KR20210124767A

KR20210124767A - 실크 피브로인을 포함하는 광경화성 하이드로겔 지혈제 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20210124767A
Application number: KR1020200042231A
Authority: KR
Inventors: 박찬흠; 이영진; 이옥주; 조용준; 김순희; 이지승; 홍희선
Original assignee: 주식회사 지한
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2021-10-15

Abstract

본 발명은, 누에 고치 유래 천연 단백질 고분자인 실크 피브로인의 대량 생산성, 생분해성, 창상 재생 기능, 생체 접착 기능, 뛰어난 생체 적합성 및 생물학적 위험성이 없다는 장점을 이용하여 이를 주성분으로한 광경화성 하이드로겔 지혈제를 제조함으로써, 실크 피브로인의 우수한 접착 강도와 생체 적합성, 지혈 및 창상 치유 능력이 동등 이상으로 유지되면서 출혈 및 창상 봉합이 필요한 부위에 적용할 수 있는 급속 광경화 하이드로겔 지혈제 및 이의 제조방법 제공한다.

Description

실크 피브로인을 포함하는 광경화성 하이드로겔 지혈제 및 이의 제조 방법{Photocuring hemostatic hydrogel containing silk fibroin and preparation method thereof}

본 발명은 누에 고치 유래 천연 단백질 중 하나인 실크 피브로인을 주성분으로 포함하는 광경화성 하이드로겔 지혈제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

[과제고유번호] PJ01313901

[부처명] 농촌진흥청

[연구관리 전문기관] 농촌진흥청

[연구사업명] 차세대바이오그린 21 사업

[연구과제명] 창상 치유 및 급속 지혈 효과를 가진 광경화 실크 피브로인 지혈제 개발

[기여율] 1/1

[주관기관] 한림대학교산학협력단

[연구기간] 2020.01.01 ~ 2020.12.31.

외과 시술시 또는 수술 후의 출혈은 기대 이상의 사망률을 가져올 수 있는 매우 심각한 문제로, 수술 시 '지혈제'는 필수불가결한 요소이다. 작은 수술에서부터 개복수술에 이르기까지 일반 외과술 중 개복, 개흉 수술같이 상태가 중증인 경우 대량 출혈 등 우연치 않은 사고에 대비하기 위해 지혈제의 중요성은 대단히 크며 다양한 종류의 지혈제가 필요하다.

현재 시장에 나와 있는 지혈제의 종류에는 액체로 되어 상처에 도포하면 굳는 글루 타입 (Glue type), 그물망처럼 생겨 상처부위를 압박하는 형태인 패치 타입, 패치 위에 지혈제 성분을 입힌 혼합형 타입이 제품화 되어 있다. 그러나 기존 지혈제들은 1) 낮은 생체적합성, 2) 느린 지혈시간, 3) 낮은 조직접착력 및 4) 낮은 보관 안정성과 같은 단점이 있으며, 또한 대부분 한가지 기능만을 가지고 있다. 즉, 빠른 지혈효과와 더불어 생체적합성, 생분해성, 조직치유, 경제성, 보관 안정성, 사용편의성 등과 같은 요구를 동시에 만족시키는 제품은 없다.

실크(silk)는 누에나방 벌레(Bombyx morisilk-worm)에서 추출한 천연 섬유상 중합체로, 피브로인(fibroin)과 세리신(sericin)의 두 가지 단백질로 이루어져 있다. 특히, 실크 단백질의 주성분인 피브로인은 뛰어난 인장 강도, 작은 항원성, 비 염증성 특성 및 조절 가능한 생물 분해성 등으로 인해 생의학 분야에서 다양하게 활용되고 있다.

실크 피브로인(fibroin)은, 빠른 가교 결합의 형성 및 기계적 강성을 유지할 수 있고, 하이드로 겔로 형성시 안정성 측면에서 우수한 기계적 특성을 가질 뿐만 아니라 창상 부위에서 세포의 부착 및 분화에 적합한 미세환경을 조성할 수 있는 장점이 있다.

등록번호 제10-1474237호(2014.12.12 등록)

본 발명은, 누에고치 유래 천연 단백질 고분자인 실크 피브로인의 대량 생산성, 생분해성, 창상 재생 기능, 생체 접착 기능, 뛰어난 생체 적합성 및 생물학적 위험성이 없다는 장점을 이용하여 이를 주성분으로 포함하는 광경화성 하이드로겔을 제조함으로써, 실크 피브로인의 우수한 접착 강도와 생체 적합성, 지혈 능력이 동등 이상으로 유지되면서 출혈 및 창상 봉합이 필요한 부위에 적용할 수 있는 급속 광경화 하이드로겔 지혈제 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 광경화성 하이드로겔 지혈제는, 실크 피브로인(Silk Fibroin) 메타크릴레이트(Methacrylate)계 화합물이 중합된 고분자 중합체; 및 광개시제;를 포함할 수 있다.

상기 고분자 중합체는, 실크 피브로인의 아미노산 잔기에 하나 이상의 메타크릴레이트계 화합물이 공중합되어 형성된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 광경화성 하이드로겔 지혈제는 생물학적 활성인자 및 세포를 더 포함할 수 있으며, 사용 부위에 따른 물성 개선을 위해, 젤라틴, 콜라겐, Polyvinyl Alcohol(PVA), 알진네이트, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 키토산, PEO(polyethylene oxide), PEG(polyethylene glycol) 중 선택된 어느 하나이상으로 이루어진 고분자 또는 메타크릴레이트계 화합물을 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 광개시제는, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명이 다른 실시 형태는, 누에 고치(Bombyx mori)로부터 세리신 단백질 및 불순물을 제거한 후, 용매에 실크 피브로인(Silk Fibroin)을 용해시켜 실크 피브로인 용액을 제조하는 제1단계; 실크 피브로인 용액에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 후, 이를 반응시켜 고분자 중합체를 제조하는 제2단계; 제2단계를 통해 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 건조하여 분말화시키는 제3단계; 및 물 기반 용매에 제3단계를 통해 제조된 분말과 광개시제를 혼합하는 제4단계;를 포함하는 광경화성 하이드로겔 지혈제의 제조 방법을 포함한다.

상기 제1단계는, 브롬화리튬(LiBr)용액 또는 염화칼슘(CaCl₂)용액에 실크 피브로인을 0.05 ~ 0.35 g/ml 농도로 용해시킨 후, 40 ~ 80 분간 50 ~ 70 ℃ 온도로 가열할 수 있다.

상기 제2단계 후에, 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 투석 튜브에 넣고, 물에 침지시켜 불순물을 제거하는 투석단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 투석단계는, 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 12 ~ 14 kDa cutoff 투석튜브에 넣은 후, 물에 3 ~ 7일간 침지시켜 불순물을 제거하는 것이 바람직하다.

상기 제2단계는, 실크 피브로인이 용해된 용액에 141 ~ 705 mM 농도로 메타크릴레이트계 화합물을 투입하며, 실크 피브로인이 용해된 용액에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 후, 50 ~ 70 ℃ 온도에서 2 ~ 4 시간 동안 200 ~ 400 rpm 회전속도로 교반할 수 있다.

상기 제3 단계는, 상기 고분자 중합체가 포함된 용액을 -90 ~ -70 ℃ 온도로 10 ~ 14시간 동안 동결한 다음, 동결온도와 동일 온도하에서 40 ~ 60 시간 동안 동결건조하는 것이 바람직하다.

상기 제4단계는, 젤라틴, 콜라겐, Polyvinyl Alcohol(PVA), 알진네이트, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 키토산, PEO(polyethylene oxide), PEG(polyethylene glycol) 또는 메타크릴레이크계 화합물을 추가로 혼합할 수 있다.

또한, 상기 제4단계는, 물 기반 용매에 제3단계를 통해 제조된 분말 5 ~ 30 wt% 및 광개시제 0.1 ~ 0.3 wt%를 혼합하되, 상기 용매, 분말 및 광개시제의 합이 100 wt%를 넘지 않는 것이 바람직하다.

상기 4단계에서 사용하는 광개시제는, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 사용할 수 있다.

본 발명은, 대량 생산성, 생분해성, 창상 재생 기능, 생체 접착 기능, 뛰어난 생체 적합성 및 생물학적 위험성이 없는 누에고치 천연 단백질인 실크 피브로인을 기반으로 중합반응을 통해 광 노출시 겔화 또는 급속 경화 반응을 일으킬 수 있는 급속 광경화 하이드로겔 지혈제를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 하이드로겔 지혈제는 기존에 사용되는 창상 피복제를 대체할 수 있는 치유효과 및 지혈효과를 동시에 갖는 복합 기능성 지혈 치료제로 누공, 천공, 대량출혈, 모든 외상 및 외과적 수술 시 발생하는 출혈 등과 같은 다양한 분야에 폭넓게 적용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 하이드로겔 지혈제는 경화 반응에 의한 형상 변화를 통해 기존의 패치나 파우더 제형의 지혈제나 창상피복제, 연부조직접착제를 대체할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시 형태인 광경화성 하이드로겔 지혈제의 주요 성분과 제조 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 광경화성 하이드로겔 지혈제의 제조과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조된 광경화성 하이드로겔 지혈제의 조직 접착 능력을 확인하기 위하여 그 부착 물성을 생체외에서 측정하는 과정과 그 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 광경화성 하이드로겔 지혈제 및 비교예(Medifoam L, 3M Tape)의 조직 접착 성능을 비교하기 위한 중첩 전단 강도 (Lap Shear Strength)의 생체외 측정 방법과 그 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 광경화성 하이드로겔 지혈제 및 비교예(Medifoam L, 3M Tape)의 조직 접착 성능을 확인하기 위한 생체외 필시험 (peel test) 과정과 결과를 나타낸 것이다.
도 6a와 6b는 각각 본 발명에 따라 제조된 실크 피브로인과 GMA가 중합된 중합체 (Silk-GMAS)가 경화 시간에 따른 하이드로겔의 세포독성(도 6a) 및 in vivo 염증 반응에 따른 CD68 발견의 결과를 나타낸 형광 현미경 사진(도 6b)이다.
도 7a와 7b는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 Silk-GMAS의 피부 및 내부장기 지혈제로서의 성능을 확인하기 위한 in vivo 실험 과정을 나타낸 사진이다.
도 8a와 8b는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오글루 및 비교예(Fibrin glue)의 내부장기 출혈 실란트(sealant)로서의 효과를 간출혈모델에서 관찰한 사진이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시 예를 통해 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀 둔다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

각 단계들에 있어 식별부호는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 하이드로겔 지혈제 및 이의 제조방법에 관하여 보다 상세히 설명하고자 한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 하이드로겔 지혈제는, 생체재료로 사용할 수 있는 생체적합성이 있는 물질, 일 예로, 아가로즈(agarose), 피브리노겐(fibrinogen), 메타아크릴레이티드 히알루론산(HAMA), 사이올레이티드 히알루론산, 젤라틴, 젤라틴 메타아크릴레이티드(GelMA), 사이올레이티드 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 합성펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 기초의 하이드로겔, PVA(Poly vinyl alcohol), PGA(Polyglycolic acid), PLGA(poly-lactic-co-glycolic acid), PLA(Polylactic acid), PLLA( poly(L-lactic acid)), PCL(Polycaprolactone), PHB(Polyhydroxybutyrate), PHV(Polyhydroxyvalerate), PDO(Polydioxanone), PTMC(Polytrimethylenecarbonate) 등의 물질 보다 상대적으로 생체 적합성, 창상 재생능력 및 물리적 성질이 뛰어난 실크 피브로인(fibroin)를 기반으로 하고 있으며, 상기 물질과 실크 프브로인(fibroin)을 혼합하여 제작하는 것도 가능하다.

본 발명에 따른 광경화성 하이드로겔 지혈제의 주요 성분으로 사용되는 실크 피브로인은 누에고치에서 세리신을 제거한 천연 단백질 고분자로서, 상기 실크 피브로인 내 아미노산 잔기 중 하나와 메타크릴레이트계 화합물을 중합반응을 통해 고분자 중합체를 제조할 수 있으며, 바람직하게는 실크 피브로인 내 아미노산기 중 라이신 잔기에 하나 이상의 메타크릴레이트계 화합물이 공중합되어 상기 실크 피브로인의 아민기에 메타크릴레이트 비닐기가 형성된 고분자 중합체를 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로겔 지혈제는, 천연 단백질 고분자인 실크 피브로인에 화합물이 중합된 중합체를 광개시제와 함께 광(예를 들어, UV)에 노출시켜 하이드로 겔을 형성하여, 지혈 및 창상 봉합, 재생 기능을 가진다.

일 예로, 상기 고분자 중합체는 도 1과 같이 메타크릴레이트계 화합물로, 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate, GMA)를 사용하여 상기 실크 피브로인과 중합 반응시켜 실크 피브로인 분자 내 아민(amine)에 메타아크릴레이트기(metacrylate group)가 중합된 고분자 중합체(이하, SGMA)일 수 있다.

상기 광개시제는 광에 노출시 상기 고분자 중합체를 공격하여 라디칼 반응을 일으킬 수 있되, 화학적으로 안정하고 인체에 독성이 없는 화합물이면 특별히 한정되지 않고 사용 가능하다.

일 예로, 본 발명의 하이드로겔 지혈제 내에 포함되는 광개시제로는, 프리 라디컬계 광개시제가 사용될 수 있는데, 보다 구체적으로는, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 세포 독성이 낮은 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP)를 사용할 수 있다.

구체적으로 광경화성 하이드로겔 지혈제에 광 조사시, 광개시제가 상기 고분자 중합체의 비닐 모노머를 공격하여 라디칼 반응이 발생되며, 이로 인하여 생성된 자유 라디칼에 의하여 중합반응을 통해 경화되어 결정화(crystallized)된 구조체를 형성할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 하이드로겔 지혈제에는 앞서 언급한 실크 피브로인과 메타크릴레이트계 화합물이 중합된 고분자 중합체 및 광개시제 외에도 사용 부위 또는 용도에 따라 세포, 성장인자, 지혈 성분, 생물학적 활성인자 등이 유효한 양으로 적절히 더 포함될 수 있다.

또한, 물리적 물성을 개선 하기 위해, 본 발명의 하이드로겔 지혈제에는 아가로즈(agarose), 피브리노겐(fibrinogen), 메타아크릴레이티드 히알루론산(HAMA), 사이올레이티드 히알루론산, 젤라틴, 젤라틴 메타아크릴레이티드(GelMA), 사이올레이티드 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 합성펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 기초의 하이드로겔, PVA(Poly vinyl alcohol), PGA(Polyglycolic acid), PLGA(poly-lactic-co-glycolic acid), PLA(Polylactic acid), PLLA(poly(L-lactic acid)), PCL(Polycaprolactone), PHB(Polyhydroxybutyrate), PHV(Polyhydroxyvalerate), PDO(Polydioxanone), PTMC(Polytrimethylenecarbonate) 등의 고분자가 더 포함될 수 있다.

상기 하이드로겔 지혈제에 관한 구체적인 성분의 함량 및 구조는 하기 바이오글루의 제조방법을 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다.

한편, 본 발명의 다른 실시 형태는 하이드로겔 지혈제의 제조방법에 관한 것으로서, 누에 고치(Bombyx mori)로부터 세리신 단백질 및 불순물을 제거한 후, 용매에 실크 피브로인(Silk Fibroin)을 용해시켜 실크 피브로인 용액을 제조하는 제1단계(도 2의 (a)); 실크 피브로인 용액에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 후, 이를 반응시켜 고분자 중합체를 제조하는 제2단계(도 2의 (b)); 제2단계를 통해 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 건조하여 분말화시키는 제3단계(도 2의 (d)및(e)); 및 물 기반 용매에 제3단계를 통해 제조된 분말과 광개시제를 혼합하는 제4단계(도 2의 (f));를 포함하여 바이오글루를 제조할 수 있다.

상기 실크 피브로인은, 천연 단백질 고분자로 체내에 거부반응 및 면역반응이 일어나지 않고, 염증반응이 적어 생체적합성이 우수하다는 장점이 있다. 상기 실크 피브로인은 누에고치(Bombyx mori)로부터 빼낸 그대로의 누에고치 생사를 정련과정을 통해 세리신과 불순물을 제거한 것으로서, 일반적으로 누에고치 생사를 정련하는 방법은 열탕으로 10시간 이상 끓이거나, 묽은 알칼리성 용액으로 처리하는 방법 등이 있으며, 누에고치 생사로부터 세리신 및 불순물을 제거하여 정련된 실크 피브로인을 수득하는 기술은 일반적으로 널리 알려진 방법이면 사용 가능하므로 이의 자세한 설명은 생략하기로 한다.

정련공정을 통해 정련된 실크 피브로인은 물, 묽은 산 또는 묽은 염기 등 묽은 수용액에서는 용해되지 않는 성질을 가지고 있어, 상기 제1단계에서 용매에 실크 피브로인을 용해시키기 위해서는 브롬화리튬 용액에 50 ~ 70 ℃ 온도로 40 ~ 80 분 동안 가열하여 용해시킬 수 있다. 이 때 제1단계에서 사용되는 용매로, 묽은 용액에는 상기 실크 피브로인이 충분히 용해되지 못하므로 바람직하게는 8.0 ~ 10.0 M의 브롬화리튬(LiBr)용액 또는 염화칼슘(CaCl₂)용액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 8.7 ~ 9.8 M의 브롬화리튬 용액을 사용할 수 있다.

상기 제1단계를 통해 제조된 실크 피브로인이 용해된 용액에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 후, 이를 교반시켜 고분자 중합체를 제조하는 제2단계는, 실크 피브로인의 아미노산 잔기에 메타크릴레이트기를 중합시켜 고분자 중합체를 제조함으로써, 이를 광에 노출시 압축강도, 인장강도 및 저장 탄성률 등의 기계적 물성이 향상된 하이드로겔로 이루어진 구조체를 성형할 수 있다.

이때, 아미노산 잔기는 실크 피브로인에 포함된 각종 아미노산의 분자 구성 중 H, OH가 이탈한 구성 단위를 의미하며, 넓은 의미로는 펩타이드나 단백질을 구성하는 각각의 아미노산을 의미한다.

구체적으로, 상기 제2단계는 실크 피브로인이 용해된 용매에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 다음, 50 ~ 70 ℃ 온도에서 2 ~ 4 시간 동안 200 ~ 400 rpm 속도로 교반하여 중합체를 제조할 수 있다.

본 발명의 하이드로겔 지혈제 내에 포함되는 고분자 중합체는, 실크 피브로인(Slik Fibtoin, SF)과 메타크릴레이트계 화합물이 공중합되어 제조된 고분자 중합체로 실크 피브로인 내 포함된 아미노산의 잔기에 하나 이상의 메타크릴레이트계 화합물이 공중합되어, 상기 아미노산의 잔기에 메타크릴레이트기가 결합된 코폴리머(co-polymer)를 형성함으로써 고분자 중합체를 제조할 수 있다.

바람직하게는 상기 실크 피브로인 내 포함된 아미노산의 잔기에 2개의 메타크릴레이트계 화합물이 중합되어 고분자 중합체를 제조할 수 있으며, 이를 광개시제와 함께 광(light)에 노출시 경화반응을 일으켜 하이드로겔을 형성할 수 있다. 이 때 사용되는 광(light)의 파장은 상기 광개시제가 라디칼 반응을 개시할 수 있는 광파장 영역을 조사시켜 바이오글루의 겔화, 경화반응을 개시할 수 있다.

일 예로, 상기 고분자 공중합체는 실크 피브로인(SF)와 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate, GMA)를 중합시켜, 실크 피브로인 분자 내 아민(amine), 바람직하게는 상기 글리시딜 메타크릴레이트의 에폭시 고리가 끓어지면서 실크 피브로인 분자 내 라이신기의 아민에 메타아크릴레이트기(metacrylate group)가 중합된 고분자 중합체(이하, Silk-GMAS)를 제조할 수 있다. 구체적으로 실크 피브로인(SF)의 α나선 또는 β시트의 라이신기의 아민(-NH₂)에 상기 메타아크릴레이트기의 에폭시 고리가 끊어지면서 친핵성 반응을 통해 상기 아민에 메타크릴레이트기가 중합된 고분자 중합체인 Silk-GMAS를 제조할 수 있다.

따라서, 바람직한 고분자 중합체를 제조하기 위해서는 상기 제2단계에서 혼합되는 실크 피브로인과 메타크릴레이트계 화합물의 혼합비율이 가장 중요하다.

상기 제1단계에서 용매에 실크 피브로인을 0.05 ~ 0.35 g/ml 농도로 용해시킨 용액에 141 ~ 705 mM 농도로 메타크릴레이트계 화합물을 투입하여 제2단계를 진행하는 것이 바람직하며, 상기 실크 피브로인과 메타크릴레이트계 화합물의 비율이 상기 범위를 벗어나게 되는 경우 미반응된 실크 피브로인 또는 메타크릴레이트계 화합물이 잔존량이 증가로 경제성이 저하되거나, 제조된 하이드로겔 지혈제의 기계적 강도가 저하될 수 있다.

상기 제2단계를 통해 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액 내 포함된 이온 성분 즉, 제1단계에서 사용된 용매 내 포함된 이온인 불순물을 제거하기 위하여 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 투석 튜브에 넣고, 물에 침지시키는 투석단계(도 2의 (c))를 더 포함하는 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게는 상기 투석단계 전에 고분자 중합체가 포함된 용액을 필터를 사용하여 여과한 다음, 용액 내 포함된 이온성분을 제거하기 위한 투석단계를 수행할 수 있다.

상기 투석단계는 이온성분은 통과하되 고분자 중합체는 통과하지 못하는 크기의 투석튜브를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 12 ~ 14 kDa cutoff 투석튜브에 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 투입한 후 물에 3 ~ 7일간 침지시키는 것이 바람직하다. 상기 투석시간이 3일 미만일 경우 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액 내 포함된 이온 성분의 제거가 충분하지 못하여 생체 적합성이 저하되거나 프린팅으로 제조된 구조체의 기계적 강도가 저하되는 문제가 발생될 수 있고, 투석시간이 7일을 초과하게 되는 경우 시간 초과에 따른 이익이 없어 경제성이 저하될 수 있다.

상기 투석단계를 통과한 고분자 중합체가 포함된 용액을 건조하여 분말화시키는 제3단계는, 액체상태의 바이오글루의 유통 및 저장성을 향상시키고 바이오글루의 화학적 안정성 및 사용의 편리성을 부여하기 위하여 상기 고분자 중합체가 포함된 용액을 동결건조하여 분말화시키는 것이 바람직하다.

구체적으로 상기 제3 단계는, 투석이 충분히 진행되어 이온성분이 제거된 고분자 중합체가 포함된 용액을 먼저 -90 ~ -70 ℃ 온도로 10 ~ 14시간에 걸쳐 완전히 동결시킨 다음, 40 ~ 60 시간 동안 동결온도와 동일 온도하에서 동결건조하는 것이 바람직하다. 상기 동결건조된 고분자 중합체가 포함된 용액은 파쇄, 분쇄 등의 가공을 거쳐 적절한 크기의 입도를 가지도록 분말화시키는 것이 바람직하다.

상기 제3단계를 거쳐 제조된 고분자 중합체가 포함된 분말은, 용매 및 물 기반의 용매에 광개시제와 함께 혼합하는 제4단계를 통해 본 발명의 하이드로겔 지혈제를 제조할 수 있다.

바람직하게는 상기 제4단계는 용매, 특히 물 기반 용매에 상기 제3단계를 통해 제조된 분말 5 ~ 30 wt%과 및 광개시제 0.1 ~ 0.3 wt%를 혼합하는 것이 바람직하며, 이때 용매, 분말 및 광개시제의 합이 100 wt%를 넘지 않도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 제4단계는, 물, 분말 및 광개시제 이외에도 젤라틴, 콜라겐, Polyvinyl Alcohol(PVA), 알진네이트, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 키토산, PEO(polyethylene oxide), PEG(polyethylene glycol) 등의 고분자 또는 메타크릴레이크계 화합물을 더 첨가하여 혼합할 수 있다. 구체적으로, 물 기반 용매에 상기 제3단계를 통해 제조된 분말과 상기 고분자 또는 메타크릴레이크계 화합물을 혼합한 후 광개시제를 혼합할 수 있다.

상기 광개시제에 관한 구체적인 설명은 앞서 언급하였으므로 여기서는 생략하기로 한다.

이와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 하이드로겔 지혈제는 일 예로, 상기 광 개시제가 광중합 반응을 개시할 수 있는 파장의 광에 노출시켜 젤화 또는 경화되어 하이드로겔을 형성할 수 있다.

이와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 하이드로겔 지혈제는 광(자외선, UV)에 노출시키면 제조된 실크 피브로인의 메타크릴기의 이중결합 부분의 사슬 내부의 결합, 그 사이의 공유 결합이 유발될 뿐만 아니라, 고분자 중합체의 긴 사슬 간의 물리적 얽힘 등을 통해 빠른 시간내에 겔화 또는 경화되어 창상 부위에 점착 및 접착 능력을 가진 하이드로겔을 형성할 수 있다. 이로 인해 급속 지혈 필요한 부위 에 사용이 가능하다.

또한 경화된 하이드로겔은 물리적 우수한 물성으로 봉합이 요구되는 부위에도 사용될 수 있다. 그리고 함유된 실크 피브로인 및 혼합된 화합물의 생물학적 안전성 및 활성도로 인해 창상 재생 능력을 갖는다. 이러한 기능 강화를 위해 다양한 생물학적 활성인자 및 화합물, 세포를 함유 할 수 도 있다.

창상 재생을 위한 생물학적 활성인자로 피부를 재생 또는 손상된 피부를 치료하기 위하여 생체 내에서 발현하는 단백질이 사용될 수 있다. 예를 들면, PDGF-BB (platelet derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), aFGF (acidic fibroblast growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), IGF-I (insulin-like growth factor-I) 및 TGF-ß1 (transforming growth factor-beta-1) 등이 포함되나, 이에 제한되지 아니한다.

또한, 지혈 특성 향상을 위한 생물학적 활성인자로서, 트롬빈 또는 트롬빈 함유 혈장 분획물, 재수화 동결건조(RL) 혈소판, RL 혈액 세포, 피브린, 피브리노겐 및 이들의 배합물이 포함된다. 바람직한 한 양태에서, 트롬빈은 추가의 지혈 작용을 부여하기 위하여 직물에 혼입된다. 트롬빈은 어떠한 공급원으로부터도 얻을 수 있으며(자연 분리, 재조합 등), 트롬빈과, 인자 XⅡ, 인자 XⅡa, 인자 XⅠ, 인자 XⅠa, 인자 XⅢ, 인자 XⅢa, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅸa, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅷa, 인자 vWF, 인자 Ⅴ, 인자 Ⅴa, 인자 Ⅹ, 인자 Ⅹa 및 이들의 배합물과 같은 추가의 응고 인자, 또는 렙틸라제(reptilase)와 같은 동물 독액 성분과 같은 응고 보조인자, 또는 엔도텔린, 트롬복산, 산화질소(NO) 스캐빈저 또는 이들의 배합물과 같은 혈관작용제를 함유하는 혈장 분획물 또는 혈청의 형태일 수 있다. 이러한 추가의 생물학적 활성인자들은 신체의 자연적 지혈 연쇄 반응의 활성화를 돕고, 출혈을 신속하게 억지할 수 있는 재료를 제공한다.

이하에서는, 본 발명의 실시 예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시 예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.

[제조예 1]

대한민국 농촌 진흥청에서 입수된 누에고치(B. mori)를 4조각으로 자른 후, 자른 누에고치 40 g을 0.05 M 탄산나트륨 수용액 1L에 침지시켜 100 ℃ 온도로 30 분간 가열한 뒤 이를 증류수로 수회 세정한 다음, 이를 실온에서 건조시켜 세리신이 제거된 누에 고치 즉, 실크 피브로인 31.1 g(약 80 % 수득률)을 수득하였다.

수득된 실크 피브로인 20 g을 9.3 M 브롬화리튬 수용액 100 ml에 투입시킨 후 이를 60 ℃ 온도로 1시간 동안 가열하여 실크 피브로인을 브롬화리튬 수용액에 완전히 용해시켰다(도 2의 (a)).

실크 피브로인이 용해된 브롬화리튬 수용액에 GMA(Glycidyl methacrylate)가 424 mM 농도로 포함될 수 있도록 상기 실크 피브로인이 용해된 브롬화리튬 수용액에 GMA 용액(Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA)을 각각 6 ml씩 투입한 뒤, 상기 실크 피브로인과 GMA가 충분히 중합 반응할 수 있도록 60 ℃ 온도에서 300 rpm 속도로 3시간 동안 교반시켰다(도 2의 (b)).

미라클로스(miracloth)(Calbiochem, SanDiego, CA) 필터를 사용하여 여과한 다음, 13 kDa cut-off 투석 튜브에 실크 피브로인과 GMA이 중합 반응된 SGMA가 포함된 용액을 담은 후 증류수에 상기 투석튜브가 완전히 침지될 정도로 4일동안 방치하여 용액 내 포함된 이온, 불순물을 투석하여 제거하였다(도 2의 (c)).

투석이 끝난 용액은 평균 -80 ℃ 온도로 12시간 동안 동결한 다음, 48 시간동안 동결건조한 후(도 2의 (d)), 이를 분말화시켜 Silk-GMAS 분말을 제조하였다(도 2의 (e)).

[실시예]

물 10 mL에 상기 제조예 1에서 제조된 Silk-GMAS 분말과 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 분말(이하, LAP분말; Tokyo chemical industry, Tokyo, Japan) 0.3%를 투입한 후, 상기 SGMA 분말과 LAP 분말을 완전히 용해시켜 하이드로겔 지혈제(C-Silk-GMAS)를 제조하였다.

이렇게 제조된 25wt% C-Silk-GMAS 지혈제의 물성 측정 결과는 다음의 표와 같다.

Mechanical Properties	25% C-Silk-GMAS
전단 점성률(shear viscosity)	952 mPa s
압축 응력(compressive stress at break)	636 kPa
압축 변형(compressive strain at break)	72.6 %
압축 탄성 계수(compressive elastic modulus @5% strain)	100 kPa
인장 응력(tensile strss at break)	32.9 kPa
인장률(elongation at break)	197 %
탄성률(tensile elastic modulus @5% strain))	14 kPa
팽윤도(sewlling ratio @ 5 hrs in DW)	149.2 %
팽윤도(sewlling ratio @ 5 hrs in PBS)	116.2 %

[실험예 1] SGMA의 조직접착효과

본 발명의 하이드로겔 지혈제의 조직과 접합 성능을 생체외에서 확인하기 위하여 다양한 ASTM 표준 테스트를 수행하였다. 중첩 전단 강도 (lap shear strength), 필시험 (peel test), 창상 폐쇄 시험 (wound closure test) 등의 테스트를 앞서 제조된 실시예(25wt% C-Silk-GMAS) 및 상용화제품 Medifoam L을 비교예로 하여 수행하였으며, 그 결과를 도 3 내지 5로 정리하였다.

바이오글루의 전단력은 ASTM F2255-01 스탠다드에 기반한 중첩 전단 강도 (lap shear strength)로 확인하였다. 실시예와 Medifoam L(liquid)를 이용하여 2개의 슬라이드 글라스를 접착시킨 후 3kg 로드셀이 장착된 universal testing 장치(QM100S, QMESYS, 대한민국)를 사용하여 실온에서 5mm/min의 신장 속도로 인장응력(Tensile stress)을 측정하였다. 측정 결과는 도 3에 제시된 바와 같이 실시예가 비교예에 비해 높은 전단력을 보여주었다.

90º 필시험(peel test)을 위하여 실시예와 비교예 각각을 2개의 지그를 접착시킨 후 3kg 로드셀이 장착된 universal testing 장치(QM100S, QMESYS, 대한민국)를 사용하여 실온에서 5mm/min의 신장 속도로 인장응력(Tensile stress)을 측정하였다. 실시예가 서로 부착하여 견딜 수 있는 평균 하중이 비교예에 비해 현저하게 상승하는 것으로 평가되었다(도 4 참조).

[실험예 2]

창상폐쇄실험 (wound closure test)를 위하여 실시예와 Medifoam liquid, 3M Tape를 이용하여 슬라이드 글라스 사이에 결합된 쥐의 피부 사이를 절단시킨 후 접착시키고, 3kg 로드셀이 장착된 universal testing 장치(QM100S, QMESYS, 대한민국)를 사용하여 실온에서 5mm/min의 신장 속도로 인장응력(Tensile stress)을 측정하였다.

도 5에서 확인되듯이, 비교예인 Medifoam L과 비교했을 때 실시예의 최대 인장응력이 높게 나타났는데, 이는 실시예가 비교예에 비해 높은 탄성력을 갖고 있음을 의미한다.

[실험예 3]

UV 조사 후 미경화 물질에 대한 세포적합성 및 in vivo 내에서 염증 반응을 확인하기 위하여, 미경화 물질에 대한 용출물에 따른 세포 독성(생존) 실험 및 완전히 경화된 실시예에서 제조된 하이드로겔 지혈제의 in vivo 염증 테스트를 진행하였다.

세포 독성(생존)에 사용된 세포는 NIH/3T3 cell을 사용하였으며, 이는 ATCC(Manassas, Virginia)에서 구입하였다. 세포는 DMEM((dulbecco's modified Eagle medium) 배지에서 10 v/v% FBS(fetal bovine serum), 1 v/v% 페니실린 스트렙토마이신 첨가한 배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2(5% CO2) 에서 배양하였고, 배지는 3일마다 교환하였다.

미경화 물질에 대한 용출물은 365nm(3.5 ㎽/cm²)의 UV 라이트를 이용하여 각각 10,20,30초 경화 시킨 하이드로겔 지혈제(C-Silk-GMAS) 1g 기준 DMEM(dulbecco's modified Eagle medium) 배지 10mL에 48시간 동안 침지 시킨 후 배지를 수집하였다.

배양된 각각의 세포 (1 x 10⁷cell/mL)을 48 well plate에 seeding한 후 각각의 용출물을 처리하고 3일간 세포 생존률을 관찰 하였다.

세포 증식실험은 CCK-8 분석(Dojindo molecular technologt, Rockville,USA)을 통해 진행하였으며 그 결과는 도 6a와 같으며, 이는 세포 증식 비율을 나타낸 그래프로, 모든 그룹에서 3일에 걸쳐 서서히 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다.

In vivo 내에서 염증 테스트는 DLP(Digital light processing) 프로젝터(365 ㎚, 3.5 ㎽/cm2)를 통해 5mm x 5mm x 2mm 의 육면체를 상기 프로젝터로 조각을 투영하여 3D 형태의 구조체(시편)를 제조한 후, 이를 SD Rat(8주령) 피하에 이식하여 16주에 걸쳐 형광 염색을 통해 관찰을 진행하였다.

또한, 분석 결과를 통해서 모든 그룹에서 세포수가 시간에 따라 증가함을 관찰 할 수 있었고, 염증 테스트 결과 CD68(마크로파지)가 시간이 지남에 따라 발현 정도가 줄어드는 것으로 미루어 미경화 재료가 세포독성과 염증반응이 없음을 확인 할 수 있었다.

[실험예 4]

상기 실시예에서 제조된 하이드로겔 지혈제(C-Silk-GMAS)의 지혈효과를 확인하기 위하여 동물 두께 0.2cm, 너비 2cm 크기의 피부 손상 모델을 만들었다. 실시예를 처리하여 UV경화를 시키고 난 후에 거즈로 표면을 지압했을 때 피가 묻어나지 않음을 확인하였다(도 7a).

또한, 출혈중에서 실시예(하이드로겔 지혈제)의 실란트 성능 유무를 in vivo 상에서 평가한 결과를 나타내었다. 실험 동물로는 쥐를 사용하였으며, 편측 서혜부를 절개하여 대퇴 동맥과 대퇴 정맥을 노출시켰다. 이후 수술용 매스를 이용하여 노출된 혈관을 절단하는 시술을 시행하였다. 출혈을 확인한 후 가벼운 지혈즉시 300 uL 의 실시예(SGMA 바이오글루)를 대동맥의 문합점에 적용하고 UV 조사를 약 10초간 시행하였다. 10초 후 지혈 및 손상 영역이 봉합 되었음을 확인하였다(도 7b).

[실험예 5]

쥐의 간 절개 모델에서 실시예에 따른 하이드로겔 지혈제가 실란트로서의 기능을 수행할 수 있는지 여부를 확인하였다.

이 실험을 위하여 쥐의 간 좌엽 또는 우엽에 5 mm 지름의 펀치를 이용하여 손상을 내고 출혈을 유발하였다. 가벼운 지혈 즉시 300 uL의 실시예(SGMA 바이오글루)를 처리하고 UV 조사를 10초간 진행하였다. 비교예로서 피브린 글루와 트롬빈 혼합액을 같은 양 처리하였다. 도 8a에서와 같이 10초 후 지혈 및 손상 영역이 봉합 되었음을 확인하였다.

재료와 간 조직사이에 상호작용을 보기 위하여 1, 2, 4주째 쥐를 희생시켜 실시예(하이드로겔 지혈제)의 상태를 확인하였다. 도 8b에서 확인되듯이 fibrin glue의 경우 4주째에 형태를 찾아볼 수 없지만 하이드로겔 지혈제의 경우 8주까지 상처부위에 형태를 유지하며 지혈 기능을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명에 따른 C-Silk-GMAS 중합체 기반의 광경화성 하이드로겔 지혈제는 우수한 유변학적/기계적 물성을 가지고 있으며, 지혈은 물론 창상치유효과, 피부 봉합, 장기 봉합, 혈관 봉합능력을 가지고 있으며 생체적합성이 뛰어나 다기능성 지혈제로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예 및 실험예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

실크 피브로인(Silk Fibroin)과 메타크릴레이트(Methacrylate)계 화합물이 중합된 고분자 중합체; 및 광개시제;를 포함하는, 하이드로겔 지혈제.
제1항에 있어서,
상기 고분자 중합체는,
실크 피브로인의 아미노산 잔기에 하나 이상의 메타크릴레이트계 화합물이 공중합되어 형성된 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제.
제1항에 있어서,
상기 하이드로겔 지혈제는,
젤라틴, 콜라겐, Polyvinyl Alcohol(PVA), 알진네이트, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 키토산, PEO(polyethylene oxide) 및 PEG(polyethylene glycol)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 고분자; 메타크릴레이크계 화합물; 생물학적 활성인자; 및 세포;를 더 포함하는, 하이드로겔 지혈제.
제1항에 있어서,
상기 광개시제는,
리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제.
누에 고치(Bombyx mori)로부터 세리신 단백질 및 불순물을 제거한 후, 용매에 실크 피브로인(Silk Fibroin)을 용해시켜 실크 피브로인 용액을 제조하는 제1단계;
실크 피브로인 용액에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 후, 이를 반응시켜 고분자 중합체를 제조하는 제2단계;
제2단계를 통해 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 건조하여 분말화시키는 제3단계; 및
물 기반 용매에 제3단계를 통해 제조된 분말과 광개시제를 혼합하는 제4단계;를 포함하는 하이드로겔 지혈제의 제조방법
제5항에 있어서,
상기 제1단계는,
브롬화리튬(LiBr)용액 또는 염화칼슘(CaCl₂)용액에 실크 피브로인을 0.05 ~ 0.35 g/ml 농도로 용해시킨 후, 40 ~ 80 분간 50 ~ 70 ℃ 온도로 가열하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 제2단계는,
실크 피브로인이 용해된 용액에 141 ~ 705 mM 농도로 메타크릴레이트계 화합물을 투입하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 제2단계 후에,
제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 투석 튜브에 넣고, 물에 침지시켜 불순물을 제거하는 투석단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 투석단계는,
제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 12 ~ 14 kDa cutoff 투석튜브에 넣은 후,
물에 3 ~ 7일간 침지시켜 불순물을 제거하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 제2단계는
실크 피브로인이 용해된 용액에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 후,
50 ~ 70 ℃온도에서 2 ~ 4 시간 동안 200 ~ 400 rpm 회전속도로 교반하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 제4단계는,
젤라틴, 콜라겐, Polyvinyl Alcohol(PVA), 알진네이트, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA), 키토산, PEO(polyethylene oxide), PEG(polyethylene glycol) 또는 메타크릴레이크계 화합물을 추가로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 제4단계는,
물 기반 용매에 제3단계를 통해 제조된 분말 5 ~ 30 wt% 및 광개시제 0.1 ~ 0.3 wt%를 혼합하되,
상기 용매, 분말 및 광개시제의 합이 100 wt%를 넘지 않는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 광개시제는,
리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 제3단계는,
상기 고분자 중합체가 포함된 용액을 -90 ~ -70 ℃ 온도로 10 ~ 14시간 동안 동결한 다음,
동결온도와 동일 온도하에서 40 ~ 60 시간 동안 동결건조하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 지혈제의 제조방법.