CN115820469A - 布氏慢生乳杆菌菌株及其用途 - Google Patents
布氏慢生乳杆菌菌株及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115820469A CN115820469A CN202211184890.7A CN202211184890A CN115820469A CN 115820469 A CN115820469 A CN 115820469A CN 202211184890 A CN202211184890 A CN 202211184890A CN 115820469 A CN115820469 A CN 115820469A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactobacillus buchneri
- slow
- strain
- buchneri
- substances
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物领域，具体涉及发酵产多种花果香风味物质的布氏慢生乳杆菌菌株及其用途。针对现有白酒酿造过程中布氏慢生乳杆菌种类出现较少，对布氏慢生乳杆菌发酵所产风味物质尤其是香气物质的研究处于空白，本发明提供了一种布氏慢生乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)菌株及其用途。其能够同时产花果香醇类物质，包括反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1‑壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮。因此，该菌株能用于制备天然花果香型风味物质，用于酒醅微生物优化，强化白酒酿造过程中生香微生物丰度，有良好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及发酵产多种花果香风味物质的布氏慢生乳杆菌菌株及其用途。
背景技术
风味物质种类繁多，除少数成分，大多数为非营养性物质，在食品中含量甚微，但对其感官效果显著，根据化学结构(官能团)可分为酯类、醇类、醛类、酸类、酚类、酮类、烃类、呋喃类、吡嗪类、含硫与杂环化合物等挥发性物质；据其感官效果可分为果香型、青香型、辛香型、木香型、醛香型等，如酯类和醇醛类物质具有让人愉悦的水果香和花香风味，吡嗪类物质具有焙烤的香味，硫化物有胶水或橡胶臭味，丁酸等短链脂肪酸具有汗臭、酸臭味，苯酚类具有墨水或窖泥味，愈创木酚具有水果香味。这些风味物质的浓度、嗅闻阈值影响了对食品风味的感知。
布氏慢生乳杆菌属于革兰氏阳性厌氧菌，目前研究发现其在饲料发酵、食品发酵中具有重要作用，如Yang H等人(Yang H,Wang B,Zhang Q,et al.Improvement ofFermentation Quality in the Fermented Total Mixed Ration with OatSilage.2021.)研究了在发酵全混合日粮中添加燕麦青贮对发酵、化学成分和细菌群落的影响，在添加青贮后，发酵过程中细菌多样性增加，出现了如布氏慢生乳杆菌、Lentilactobacillus brevis、Companilactobacillus versmoldensis的异源发酵乳酸菌。Koichi Tanabe等(Koichi Tanabe，Masaki Monguchi，Ryoga Inoue,etal.Lentilactobacillus buchneri domination during the fermentation of Japanesetraditional fermented fish(funazushi).2022.)对日本传统的发酵鱼进行菌株分离鉴定，结果表明布氏慢生乳杆菌是其发酵的优势菌株。但现有对白酒酿造过程中酒曲、窖泥、酒醅微生物的研究中较少出现布氏慢生乳杆菌，且未有对布氏慢生乳杆菌发酵所产风味物质尤其是香气物质进行研究。
发明内容
针对现有白酒酿造过程中布氏慢生乳杆菌种类出现较少，对布氏慢生乳杆菌发酵所产风味物质尤其是香气物质的研究处于空白，本发明提供了一种布氏慢生乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)菌株及其用途。
本发明的布氏慢生乳杆菌，保藏编号为：CGMCC NO.25139。保藏时间为2022年06月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
其中，上述布氏慢生乳杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
其中，所述布氏慢生乳杆菌能同时产反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮。
其中，所述反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮含量分别为0.842、2.019、0.433、0.708、1.856、0.485、0.255mg/L。
其中，所述布氏慢生乳杆菌的生物学特征为：在MRS琼脂培养基上，菌落凸起，白色，呈圆形，边缘整齐。
其中，所述布氏慢生乳杆菌的生长条件为：生长温度为30℃-40℃，最适温度为37℃，pH值为5.0-7.0，生长周期为20-48h。
本发明还提供了上述布氏慢生乳杆菌在白酒酿造中的用途。
本发明还提供了布氏慢生乳杆菌在发酵产多种花果香风味物质方面的用途。
其中，上述用途中，花果香风味物质为花果香醇类物质，包括反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮。
有益效果：本发明所提供的布氏慢生乳杆菌是从泸州老窖酒醅样品中分离出的一株具有产多种花果香风味物质的乳酸菌，并命名为zqw40。该菌株培养时间短、原料简单易得、适应性强，能够同时产反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮，含量分别为0.842、2.019、0.433、0.708、1.856、0.485、0.255mg/L。因此，该菌株能用于制备天然花果香型风味物质，用于酒醅微生物优化，强化白酒酿造过程中生香微生物丰度，有良好的工业应用前景。
本发明的布氏慢生乳杆菌，保藏编号为：CGMCC NO.25139。保藏时间为2022年06月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。分类命名为：Lentilactobacillus buchneri。
附图说明
图1为本发明实施例1布氏慢生乳杆菌镜检图；
图2为本发明实施例1中菌株挥发性物质GC-MS检测谱图。
具体实施方式
本发明的布氏慢生乳杆菌，保藏编号为：CGMCC NO.25139。保藏时间为2022年06月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
其中，上述布氏慢生乳杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1布氏慢生乳杆菌的16S rDNA序列
TATTCATCTGTCAACCTTAGACGGCTGGTCCCCGAAGGTTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGCCTCCCGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTAGGCCGTTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGACAGCCGAAGCCGTCTTTTAAACCAAAACCAGGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTCTCAATGTTAAATCTTTCAAATGCAAGCACCTTAAAATCATTAACGGAGACGCGTTCGACTTGCATTATAGCAC。
其中，所述布氏慢生乳杆菌的生物学特征为：在MRS琼脂培养基上，菌落凸起，白色，呈圆形，边缘整齐。
其中，所述布氏慢生乳杆菌的生长条件为：生长温度为30℃-40℃，最适温度为37℃，pH值为5.0-7.0，生长周期为20-48h。
本发明的布氏慢生乳杆菌是从泸州老窖酒醅样品中分离出，能同时产反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮，含量分别为0.842、2.019、0.433、0.708、1.856、0.485、0.255mg/L。
本发明还提供了上述布氏慢生乳杆菌在白酒酿造中的用途。
本发明还提供了布氏慢生乳杆菌在发酵产多种花果香风味物质方面的用途。
其中，上述用途中，花果香风味物质为花果香醇类物质，包括反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮。
本发明的布氏慢生乳杆菌发酵产花果香醇类物质的具体方法为：将布氏慢生乳杆菌接种于发酵培养基中，37℃静置培养24h，pH值为6.0，即可；所述布氏慢生乳杆菌的接种量为2％(×107cfu/mL)。
更具体地，所述发酵培养基的组成为每升培养基中含有16g葡萄糖，10g胰蛋白胨，2.5g酵母粉，5g牛肉膏，3.85g牛脑，4.9g牛心，0.5g吐温80，1g柠檬酸铵，2.5g氯化钠，2.5g无水乙酸钠，0.05g硫酸镁，0.025g硫酸锰，1.25g磷酸氢二钠，1g磷酸氢二钾。
采用上述发酵工艺，布氏慢生乳杆菌zqw40能产多种花果香风味物质，包含反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮，含量分别为0.842、2.019、0.433、0.708、1.856、0.485、0.255mg/L。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中涉及的培养基配方：
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉4g/L，牛肉浸粉5g/L，吐温801g/L，柠檬酸三铵2g/L，醋酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，磷酸氢二钾1g/L，pH6.0，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基基础上添加15g/L的琼脂，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
发酵培养基：葡萄糖16g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉2.5g/L，牛肉膏5g/L，牛脑3.85g/L，牛心4.9g/L，吐温80 0.5g/L，柠檬酸铵1g/L，氯化钠2.5g/L，无水乙酸钠2.5g/L，硫酸镁0.05g/L，硫酸锰0.025g/L，磷酸氢二钠1.25g/L，磷酸氢二钾1g/L，pH 6.0，115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
实施例1：菌株的分离纯化
1)分离方法：取20g泸州老窖酒醅样品，放入装有180mL无菌蒸馏水的锥形瓶中，恒温摇床振荡10min将样品充分打散、混匀。取1mL样品悬液，采用倍比稀释法，稀释至10-2～10-7，从每个梯度的稀释液中吸取100μL，均匀涂布于MRS固体培养基平板上，平行制备两块平板，倒置，放于37℃静置培养36-48h，并及时观察。
2)划线纯化：将长出菌落的平板取出，挑取不同菌落形态的单菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。
3)菌种保藏：将纯化完成后的每种菌株的单菌落挑入5mLMRS液体培养基中，置于37℃静置培养20-24h，吸取1mL菌液至保菌管中，加入0.5mL60％的无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。
4)GC-MS检测：
采用顶空固相微萃取法：对菌液进行离心处理，取上清液，加入顶空瓶中，加入饱和NaCl溶液，将制备好的样品于60℃保温平衡5min后，用50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取头在60℃萃取40min，萃取结束后在GC进样口250℃解吸5min。化合物检索结果与NIST标准谱库进行匹配，相似度达到80％以上确认为目的化合物。
GC-MS检测色谱条件：
气相色谱条件：HP-INNOWAX色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：起始温度40℃，保持5min，以4℃/min升到100℃，再以6℃/min升至230℃，
保持10min，载气为高纯氦气(1.0mL/min)；进样口温度250℃，不分流。
质谱条件：电子电离源，电子能量70eV；电子倍增器电压350V；离子源温度230℃；传输线温度250℃；质量范围40-450m/z。
通过GC-MS检测结合感官评分，在分离得到的菌株中获得一株发酵液花果香较为浓郁的乳酸菌菌株，选择该菌株做进一步研究。
实施例2：菌株的鉴定
16S rDNA序列扩增：吸取1mL目标菌株培养菌液10000rpm离心5min，去上清，得菌泥，加入CTAB溶液及苯酚-氯仿—异戊醇(25：24：1)萃取核酸DNA，12500rpm离心5min取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，混匀后12000rpm离心5min取上清，乙醇溶液漂洗两次，12000rpm离心5min去上清，沉淀吹干，加入50μL无菌水重悬，即得菌株DNA模板。引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO:2)和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO:3)，进行PCR扩增。
测序获得16S rDNA片段的基因序列，通过NCBI的BLAST比对，确定菌株种属信息，鉴定其为布氏慢生乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)，并命名为布氏慢生乳杆菌zqw40。
实施例3：产花果香风味物质能力检测
将布氏慢生乳杆菌zqw40甘油保存管溶解后接种于MRS液体培养基中，并于37℃静置培养24h，活化三代后按2％(体积比)接种量接入50mL发酵培养基中进行培养24h。发酵结束后得到菌液，10000rpm离心5min后取上清。检测方法同实施例1中的GC-MS检测方法，以0.822mg/mL的2-辛醇为内标物，以原始培养基为空白对照，计算各挥发性物质的含量。
花果香风味物质的检测结果如表1所示，布氏慢生乳杆菌zqw40可产反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮，含量分别为0.842、2.019、0.433、0.708、1.856、0.485、0.255mg/L。
表1布氏慢生乳杆菌zqw40发酵液中花果香风味物质的检测结果
| 花果香风味物质 | 含量mg/L | 感官特征 |
| 反油酸乙酯 | 0.842 | 花香、果香以及油脂气息 |
| 正辛醇 | 2.019 | 强烈的油脂气味和柑橘气息 |
| 正己醇 | 0.433 | 嫩枝叶气息，微带酒香、果香和脂肪气息 |
| 1-壬醇 | 0.708 | 玫瑰和橙的愉快香气 |
| 苯乙醇 | 1.856 | 柔和、愉快而持久的玫瑰香气 |
| 甲基庚烯酮 | 0.485 | 水果香气和新鲜清香香气 |
| 香叶基丙酮 | 0.255 | 木兰香气 |
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
Claims (9)
1.布氏慢生乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)，其特征在于：保藏编号为：CGMCCNO.25139。
2.根据权利要求1所述的布氏慢生乳杆菌，其特征在于：其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的布氏慢生乳杆菌，其特征在于：其能同时产反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮。
4.根据权利要求3所述的布氏慢生乳杆菌，其特征在于：所述反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮含量分别为0.842、2.019、0.433、0.708、1.856、0.485、0.255mg/L。
5.根据权利要求1所述的布氏慢生乳杆菌，其特征在于：其生物学特征为：在MRS琼脂培养基上，菌落凸起，白色，呈圆形，边缘整齐。
6.根据权利要求1所述的布氏慢生乳杆菌，其特征在于：其生长条件为：生长温度为30℃-40℃，最适温度为37℃，pH值为5.0-7.0，生长周期为20-48h。
7.权利要求1-6任一项所述的布氏慢生乳杆菌在白酒酿造中的用途。
8.权利要求1-6任一项所述的布氏慢生乳杆菌在发酵产多种花果香风味物质方面的用途。
9.根据权利要求8所述用途，其特征在于：所述花果香风味物质为花果香醇类物质，包括反油酸乙酯、正辛醇、正己醇、1-壬醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、香叶基丙酮。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211184890.7A CN115820469A (zh) | 2022-09-27 | 2022-09-27 | 布氏慢生乳杆菌菌株及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211184890.7A CN115820469A (zh) | 2022-09-27 | 2022-09-27 | 布氏慢生乳杆菌菌株及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115820469A true CN115820469A (zh) | 2023-03-21 |
Family
ID=85524085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211184890.7A Pending CN115820469A (zh) | 2022-09-27 | 2022-09-27 | 布氏慢生乳杆菌菌株及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115820469A (zh) |
-
2022
- 2022-09-27 CN CN202211184890.7A patent/CN115820469A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102505002B (zh) | 一种用于烤烟快速增香的微生物菌株及烟叶发酵的应用 | |
| CN116138429B (zh) | 矮小哈萨克斯坦酵母xj-65及其在辣椒发酵中的应用 | |
| CN113388533B (zh) | 一株发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌及其筛选方法 | |
| CN109971689B (zh) | 一株戊糖片球菌zf618及其应用 | |
| JP4672776B2 (ja) | マンニトール生成能が優れた耐酸性ロイコノストックメセンテロイデス及びそれを利用したキムチの製造方法 | |
| CN111248409A (zh) | 一种低盐豆瓣酱发酵方法 | |
| CN111961601B (zh) | 固态发酵高产乙酸异戊酯的酵母及其应用 | |
| CN109749914B (zh) | 一种用于提高山西老陈醋γ-氨基丁酸含量的生物强化方法 | |
| CN112725204B (zh) | 一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株HSP11及其应用 | |
| CN113439830B (zh) | 一种复合发酵剂的制备方法及其在辣椒发酵增香中的应用 | |
| CN110669683A (zh) | 一种酿酒酵母菌及其在制备烟用香料中的应用 | |
| CN116804175B (zh) | 一株植物乳杆菌xz8-2及其在天麻发酵加工中的应用 | |
| CN114107100B (zh) | 一种食源性乳酸菌及其应用 | |
| CN115820469A (zh) | 布氏慢生乳杆菌菌株及其用途 | |
| CN112662574B (zh) | 一株酵母Papiliotrema laurentii菌株HSP22及其应用 | |
| CN113943668B (zh) | 一株植物乳杆菌及其应用 | |
| CN115747085B (zh) | 一株产多种吡嗪的酵母菌哈萨克斯坦酵母及其应用 | |
| CN116536223B (zh) | 一种梭菌菌种及其应用 | |
| CN115820432B (zh) | 一株产香云芝栓孔菌及其应用 | |
| CN114717151B (zh) | 金黄杆菌属新菌种及其用途 | |
| CN116970522A (zh) | 一株产棕榈酸乙酯的食丙二醇慢生乳杆菌及其应用 | |
| CN115960732B (zh) | 一株盔状毕赤酵母及其微生物菌剂和应用 | |
| CN116751713A (zh) | 一株能产丁位十二内酯的戊糖片球菌及其应用 | |
| CN116218743A (zh) | 一株可同时产2-壬醇及油酸乙酯的食丙二醇慢生乳杆菌及其应用 | |
| CN116716199A (zh) | 一株戊糖片球菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |