CN115844019A - 一种能够调节肠道的益生菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够调节肠道的益生菌及应用方向，属于微生物技术领域。本发明提供了植物乳杆菌CCFM8661在改善便秘方面的新用途，能够提高小鼠的粪便含水量；提高小鼠小肠推进率，缩短小鼠首次排黑便的时间。本发明的植物乳杆菌CCFM8661可搭配/代替药物缓解便秘，也可用于制备缓解便秘的普通食品和保健食品，具有非常广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够调节肠道的益生菌及应用方向，属于微生物技术领域。
背景技术
益生菌是指“当摄取足够数量时，对人体健康有益的活的微生物”。一方面，益生菌可防止病原体定殖和黏膜感染；另一方面，益生菌可通过稳定肠黏膜、增加黏液分泌和改善肠道蠕动来保护并治疗肠道疾病。在预防或治疗疾病的过程中，传统益生菌的主要限制是定植能力低，与病原体竞争和发挥免疫调节作用的能力较弱。为克服传统益生菌的局限性。目前市面上的有益菌具备以下特点：(1)能够耐受胃酸和胆汁；(2)可以在肠上皮细胞上黏附，并持续长久发挥益生效果。
肠道健康主要依靠肠道的免疫屏障、生物屏障和黏膜屏障。肠道免疫屏障是由肠道免疫细胞及其分泌物构成；肠道生物屏障由肠道内正常菌群构成；肠道黏膜屏障由完整的肠上皮细胞及其间的细胞连接和肠道黏液层构成，三大屏障之间的良性互作是维持肠道稳态的关键。随着饮食结构的改变和生活压力的增加，便秘已成为困扰现代人的主要健康问题之一。便秘是一种功能性胃肠病，主要临床表现为内容物干结缺水，排泄物在肠道内长时间滞留，排泄不通顺等症状。调查显示，在亚洲便秘的平均患病率为14％，其中老人和儿童的患病率较高，其中儿童在出生后第一年发病的机率为17％-40％。大多数便秘可以独立发生，也与许多系统性疾病相关，例如老年痴呆等。目前治疗便秘的方法包括基础治疗(改变饮食方式，多饮水，增加运动量等)；药物治疗(促胃肠动力药、泻剂)，如莫沙必利和塞纳，但是长期服用此类药物会产生腹泻腹痛、恶心、头痛、电解质紊乱等副作用，因此找到一种安全有效的缓解便秘的方法至关重要。研究表明，益生菌能够通过调节肠道菌群结构和改善肠道生态环境来改善肠道功能，从而达到缓解便秘的效果，近年来益生菌制剂已逐渐成为缓解便秘的健康选择方式。
发明内容
本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8661在制备改善便秘，或有助于润肠通便的产品中的应用，所述植物乳杆菌CCFM8661于2011年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.5494，已公开于公开号为CN111869735A的专利申请文件中。
在一种实施方式中，所述的植物乳杆菌CCFM8661具有如下特征：
菌体特征：革兰氏染色阳性，细胞杆状，菌体约2-4μm长，0.5-1.0μm宽，成单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形。
菌落特征：在MRS培养基上能够形成明显的菌落，直径在0.3-2.0mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。
生长特性：该菌株的最低生长温度为20℃，最高生长温度为40℃，在温度30-37℃下生长最佳，最高和最低初始生长pH为9.0和2.5，最适生长初始pH为6.0。
在一种实施方式中，所述产品中植物乳杆菌CCFM8661的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在一种实施方式中，所述产品包括普通食品或者保健食品。
在一种实施方式中，所述普通食品是固体饮料、发酵乳、凝胶糖果或压片糖果。
在一种实施方式中，所述保健食品的剂型为片剂或胶囊。
在一种实施方式中，益生菌固体饮料包括以下重量百分比原料：3％-15％植物乳杆菌CCFM8661，30％-45％木糖醇，25％-40％益生元，5％-15％抗性糊精，10-25％猕猴桃果粉；所述益生元包括水苏糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖中的一种或多种。
在一种实施方式中，益生菌固体饮料中各物料所占比例(按质量计)：13％植物乳杆菌CCFM8661，36％木糖醇，6％水苏糖，20％低聚果糖，8％抗性糊精，17％猕猴桃果粉。
在一种实施方式中，益生菌固体饮料制备方法包括以下步骤：
(1)按照以下重量百分比称量原料：13％植物乳杆菌CCFM8661，36％木糖醇，6％水苏糖，20％低聚果糖，8％抗性糊精，17％猕猴桃果粉；
(2)将木糖醇、水苏糖、低聚果糖、抗性糊精、猕猴桃果粉分别过40目筛后备用；
(3)将过筛后的木糖醇、水苏糖、低聚果糖和抗性糊精加入流化床中，使用10％低聚果糖溶液作为粘合剂进行喷雾造粒，结束造粒后对所得的颗粒进行干燥；
(4)筛分处理，取20-60目颗粒得造粒体；
(5)按照配比，将植物乳杆菌CCFM8661、猕猴桃果粉与造粒体混合均匀，得总混料；
(6)将总混料分装成1.5g/袋的小包装，获得直饮式益生菌固体饮料成品。
有益效果：本发明的植物乳杆菌CCFM8661能够提高小鼠的粪便含水量；提高小鼠小肠推进率，缩短小鼠首次排黑便的时间。因此，可选择使用本发明的植物乳杆菌CCFM8661搭配/代替药物缓解便秘。而且植物乳杆菌CCFM8661可用于制备缓解便秘的普通食品和保健食品，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
图1为不同组小鼠的粪便含水率。
图2为不同组小鼠的首例排黑便时间。
图3为不同组小鼠的小肠推进率。
具体实施方式
下述实施例中涉及的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8661的保藏编号为CGMCC No：5494，已公开于公开号为CN111869735A的专利申请文件中；下述实施例中涉及的SPF级8周龄雄性BALB/C小鼠购自斯莱克实验动物有限公司；下述实施例中涉及的脱脂乳购自恒天然商贸(上海)有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
固体培养基(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏10、葡萄糖20、乙酸钠2、酵母粉5、柠檬酸氢二铵2、K2PO4·3H2O 2.6、MgSO4·7H2O 0.1、MnSO4 0.05、吐温80 0.001、琼脂20、半胱氨酸氨酸盐0.5，pH6.8
液体培养基(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏10、葡萄糖20、乙酸钠2、酵母粉5、柠檬酸氢二铵2、K2PO4·3H2O 2.6、MgSO4·7H2O 0.1、MnSO4 0.05、吐温80 0.001、半胱氨酸氨酸盐0.5，pH6.8
下述实施例中涉及的脱脂乳及脱脂乳菌悬液的制备方法如下：
脱脂乳的制备方法：将质量百分比为10％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀,充分溶解后,在125℃下灭菌15min，冷却至室温。
脱脂乳菌悬液的制备方法：将植物乳杆菌CCFM8661接种于固体培养基上，35℃条件下培养48h，得到单菌落。在超净工作台中挑取单菌落接种至液体培养基中，35℃条件下培养18h进行活化，连续活化2代，得到活化液；将活化液按照2％(v/v)的接种量接种至液体培养基中，35℃条件下培养18h，将整个基质在4500r/min条件下离心10min，弃去上清液，得到植物乳杆菌CCFM8661菌体。用pH7.0的生理盐水重复洗涤植物乳杆菌CCFM8661菌体3次后重悬于脱脂乳液中，直至菌浓度为1.0×109CFU/mL。
实施例1植物乳杆菌CCFM8661灌喂小鼠时小鼠的耐受剂量实验
将植物乳杆菌CCFM8661冻干菌粉重悬于脱脂乳粉中，制成浓度为1.0×109CFU/mL的脱脂乳菌悬液。取体重25g左右的健康雄性BALB/C小鼠10只，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况，试验结果见表1。结果表明，喂食浓度1.0×109CFU/mL的植物乳杆菌CCFM8661未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
表1小鼠体重的变化及死亡情况
注：-：小鼠无死亡
实施例2植物乳杆菌CCFM8661对小鼠便秘的缓解作用
小鼠造模灌胃如表2所示，具体如下：取体重20-25g的健康雄性BALB/C小鼠32只，随机分为4组：空白对照组、便秘模型对照组、植物乳杆菌CCFM8661干预组和酚酞治疗对照组，每组含小鼠8只。实验前14天每天给植物乳杆菌CCFM8661干预组小鼠灌喂0.25mL浓度为1.0×109CFU/mL的植物乳杆菌CCFM8661脱脂乳悬液，其余3组灌喂0.25mL不含菌的脱脂乳。试验第15-16天，空白对照组灌胃0.25mL生理盐水，其余3组灌胃0.25mL，1mg/mL的洛哌丁胺溶液，并确保小鼠洛哌丁胺的灌胃量为10mg/kg。灌胃结束1h后，空白对照组和便秘模型对照组灌胃0.25mL脱脂乳，植物乳杆菌CCFM8661干预组小鼠灌喂0.25mL浓度1.0×109CFU/mL的植物乳杆菌CCFM8661菌液，酚酞治疗对照组灌胃0.25mL，7mg/mL的酚酞溶液，并确保小鼠酚酞灌胃量为70mg/kg。实验期间的每天收集小鼠粪便，用于小鼠粪便含水量的计算，并按照下式计算粪便含水量：
粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100。
第17天上午除空白对照组灌胃0.25mL生理盐水，其余组均灌胃0.25mL，1mg/mL的洛哌丁胺溶液，并确保小鼠洛哌丁胺的灌胃量为10mg/kg。灌胃1h后，对所有小鼠灌胃0.25mL活性炭阿拉伯树胶水溶液，然后将每只小鼠单独放置在一个干净的铺有吸水纸的不锈钢笼中，记录从灌胃活性炭开始到第一粒黑便排出的时间，期间小鼠自由进食和饮水。在第17日下午6点左右对小鼠进行禁食，于第18日上午重复17日上午的实验一次，不同之处就是在灌胃洛哌丁胺30mim后，取血并处死小鼠，剖开腹腔并分离小鼠的肠系膜，剪取上自幽门、下至回盲部的整根肠管，放于吸水纸上，将此条肠管拉成直线，所测肠管长度即为小肠总长度，从幽门至活性炭汁前沿为“活性炭推进长度”。通过测量小肠中活性炭的推进长度，按下式计算推进率：
推进率(％)＝(活性炭推进距离)/(小肠总长度)×100。
表2不同组小鼠造模方法
小鼠粪便含水量、首粒排黑便时间以及小肠推进率结果如图1，图2，图3所示，由图可以看出，植物乳杆菌CCFM8661干预组和酚酞治疗对照组均能够显著提高粪便的含水量、小肠推进率以及缩短首粒黑便时间，与空白对照组相比，植物乳杆菌CCFM8661干预组能够将小鼠粪便含水量从54％提高至57％；小鼠小肠推进率从40％提高至52％；小鼠首粒排黑便时间从192min缩短至165min。而且，本发明植物乳杆菌CCFM8661在改善粪便含水量、提高小肠推进率方面能够达到泻剂酚酞的治疗效果，而在提高整个肠道运转时间(首粒排黑便时间)方面优于酚酞并呈现最好的效果。这说明植物乳杆菌CCFM8661具有缓解便秘的作用。
实施例3使用植物乳杆菌CCFM8661制作益生菌固体饮料
按照以下重量百分比称量原料：13％植物乳杆菌CCFM8661菌粉，36％木糖醇，6％水苏糖，20％低聚果糖，8％抗性糊精，17％猕猴桃果汁粉(拓丰TF3024)；将木糖醇、水苏糖、低聚果糖、抗性糊精、猕猴桃果粉分别过40目筛后备用；将过筛后的木糖醇、水苏糖、低聚果糖和抗性糊精加入流化床中，使用100g/L低聚果糖溶液作为粘合剂进行喷雾造粒，结束造粒后对所得的颗粒进行干燥、筛分处理，取20-60目颗粒得造粒体；按照配比，将植物乳杆菌CCFM8661、猕猴桃果粉与造粒体混合均匀，得总混料；将总混料分装成1.5g/袋的小包装，获得菌浓≥400亿CFU/g的直饮式益生菌固体饮料成品。
实施例4使用植物乳杆菌CCFM8661制作发酵乳
称取20g全脂奶粉，40g脱脂奶粉，36g蔗糖溶于550mL饮用水中(55℃左右)，先在900rpm搅拌至奶粉全部溶于水中，降低转速至650RPM，搅拌15min后静止水合30min。乳液在20Mpa压力下均质后在95℃热杀菌20min，然后冷却至4℃，加入植物乳杆菌CCFM8661作为发酵剂，使其浓度达到106CFU/mL以上，接种完的奶液放置于43℃条件下发酵5h左右(发酵过程中应尽量减少搅拌，以保持质地的完整性)，发酵结束后在温度4℃下冷藏24h，即得含有本发明植物乳杆菌CCFM8661的发酵乳。
实施例5使用植物乳杆菌CCFM8661制作胶囊
将本发明的植物乳杆菌CCFM8661在液体培养基中培养24h，于4℃条件下，4000RPM离心20min，用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗两次后，使用脱脂乳重悬菌体，并使最终菌体浓度达到1×1010-3×1010CFU/mL。将菌悬液加入到3％的海藻酸钠溶液中，充分搅拌，使菌体均匀地分散于海藻酸钠溶液中，然后将此混合液挤压到2％的氯化钙溶液中形成胶粒，静止固化30min，过滤收集胶粒，将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到含有本发明植物乳杆菌CCFM8661的粉剂，把这种粉剂装入到明胶胶囊壳中，也可使用产业化的植物乳杆菌CCFM8661菌粉，和硬脂酸镁一起装填进明胶胶囊壳中，即得所述的胶囊制品。
实施例6使用植物乳杆菌CCFM8661制作压片糖果
首先按照以下重量百分比称量原料：15％菌粉，45％糖醇，10％低聚半乳糖，10％抗性糊精，14％甜橙粉，6％硬脂酸镁，按照下述步骤进行压片：
原料处理→原辅料混合(除硬脂酸镁和菌粉)→制湿颗粒(55％乙醇)→干燥→整粒混合(过14目筛，加入硬脂酸镁和菌粉)→压片。操作要点如下：
(1)原料处理：按照配方比例将称好的糖醇、低聚半乳糖、抗性糊精、甜橙粉过40目筛，保存备用。
(2)原辅料混合：将过筛后的糖醇、低聚半乳糖、抗性糊精、甜橙粉充分混合30min。
(3)制湿颗粒：在处理好的样品中加入浓度为55％乙醇，加入量为原辅料质量的7％，搅拌5min后制成适宜的湿颗粒。
(4)干燥：将制成的湿颗粒均匀分散在不锈钢托盘上，置于60℃恒温干燥箱中干燥3h，每隔30min翻动1次，保证干燥后的颗粒湿度在3％～5％。
(5)整理混合：将干燥后的颗粒过14目筛，加硬脂酸镁和菌粉充分混合。
(6)压片：使用压片机进行压片，即得压片糖果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8661在制备改善便秘的产品中的应用，所述植物乳杆菌CCFM8661于2011年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.5494。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品中植物乳杆菌CCFM8661的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括普通食品或者保健品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述普通食品是固体饮料、发酵乳、凝胶糖果或压片糖果。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保健品是有助于润肠通便的保健品。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述保健品的剂型为片剂或胶囊。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固体饮料含有按重量百分比计：3％-15％植物乳杆菌CCFM8661，30％-45％木糖醇，25％-40％益生元，5％-15％抗性糊精，10-25％猕猴桃果粉；所述益生元包括水苏糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖中的一种或多种。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固体饮料含有按重量百分比计：13％植物乳杆菌CCFM8661，36％木糖醇，26％益生元，8％抗性糊精，17％猕猴桃果粉；所述益生元包括水苏糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖中的一种或多种。
9.一种能够改善便秘、有助于润肠通便的益生菌固体饮料，其特征在于，按如下方法制备：
(1)按重量百分比称量原料：3％-15％植物乳杆菌CCFM8661，30％-45％木糖醇，25％-40％益生元，5％-15％抗性糊精，10-25％猕猴桃果粉；所述益生元包括水苏糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖中的一种或多种；
(2)将木糖醇、水苏糖、低聚果糖、抗性糊精、猕猴桃果粉过筛；
(3)将过筛后的木糖醇、水苏糖、低聚果糖和抗性糊精加入流化床中，使用低聚果糖溶液作为粘合剂进行喷雾造粒，结束造粒后对所得的颗粒进行干燥；
(4)筛分处理，取20-60目颗粒得造粒体；
(5)将植物乳杆菌CCFM8661、猕猴桃果粉与造粒体混合均匀，得总混料；
(6)将总混料分装，获得直饮式益生菌固体饮料成品；
所述植物乳杆菌CCFM8661于2011年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.5494。
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| CN116803300A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-09-26 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 一种具有改善慢性便秘症状的合生元组合物及其制备方法与应用 |
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