CN115814146B - 一种仿生凝血机制的止血粉制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种仿生凝血机制的止血粉制备方法，属于生物医药和医疗技术领域。本发明利用由单宁酸、聚乙二醇、聚乳酸‑羟基乙酸‑聚乙二醇‑聚乳酸‑羟基乙酸，得到了止血效果良好的止血粉，其止血机制源于天然止血过程，并且独立于自身的凝血途径，凝聚体中交联的热响应胶束提高止血粉的粘结强度和温敏性。通过界面吸水和热响应交联机制，与组织接触，使其表面快速凝胶化，在血管损伤部位迅速形成仿生凝块，达到有效止血的目的。本发明制备过程简便，成本低廉，产品安全无毒副作用，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种仿生凝血机制的止血粉制备方法

技术领域

本发明属于医疗技术领域，特别涉及一种基于仿生天然止血机制的止血粉制备方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

不可控的出血是导致人类死亡的主要原因，高效地止血对提高患者生存率至关重要。目前常用的止血材料包括止血凝胶、纱布、绷带、海绵、薄膜等，上述止血材料大多通过物理压迫和被动吸收来止血，凝胶止血由于其亲水性和溶胀性导致其在湿润和动态环境下的性能较差，海绵仅被动吸收血液、缺乏与组织的相互作用。以上材料对于急性出血和不可压缩性伤口止血效率较差，缺乏对天然止血机制的理解和应用。止血粉可以处理不可压缩伤口的、不规则损伤和深度出血，存在止血效率高、长期储存、使用方便等优势。

专利CN 113274544 A公开了一种基于PEG的止血粉，该止血粉通过两种不同官能团的PEG分子化学交联形成凝胶，通过物理作用吸收水分，形成与组织粘附性的凝胶封堵伤口。但是该止血粉仅依靠物理封堵作用止血，缺乏仿生止血机制。

专利CN 201710853874公开了一种仿生止血生物胶，该胶包含氨基酸序列为SEQID NO:1的蛋白和Dopa修饰的海藻酸钠，多肽的加入能够改善材料的超微结构，具有良好的止血效果，但是该止血胶制备过程中涉及多肽的提取和聚合物的化学修饰，制备过程复杂。

发明内容

本发明提出了一种仿生凝血机制的止血粉制备方法，旨在解决现有止血粉成胶力学性能差、且与组织粘附力弱、降解性能差的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种仿生凝血机制的止血粉制备方法，包括：

将止血粉末用的PEG和多酚溶液混合均匀，固液分离，去除上清液，得到凝聚相TAPE；

将PLGA-PEG-PLGA溶液加入到所述凝聚相TAPE中混合均匀，固液分离，去除上清液，得到下层凝聚物；

将所述下层凝聚物冻干、研磨，即得。

研究发现：单宁酸(TA)和聚乙二醇(PEG)之间氢键作用驱动的会形成中性凝聚剂(TAPE)，PEG的氧乙烯基接受TA酚羟基提供的氢，当TA与PEG溶液混合以后，立刻形成凝聚液滴，液滴持续增长形成富聚合物的密集相。聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)是一种含有聚乙二醇的三嵌段聚合物(TB)，在37℃时发生可逆的热响应溶胶-凝胶转变,因此在生物医学应用中常用作可注射热凝胶。在水中PLGA-PEG-PLGA形成纳米胶束，温度升高时，通过疏水作用形成热凝胶。

本发明止血材料的制备方法采用TA、PEG和PLGA-PEG-PLGA为原料，以水为溶剂，通过氢键驱动形成凝聚体，随后离心冻干研磨的方式制备了具有仿生凝血机制的止血粉，止血粉通过激活、粘附、聚集、凝胶化和降解来发挥仿生凝血效果。本发明止血材料通过混匀离心冻干研磨，操作简便易行，可快速、高效的制备止血材料。本发明的止血粉可在多种伤口表面应用，适用于精细组织、不可压缩和不规则伤口的止血，同时独立于自身的凝血能力。

本发明中PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物(TB)既增加了止血粉末对生物组织的粘附性，又赋予材料温敏成胶的性质。通过界面吸水和热响应交联机制，与组织接触，使其表面快速凝胶化，在血管损伤部位迅速形成仿生凝块，达到有效止血的目的。

本发明的第二个方面，提供了上述的方法制备的仿生凝血机制的止血粉。

本发明的第三个方面，提供了上述的仿生凝血机制的止血粉在制备医用材料中的应用。

本发明的有益效果

(1)本发明的止血针机理主要为：止血粉通过激活、粘附、聚集、凝胶化和降解来发挥仿生凝血效果。

(2)本发明制备方法简单、实用性强，易于推广。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明制备的P-TAPE/TB止血粉图片；

图2为本发明组成成分TA、PEG、PLGA-PEG-PLGA；

图3为本发明TA、PEG、PLGA-PEG-PLGA氢键作用红外光谱；

图4为本发明P-TAPE/TB的仿生止血机理；

图5为本发明P-TAPE/TB止血粉的粘附性能；

图6为本发明TAPE/TB温敏性测试；

图7为本发明P-TAPE/TB止血粉止血性能表征。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种基于自然止血过程的止血抗菌材料，所述材料包括TA、PEG、PLGA-PEG-PLGA。

本发明的又一具体实施方式中，所述PLGA-PEG-PLGA采用如下方法制备得到：

(1)称量4.01g PEG放置于烧瓶中，在130℃真空条件下加热3h以去除水分，然后烧瓶在氮气下冷却到100℃。

(2)将12mg乙酸亚锡溶解于100μL甲苯中；

(3)向体系中加入7.06g丙交酯、2.27g乙交酯，待其完全溶解后加入已溶解的乙酸亚锡的甲苯溶液，利用真空泵抽真空除去甲苯15min；

(4)150℃氩气条件下搅拌12h；

(5)150℃利用真空泵抽真空3h除去未反应单体；

(6)最后用水冲洗3次，最终纯化产物经冻干后保存在-20℃。

在一些实施例中，所述干燥优选采用冷冻干燥方式进行，所述冷冻干燥程序为在-80～-40℃冷冻干燥24-72h，优选为在-60℃冷冻干燥48h。

经研究发现，采用上述方法制得的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物组成为LA₁₉GA₈-EG₃₄-GA₈LA₁₉，分子量为5.2kDa,多分散指数为1.28。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述止血抗菌材料在制备止血粉中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种仿生凝血机制的止血粉，所述止血粉由上述止血抗菌材料制成，因此，所述止血抗菌止血粉包含上述单宁酸、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸。

更具体的，所述PEG和TA的质量比为1～6：10～20，优选为1～3：2～12。

所述制备方法包括：

(1)制备10％(w/w)的TA、PEG、PLGA-PEG-PLGA溶液；

(2)204mg PEG和796mg TA溶液在涡旋仪上混合均匀，以10000rpm离心5min；去掉上清液，得到粘稠状凝聚相TAPE；

(3)加入25mg PLGA-PEG-PLGA溶液，混合均匀后以10000rpm离心5min，去除上清液，得到下层凝聚物；

(4)将下层凝聚物放入液氮中10min，随后冷冻干燥48h，得到固体；

(5)研磨15min得止血粉末。

其中TA、PEG、PLGA-PEG-PLGA的浓度控制为1～200mg/mL，进一步优选为50～150mg/mL。

在一些实施例中，所述的多酚为单宁酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、邻苯三酚、邻苯二酚、儿茶素、多巴胺、没食子酸、儿茶素水合物中的一种或两种的组合。

在一些实施例中，PEG为直链聚乙二醇、四臂聚乙二醇、八臂聚乙二醇、以及氨基、甲氧基、苯甲醛、巯基等不同官能团封端的聚乙二醇衍生物。

在一些实施例中，所述止血粉末用的PEG分量范围为1～100kDa，进一步优选为1～10kDa,更进一步优选为1～5kDa。

在一些实施例中，所述离心时间为5-30min。

在一些实施例中，所述离心速度范围为8000-20000rpm。

在一些实施例中，所述溶剂为三次水。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

以下实施例中，制备PLGA-PEG-PLGA中所用的PEG为分子量1.5kDa的无官能团修饰的直链PEG，以获得预期的最低临界溶解温度。

实施例1

(1)准确称量4.01g 1.5kDa PEG放置于烧瓶中，在130℃真空条件下加热3h以去除水分，然后烧瓶在氮气下冷却到100℃。

(2)将12mg乙酸亚锡溶解于100μL甲苯中；

(3)向步骤(1)中含有PEG的烧瓶中加入7.06g丙交酯、2.27g乙交酯，待其完全熔化后加入已溶解的乙酸亚锡的甲苯溶液，真空泵真空除去甲苯15min；

(4)150℃氩气条件下搅拌12h；

(5)150℃利用真空泵抽真空3h除去未反应单体；

(6)最后用水冲洗3次，最终纯化产物(PLGA-PEG-PLGA)经冻干后保存在-20℃。

(7)制备10％(w/w)的TA、1.5kDa直链PEG、PLGA-PEG-PLGA溶液；

(8)204mg 1.5kDa直链PEG和796mg TA溶液在涡旋仪上混合均匀，以10000rpm离心5min；去掉上清液，得到粘稠状凝聚相TAPE；

(9)加入25mg PLGA-PEG-PLGA溶液，混合均匀后以10000rpm离心5min，去除上清液，得到下层凝聚物；

(10)将下层凝聚物放入液氮中10min，随后冷冻干燥48h,得到固体；

(11)研磨15min得止血粉末。

实施例2

(1)制备8％(w/w)的TA、1.5kDa直链PEG、PLGA-PEG-PLGA溶液(PLGA-PEG-PLGA的制备方法与实施例1相同)；

(2)300mg 1.5kDa直链PEG和700mg TA溶液在涡旋仪上混合均匀，以10000rpm离心5min；去掉上清液，得到粘稠状凝聚相TAPE；

(3)加入30mg PLGA-PEG-PLGA溶液，混合均匀后以10000rpm离心5min，去除上清液，得到下层凝聚物；

(4)将下层凝聚物放入液氮中10min，随后冷冻干燥48h，得到固体；

(5)研磨15min得止血粉末。

实施例3

(1)制备8％(w/w)的EGCG、1.5kDa直链PEG、PLGA-PEG-PLGA溶液(PLGA-PEG-PLGA的制备方法与实施例1相同)；

(2)200mg 1.5kDa直链PEG和800mg EGCG溶液在涡旋仪上混合均匀，以10000rpm离心5min；去掉上清液，得到粘稠状液体；

(3)加入30mg PLGA-PEG-PLGA溶液，混合均匀后以10000rpm离心5min，去除上清液，得到下层凝聚物；

(4)将下层凝聚物放入液氮中10min，随后冷冻干燥48h，得到固体；

(5)研磨15min得止血粉末。

实施例4

(1)制备10％(w/w)的TA、1.5kDa 8-arm PEG、PLGA-PEG-PLGA溶液(PLGA-PEG-PLGA的制备方法与实施例1相同)；

(2)200mg 1.5kDa 8-arm PEG和800mg TA溶液在涡旋仪上混合均匀，以10000rpm离心15min；去掉上清液，得到粘稠状凝聚相TAPE；

(3)加入30mg PLGA-PEG-PLGA溶液，混合均匀后以10000rpm离心15min，去除上清液，得到下层凝聚物；

(4)将下层凝聚物放入液氮中10min，随后冷冻干燥48h，得到固体；

(5)研磨15min得止血粉末。

实施例5

(1)制备10％(w/w)的TA、2kDa 4-armPEG、PLGA-PEG-PLGA溶液；

(2)200mg 2kDa 4-armPEG和800mg TA溶液在涡旋仪上混合均匀，以10000rpm离心5min；去掉上清液，得到粘稠状凝聚相TAPE；

(3)加入25mg PLGA-PEG-PLGA溶液溶液，混合均匀后以10000rpm离心10min，去除上清液，得到下层凝聚物；

(4)将下层凝聚物放入液氮中20min，随后冷冻干燥72h，得到固体；

(5)研磨15min得止血粉末。

实验例1

本发明所提供了实施例1制备的基于凝聚体的、可控降解的的复合止血粉(P-TAPE/TB)(如图1)，由单宁酸(TA)、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)三种组分构成(如图2)。TA、PEG和PLGA-PEG-PLGA可以通过氢键相互作用形成凝聚体(如图3)，冻干粉在湿性组织生理环境下的形态变化为激活、粘附、聚集、凝胶化和降解(如图4)，这与自然止血过程相似。止血粉制备采用的均是生物相容性原料，制备方法方便。主要的优点是凝聚体疏水作用下的防水粘附，凝聚体中交联的热响应胶束(PLGA-PEG-PLGA)提高凝集水凝胶的粘结强度(图5)和温敏性(图6)。通过界面吸水和热响应交联机制，与组织接触，使其表面快速凝胶化，在血管损伤部位迅速形成仿生凝块，达到有效止血的目的。

实验例2

止血粉性能检测

(1)肝脏止血能力实验

使用健康的昆明小鼠腹腔内注射戊巴比妥麻醉，23G注射器诱导昆明鼠肝脏出血，并立即使用100mg实施例1制备的P-TAPE/TB止血粉，对出血量进行统计分析，止血效果见图7。

(2)断尾止血能力实验

使用健康的昆明小鼠腹腔内注射戊巴比妥麻醉，使用剪刀剪断昆明鼠尾部，并立即使用50mg实施例1制备的P-TAPE/TB止血粉，对出血量进行统计分析，止血效果见图7。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种仿生凝血机制的止血粉制备方法，其特征在于，包括：

将止血粉末用的PEG和多酚溶液混合均匀，固液分离，去除上清液，得到凝聚相；

将PLGA-PEG-PLGA溶液加入到所述凝聚相中混合均匀，固液分离，去除上清液，得到下层凝聚物；

将所述下层凝聚物冻干、研磨，即得；

其中，所述PEG和多酚的质量比为1~6：10~20；

所述多酚、PEG、PLGA-PEG-PLGA的浓度皆为1~200 mg/mL；

PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物组成为LA₁₉GA₈-EG₃₄-GA₈LA₁₉，分子量为5.2 kDa, 多分散指数为1.28。

2.如权利要求1所述的仿生凝血机制的止血粉制备方法，其特征在于，所述PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物采用分子量1.5kDa的无官能团修饰的直链PEG、丙交酯、乙交酯制备。

3.如权利要求1所述的仿生凝血机制的止血粉制备方法，其特征在于，止血粉末用的PEG为直链聚乙二醇、四臂聚乙二醇、八臂聚乙二醇、以及氨基、甲氧基、苯甲醛或巯基封端的聚乙二醇衍生物中的至少一种，分子量范围为 1~100 kDa。

4.如权利要求1所述的仿生凝血机制的止血粉制备方法，其特征在于，所述多酚为单宁酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、邻苯三酚、邻苯二酚、儿茶素、多巴胺、没食子酸、儿茶素水合物中的至少一种。

5.如权利要求1所述的仿生凝血机制的止血粉制备方法，其特征在于，所述多酚、PEG、PLGA-PEG-PLGA的浓度皆为50~150 mg/mL。

6.如权利要求1所述的仿生凝血机制的止血粉制备方法，其特征在于，冷冻干燥程序为在-80~-40 °C冷冻干燥24-72 h。

7.如权利要求1所述的仿生凝血机制的止血粉制备方法，其特征在于，冷冻干燥程序为在-60 °C冷冻干燥48 h。

8.权利要求1-7任一项所述的方法制备的仿生凝血机制的止血粉。

9.权利要求8所述的仿生凝血机制的止血粉在制备医用材料中的应用。