CN115838704A - 脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程和蛋白质改造技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其应用。与野生型相比，该突变体包含K79R，I91C，R113K，I260C四个突变位点，其在里氏木霉中的表达酶活提高了35%，取得了意料不到的技术效果，有利于降低该酶的生产成本，促进其在医药、饲料、食品等工业领域中的广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其应用。
背景技术
脂肪酶（EC3.1.1.3）能够在油水界面水解油脂形成脂肪酸、甘油二酯、单甘酯和甘油等产物；同时在非水相条件下脂肪酶还可以催化酯化、酯交换、醇解和酸解等反应。由于脂肪酶特殊的酶学特性使其在食品、油脂改性、洗涤、生物柴油、生物制药等领域具有广泛的应用潜力。脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，与动植物相比，微生物来源的脂肪酶具有更广的pH值、作用温度范围及底物特异性，此外微生物来源的脂肪酶一般为胞外酶，更适合工业化大生产，因此目前市面商品化的脂肪酶主要为微生物脂肪酶。
自1834年Eberl首次发现兔胰脂肪酶至今，科学家已经确定在自然界中能够产脂肪酶的微生物分布较为广泛，约有65个属。根据微生物脂肪酶来源不同，主要分为细菌脂肪酶、真菌脂肪酶和其它来源微生物脂肪酶。随着科研人员对脂肪酶研究的深入，越来越多的微生物脂肪酶被发掘，表征和商业化。目前微生物脂肪酶的研究主要集中在细菌脂肪酶和真菌脂肪酶，细菌脂肪酶则主要集中于芽孢杆菌脂肪酶和假单胞菌脂肪酶；真菌脂肪酶则主要集中于根霉脂肪酶、酵母脂肪酶以及曲霉脂肪酶。
当今时代，随着更多酶的高级结构逐渐被解析出来，生物信息学及蛋白质工程技术的普遍应用更是加速了人们对脂肪酶的研究，多种具有耐高温、耐有机溶剂等优良特性的酶被改造出来。例如，为了提高土曲霉脂肪酶的催化活性，Zhang X 等人通过理性设计，对酸性脂肪酶 ATL 的盖子结构域和底物结合口袋等结构域中的几种氨基酸进行定点突变，获得的突变体 ATLLid 和 ATLV218W 对对硝基苯基月桂酸酯等底物表现出更高的水解活性，其Kcat值分别是野生型脂肪酶的39.37倍和50.79倍，Kcat / Km值分别比野生型高2.85和8.48倍；Yaacob N 等人将荧光假单胞菌AMS8脂肪酶盖子1区域的氨基酸进行突变，获得T52Y和G55Y这两种突变体。与野生型相比，两种突变体均显示出更好的催化功能；为了提高脂肪酶MAS1的催化活性和热稳定性，Zhao G等人将位于脂肪酶MAS1底物结合口袋中具有较大侧链的八个氨基酸分别替换成丙氨酸。最终得到一个半衰期比野生型长五倍的突变体，此外还筛选到两个对棕榈硬脂酸显示出更高水解能力的突变体；Mohammadi M等人对粘质沙雷氏菌脂肪酶A进行定点诱变，结果表明，通过突变可以增强脂肪酶SML的活性和热稳定性。
由于天然脂肪酶具有较低的表达量，限制了其产业化应用，因此需要定向的提升脂肪酶的表达量，从而为其进一步应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酶突变体及其应用。与野生型相比，该突变体的酶活水平得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明涉及一种脂肪酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：79，91，113，260。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：K79R，I91C，R113K，I260C。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：
K79R；
I91C；
R113K；
I260C；
K79R/I91C；
K79R/R113K；
K79R/I260C；
I91C/R113K；
I91C/I260C；
R113K/I260C;
K79R/I91C/R113K；
K79R/I91C/I260C；
K79R/R113K/I260C；
I91C/R113K/I260C；
K79R/I91C/R113K/I260C。
本发明还涉及编码上述脂肪酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
将上述的重组表达载体转入宿主细胞中，重组表达的脂肪酶突变体的酶活得到显著提升。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
本发明提供的脂肪酶突变体包含K79R、I91C、R113K和I260C四个突变位点。与野生型相比，所述突变体在里氏木霉中的表达酶活提高了35%，摇瓶发酵酶活达到2761U/mL，取得了意料不到的技术效果，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在食品、饲料、医药等工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，里氏木霉宿主菌Q4本公司保藏、载体pKL本公司保藏，Amp等购自上海生工生物工程有限公司。
酶与试剂盒：DNA聚合酶购买自NEB公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
主要培养基：
LB培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；
LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素；
YEG培养基：0.5%酵母粉、1%葡萄糖
上层半固体培养基：0.1%MgSO4, 1%KH2PO4, 0.6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖；
下层基础培养基：2%葡萄糖，0.5%(NH4)2SO4, 1.5%KH2PO4, 0.06%MgSO4, 0.06%CaCl2，1.5%琼脂粉；
MM发酵培养基：1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH4)2SO4，0.09%MgSO4，2%KH2PO4，0.04%CaCl2，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000
下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。
实施例1 脂肪酶基因克隆
申请人将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的野生型脂肪酶基因命名ZFTL，根据里氏木霉的密码子偏好性，对其进行密码子优化，送华大基因进行基因合成。所述野生型脂肪酶ZFTL基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
运用PCR技术克隆脂肪酶ZFTL基因片段，引物和反应条件如下：
上游引物1(F)：GTACGGTACCAGCCCCATCCGCCGCGAGGTCAG（下划线为KpnI酶切位点）；
下游引物1(R)：CTGATCTAGATTAGAGGCAAGTGCCGATGGGGCCGA（下划线为XbaI酶切位点）。
PCR条件为：98℃变性1min；98℃变性10s，56℃复性15s，72℃延伸1min，30个循环，72℃保温5min。ZFTL基因全长822bp。
实施例2 脂肪酶突变体的筛选与里氏木霉工程菌的构建
申请人为了进一步提高野生型脂肪酶ZFTL的表达酶活，通过定向进化技术对该酶的基因进行了大量突变的筛选。
以优化后的脂肪酶基因为模板，利用引物上游引物1(F)和下游引物1(R)，用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增；胶回收PCR产物。所述PCR产物即为脂肪酶突变体的基因片段。
2.1表达质粒的构建
将野生型脂肪酶ZFTL的基因片段和上述获得的PCR产物用限制性内切酶Kpn I和Xba I进行双酶切，同样对木霉表达载体pKL用限制性内切酶Kpn I和Xba I进行双酶切。然后用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体22℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养。待转化子出现后，用牙签逐个挑至多个96孔板，然后提取质粒用于里氏木霉转化。
2.2里氏木霉原生质体制备
接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长7天；切取直径约3cm的菌落置于约60ml YEG液体培养基中，30℃，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20ml裂解酶液（0.2g/10ml，0.7 M NaCl溶解，Sigma L1412）酶解2 h；取出酶解液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加5 ml 溶液2悬浮，然后3000 rpm，离心10 min；加适量溶液2悬浮分装（200 µl/管，108个/ml）。
2.3转化
每个质粒 DNA取10 ul 加入到200µl原生质体中，接着加入50µl 25%PEG溶液轻轻混匀，冰浴20min；然后加入2 ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基，轻轻混匀后倒入含100µg/ml潮霉素下层基础培养基，30℃黑暗培养数天至转化子长出。
上述获得的阳性转化子即为重组表达野生型脂肪酶ZFTL及其突变体的里氏木霉工程菌株。
2.4摇瓶发酵验证
将上述构建得到的重组表达野生型脂肪酶ZFTL及其突变体的里氏木霉工程菌株分别接种于MM发酵培养基，30℃培养48h，然后25℃乳糖诱导培养72h。离心取发酵上清液，进行脂肪酶酶活测定分析。
结果显示，与重组表达野生型脂肪酶ZFTL的工程菌相比，本发明构建的重组表达脂肪酶突变体的工程菌中，多数菌株的发酵酶活不同程度下降，仅有1株菌的酶活显著提高。申请人将该工程菌命名为里氏木霉ZFTL-32（Trichoderma reesei ZFTL-32）。
该菌株摇瓶发酵上清液中脂肪酶酶活高达2761 U/ml，与重组表达野生型脂肪酶ZFTL的工程菌提高了35%，取得了意料不到的技术效果。
脂肪酶酶活测定方法
（1）酶活定义：
在40℃、pH值为7.5的条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
（2）底物溶液：
秤取聚乙烯醇（PVA：聚合度1750±50）40g，加水800ml，浸泡4-6h，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，搅拌冷却后定容至1000ml，用干净的6-8层纱布过滤，取滤液备用。量取上述滤液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机处理10min（分4次处理，间隔5min，每次处理2-3min），即得乳白色PVA乳化液。现用现配。
（3）测定方法：
取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入底物溶液4ml和pH7.5磷酸缓冲液5ml，再于空白瓶（A）中加入95%乙醇15ml，于40℃水浴中预热5min；向空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入待测酶液1ml，立即混匀计时，准确反应15min后，使用分样移液器于样品瓶（B）中立即补加95%乙醇15ml终止反应，取出；将上述反应液倒入50ml烧杯中，向三角瓶中加入5ml纯水，摇匀后倒入50ml烧杯中，加入2滴酚酞指示剂；使用校正过碱性条件的pH计，在搅拌的条件下向烧杯中加入0.05mol/L的氢氧化钠溶液，滴定至pH值为9.92；滴定至pH值在20s不再变化为终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
酶活力计算公式：X=
。
X——脂肪酶活力，u/ml；
V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml；
V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml；
C——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
50——0.05mol/L氢氧化钠溶液1ml相当于脂肪酸50μmol；
n——酶液稀释倍数；
0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；
15——时间换算系数。
实施例4 脂肪酶突变体序列的确定
4.1 总DNA的提取
将上述构建得到的酶活水平最高的里氏木霉ZFTL-32过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液（100 mM Tris-HCl，100 mMEDTA，250 mM NaCl，1%SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl 10M NH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。
4.2 测序分析
利用实施例1中所述上下游引物进行PCR，扩增目的基因。PCR扩增条件为94℃3min；94℃ 30S；56℃ 30S，72℃ 60S 30个循环；72℃5min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。PCR回收产物做TA克隆，挑取阳性转化子送上海生工生物工程有限公司测序分析。
测序结果显示，从里氏木霉ZFTL-32中扩增得到的脂肪酶突变体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
将野生型脂肪酶ZFTL与上述脂肪酶突变体的氨基酸序列进行比对发现，所述脂肪酶突变体中包含四个突变位点，分别为K79R、I91C、R113K和I260C。
本发明提供的脂肪酶突变体能显著提高其在里氏木霉中的表达量，有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料、食品、医药等工业领域的广泛应用。
Claims (10)
1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：79，91，113，260。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：K79R，I91C，R113K，I260C。
5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：
K79R；
I91C；
R113K；
I260C；
K79R/I91C；
K79R/R113K；
K79R/I260C；
I91C/R113K；
I91C/I260C；
R113K/I260C;
K79R/I91C/R113K；
K79R/I91C/I260C；
K79R/R113K/I260C；
I91C/R113K/I260C；
K79R/I91C/R113K/I260C。
6.编码权利要求1-5任一所述的脂肪酶突变体的DNA分子。
7.包含权利要求6所述的DNA分子的重组表达载体。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求7所述的重组表达载体。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
10.权利要求1-5任一所述脂肪酶突变体在饲料或医药领域中的应用。
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