CN115818653B - 一种介孔二氧化硅微球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种介孔二氧化硅微球及其制备方法和应用，具体步骤如下：由硅酸盐制备纳米硅溶胶，经与脲醛共聚成球、高温烧结，再进一步通过酸碱溶液处理，制备出一种微孔少、孔径分布窄、强度高的介孔二氧化硅微球，在上述二氧化硅微球基础上，采用气固合成反应进一步键合一系列硅烷固定相，得到的色谱固定相具备以下特点：微孔少，强度高，耐碱洗，收率高等特点。

Description

一种介孔二氧化硅微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及色谱填料技术领域，尤其涉及一种介孔二氧化硅微球及其制备方法和应用。

背景技术

色谱/层析技术是现代工业中最重要、最有效的物质分离技术之一，其条件温和、适用范围广，可以对复杂组分进行分离纯化。其原理是当流动相推动混合样品中的各组分在色谱填料填充的色谱柱中迁移时，各组分在两相中进行连续反复多次分配，出现差速移动，形成时间差异，达到从色谱柱中先后洗脱、分离的目的。高纯度、高活性的生物制品制造基本都是依赖色谱层析技术和色谱层析填料，生物医药行业的迅速发展带动色谱填料需求的大量增长。

以介孔二氧化硅为基质的色谱固定相，在同时具有稳定的物化性质、极强的吸附能力、良好的生物相容性、易分离和多孔结构的硅胶特性外还由于其表面附带不同的功能化基团、使其广泛用于生物医药的色谱纯化制备。近年来随着多肽类化合物、寡核酸类化合物以及多糖类物质在医药、食品添加剂和化妆品添加剂等方面应用的快速发展和纯度要求的提高，亟需满足这类物质纯化分离的硅胶基质的反相色谱填料。基于这类物质的特点和分离纯化的工艺需求，所使用的色谱填料需要具备以下特点：粒径均匀，耐磨耐压，耐腐蚀（耐碱、耐高盐），耐污染，较好的分离效果和较高的上载量。根据多年的研究经验，我们发现上述这些性能与硅胶骨架中的微孔数量有着紧密的关联；并且由于制备色谱的载样量与孔隙率及比表面关系紧密，在保障耐压、耐腐蚀、耐污染和分离效果的同时，还要尽可能提高孔隙率和比表面。

中国专利申请20101056728.6于2010年12月公开了一种功能化均粒多孔二氧化硅微球制备方法及其应用，包括预先制备多孔聚合物微球，加入二氧化硅前驱体，加热去除聚合物，表面修饰等工艺。此类模板法制备二氧化硅，虽然可以得到均匀的粒径，但具有成本高、工艺路线过长、微孔多、收缩比例大等问题，不适合大规模生产。

美国专利US4011096和日本专利60-071515公开了一种二氧化硅微球的制备方法，将水玻璃或硅溶胶分散乳化到含有表面活性剂的有机分散介质中，控制分散体系的pH和温度，加热蒸馏脱水使颗粒固化，获得0.5-100um的二氧化硅微球，此方法获得的二氧化硅微球粒径分散很宽、强度差、微孔过多且易粘连，也不适合多肽色谱纯化。

美国专利US4010242披露的共聚法虽然可以得到粒径均匀，耐高压，耐污染的介孔二氧化硅，但孔隙率和比表面很低，适合于作为分析色谱固定相的基质，但不能满足制备固定相高孔隙率和高有效比表面的要求。

因此，探索一种新的介孔二氧化硅微球基质的制备方法，以便满足粒径均匀、微孔少（孔径均匀），同时又具备高孔隙率和高有效比表面的特点，从而具备高柱效，低柱压；耐磨耐压、耐腐蚀和污染、以及高载量等制备色谱需要的优良性能，是多肽色谱纯化亟待解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种粒径和孔径分布均匀、微孔少、耐碱性好、强度高和高载量的介孔二氧化硅微球的制备方法和基于二氧化硅微球的色谱固定相的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供的一种本发明提供的一种介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：由硅酸盐水溶液制备纳米硅溶胶；

S2：将S1制备的纳米硅溶胶酸化并在加热条件下与脲醛溶液混合，得到白色复合微球沉淀

S3：将S2得到的白色复合微球沉淀在600°C以上条件下焙烧，得到介孔二氧化硅微球；

S4：对S3焙烧得到的介孔二氧化硅微球进行浮选，并进一步在酸性和/或碱性溶液中处理和表面惰性处理，得到最终的介孔二氧化硅微球。

具体地，所述S1的具体步骤如下：首先，硅酸盐水溶液由正硅酸酯或二氧化硅与无机氢氧化物在水中加热制备（可以适当加入少量的醇，以利于正硅酸酯与水的混合；一般而言，醇含量不需要超过50%，醇含量的比例会对后续硅溶胶的粒径和比表面产生影响）；正硅酸酯包括但不限于正硅酸甲酯，正硅酸乙酯等；正硅酸酯中金属总含量不超过50ppm；二氧化硅包括晶态或非晶态或混合态的固体二氧化硅或水合二氧化硅，二氧化硅中钾钠之外其它金属含量不超过50ppm；无机氢氧化物包括但不限于氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化锂等，一般应选择一价金属盐。所述硅酸盐中SiO₂与无机氢氧化物的摩尔比为1.5:1-4.5:1，优选地，硅酸盐中SiO₂与无机氢氧化物的摩尔比为2.5:1-3.5:1。

具体地，所述S1的具体步骤中，纳米硅溶胶制备方法是将硅酸盐水溶液通过离子交换柱或其它方式进行离子交换除掉金属离子，pH值控制在4.5以下，得到纳米胶体溶液；随后用有机碱将pH调整到5-11，在20-120℃下搅拌或放置2-150h；优选地，在pH为6-10，30-100℃下搅拌或放置5-100h；浓缩至二氧化硅含量为6-20%，平均粒径为5-30nm，比表面为100-600 m²/g；优选的，平均粒径为6-20nm，比表面积为200-400 m²/g。调整pH的有机碱包括但不限于铵盐，三乙胺，二乙胺，乙二胺，氨水，以及其它一级、二级或三级的短链胺或季铵盐。短链胺或季铵盐是一般指不超过4碳原子的烃基或羟烃基。硅溶胶的制备工艺对于最终制备得到的二氧化硅微球减少微孔，得到合适的孔隙率和有效比表面有着关键的作用。

具体地，所述S2是将S1所得的硅溶胶混合在脲醛溶液中。脲醛溶液可由尿素与甲醛、乙二醛，丙二醛，丁二醛中的一种或多种在酸性条件下制成；酸为有机酸或无机酸，优选地，酸为乙酸、柠檬酸或硝酸；反应温度为0-95℃，优选地，反应温度为30-70℃。

一种变通方式：将硅溶胶灌入水溶液可以浸润的均匀的高聚物微球的孔中，然后将水分挥发，也可以得到高聚物或二氧化硅复合微球。

具体地，所述S3中得到的复合材料微球在600-900℃高温下焙烧硬化，时间5-20h。

具体地，所述S4中包含对焙烧后/或酸碱处理后的介孔二氧化硅需进一步进行浮选，相邻浮选瓶直径比为1.1-1.8，优选为1.3-1.5；浮选是通过二氧化硅微球粒径的差异引起二氧化硅在水中沉降速度的差异实现不同粒径分离的。通过浮选可获得粒径范围更窄的二氧化硅微球。

具体地，所述S4中对焙烧后得到的介孔二氧化硅微球，用酸和/或碱水溶液分别或顺序在20-100℃下处理2-100h，可单独用酸、单独用碱、酸碱结合的方式进行处理，优选的，顺序是先碱后酸进行处理。碱的浓度在1-15%重量范围内，优选的，碱的浓度为2-10%，酸的浓度在0.1-20%的重量范围内，优选的，酸的浓度为1-10%。其中碱可以是氨水、铵盐、短链胺或季铵盐化合物；酸可以是无机酸或有机酸，优选为盐酸、硝酸或氢氟酸。

具体地，所述S4还包括对酸碱处理后的介孔二氧化硅微球进一步进行表面惰化处理，将短链硅烷和二氧化硅微球在惰性溶剂中回流2-48h；或者将上述二氧化硅微球用包含短链硅烷，水和有机溶剂的混合液进行涂敷并加热。短链硅烷包括但不限于甲基三甲氧基、甲基三乙氧基、乙基三甲氧基、四乙氧基、四甲氧基、乙撑六甲氧基、乙撑六乙氧基或上述各类短链硅烷的混合物，以及上述短链硅烷或任意混合后与水及有机溶剂按照一定比例混合的溶液，短链硅烷与水的质量比在100：1-10：1；短链硅烷与有机溶剂的比例在1：100-10：1。所用的溶剂包括但不限于甲苯、乙醇、二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃、正癸烷。

经过上述步骤制备出的二氧化硅微球孔径分布窄、微孔少、强度高，平均粒径为5-20um，比表面积为200-500m²/g，平均孔径为80Å-300Å，平均孔径±25%占比为≥70%，70Å以下的微孔占比小于10%，孔隙率为0.6-1.2 ml/g；优选的，孔隙率为0.7-0.9 ml/g，耐压≥50MPa。

本发明基于上述二氧化硅微球的色谱固定相的制备方法，采用在惰性溶剂中回流或气相合成反应对二氧化硅表面进行功能化修饰：

具体地，将介孔二氧化硅微球和硅烷化试剂加入到惰性有机溶剂中回流2-24h；所述硅烷化试剂的通用分子式为n-SiX₃或n-Si（CH₃）₂-X；n-包括但不限于十八烷基、辛基、丁基、氨丙基、环氧丙基、巯基、苯基、甲基，氰基等，X包括但不限于氯、烷氧基、二甲氨基、二乙氨基等能够水解成为OH的基团；惰性溶剂包括但不限于甲苯、二甲苯、四氢呋喃、辛烷等。

具体地，在一个除氧、负压的容器中加入介孔二氧化硅微球和硅烷化试剂，然后加热使硅烷化试剂气化，加热2-24h后，冷却到室温并用溶剂清洗反应后的二氧化硅微球，得到所需的色谱固定相。所述硅烷化试剂的通用分子式为：n-SiX₃或n-Si（CH₃）₂-X；n-包括但不限于十八烷基、辛基、丁基、氨丙基、环氧丙基、巯基、苯基、甲基，氰基等，X包括但不限于氯、烷氧基、二甲氨基、二乙氨基等能够水解成为OH的基团。

本发明还提供一种纯化多肽的制备色谱方法，包括如下步骤：

（1）用上述方法制备的色谱固定相填充得到一个色谱柱；

（2）将待纯化的多肽样品加入到色谱柱上端；

（3）用水或有机溶剂将样品逐步洗脱分离；

（4）收集达到纯度要求的目标物馏分。

所述多肽样品包括但不限于胰岛素，索玛鲁肽，利拉鲁肽等粗品；有机溶剂包括但不限于乙腈，甲醇，乙醇，丙酮等与水可以互溶的溶剂；色谱固定相包括但不限于十八烷基或辛基键合的固定相。

本发明提供的一种介孔二氧化硅微球及其制备方法和应用，具有如下有益效果。

1．本发明在大量实验数据分析的基础上，创造性综合运用了多项独立的材料制备和结构改造技术，从而得到一种适合多肽、寡合酸等极性强分子量在1000-10000D的目标物色谱纯化固定相的完整的新工艺方法。

2．本发明起始于高纯硅酸盐制备的硅溶胶的完整工艺，解决了美国专利US4010242披露的共聚法所得到的二氧化硅微球孔隙率低，有效比表面低的问题；同时解决了模板法（中国专利20101056728.6）所得二氧化硅微球孔径分布宽，强度和耐腐蚀性差的问题。本发明中的微球成球步骤仍然采用共聚法，从而得到较均匀的粒径，但其它步骤采用了不同的方法；并且高温焙烧（600°C以上）从另一方面保证了二氧化硅微球的强度和减少微孔，是本发明整个方法的另一关键。本发明所披露的焙烧后二氧化硅微球的进一步处理的方法，进一步封闭和减少了微孔，改善了耐碱的性能，降低了拖尾，并且提高了载样量，是本发明整体中不可分割和至关重要另外一部分。本发明中介孔二氧化硅微球微球制备的四个主要步骤组成一个完整的方法，是本发明能够给出适合多肽和寡合酸色谱纯化的固定相的基础。通过上述工艺制备得到微米级、粒径孔径可控、微孔少、耐碱耐盐性好和强度高、高载量的多孔球形二氧化硅微球，可用于制备各类色谱固定相，用于生物分子的纯化、高效液相色谱的分析检测等，特别适用于多肽、寡核酸和寡糖大分子的纯化。

3．本发明采用的气相反应法对二氧化硅表面进行功能化修饰，有效避免了修饰过程中大量有机溶剂的使用；绿色环保，且可获得较高的键合相密度，可制备正相和反相用于高纯、高强度的色谱纯化和分析的色谱固定相。

附图说明

图1为本发明制备得到的介孔二氧化硅微球的显微镜照片；

图2为本发明制备得到的介孔二氧化硅微球的粒径分布图；

图3-1为 S4处理前介孔二氧化硅微球的孔径分布图；

图3-2为 S4处理后介孔二氧化硅微球的孔径分布图；

图4为介孔二氧化硅微球在压力测试仪测试后的显微镜照片，通过4300N压强下的破碎程度对比；

图5为C18反相二氧化硅微球的常规谱图测试图；

图6-1为处理前的C18键合反相二氧化硅微球用于五种肽（血管紧张肽、脑啡肽、催产素、蛋氨酸脑啡肽、索马鲁肽）的分离纯化色谱对比图；

图6-2为处理后的C18键合反相二氧化硅微球用于五种肽（血管紧张肽、脑啡肽、催产素、蛋氨酸脑啡肽、索马鲁肽）的分离纯化色谱对比图；

图7 为C8键合反相二氧化硅填料用于胰岛素的分离纯化色谱图；

图8为二氧化硅浮选装置示意图；

图9（a）为含微孔的二氧化硅微球骨架示意图，（b）为不含微孔的二氧化硅微球骨架示意图。

图中：

1.浮选瓶一 2.浮选瓶二 3.浮选瓶三 4.蠕动泵。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。

本发明提供的一种介孔二氧化硅微球的制备方法，包括如下步骤：

S1：由硅酸盐水溶液制备纳米硅溶胶。首先，硅酸盐水溶液由正硅酸酯或二氧化硅与无机氢氧化物在水中加热制备（可以适当加入少量的醇，以利于正硅酸酯与水的混合）；所述硅酸盐中SiO₂与Na₂O或K₂O的摩尔比为1.5:1-4.5:1, 优选地，硅酸盐中SiO₂与Na₂O或K₂O的摩尔比为2.5:1-3.5:1。再将硅酸盐水溶液通过离子交换柱或其它方式进行离子交换除掉金属离子， pH值控制在4.5以下，得到纳米胶体溶液；随后用有机碱将pH调整到5-11，在20-120℃下搅拌或放置2-150h；优选地，在pH为6-10，30-100℃下搅拌或放置5-100h；浓缩至二氧化硅含量为6-20%，平均粒径为5-30nm，比表面为100-600 m²/g；优选的，平均粒径为6-20nm，比表面积为200-400 m²/g。

S2：将S1所得的硅溶胶混合在脲醛溶液中。脲醛溶液可由尿素与甲醛、乙二醛，丙二醛，丁二醛中的一种或多种在酸性条件下制成；酸为有机酸或无机酸，优选地，乙酸、柠檬酸或硝酸；反应温度为0-95℃，优选地，反应温度为30-70℃。

S3：复合二氧化硅微球在600-900℃高温下焙烧硬化，时间5-20h。

S4：对焙烧后得到的介孔二氧化硅微球进行浮选，再进一步用酸和/或碱水溶液分别或顺序在20-100℃下处理2-100h，可单独用酸、单独用碱、酸碱结合的方式进行处理，优选的顺序是先碱后酸进行处理。碱的浓度在1-15%重量范围内，优选为2-10%，酸的浓度在0.1-20%的重量范围内，优选为1-10%。

其中，S4还包括对酸碱处理后的介孔二氧化硅微球可以进一步进行表面惰化处理，将短链硅烷和二氧化硅微球在惰性溶剂中回流2-48h；或者将上述二氧化硅微球用包含短链硅烷，水和有机溶剂的混合液进行涂敷并加热。短链硅烷包括但不限于：甲基三甲氧基、甲基三乙氧基、乙基三甲氧基、四乙氧基、四甲氧基、乙撑六甲氧基、乙撑六乙氧基或上述各类短链硅烷的混合物，以及上述短链硅烷或任意混合后与水及有机溶剂按照一定比例混合的溶液，短链硅烷与水的质量比在100：1-10：1；短链硅烷与有机溶剂的比例在1：100-10：1。所述有机溶剂包括但不限于甲苯、乙醇、二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃、正癸烷

通过本发明的S1到S4，可制备出二氧化硅微球孔径分布窄、微孔少、强度高，平均粒径为5-20um、比表面积为200-500m²/g、平均孔径为80Å-300Å、平均孔径±25%占比为≥70%，70Å以下的微孔占比小于10%（数量比），孔隙率为0.6-1.2。如图1-2所示，分别为本发明制备得到的介孔二氧化硅微球的显微镜照片和介孔二氧化硅微球的粒径分布图。

实施例1：硅溶胶的制备

（1）纳米硅溶胶的制备

20L去离子水中加入2.4kg氢氧化钠，搅拌溶解后加入二氧化硅石英颗粒，高压下加热至300℃，搅拌直到形成清晰、均匀的钠水玻璃溶液。10kg的钠水玻璃加入15kg的去离子水进行稀释，稀释后的钠水玻璃通过阳离子交换树脂-阴离子交换树脂-阳离子交换树脂。所制备的小粒径溶胶的pH值为3.5，SiO₂含量4.5%，粒径约2-3nm。

（2）纳米硅溶胶的进一步处理

取上述制备的纳米硅溶胶10000g，加入70g氨水溶液，搅拌并加热至95℃，恒温反应5h。冷却至室温，然后加入20L旋转蒸发器，蒸馏至将溶胶浓缩到15.5%。制备的硅溶胶pH为9.05，500℃烧结后比表面积为430 m²/g，硅溶胶的平均粒径为7-8nm。

实施例2：介孔二氧化硅微球的制备

采用实施例1制备的硅溶胶5000g进行1：1稀释后，加热至70℃，加入7ml浓硝酸、400g尿素，搅拌使其溶解。快速搅拌下加入500ml甲醛，持续搅拌60s。静置，析出白色沉淀。抽滤后获得单分散二氧化硅微球。650℃下焙烧5h、800℃下焙烧10h进行测试。二氧化硅微球粒径为10μm，孔径10nm，比表面积380 m²/g。

实施例3 ：浮选和进一步处理

对实施例2制备的二氧化硅微球采用图8的自制浮选装置对微球进行浮选，去除小粒径和粘球。浮选瓶一1，浮选瓶二2，浮选瓶三3通过管路连接，左侧为蠕动泵4，用蠕动泵4将待浮选的二氧化硅微球300g匀浆液（300g二氧化硅微球加入1L纯水，搅拌均匀）打入浮选瓶一1，更换纯水继续进水浮选。

为获得更优的二氧化硅微球孔结构，浮选后的微球，需再进一步处理

取浮选后的二氧化硅微球100g，加入1000ml 10% 的氨水溶液，30℃下处理24h，降温后纯水洗至中性，150℃烘烤16h。烘烤后的二氧化硅微球加入1M 盐酸水溶液，50℃下处理24h，纯水洗中性，150℃烘烤16h。

对氨水和盐酸处理处理前后的二氧化硅微球用比表面孔径测试仪（BET4800）对孔径进行氮气吸附测试，氨水和盐酸处理前后的BJH-吸附-孔径分布-曲线图见图3-1和图3-2（横坐标为孔宽，孔宽为孔的直径，简称为孔径；纵坐标左侧为孔微分分布，右侧为孔积分分布），且从吸附详细测试数据进行不同孔径占比（孔微分体积/孔积分体积）计算见表1，从图3-1和图3-2可看出，处理后的孔径分布更加集中，且有很好的正态分布。从表1可看出，小于7nm的孔从18.13%降低到6.32%。经过此步处理，微球孔结构进行了优化孔隙的正态分布提升，有利于色谱性能的提高和二氧化硅寿命的提高。

表1 氨水盐酸处理前后的孔径占比%

对氨水处理后的二氧化硅微球和进口硅胶进行强度耐压测试

使用精密强度测试仪（配套压力传感器）对氨水盐酸处理后的二氧化硅微球胶和进口硅胶进行3500N和4300N不同压强下的强度耐压实验，10S后取压后二氧化硅微球在可拍照的UB103i生物数码显微镜（1200万像素）进行拍照，不同压强下实验后照片见图4，在相同的压强条件下，本专利产品和进口K品牌强度相当，二氧化硅微球破碎少。可得出本发明获得的二氧化硅微球机械强度高，耐压高。

实施例4 ：表面惰化处理

取上述表面处理后的50g， 加四甲氧基硅烷5g，三乙胺1g，甲苯200ml；电动搅拌下110℃加热回流16 h；过滤，分别用100 ml甲苯洗涤3次；100 ml甲醇洗涤3次；真空干燥12h；得白色球形固体粉末48g。C%=1，硅羟基酸性由pH=7.1降低至 pH=5.4。

本发明基于上述二氧化硅微球的色谱固定相的制备方法，采用常规惰性溶剂和/或气相沉积法对二氧化硅表面进行功能化修饰，如下：

具体地，将介孔二氧化硅微球和硅烷化试剂加入到惰性有机溶剂中回流2-24小时；所述硅烷化试剂的通用分子式为：n-SiX₃或n-Si（CH₃）₂-X；n-包括但不限于十八烷基、辛基、丁基、氨丙基、环氧丙基、巯基、苯基、甲基，氰基等，X包括但不限于氯，烷氧基，二甲氨基，二乙氨基等能够水解成为OH的基团；惰性溶剂包括但不限于甲苯，二甲苯，四氢呋喃，辛烷等。

具体地，在一个除氧、负压的容器中加入介孔二氧化硅微球和硅烷化试剂，然后加热使硅烷化试剂气化，加热2-24h后，冷却到室温并用溶剂清洗反应后的二氧化硅微球，得到所需的色谱固定相。所述硅烷化试剂的通用分子式为：n-SiX₃或n-Si（CH₃）₂-X；n-包括但不限于十八烷基、辛基、丁基、氨丙基、环氧丙基、巯基、苯基、甲基，氰基等，X包括但不限于氯，烷氧基，二甲氨基，二乙氨基等能够水解成为OH的基团。

实施例5：C18色谱固定相-气相沉积法

500ml四口瓶中加入50g二氧化硅微球、 300ml乙醇、25g C18硅烷和15ml三乙胺，在40℃温度条件下混合物震荡4h，然后升温至90℃，蒸馏去除乙醇后，倒入玻璃盘中放入150℃烤箱中加热16h，降温后，依次用甲醇、乙醇和甲醇进行清洗，进而在100℃温度条件下烘烤，进行元素分析测试C含量为19.85%；

在1L高压气相反应釜，加入250g上述键合后C18硅胶，再加入三甲基氯硅烷250g，密封后，设定温度为120℃，反应16h，反应过程中，高压反应釜不断摇晃使二氧化硅能完全接触三甲基氯硅烷。反应泄压后，用甲醇清洗三次，进行选择性常规测试，测试条件见表2。常规测试谱图（嘧啶、苯酚、硝基苯、萘）尿如图5所示。从图上也可看出，几种物质可高效地实现分离。

表2 测试条件

实施例6：C8色谱固定相-惰性溶剂法

采用上述实施例3的二氧化硅微球50g，十八烷基二甲基氯硅烷25g，三乙胺20g，甲苯250ml，约110℃回流6h。所得固体过滤，用甲苯洗涤3次，每次250ml；甲醇洗涤6次，每次250ml；真空干燥100℃，8h。上述键合后硅胶，三甲基氯硅烷40g，三乙胺20g，甲苯250ml，约110℃回流2h。所得固体过滤，用甲苯洗涤3次，每次250 ml；甲醇洗涤6次，每次250 ml；真空干燥100℃，8 h。进行元素分析测试C含量为18.25%。

实施例7：C18色谱固定相在多肽的分离应用

采用实施例5的C18色谱固定相和表1的条件对五种多肽进行分离应用测试，测试图谱如图6-1和图6-2所示。从图6-1和图6-2可看出，相同C18键合方式和相同的测试条件，改变二氧化硅微球孔道结构，使得孔径分布更窄、有效孔道占比更大，在相同条件下有着完全不同的测试结果，分离度大幅提升。

五种多肽：血管紧张肽、脑啡肽、催产素、蛋氨酸脑啡肽、索马鲁肽，测试条件详见表3。

表3 测试条件

实施例8：C8色谱固定相-胰岛素纯化应用实验

采用实施例6的C8色谱固定相装一根50*250动态弹簧压缩制备柱，采用如下表4的制备方法对胰岛素进行纯化制备，并对不同接收管进行收集测试及合并，实验结果见表5，纯化后胰岛素纯度可达99.7%，回收率为96.3%。分离纯化色谱谱图见图7。

表4 制备方法

表5 胰岛素纯化实验结果

实施例9：红景天苷纯化实验-高载量

采用实施例5的C18色谱固定相和进口J和C品牌的C18对红景天苷粗分后浓缩液进行精分，以固体量为50g/L的发酵过滤液计算，上样量、纯度、回收率结果见表五。经本专利二氧化硅微球纯化后的红景天苷的上样量和填料量之比可达到8.1%，且经50%甲醇淋洗后，即可得到红景天苷高纯物，纯度可达92.5%。

表6 红景天苷纯化结果

本发明所披露的介孔二氧化硅微球的制备方法，在有效的降低微孔的比例的同时，使孔隙率、有效孔径和有效比表面得到优化，更好的满足多肽化合物（分子量在1000D-10000 D）的工业色谱纯化的需求。有效比表面是指纯化目标分子能够进入并进行分离的孔所对应的表面，更高的有效比表面能够获得更高的载量。在本发明的说明书和权利要求中，有效比表面是指孔径大于7nm的孔所对应的比表面。本发明得到的二氧化硅微球特别适合分子量在1000D-10000D范围的极性或中等极性化合物的色谱分离纯化，如多肽、寡合酸和寡糖等。

图9（a）为含微孔的二氧化硅微球骨架示意图，（b）为不含微孔的二氧化硅微球骨架示意图。（a）中有较多的微孔，以二氧化硅微球为基质的多功能复合材料在使用过程中流动相或样品中会含有酸碱盐的物质，小于7nm的微孔在多肽、寡核酸和寡糖的分离中会造成样品和酸碱盐的微孔沉积，导致二氧化硅微球被酸碱盐不断腐蚀，影响二氧化硅微球的强度、使用寿命、抗污染能力和载样量。（b）中骨架几乎不含微孔，在使用过程中不会被酸碱盐侵蚀，使用寿命，抗污染能力增强。

本发明有效地控制了2-7nm微孔的存在，可以提高二氧化硅微球的耐磨耐压，耐腐蚀，耐污染（微孔导致的小分子杂质的强吸附）；并且通过本发明得到合适的窄分布的孔径和比表面的优化范围，使该材料更适合多肽、寡核酸的色谱纯化分离。

本发明中硅溶胶制备工艺步骤、结合复合微球的超高温焙烧工艺和后处理工艺步骤是降低微孔同时优化孔隙率和有效比表面的关键；而共沉淀步骤保证了微球粒径的均匀性；表面惰化修饰进一步封闭和减少了微孔，改善了耐碱、耐盐的性能，并降低了微孔造成的死吸附；并且通过处理，调整表面极性，从而进一步提高了载样量。本发明在我们对二氧化硅微球制备各步骤工艺参数对于硅胶性能影响的系统分析基础上，给出了新的工艺步骤和关键参数的系统组合，从而可以得到特别适用于多肽、寡合酸等（分子量在1000-10000D之间）进行色谱纯化分离的反相色谱填料。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：由硅酸盐制备得到纳米胶体溶液，硅酸盐由正硅酸酯或二氧化硅与无机氢氧化物在水中加热制备，硅酸盐中SiO₂与无机氢氧化物的摩尔比为1.5:1-4.5:1，硅酸盐水溶液通过离子交换除掉金属离子，pH值控制在4.5以下，得到粒径为2-3nm的纳米胶体溶液；

S2：将S1制备的2-3nm胶体溶液用有机碱调整pH到5-11，有机碱为铵盐、氨水、或其它一级、二级、三级的短链胺或季铵盐，所述短链胺或季铵盐是指不超过4碳原子的烃基或羟烃基，随后在在20-120℃下搅拌或放置2-150h，浓缩至二氧化硅含量为6-20％，制备得到平均粒径为5-30nm，比表面为100-600m²/g的纳米硅溶胶；

S3：将S2制备的纳米硅溶胶酸化并在加热条件下与脲醛溶液混合，得到白色复合微球沉淀；

S4：将S3得到的白色复合微球沉淀在600℃以上条件下焙烧，得到介孔二氧化硅微球；

S5：对S4焙烧得到的介孔二氧化硅微球进行浮选，并进一步用碱和酸水溶液顺序在20-100℃下进行2-100h的后处理，得到最终的介孔二氧化硅微球，后处理所用碱为氨水，铵盐，短链胺或季铵盐化合物，浓度在1-15％，所述短链胺或季铵盐是指不超过4碳原子的烃基或羟烃基，酸为无机酸或有机酸，浓度在0.1-20％。

2.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，所述S1中，正硅酸酯中金属总含量不超过50ppm，所述二氧化硅为晶态、非晶态或混合态的固体二氧化硅或水合二氧化硅，所述二氧化硅中除钾钠之外其它金属含量不超过50ppm，所述无机氢氧化物为氢氧化钠，氢氧化钾或氢氧化锂。

3.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，所述S3中，将S2制备的纳米硅溶胶混合在脲醛溶液中，所述脲醛溶液由尿素与甲醛、乙二醛、丙二醛、丁二醛中的一种或多种在酸性条件下制成，酸为有机酸或无机酸，反应温度为0-95℃。

4.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，所述S4中，白色复合微球在600-900℃高温下焙烧硬化，时间为5-20h。

5.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，所述S5中，对焙烧后或酸碱处理后的介孔二氧化硅进一步进行浮选，相邻浮选瓶直径比为1.1-1.8。

6.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，所述S5中，对酸碱处理后的介孔二氧化硅微球进行表面惰化处理，将短链硅烷和介孔二氧化硅微球在惰性溶剂中回流2-48h，或者将介孔二氧化硅微球用包含短链硅烷，水和有机溶剂的混合液进行涂敷并加热，所述短链硅烷为甲基三甲氧基、甲基三乙氧基、乙基三甲氧基、四乙氧基、四甲氧基、乙撑六甲氧基、乙撑六乙氧基或上述短链硅烷的混合物，或上述短链硅烷任意混合后与水及有机溶剂按照比例混合的溶液，短链硅烷与水的质量比为100：1-10：1；短链硅烷与有机溶剂的质量比为1：100-10：1，有机溶剂为甲苯、乙醇、二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃或正癸烷。

7.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，所述最终的介孔二氧化硅微球平均孔径±25％占比为≥70％，以下的微孔占比小于10％，平均粒径为5-20um，比表面积为200-500m²/g，平均孔径为/>孔隙率为0.7-0.9ml/g，耐压≥50MPa。

8.根据权利要求1所述的一种介孔二氧化硅微球的制备方法，其特征在于，所述S2中，有机碱为三乙胺、二乙胺或乙二胺。