CN115839876A

CN115839876A - 一种降低次生代谢物的植物细胞悬浮液制备方法

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Publication number: CN115839876A
Application number: CN202211539437.3A
Authority: CN
Inventors: 贾艳霞; 杨俊波; 任元; 杨兴龙
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明提供了一种降低次生代谢物的植物细胞悬浮液制备方法，属于细胞核提取技术领域。本发明所述植物细胞悬浮液制备方法包括：将植物叶片置于处理液中浸泡5‑15h后，于mG^b解离液中解离得到细胞核悬浮液。本发明处理液可将植物叶片中多酚、多糖或其他次生代谢物含量高的植物组织细胞核充分解离，降低次生代谢物对细胞核DNA含量检测的影响。采用本发明方法得到的细胞核悬浮液检测，具有进样粒子数多、收集粒子数多、变异系数(CV)小、DNA含量检测准确性高的特点。

Description

一种降低次生代谢物的植物细胞悬浮液制备方法

技术领域

本发明属于细胞核提取技术领域，尤其涉及一种降低次生代谢物的植物细胞悬浮液制备方法。

背景技术

在研究植物的过程中，往往要对其生长发育和基因等因素进行检测研究。其中，对植物的基因组大小以及其DNA倍性的研究对该植物的品系、性状及营养和药用价值等均有极其密切的关联。流式细胞仪运用激光技术和光电测量技术，并将计算机技术和流体力学结合起来，以细胞免疫荧光化学技术为基础，检测细胞的大小、内部结构、DNA含量、特异蛋白质等。这一方法包括完整细胞核DNA的提取和荧光染色，根据相对荧光强度来分析DNA的含量。

而在检测过程中，植物组织中的某些物质对DNA含量测定有一定影响。这类物质是植物在长期进化过程中与生物或非生物因素相互作用，以适应环境而代谢产生一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，即次生代谢物。其主要分为含氮有机物、萜类化合物和酚类化合物三大类，如色素、生物碱、萜类、抗生素等。这类次生代谢物不仅难去除，还会介导基因组DNA的降解以及包裹吸附在基因组DNA表面，使得DNA含量检测不准确。

目前常规的细胞核悬浮液制备方法对次生代谢物含量高的植物组织存在一定局限性，如：1.部分试剂的细胞壁渗透性低；2.许多细胞结构可能会与荧光标记物非特异性结合，从而荧光色素发出的荧光难以与测量信号区分开。而植物细胞中常存在的次生代谢物可能会干扰荧光染料的染色和/或荧光信号；3.次生代谢物的自发荧光、黏性物质等干扰细胞核的检测(带动粒子的不规则运动)，从而影响植物细胞核DNA含量的测定；4.尼龙膜仅可以过滤部分大分子细胞碎片及杂质，而较多小分子的次生代谢物难以过滤去除；5.常用解离液如mG^b、WPB等，以及加入一定浓度DTT(巯基化DNA的还原剂和去保护剂，降低一些偶联反应实验的效率；在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后，可以降低DNA的二聚化)、β-巯基乙醇等还原剂，不能很好地对杨梅、杜鹃等多酚、多糖或其他次生代谢物含量高的植物组织的细胞核进行充分解离，使得DNA含量检测受影响。因此，亟需发明一种降低植物组织中次生代谢物对DNA含量检测影响的处理方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种降低次生代谢物的植物细胞悬浮液制备方法，能显著降低植物组织中次生代谢物对细胞核DNA含量检测的影响。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种降低次生代谢物的植物细胞悬浮液制备方法，所述方法包括：将植物叶片置于处理液中浸泡5-15h后，于mG^b解离液中解离得到细胞核悬浮液；所述处理液包括乙醇溶液和/或PVP10溶液。

优选的，所述次生代谢物包括多酚和/或多糖。

优选的，所述次生代谢物为多酚时，所述处理液为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积百分含量为70％-80％。

优选的，所述植物包括杨梅、杜鹃。

优选的，所述生次生代谢物为多糖时，所述生次生代谢物为多糖时，所述处理液中包括乙醇溶液和PVP10溶液；所述处理液的制备方法包括：在体积百分含量为70％-80％的乙醇溶液中加入PVP10；所述处理液中PVP10的质量体积比为0.5％-2％。

优选的，所述植物包括海带。

优选的，所述mG^b解离液包括以下浓度的组分：40-50mMMgCl₂·6H₂O，15-25mMMOPS，25-35mM柠檬酸钠，质量体积比为0.5％-2％的PVP40，体积比为0.1％-0.2％的Tritonx-100，8-12mMNa₂EDTA。

优选的，所述植物叶片与mG^b解离液的质量体积比为(30-40):(0.5-1)mg/mL；所述解离的时间为8-12min。

优选的，所述解离过程中还包括将所述植物叶片切碎。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明制备植物细胞悬浮液的方法包括：将植物叶片置于处理液中浸泡5-15h后，于mG^b解离液中解离得到细胞核悬浮液。本发明处理液可将植物叶片中多酚、多糖或其他次生代谢物含量高的植物组织细胞核充分解离，降低了次生代谢物对细胞核DNA含量检测的影响。采用本发明方法得到的细胞核悬浮液检测，具有进样粒子数多、收集粒子数多、峰形好、成图美观、DNA含量检测准确的特点。

附图说明

图1为实施例1利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图2为实施例3利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图3为实施例4利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图4为对比例1利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图5为对比例2利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图6为对比例3利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图7为对比例4利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图8为对比例5利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图9为对比例6利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图10为对比例7利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图11为对比例8利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图12为对比例9利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果；

图13为对比例10利用流式细胞仪对DNA含量检测的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种降低次生代谢物的植物细胞悬浮液制备方法，包括：将植物叶片置于处理液中浸泡5-15h后，于mG^b解离液中解离得到细胞核悬浮液；所述处理液包括乙醇溶液和/或PVP10溶液。

本发明所述方法能降低植物细胞悬浮液中的次生代谢物；所述次生代谢物优选包括多酚和/或多糖。

当所述生代谢物为多酚时，所述处理液优选为乙醇溶液；所述乙醇溶液的体积百分含量优选为70％-80％，更优选为75％；所述浸泡时间优选为5.5-7h，更优选为6h；作为一种实施方式，所述植物可选的包括杨梅、杜鹃。

当所述次生代谢物为多糖时，所述处理液包括乙醇溶液和PVP10溶液；所述乙醇溶液的体积百分含量优选为70％-80％，更优选为75％；所述PVP10溶液的质量体积比优选为0.5％-2％，更优选为1％；作为一种实施方式，所述处理液的制备方法包括，在2mL体积百分含量为75％的乙醇溶液中加入0.02g质量的PVP10粉末。所述浸泡时间优选为10-14h，更优选为12h。

在本发明中，乙醇溶液能有效固定DNA，以免细胞成团，降低黏附，叶片中的次生代谢物能溶解于乙醇溶液，可降低次生代谢物对检测细胞核DNA含量的影响；PVP10可使酚类物质从蛋白质和DNA被氧化之前剥离，抑制氧化。本发明针对不同植物组织的大小、厚薄中的次生代谢物，采用不同的处理液和不同的处理时间，对叶片进行处理后，能将叶片中的次生代谢物溶解，抑制DNA被氧化，降低次生代谢物对细胞核DNA含量的影响。

在本发明中，所述mG^b解离液优选包括以下浓度的组分：40-50mM MgCl₂·6H₂O，15-25mMMOPS，25-35mM柠檬酸钠，质量体积比为0.5％-2％的PVP40，体积比为0.1％-0.2％的Tritonx-100，8-12mMNa₂EDTA，；更优选为45mMMgCl₂·6H₂O，20mMMOPS，30mM柠檬酸钠，质量体积比为1％PVP40，体积比为0.2％Tritonx-100，10mMNa₂EDTA，pH7.5；所述植物叶片与mG^b解离液的质量体积比优选为(30-40):(0.5-1)mg/mL，更优选为35:0.8mg/mL；所述解离的时间优选为8-12min，更优选为10min；所述解离过程中还优选包括将所述植物叶片切碎。本发明解离步骤能够有效解离细胞组织，使细胞核得以释放。

在所述解离步骤后还优选包括用35-45μm孔径尼龙膜滤网过滤，更优选为40μm。

本发明对所述原料的来源没有特殊的限定，采用本领域常规市售产品即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例和对比例中使用的mG^b解离液由以下浓度的组分组成：45mM MgCl₂·6H₂O，20mMMOPS，30mM柠檬酸钠，1％(W/V)PVP40，0.2％(v/v)Tritonx-100，10mMNa2EDTA，pH7.5。

实施例1

(1)材料的选取：摘选长度8-10厘米成熟的杨梅叶片，将其表面轻轻擦拭干净，切取植物组织35mg，置于洁净EP管备用；

(2)处理液的制备和材料的前处理：向管内加入配制的体积百分含量为75％的乙醇溶液；将称取好的植物组织置于乙醇溶液中，浸泡6h；

(3)取出处理后的杨梅叶片，将其表面擦拭干净并用UP水冲洗，置于0.8mL预冷的mG^b解离液中，用锋利的刀片将组织迅速垂直切碎，将培养皿静置于冰上解离10min，期间用移液器轻轻吹打两次；

(4)吸取步骤(3)液体，用40μm孔径尼龙膜滤网过滤，即得到细胞核悬浮液。

实施例2

(1)材料的选取：摘选长度9-11厘米成熟的杜鹃叶片，将其表面轻轻擦拭干净，切取植物组织35mg，置于洁净EP管备用；

(3)取出处理后的杜鹃叶片，将其表面擦拭干净并用UP水冲洗，置于0.8mL预冷的mG^b解离液中，用锋利的刀片将组织迅速垂直切碎，将培养皿静置于冰上解离10min，期间用移液器轻轻吹打两次；

实施例3

(1)材料的选取：摘选厚度约为0.3mm的成熟期的海带叶片的根部，将其表面轻轻擦拭干净，切取植物组织35mg，置于洁净EP管备用；

(2)处理液的制备和材料的前处理：在2mL体积百分含量为75％的乙醇溶液中加入0.02g质量的PVP10粉末，得到处理液；将称取好的植物组织置于处理液中，浸泡12h；

(3)取出处理后的海带叶片，将其表面擦拭干净并用UP水冲洗，置于0.8mL预冷的mG^b解离液中，用锋利的刀片将组织迅速垂直切碎，将培养皿静置于冰上解离10min，期间用移液器慢慢吹打两次；

实施例4

具体实施方式和实施例1相同，不同的是将杨梅叶片改为杜鹃叶片。

对比例1

具体实施方式和实施例1相同，不同的是处理液为无水乙醇。

对比例2

具体实施方式和实施例1相同，不同的是处理液为卡诺氏固定液。

对比例3

具体实施方式和实施例1相同，不同的是未进行步骤(2)。

对比例4

具体实施方式和实施例3相同，不同的是处理液为75％乙醇溶液。

对比例5

具体实施方式和实施例3相同，不同的是处理液为75％乙醇溶液和1.5％的PVP10。

对比例6

具体实施方式和实施例3相同，不同的是处理液为75％乙醇溶液和2％的PVP10。

对比例7

具体实施方式和实施例3相同，不同的是未进行步骤(2)。

对比例8

具体实施方式和实施例4相同，不同的是处理液为无水乙醇。

对比例9

具体实施方式和实施例4相同，不同的是处理液为卡诺氏固定液。

对比例10

具体实施方式和实施例4相同，不同的是未进行步骤(2)。

实验例1

流式细胞术(Flowcytometry，FCM)测定基因组大小是近年发展起来且已经逐渐成为常用的测定方法，样本的完整细胞核以快速流动的状态通过流式细胞仪的激光器，从而得到样品的大小、形态、内部复杂度和荧光信号灯数据参数。通过比较参照植物和样品的荧光强度，从而计算出待测样品DNA含量。具体计算公式如下：待测样品基因组大小＝待测样品的荧光强度/参照植物荧光强度×参照植物基因组大小。该方法简便易行，检测结果较为稳定可靠。

(1)分别向0.5mL实施例1、实施例3、对比例1-7的细胞核悬浮液中加入预冷的25μL碘化丙啶PI(工作浓度50μg/mL)和25μLRNase溶液(工作浓度50μg/mL)，置于冰上避光染色0.5-1h；

(2)利用BD FACScalibur流式细胞仪对染色后的细胞核悬浮液样品上机检测，采用488nm蓝光激发，检测碘化丙啶的发射光荧光强度。每次检测以相同速度、收集相同时间内碘化丙啶的发射光荧光强度。使用Cell Quest分析软件作图分析；

(3)通过作图得到散点图、植物细胞流式细胞仪图(R1细胞群)、(根据R1细胞群)单参数直方图(位置出现高尖峰)，具体结果见表1-2和图1-13。

表1各处理杨梅细胞核收集情况

表2各处理海带细胞核收集情况

由表1和图1、图4-6可知，材料为杨梅，实施例1相对于对比例1-3，上样速度快、收集到的目的细胞核多、CV(变异系数，CV越小说明细胞核越完整、特异性越好)小、有效分离得到细胞效果最佳、DNA含量检测更准确；由表2和图7-10可知，材料为海带，实施例3相对于对比例4-7，上样速度快、收集到的目的细胞核多、CV(变异系数，CV越小说明细胞核越完整、特异性越好)小、有效分离得到细胞效果最佳、DNA含量检测更准确。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种降低次生代谢物的植物细胞悬浮液制备方法，其特征在于，所述方法包括：将植物叶片置于处理液中浸泡5-15h后，于mG^b解离液中解离得到细胞核悬浮液；

所述处理液包括乙醇溶液和/或PVP10溶液。

2.根据权利要求1所述的植物细胞悬浮液制备方法，其特征在于，所述次生代谢物包括多酚和/或多糖。

3.根据权利要求2所述的植物细胞悬浮液制备方法，其特征在于，所述次生代谢物为多酚时，所述处理液为乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积百分含量为70％-80％。

4.根据权利要求3所述的植物细胞悬浮液制备方法，其特征在于，所述植物包括杨梅、杜鹃。

5.根据权利要求2所述的植物细胞悬浮液制备方法，其特征在于，所述次生代谢物为多糖时，所述处理液包括乙醇溶液和PVP10溶液；所述处理液的制备方法包括：在体积百分含量为70％-80％的乙醇溶液中加入PVP10；所述处理液中PVP10的质量体积比为0.5％-2％。

6.根据权利要求5所述的植物细胞悬浮液制备方法，其特征在于，所述植物包括海带。

7.根据权利要求1所述的植物细胞悬浮液制备方法，其特征在于，所述mG^b解离液包括以下浓度的组分：40-50mMMgCl₂·6H₂O，15-25mM MOPS，25-35mM柠檬酸钠，质量体积比为0.5％-2％的PVP40，体积比为0.1％-0.2％的Tritonx-100，8-12mMNa₂EDTA。

8.根据权利要求7所述的植物细胞悬浮液制备方法，其特征在于，所述植物叶片与mG^b解离液的质量体积比为(30-40):(0.5-1)mg/mL；所述解离的时间为8-12min。

9.根据权利要求1所述的植物细胞悬浮液制备方法，其特征在于，所述解离过程中还包括将所述植物叶片切碎。