CN115820675A - 一种改进的ccdB蛋白编码基因及其相关生物材料和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改进的ccdB蛋白编码基因及其相关生物材料和应用,属于基因工程技术领域。所述改进的ccdB蛋白编码基因具有SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.7任一所示的核苷酸序列。本发明还公开了与所述改进的ccdB蛋白编码基因相关的生物材料。利用本发明所述的改进的ccdB蛋白编码基因或其相关生物材料制备单克隆抗体相关蛋白,能够大大提升转化效率,适用于高通量单克隆抗体的开发和生产,具有非常好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体地,涉及一种改进的ccdB蛋白编码基因及其相关生物材料和应用。
背景技术
经过多年的发展,单克隆抗体已经走出实验室延伸到临床诊断和治疗性单克隆抗体药物,在基础科研和生命科学各领域中发挥着越来越重要的作用。B细胞克隆技术是近年来新发展的一种速制备单克隆抗体的技术,是根据单个B细胞只产生一种特异性抗体的特性,通过分子克隆技术从单个抗体分泌B细胞中扩增IgG重链(Heavy chain)和轻链(Lightchain)的全长(Full length)或可变区(Variable region)基因并构建到载体(vector)上,然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。这种方法既保留了重链和轻链的天然配对,又具有基因多样性好、效率高、全天然源性的特点,也成为了目前快速开发诊断抗体原料和治疗性抗体药物前体的重要策略。但高通量抗体基因的重组成功率仍然是现在B细胞克隆技术所面临的难题之一,即在通过PCR获得大量抗体基因后,如何快速高效地实现大规模重组载体构建的问题。
B细胞克隆技术的其中一个过程是将抗体的重链和轻链基因克隆到表达载体上,以获得大量的重组质粒转染哺乳动物细胞,如HEK293细胞、CHO细胞等,表达产生基因工程抗体。传统分子克隆方法采用(双)酶切-去磷酸化的方法制备载体,并通过胶回收方法或磁珠法进行载体纯化。但一直存在酶切不完全、去磷酸化不彻底的问题,这一问题会导致载体自连产生空载体从而影响高通量重组成功率。为了解决这一问题,可引入ccdB等自杀基因,使含自连空载体的宿主菌无法存活,从而提供重组阳性率。
自杀基因ccdB编码一个含101个氨基酸的毒素蛋白ccdB。细胞内和细胞外试验证明,ccdB能与解旋酶-DNA复合体结合并阻止DNA缺口的重新缝合,导致双链DNA损伤,阻止DNA和RNA聚合酶的通过,影响DNA复制和转录,从而导致细胞死亡。由于ccdB的这种强毒性效应,ccdB可以被构建到表达载体上然后再转化到大肠杆菌感受态细胞中。ccdB的表达产物能抑制普通大肠杆菌生长,所以只有那些成功克隆进外源基因的大肠杆菌才能正常生长,而克隆时没有被切开或自身环化的载体因为仍然含有ccdB基因,所以其转化的大肠杆菌在转化后则不能生长。这样生长起来的克隆为含有外源基因的所需克隆。
在载体中引入ccdB等自杀基因是分子克隆技术的一大进步,与不含自杀基因的载体相比可显著降低自连空载体比例,可使重组成功率达到90%以上,但仍无法彻底消除空载体。这在大规模、高通量的载体构建中仍然会产生少部分的假阳性,给下游的表达带来不确定性,所以天然ccdB基因的引物仍无法满足高通量重组抗体构建的需求。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
本发明第一方面提供一种改进的ccdB蛋白编码基因,所述改进的ccdB蛋白编码基因具有SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.7任一所示的核苷酸序列。
在本发明的中,所述改进的ccdB蛋白编码基因是通过对ccdB蛋白进行密码子优化得到的。密码子在生物体遗传信息的mRNA到蛋白质的传递过程中起着关键作用,编码20种不同氨基酸的密码子共61种,其中只有Met和Trp两种氨基酸由一种密码子编码,其他18种氨基酸均由2种或2种以上的密码子编码,称为同义密码子(synonymous codon)。在蛋白质的合成过程中,同义密码子的使用概率并不相同。某一物种或某一基因通常倾向于使用一种或几种特定的同义密码子,这些密码子被称为最优密码子(Optimal Codon),此现象被称为密码子偏爱性(Codon Usage bias)。
在本发明中,根据大肠杆菌密码子偏好性,从密码子适应指数(CAI)、稀有密码子和GC含量三个方面对ccdB基因进行密码子优化,得到了具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的改进的ccdB蛋白编码基因。
密码子适应指数(CAI)是指编码区同义密码子与最佳密码子使用频率的相符程度,取值在0~1之间。CAI可以用来评估外源基因在宿主内的表达水平,CAI越高,则外源基因在宿主内的表达水平越高2。绝大多数生物体在合成蛋白质时使用密码子具有一定的偏好性,被最频繁利用的称为佳密码子,那些不被经常利用的称为稀有密码子。基因序列中GC含量会对DNA的稳定性、mRNA的二级结构等造成影响,间接影响基因的表达调控。当基因序列中稀有密码子和GC含量越高,其蛋白表达的效率越低。所以,通过优化稀有密码子和GC含量可有效提高基因在宿主细胞内的表达效率。
进一步地,发明人意外地发现,当P28的密码子为CCT或CCA、W100的密码子为GGT或GGA时ccdB基因的表达量最高,自杀效果最好,由此获得了具有SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的改进的ccdB蛋白编码基因。
本发明第二方面提供与本发明第一方面所述的改进的ccdB蛋白编码基因相关的生物材料,为下述B1)至B7)中的任一种:
B1)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的表达盒;
B2)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组载体;
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体;
B4)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组微生物;
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物;
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物。
在本发明中,所述表达盒是指包括启动子、目标基因和终止子的DNA分子。
在本发明的一些实施方案中,所述载体选自包括pcDNA载体、pTT5载体、pCMV载体、pCEP载体、pBV载体和pSV2载体的组中的一种。在本发明的一些具体实施方案中,所述载体为pBV载体。
在本发明的一些实施例中,所述重组微生物为细菌。进一步地,所述细菌为大肠杆菌,更进一步地,所述大肠杆菌选自包括DH5α、Top10和JM109的组中的一种。在本发明的一些优选实施方案中,所述大肠杆菌为DH5α。
本发明第三方面提供本发明第一方面所述的改进的ccdB蛋白编码基因或本发明第二方面所述生物材料在制备目标蛋白中的应用。
本发明第四方面提供一种制备目标蛋白的方法,包括:
S1,获得含有本发明第一方面所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组载体,在所述改进的ccdB蛋白编码基因两端分别设置第一酶切位点和第二酶切位点;
S2,将所述目标蛋白的编码基因两端设置相同的所述第一酶切位点和第二酶切位点;
S3,利用所述第一酶切位点和第二酶切位点相应的内切酶分别对所述重组载体和所述目标蛋白的编码基因进行双酶切,并将所述目标蛋白的编码基因连接到所述重组载体上,成功连接的为阳性质粒;
S4,将连接产物转化至宿主细胞内,利用平板法筛选含有所述阳性质粒的重组细胞并进行表达。
利用该方法,成功连接有所述目标蛋白的编码基因的重组载体中,自杀基因即改进的ccdB蛋白编码基因被所述目标蛋白的编码基因替换,从而使得相应的宿主细胞能够在平板上生长。相反,没有连接上所述目标蛋白的编码基因的重组载体,转化至宿主细胞后,自杀基因即改进的ccdB蛋白编码基因仍能表达,使得宿主无法生长。如此,可以提高阳性克隆率,提高获得阳性重组宿主的效率。
在本发明的一些实施方案中,步骤S1获得重组载体的具体步骤如下:
S11,获得包含所述第一酶切位点和所述第二酶切位点的空载体;
S12,利用所述第一酶切位点和第二酶切位点相应的内切酶对所述空载体进行线性化,得到线性化载体;
S13,利用T4 DNA连接酶将所述改进的ccdB蛋白编码基因与所述线性化载体连接,得到所述的重组载体。
在本发明的一些实施方案中,所述载体选自包括pcDNA载体、pTT5载体、pCMV载体、pCEP载体、pBV载体和pSV2载体的组中的一种。在本发明的一些具体实施方案中,所述载体为pBV载体。进一步地,所述第一酶切位点为Hind III酶切位点,所述第二酶切位点为Kpn I酶切位点。
本领域技术人员可以使用任意方法得到重组载体。其核心思想是:没有目标蛋白编码基因的重组载体,相应的宿主细胞都受限于改进的ccdB蛋白编码基因(自杀基因)的表达而不能存活和生长。而含有目标蛋白编码基因的载体,相应的宿主细胞都不能表达改进的ccdB蛋白编码基因,从而能够存活并生长。只要不违背该思想,本领域技术人员做出的任何改进的技术方案都应落入本发明的保护范围。
在本发明中,对目标蛋白的种类和类型没有任何限定,只要能够在宿主细胞中表达即可适用本发明的方法。
在本发明的一些实施方案中,所述目标蛋白为单克隆抗体相关蛋白。
进一步地,所述单克隆抗体相关蛋白选自包括单克隆抗体重链区全长或部分、单克隆抗体轻链区全长或部分、单链抗体、单域抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv片段和Fd片段的组中的一种。在本发明的一些具体实施方案中,所述单克隆抗体相关蛋白为重链可变区全长或轻链可变区全长。
本发明的有益效果
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明改进的ccdB蛋白编码基因在包括大肠杆菌在内的细菌中表达效率得到出乎意料地提高。
(2)利用本发明改进的ccdB蛋白编码基因制备重组载体,当未成功连接目标蛋白编码基因时,空载体由于含有ccdB基因并且高效表达使得宿主菌无法在平板培养基上生长,如此在平板培养基上生长起来的所有菌落均为正确连接目标蛋白编码基因的转化子,连接效率接近100%。
(3)利用本发明所述的改进的ccdB蛋白编码基因或其相关生物材料制备单克隆抗体相关蛋白,能够大大提升转化阳性克隆率,适用于高通量单克隆抗体的开发和生产,具有非常好的应用价值。
附图说明
图1示出了优化前后序列的CAI分布情况。A:Seq1;B:Seq2;C:Seq3;D:Seq4;E:Seq5;F:Seq6;G:Seq7。
图2示出了优化前后序列的GC含量分布情况。A:Seq1;B:Seq2;C:Seq3;D:Seq4;E:Seq5;F:Seq6;G:Seq7。
图3示出了优化前后序列的稀有密码子分布情况。
图4示出了优化前后序列构建的载体转化细胞后平板生长情况。A:阳性质粒;B:原始载体1;C:优化载体2;D:优化载体3;E:优化载体4;F:优化载体5;G:优化载体6;H:优化载体7。
图5示出了本发明实施例中抗体重链的PCR扩增结果。
图6示出了本发明实施例中抗体轻链的PCR扩增结果。
图7示出了原始载体构建的重链和轻链质粒双酶切电泳图。其中,*号表示假阳性质粒;1~3泳道是图5中泳道1样品与原始载体构建的质粒,4~6泳道是图6中泳道1样品与原始载体构建的质粒;7~9泳道是图5中泳道2样品与原始载体构建的质粒,10~12泳道是图6中泳道2样品与原始载体构建的质粒;13~15泳道是图5中泳道3样品与原始载体构建的质粒,16~18泳道是图6中泳道3样品与原始载体构建的质粒;19~21泳道是图5中泳道4样品与原始载体构建的质粒,22~24泳道是图6中泳道4样品与原始载体构建的质粒。
图8示出了优化载体2构建的重链和轻链质粒双酶切电泳图。其中,*号表示假阳性质粒;1~3泳道是图5中泳道1样品与优化载体2构建的质粒,4~6泳道是图6中泳道1样品与优化载体2构建的质粒;7~9泳道是图5中泳道2样品与优化载体2构建的质粒,10~12泳道是图6中泳道2样品与优化载体2构建的质粒;13~15泳道是图5中泳道3样品与优化载体2构建的质粒,16~18泳道是图6中泳道3样品与优化载体2构建的质粒;19~21泳道是图5中泳道4样品与优化载体2构建的质粒,22~24泳道是图6中泳道4样品与优化载体2构建的质粒。
图9示出了优化载体3构建的重链和轻链质粒双酶切电泳图。其中,*号表示假阳性质粒;1~3泳道是图5中泳道1样品与优化载体3构建的质粒,4~6泳道是图6中泳道1样品与优化载体3构建的质粒;7~9泳道是图5中泳道2样品与优化载体3构建的质粒,10~12泳道是图6中泳道2样品与优化载体3构建的质粒;13~15泳道是图5中泳道3样品与优化载体3构建的质粒,16~18泳道是图6中泳道3样品与优化载体3构建的质粒;19~21泳道是图5中泳道4样品与优化载体3构建的质粒,22~24泳道是图6中泳道4样品与优化载体3构建的质粒。
图10示出了优化载体4构建的重链和轻链质粒双酶切电泳图。其中,*号表示假阳性质粒;1~3泳道是图5中泳道1样品与优化载体4构建的质粒,4~6泳道是图6中泳道1样品与优化载体4构建的质粒;7~9泳道是图5中泳道2样品与优化载体4构建的质粒,10~12泳道是图6中泳道2样品与优化载体4构建的质粒;13~15泳道是图5中泳道3样品与优化载体4构建的质粒,16~18泳道是图6中泳道3样品与优化载体4构建的质粒;19~21泳道是图5中泳道4样品与优化载体4构建的质粒,22~24泳道是图6中泳道4样品与优化载体4构建的质粒。
图11示出了优化载体5构建的重链和轻链质粒双酶切电泳图。其中,*号表示假阳性质粒;1~3泳道是图5中泳道1样品与优化载体5构建的质粒,4~6泳道是图6中泳道1样品与优化载体5构建的质粒;7~9泳道是图5中泳道2样品与优化载体5构建的质粒,10~12泳道是图6中泳道2样品与优化载体5构建的质粒;13~15泳道是图5中泳道3样品与优化载体5构建的质粒,16~18泳道是图6中泳道3样品与优化载体5构建的质粒;19~21泳道是图5中泳道4样品与优化载体5构建的质粒,22~24泳道是图6中泳道4样品与优化载体5构建的质粒。
图12示出了优化载体6构建的重链和轻链质粒双酶切电泳图。其中,*号表示假阳性质粒;1~3泳道是图5中泳道1样品与优化载体6构建的质粒,4~6泳道是图6中泳道1样品与优化载体6构建的质粒;7~9泳道是图5中泳道2样品与优化载体6构建的质粒,10~12泳道是图6中泳道2样品与优化载体6构建的质粒;13~15泳道是图5中泳道3样品与优化载体6构建的质粒,16~18泳道是图6中泳道3样品与优化载体6构建的质粒;19~21泳道是图5中泳道4样品与优化载体6构建的质粒,22~24泳道是图6中泳道4样品与优化载体6构建的质粒。
图13示出了优化载体7构建的重链和轻链质粒双酶切电泳图。其中,*号表示假阳性质粒;1~3泳道是图5中泳道1样品与优化载体7构建的质粒,4~6泳道是图6中泳道1样品与优化载体7构建的质粒;7~9泳道是图5中泳道2样品与优化载体7构建的质粒,10~12泳道是图6中泳道2样品与优化载体7构建的质粒;13~15泳道是图5中泳道3样品与优化载体7构建的质粒,16~18泳道是图6中泳道3样品与优化载体7构建的质粒;19~21泳道是图5中泳道4样品与优化载体7构建的质粒,22~24泳道是图6中泳道4样品与优化载体7构建的质粒。
图14示出了原始载体1和优化载体7的转化S-RBD平板。
图15示出了原始载体1和优化载体7构建的S-RBD质粒双酶切电泳图。*号表示假阳性质粒。其中1~4泳道原始载体1构建的质粒,5~8泳道是优化载体7构建的质粒。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例,否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量,且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下,本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考,且其等价的同族专利也引入作为参考,特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致,则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值,因此除非另有说明,否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值,条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如,如果记载组分、物理或其它性质是100至1000,意味着明确列举了所有的单个数值,例如100,101,102等,以及所有的子范围,例如100到166,155到170,198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1,1.5等)的范围,则适当地将1个单位看作0.0001,0.001,0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围,通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例,并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
术语“包含”,“包括”,“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在,且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问,除非明确说明,否则本申请中所有使用术语“包含”,“包括”,或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反,出来对操作性能所必要的那些,术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明,否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白,下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术,因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白,这里所公开的特定实施例可以做很多修改,仍然能得到相同的或者类似的结果,而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义,所有在此使用的技术和科学的术语,和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同,在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林,2017)一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备,如无特殊说明,均为实验室常规仪器设备;下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 ccdB编码序列优化
1.利用CAI和GC含量利用优化
(1)ccdB原始序列Seq1(X00594.1)的核苷酸序列序列如下(SEQ ID NO.1):
ATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAA
按要求的格式提交到密码子优化数据库(http://111.203.21.178/codon/ newjob.html)中。
(2)数据库自动优化过的序列进一步对个别密码子进行调整,调整后的序列Seq2~Seq7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.7所示。
Seq2(SEQ ID NO.2):
ATGCAATTTAAAGTTTATACTTACAAACGTGAATCTCGTTACCGTCTGTTCGTAGATGTGCAGAGCGACATTATCGATACTCCGGGTCGTCGTATGGTGATCCCGCTGGCATCCGCTCGTCTGCTGTCTGATAAAGTTTCTCGCGAACTGTATCCGGTAGTTCACATCGGTGACGAATCTTGGCGTATGATGACTACCGATATGGCCTCTGTTCCGGTAAGCGTTATTGGTGAAGAGGTAGCTGACCTGTCTCACCGTGAAAACGACATCAAAAACGCTATTAACCTGATGTTCTGGGGTATCTAA
Seq3(SEQ ID NO.3):
ATGCAGTTCAAAGTATACACCTACAAACGTGAATCTCGTTACCGTCTGTTCGTTGATGTGCAATCCGATATTATTGATACTCCGGGTCGCCGTATGGTTATTCCACTGGCCTCTGCTCGTCTGCTGTCTGACAAAGTATCTCGTGAACTGTACCCGGTTGTGCATATCGGCGACGAAAGCTGGCGTATGATGACTACCGACATGGCTAGCGTTCCGGTTTCCGTAATCGGTGAGGAAGTTGCGGATCTGTCCCACCGCGAAAACGATATCAAAAACGCAATCAACCTGATGTTCTGGGGCATCTAA
Seq4(SEQ ID NO.4):
ATGCAATTTAAAGTTTATACTTACAAACGTGAATCTCGTTACCGTCTGTTCGTAGATGTGCAGAGCGACATTATCGATACTCCTGGTCGTCGTATGGTGATCCCGCTGGCATCCGCTCGTCTGCTGTCTGATAAAGTTTCTCGCGAACTGTATCCGGTAGTTCACATCGGTGACGAATCTTGGCGTATGATGACTACCGATATGGCCTCTGTTCCGGTAAGCGTTATTGGTGAAGAGGTAGCTGACCTGTCTCACCGTGAAAACGACATCAAAAACGCTATTAACCTGATGTTCTGGGGTATCTAA
Seq5(SEQ ID NO.5):
ATGCAATTTAAAGTTTATACTTACAAACGTGAATCTCGTTACCGTCTGTTCGTAGATGTGCAGAGCGACATTATCGATACTCCAGGTCGTCGTATGGTGATCCCGCTGGCATCCGCTCGTCTGCTGTCTGATAAAGTTTCTCGCGAACTGTATCCGGTAGTTCACATCGGTGACGAATCTTGGCGTATGATGACTACCGATATGGCCTCTGTTCCGGTAAGCGTTATTGGTGAAGAGGTAGCTGACCTGTCTCACCGTGAAAACGACATCAAAAACGCTATTAACCTGATGTTCTGGGGAATCTAA
Seq6(SEQ ID NO.6):
ATGCAATTTAAAGTTTATACTTACAAACGTGAATCTCGTTACCGTCTGTTCGTAGATGTGCAGAGCGACATTATCGATACTCCTGGTCGTCGTATGGTGATCCCGCTGGCATCCGCTCGTCTGCTGTCTGATAAAGTTTCTCGCGAACTGTATCCGGTAGTTCACATCGGTGACGAATCTTGGCGTATGATGACTACCGATATGGCCTCTGTTCCGGTAAGCGTTATTGGTGAAGAGGTAGCTGACCTGTCTCACCGTGAAAACGACATCAAAAACGCTATTAACCTGATGTTCTGGGGAATCTAA
Seq7(SEQ ID NO.7):
ATGCAATTTAAAGTTTATACTTACAAACGTGAATCTCGTTACCGTCTGTTCGTAGATGTGCAGAGCGACATTATCGATACTCCAGGTCGTCGTATGGTGATCCCGCTGGCATCCGCTCGTCTGCTGTCTGATAAAGTTTCTCGCGAACTGTATCCGGTAGTTCACATCGGTGACGAATCTTGGCGTATGATGACTACCGATATGGCCTCTGTTCCGGTAAGCGTTATTGGTGAAGAGGTAGCTGACCTGTCTCACCGTGAAAACGACATCAAAAACGCTATTAACCTGATGTTCTGGGGTATCTAA
其中,Seq2和Seq3是为了进一步改善CAI、降低稀有密码子和GC含量进行调整后得到的。Seq4~Seq7还对个别氨基酸的密码子进行调整,其中,Seq4和Seq5对P28的密码子进行调整,Seq4中P28的密码子为CCT,Seq5中P28的密码子为CCA;Seq6和Seq7对W100的密码子进行调整,Seq6中W100的密码子为GGA,Seq7中W100的密码子为GGT。
(3)利用https://www.novoprolabs.com/tools/codon-optimization在线工具对调整前后的序列进行评估,CAI和GC含量评估结果如表1和图1、图2所示。
表1优化前后序列CAI和GC含量
结果显示:
经过优化后的序列Seq2和Seq3,CAI由原来的0.5提高到0.85,提高了70%。Seq4~Seq7的CAI也在0.8以上。进一步研究证明,当CAI>0.8时就可认为该序列可在宿主细胞内得到良好的表达。
经过优化后的序列Seq2和Seq3,GC含量也降低到50%以下,且分布更加均匀。Seq4~Seq7与Seq2和Seq3相比,GC含量进一步下降。GC含量均匀分布将有助于表达量的提高。
对于稀有密码子,通过图3可看出,经过优化后的Seq2和Seq3中使用频率低于30%的稀有密码子被去除,并进一步提高了使用频率高于50%的密码子的含量。Seq4~Seq7稀有密码子使用频率基本保持不变。
委托基因合成公司合成优化后的Seq2~Seq7进行后续实验。
实施例2优化后基因序列表达载体的构建
(1)将含有Seq1的原始载体1用合适的限制性内切酶进行线性化处理。原始载体1包括但不限于pcDNA,pTT5,pCMV,pCEP,pBV和pSV2载体,相应地,酶切位点为BamH I、EcoRI、Hind III、Kpn I和Not I等。在本实施例中选择pBV载体,相应地酶切位点为Hind III和Kpn I。
(2)将优化后的Seq2~Seq7与上述线性化后的原始载体1按照下表的比例进行连接;
组分 | 体积(μL) |
T4 DNA连接酶缓冲液(5×) | 2 |
T4 DNA连接酶 | 1 |
线性化载体(原始载体1) | 1 |
优化后的Seq2~Seq7 | 3 |
ddH<sub>2</sub>O | 3 |
(3)将连接后的产物转化至ccdB耐受大肠杆菌感受态细胞(如DB3.1)中,然后涂布到含氨苄抗性的LB平板上,37℃培养过夜;
(4)第二天挑取平板上的单克隆接种到含有LB液体培养基的试管中,37℃,200rpm震荡培养过夜;
(3)第三天按照DNA质粒提取试剂盒说明书提取含有优化后的Seq2~Seq7的质粒;质粒送测序公司测序,测序结果与优化后的Seq2~Seq7进行对比分析,确定所提取的质粒分别含有优化后的Seq2~Seq7。
将上述含有优化后的Seq2~Seq7的质粒分别编号为优化载体2~7。
实施例3优化载体2~7的自杀效果测试
分别取等量的原始载体1,优化载体2~7和阳性质粒(不含ccdB基因),如各10ng,转化至不耐受ccdB基因的DH5α感受态细胞中,然后涂布到含氨苄抗性的LB平板上,37℃培养过夜。
第二天取出平板观察菌落生长情况,阳性质粒、含天然ccdB基因序列的原始载体1、优化载体2~7的涂布平板菌落生长情况分别如图4和表2所示。
表2涂布平板菌落生长情况
相比于阳性质粒的平板菌落数(图4中A,即对照),原始载体1的平板上(图4中B)菌落显著减少,说明ccdB自杀基因发挥作用,但仍有10~20个菌落。然而,优化载体2~3的平板上(图4中C和D)只有少数(小于5个)菌落,优化载体4~7(图4中E、F、G和H)的平板上几乎无菌落生长。说明密码子优化发挥作用,ccdB基因表达水平提高,提高了自杀效果。并且,当P28的密码子为CCT(Seq4)或CCA(Seq5)、W100的密码子为GGA(Seq6)或GGT(Seq7)时,ccdB基因的表达量最高,自杀效果最好。
实施例4动物免疫
(1)将Ki-67免疫原与弗氏佐剂混合后免疫兔子;将p16免疫原与弗氏佐剂混合后免疫balb/c小鼠;
(2)第四次免疫结束后的7-10天,取血清检测滴度;
(3)第五次免疫结束后的7-30天取抗凝血、脾脏和胸腺;
(4)抗凝血通过密度梯度离心法分离淋巴细胞;
(5)按照文献(Methods Mol Biol.2015;1318:15-28.doi:10.1007/978-1-4939-2742-5_2;Int Rev Immunol.1990;6(2-3):117-26.doi:10.3109/08830189009056623)的方法从脾脏或胸腺中分离淋巴细胞。
实施例5重链和轻链优化表达载体的构建
(1)取实施例4获得的Ki-67和p16的淋巴细胞通过中国发明专利CN106350485A公开的方法筛选到阳性的B细胞克隆用中国发明专利CN110229777A公开的方法制备裂解液。
(2)取80μL B细胞裂解液转移到TurboCapture管,室温摇床孵育1h。
(3)孵育结束后将TurboCapture管中液体吸掉,用100μL TCW洗涤管子3次。
(4)按照下表配置RT体系:
(5)向TurboCapture管中加入80μL RT体系,放入PCR仪中,运行程序:
(6)RT程序结束后将TurboCapture管取出吸掉管中液体,用100μL TCW洗涤管子3次。
(7)利用Mouse Ig-Primer Set试剂盒(Sigma-Aldrich,货号69831),按照下表配制PCR体系:
组分 | 体积(μL) |
10×Buffer | 8 |
Mg2+ | 4 |
dNTPs(10mM) | 4 |
正向引物 | 4 |
反向引物 | 4 |
Taq DNA聚合酶 | 2 |
H<sub>2</sub>O | 54 |
总计 | 80 |
(8)向TurboCapture管中加入80μLPCR体系,放入PCR仪中,运行程序:
(9)PCR程序结束后取出PCR产物,进行磁珠法清洁。
i.实验前30min将磁珠从4度冰箱取出,平衡至室温。使用前上下颠倒6-8次以混匀磁珠;
ii.根据样品数量配制80%乙醇;
iii.80%的乙醇分别加入两块96孔圆底方孔板2.2中,每孔200μL,两块孔板分别编号为3和4;
iv.在另一块96孔圆底方孔板中加入去离子水,每孔120μL,编号为6;
v.取出另一块96孔圆底方孔板,每孔加入80μL的PCR产物,再加入50μL的磁珠,编号为1;
vi.四块板按照编号卡入卡槽;
vii.运行程序磁珠清洁程序,大约30min;
viii.待程序结束后,取下6号板,测定样品浓度并进行电泳检测。如图5和图6所示。
(10)将含有Seq1的原始载体1、优化载体2~7分别用相应的限制性内切酶进行线性化处理;
(11)上述经过纯化后的PCR产物分别与原始载体1、优化载体2~7进行同源重组连接,体系如下:
组分 | 体积(μL) |
Super Fusion Clone Mix(2×) | 5 |
线性化载体(原始载体1或优化载体2~7) | 1 |
纯化PCR产物 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 3 |
(12)连接后转化至大肠杆菌感受态细胞,涂布含氨苄抗性的LB平板。37℃培养过夜。
(13)第二天从每个平板上挑取3个单菌落接种到含氨苄抗性的LB液体培养基中,37℃,200rpm震荡培养过夜。
(14)进行磁珠法质粒提取。提取的质粒进行双酶切,如下:
组分 | 体积(μL) |
10×酶切缓冲液 | 1 |
Hind III | 0.5 |
Kpn I | 0.5 |
质粒 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 7 |
(15)37℃孵育30-60min;
(16)酶切过的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,如图7~13。
由图7中可以看出,利用原始载体1构建的表达载体,泳道3、11、13和22均出现假阳性。由图8中可以看出,利用优化载体2构建的表达载体,仅泳道3出现假阳性。而利用优化载体3~7制备的表达载体,均没有假阳性(图9-13)。
实施例6新冠刺突蛋白S-RBD优化表达质粒构建
本实施例提供新冠刺突蛋白S-RBD的优化表达,cDNA模板由上海交通大学馈赠,序列如下(SEQ ID No.8):
TCATTCACCGTGGAGAAGGGTATTTACCAAACTTCAAACTTCCGTGTTCAGCCAACTGAGTCCATCGTCAGATTCCCATCAATTACTAATCTTTGTCCATTCGGTGAGGTCTTCTCTGCTACTAGATTCGCTTCCGTTTACGCTTGGAATCGTAAGAGAATCTCTAACTGTGTCGCCGATTATTCCGTTCTCTACAACTCTGCATCTTTCAGTACGTTTAAGTGTTACGGCGTATCCCCAACCAAGCTAAACGACCTATGCTTTACCAACGTGTACGCTGATTCTTTCGTTATCAGAGGAGACGAAGTTAGACAAATTGCTCCAGGTCAAACAGGTAAGATAGCTGATTACAACTACAAACTACCAGATGATTTTACTGGTTGTGTTATTGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACTCTAAGGTTGGAGGTAACTACAACTACCTTTATAGATTATTCAGAAAGTCTAATCTCAAGCCTTTCGAGAGGGACATTTCTACTGAGATTTACCAAGCTGGATCTACCCCTTGTAACGGAGTCGAAGGTTTCAACTGCTACTTTCCACTCCAATCCTACGGTTTTCAACCTACCAACGGAGTTGGTTACCAACCTTATAGAGTGGTTGTTCTCTCTTTTGAGCTGCTTCATGCTCCAGCAACCGTCTGTGGCCCTAAAAAGTCTACCAACTTGGTTAAAAATAAGTGCGTTAACTTCAACTTTAACGGTCTAACTGGAACTGGTGTCCTAACCGAATCAAACAAAAAGTTCCTGCCATTCCAACAATTCGGCAGAGACATCGCAGATACTACAGATGCCGTCAGAGACCCACAGACTTTGGAAATTCTC
1.引物设计
正向引物(SEQ ID No.9):
5'-AAGCTTATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTTCATTCACCGTGGAG-3'
反向引物(SEQ ID No.10):
5'-GGTACCTCTCGCTTCAATGGTGATGGTGATGATGGAGAATTTCCAAAGTC-3'
正向引物5'端6个碱基AAGCTT为HindIII酶切位点,反向引物5'端6个碱基GGTACC为KpnI酶切位点;方框序列:起始密码子和终止密码子,单下划线序列:信号肽;双下划线序列:6×His标签序列;加粗序列:引物与模板结合序列。
2.PCR扩增
a)(1)PCR体系
组分 | 体积(μL) |
10×Buffer | 5 |
Mg<sup>2+</sup> | 2.5 |
dNTPs(10mM) | 2.5 |
正向引物 | 2.5 |
反向引物 | 2.5 |
Taq DNA聚合酶 | 1.2 |
H<sub>2</sub>O | 33.8 |
总计 | 50 |
b)(2)PCR程序
ix.PCR程序结束后取出PCR产物,利用实施例5相同的方法进行磁珠法清洁。
3.连接
a)将含有Seq1的原始载体1、优化载体7分别用限制性内切酶Hind III和Kpn I进行线性化处理。
b)上述经过纯化后的PCR产物分别与原始载体1、优化载体7进行同源重组连接,体系如下:
组分 | 体积(μL) |
Super Fusion Clone Mix(2×) | 5 |
线性化载体(原始载体1或优化载体2~7) | 1 |
纯化PCR产物 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 3 |
4.转化
a)连接后转化至大肠杆菌感受态细胞,涂布含氨苄抗性的LB平板,37℃培养过夜。如图14,结果表明,利用优化载体7构建的质粒,无克隆长出,表明自杀效果好。
5.培养
b)第二天从每个平板上挑取4个单菌落接种到含氨苄抗性的LB液体培养基中,37℃,200rpm震荡培养过夜。
6.双酶切
c)进行磁珠法质粒提取。提取的质粒进行双酶切,如下:
组分 | 体积(μL) |
10×酶切缓冲液 | 1 |
Hind III | 0.5 |
Kpn I | 0.5 |
质粒 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 7 |
d)37℃孵育30-60min;酶切过的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,如图15所示,可知原始载体1有部分假阳性,而优化载体7的质粒进行重组表达,均得到了阳性克隆,阳性克隆率非常高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种改进的ccdB蛋白编码基因,其特征在于,所述改进的ccdB蛋白编码基因具有SEQID NO.2~SEQ ID NO.7任一所示的核苷酸序列。
2.与权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因相关的生物材料,为下述B1)至B7)中的任一种:
B1)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的表达盒;
B2)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组载体;
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体;
B4)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组微生物;
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物;
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料,其特征在于,所述载体选自包括pcDNA载体、pTT5载体、pCMV载体、pCEP载体、pBV载体和pSV2载体的组中的一种。
4.根据权利要求2所述的生物材料,其特征在于,所述重组微生物为细菌。
5.根据权利要求4所述的生物材料,其特征在于,所述细菌为大肠杆菌,进一步地,所述大肠杆菌选自包括DH5α、Top10和JM109的组中的一种。
6.权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因或权利要求2所述的生物材料在制备目标蛋白中的应用。
7.一种制备目标蛋白的方法,其特征在于,包括:
S1,获得含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组载体,在所述ccdB蛋白编码基因两端分别设置第一酶切位点和第二酶切位点;
S2,将所述目标蛋白的编码基因两端设置相同的所述第一酶切位点和第二酶切位点;
S3,利用所述第一酶切位点和第二酶切位点相应的内切酶分别对所述重组载体和所述目标蛋白的编码基因进行双酶切,并将所述目标蛋白的编码基因连接到所述重组载体上,成功连接的为阳性质粒;
S4,将连接产物转化至宿主细胞内,利用平板法筛选含有所述阳性质粒的重组细胞并进行表达。
8.根据权利要求7所述的制备目标蛋白的方法,其特征在于,步骤S1获得重组载体的具体步骤如下:
S11,获得包含所述第一酶切位点和所述第二酶切位点的空载体;
S12,利用所述第一酶切位点和第二酶切位点相应的内切酶对所述空载体进行线性化,得到线性化载体;
S13,利用T4 DNA连接酶将所述改进的ccdB蛋白编码基因与所述线性化载体连接,得到所述的重组载体。
9.根据权利要求7或8所述的制备目标蛋白的方法,其特征在于,所述目标蛋白为单克隆抗体相关蛋白。
10.根据权利要求9所述的制备目标蛋白的方法,其特征在于,所述单克隆抗体相关蛋白选自包括单克隆抗体重链区全长或部分片段、单克隆抗体轻链区全长或部分片段、单链抗体、单域抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv片段和Fd片段的组中的一种。
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