计算平均值，作为样品粉末L*、a*、b*值，其中，L*代表亮度，L＝0与100分别为黑色和白色，a*代表红－绿色轴，a负值与正值分别代表绿色与红色，b*代表黄-蓝色轴，b负值与正值分别代表蓝色与黄色；其中饮片颜色值：每批样品以四分法取10片饮片，以表皮面和横截面分别覆盖样品测试口，每片饮片各测定3次，共记录6次颜色值，并计算平均值，作为样品饮片L*、a*、b*值；其中横截面直径：每批样品以四分法取40片饮片，用游标卡尺测定直径，记录数据后，通过丹参的横截面直径、和饮片或粉末的L*计算猪心血丹参酚酸类含量总和；通过饮片或粉末a*值计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；通过饮片或粉末L*值计算猪心血丹参水分值；
其中，性状特征指标的测定条件为：实验采用CM-5型分光测色仪，测定光源为D65,视角设置为10°，测量波长范围360～740mm；其中表皮及横截面采用SCI模式(镜面反射光与漫反射)，测量直径3mm；粉末采用SCE模式(漫反射)，测量直径30m，测量在校正后进行；
将丹参的横截面直径和粉末L*带入x1和x2，由回归方程Y％＝16.454+0.122x1-0.261x2，或将丹参的横截面直径和饮片L*带入x1和x2，由回归方程Y％＝21.382+0.124x1-0.402x2，可计算猪心血丹参酚酸类含量总和；将粉末a*值带入x，由回归方程Y％＝-0.459+0.080x，或饮片a*值带入x，由回归方程Y％＝0.078+0.131x，可计算猪心血丹参丹参酮类含量总和；将粉末L*值带入x，由回归方程Y％＝16.994-0.119x，或饮片L*值带入x，由回归方程Y％＝19.1-0.179x，计算猪心血丹参水分值。
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| CN110693943A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-01-17 | 江西中医药大学 | 一种星点设计－效应面法优化猪心血拌丹参最佳炮制工艺 |
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| 孟河医派特色猪心血丹参炮制历史沿革及现代研究进展;颜晓静;刘产明;曹震;张琪;;中国中药杂志(第15期);第67-70页 * |
| 猪心血拌丹参最佳炮制工艺的星点设计-效应面法优化;阳强;于欢;钟凌云;龚千峰;;时珍国医国药(第06期);第73-75页 * |
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