CN115807077A - Ets1在制备诊断或治疗纤毛疾病产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及ETS1在制备诊断或治疗纤毛疾病产品中的应用。本申请提供了检测ETS1表达的试剂在制备诊断纤毛疾病的产品中的应用，并提供抑制ETS1表达的抑制剂在制备治疗纤毛疾病的药物中的应用。本申请发现，在正常人中维持一定ETS1的正常表达是至关重要的，异常表达(过高/无表达)会引起纤毛的发育异常，因此将ETS1作为治疗靶点，应在纤毛病人中有效敲低并维持部分ETS1的表达对治疗纤毛疾病是重要的。

Description

ETS1在制备诊断或治疗纤毛疾病产品中的应用

技术领域

本申请属于生物医药领域，具体涉及ETS1在制备诊断或治疗纤毛疾病产品中的应用。

背景技术

纤毛疾病是一种由纤毛缺陷引起的相关疾病，如短肋-多指(趾)综合征(Shortrib-polydactyly syndrome，SRP)，具有骨骼发育不良(多指/趾、短肋和牙齿发育异常等)、胼胝体发育不全和心脑血管功能异常等累及多个器官发育的临床症状。虽然纤毛疾病被普遍认为一种罕见病，但其在人群中的发病率与熟知的唐氏综合症类似，达到了1：10000。

迄今为止，已有数百个纤毛基因被证实与纤毛疾病的发生密切相关，基于全基因组测序(WGS,Whole Genome Sequencing)的高通量测序手段已经阐明了单基因在纤毛疾病调控中的重要作用，但单基因研究不足以解释所有纤毛疾病中关键事件中发生，目前的研究也缺少对基因组范围内整体调控纤毛疾病的基因网络信息。大量研究指出，染色质可及性作为表观遗传调控的重要内容，可通过招募关键转录因子实现对下游基因网络的精准调控，进而影响疾病发展进程。因此，从转录因子层面研究纤毛基因的调控并阐明其对纤毛疾病发生的影响是十分重要的。

目前的单基因调控纤毛疾病调控多由全基因组测序(WGS,Whole GenomeSequencing)获得，但该技术往往忽略了表观遗传学在疾病调控中的作用，尤其是转录因子的作用研究，存在筛选范围有限的问题，因此有必要从表观遗传学角度挖掘并筛选可以调控纤毛疾病的转录因子，探究可被应用于纤毛疾病特别是短肋-多指(趾)综合征研究的新靶点。

发明内容

基于此，本申请提供一种用于具有多指(趾)，伴随不同程度的短肋、胼胝体发育不全和先天性心脏病的共同表征的纤毛疾病如短肋-多指(趾)综合征的治疗或诊断的新靶点ETS1，并将其用于制备诊断或治疗具有上述表征的纤毛疾病的产品。

具体技术方案如下：

本申请的第一方面，提供了检测ETS1表达的试剂在制备诊断纤毛疾病的产品中的应用。

在其中一个实施例中，所述纤毛疾病为短肋-多指(趾)综合征。

在其中一个实施例中，所述试剂包括：特异性识别ETS1基因的探针；或特异性扩增ETS1基因的引物；或特异性识别ETS1蛋白的抗体。

本申请的第二方面，提供了一种抑制ETS1表达的抑制剂，所述抑制剂能抑制ETS1基因或蛋白水平，或降低ETS1的活性。

可选地，所述抑制剂包括shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA和反义核酸中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述抑制剂为小干扰RNA和/或反义核苷酸。

在其中一个实施例中，所述小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；所述反义核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本申请的第三方面，提供了所述的抑制剂在制备治疗纤毛疾病的药物中应用。

本申请的第四方面，提供了一种构建纤毛疾病的动物模型的方法，所述方法包括敲低或过表达受试动物的ETS1的表达。

在其中一个实施例中，所述动物为斑马鱼。

本申请的第五方面，提供了一种构建纤毛发育异常的细胞模型的方法，所述方法包括敲低或过表达正常细胞的ETS1的表达。

相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：

本申请通过研究正常对照与短肋-多指(趾)综合征病人ETS1的表达水平，发现在短肋-多指(趾)综合征病中是显著上调。并通过在发育正常的细胞/个体中敲低ETS1，发现在正常细胞中如果完全丧失ETS1会导致纤毛异常，并在个体动物中出现短鳍现象，并出现明显的心包水肿及背部血流信号异常，符合纤毛疾病短肋-多指(趾)综合征的典型特征，随后进行了回补ETS1，发现异常有所缓解，进一步，在发育正常的细胞/个体中过表达ETS1，同样出现异常现象。通过上述实验发现，在正常人中维持一定ETS1的正常表达是至关重要的，异常表达(过高/无表达)会引起纤毛的发育异常，因此将ETS1作为治疗靶点，应在短肋-多指(趾)综合征病人中有效敲低并维持部分ETS1的表达对治疗纤毛疾病是重要的。

附图说明

图1(A)纤毛病人的牙齿、手指CT、心脏彩超、头颅CT和胸腔CT结果；(B)RNA-Seq基因表达谱散点图显示了正常对照组与纤毛病人基因表达的变化；(C)差异表达基因GO分析显示纤毛疾病中上调的基因参与了纤毛免疫反应和代谢过程；

图2(A)ATAC-Seq信号热图显示了正常对照组与纤毛病人染色质可及性的变化；(B)IGV图显示了纤毛疾病激活相关的染色质开放区域(CAAs)和纤毛疾病抑制相关的染色质开放区域(CIAs)在4号染色体和2号染色体上的信号分布，箭头标记了不同的开放区域；(C)CAAs邻近基因GO富集分析，结果显示CAAs附近的基因与器官形态发育等相关纤毛疾病途径密切相关；(D)基因表达散点图显示了CAAs区域差异表达图，发现CAAs附近存在大量表达上调的纤毛基因，包括CEP131、CEP41和CDC20等；

图3(A)CAAs模体(motif)分析，揭示了排名靠前的motif与ETS、BHLH、ZF和STAT家族的共识结合位点非常相似，发现ETS转录因子家族可以显著性富集在CAAs，其中转录因子ETS1的表达显著上调；(B)RNA-seq信号热图显示ETS家族转录因子的基因表达情况；(C)RNA-qPCR及免疫印迹图显示ETS1的基因和蛋白表达情况；

图4(A)免疫荧光图显示正常组(siCtrl)和ETS1敲低组(siETS1#1和siETS1#2)以及ETS1敲低后回补组(siETS1#1+Flag-ResETS1和siETS1#2+Flag-ResETS1)的纤毛荧光染色情况，ETS1敲低后，纤毛明显出现异常，而回补ETS1表达后，纤毛异常情况得到缓解；(B)免疫荧光图显示正常组(Flag)和ETS1过表达组(Flag-ResETS1#1和Flag-ResETS1#2)纤毛荧光染色情况，结果显示，在细胞中过表达ETS1后，纤毛发育出现异常；

图5(A)背侧视图显示正常组(Ctrl MO)和ETS1敲低组(ets1 MO)以及ETS1敲低后回补组(ets1 MO+mRNA)的胸鳍结构图，结果显示，ETS1敲低后，幼鱼的胸鳍出现了显著缩短的情况，而回补ETS1表达后，胸鳍发育异常情况得到缓解；ED：幼鱼胸鳍内骨骼盘，FM：幼鱼胸鳍内远端鳍膜，AR：分隔ED的胸鳍动脉；(B)正常组和ETS1过表达幼鱼的心脏侧视图及血流动力学图，结果显示，ETS1敲低后的幼鱼心脏表现出明显的心包水肿，背部血管狭窄的特征，而回补ETS1表达后，心脏及背部血管异常情况得到缓解；(C)正常组和ETS1过表达幼鱼的心脏侧视图及血流动力学图，结果显示，ETS1过表达的幼鱼心脏出现心包水肿及背部血管狭窄的特征。

具体实施方式

为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

术语解释

术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语“多种”的含义是至少两种，例如两种，三种等，除非另有明确具体的限定。

术语简称“ETS1”英文全称为ETS proto-oncogene 1，ETS原癌基因1。

术语简称“WGS”英文全称Whole Genome Sequencing，基于全基因组测序。

术语简称“RNA”英文全称Ribonucleic Acid，核糖核酸。

术语简称“CEP131”英文全称centrosomal protein 131，中心体蛋白131。

术语“CEP41”指centrosomal protein 141，中心体蛋白141。

术语“CDC20”指cell division cycle 20，细胞分裂周期20。

术语简称“NEK8”英文全称NIMA related kinase 8，NIMA相关的激酶8。

术语“Peak”指峰值、富集区。

术语“peak calling”指寻找富集区，是指使用统计学的方法计算出参考基因上比对上的测序序列显著富集的区域。

术语“Motif”指模体。

术语“Reads”指测序序列。

术语“Trimmomatic”指测序数据质控。

术语“TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for illumine”指转座酶文库构建试剂盒。

术语简称“ATAC-Seq”英文全称Assay for Transposase Accessible Chromatinwith high-throughput sequencing，指利用转座酶研究染色质可进入性的高通量测序技术。

术语“Adaptor”指接头、适配器。

术语“clusterProfiler”指富集分析。

术语简称“DWM”英文全称Dinucleotide Weight Matrix，二核苷酸权重矩阵。

术语“TRIzol”为试剂名称，RNA抽提试剂。

术语“DAPI”为4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚。

术语“morpholino”指反义寡核苷酸。

术语“dpf”英文全称Day post fertilization，受精后的天数。

术语“bpm”英文全称beat per minute，每分钟跳动次数。

术语“RNA-Seq”指RNA-sequencing，转录组测序。

本申请一实施方式提供了检测ETS1表达的试剂在制备诊断纤毛疾病的产品中的应用，该纤毛疾病以多指为表征，伴随不同程度牙齿骨骼异常、短肋等明显骨骼发育缺陷，以及胼胝体发育不全和先天性心脏病症状。

在一个具体示例中，纤毛疾病为短肋-多指(趾)综合征。与正常对照组相比，ETS1在短肋-多指(趾)综合征患者中表达显著上调。

在一个具体示例中，所述的试剂包括：特异性识别ETS1基因的探针；或特异性扩增ETS1基因的引物；或特异性识别ETS1蛋白的抗体。其中，引物和探针可通过本领域常规技术设计并合成。

本申请一实施方式还提供了一种抑制ETS1表达的抑制剂，该抑制剂能抑制ETS1基因或蛋白水平，或降低ETS1的活性。

在一个具体示例中，抑制剂包括shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA和反义核酸中的一种或多种，或抑制剂包括shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

在一个具体示例中，抑制剂为小干扰RNA和/或反义核苷酸，或小干扰RNA或反义核苷酸的构建物。

在一个具体示例中，小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；反义核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本申请还提供上述抑制剂在制备治疗纤毛疾病的药物中应用。

本申请将ETS1作为治疗靶点，应在纤毛病人中有效敲低并维持部分ETS1的表达对治疗纤毛疾病是重要的。

在一个具体示例中，纤毛疾病为短肋-多指(趾)综合征。

本申请一实施方式还提供了一种促进ETS1表达的促进剂，该促进剂能促进ETS1基因或蛋白水平，或促进ETS1的活性。

在一个具体示例中，促进剂包括含有ETS1基因的表达载体。促进剂可用于调控细胞中ETS1表达水平。

本申请一实施方式还提供了一种构建纤毛疾病的动物模型的方法，该方法包括敲低或过表达受试动物的ETS1的表达。

在一个具体示例中，纤毛疾病为短肋-多指(趾)综合征。

可选地，所述动物为斑马鱼。

具体地，通过敲低斑马鱼胚胎细胞或斑马鱼幼鱼中ETS1的表达构建短肋-多指(趾)综合征的动物模型。

本申请将ETS1在斑马鱼胚胎中敲低或过表达后，幼鱼的胸鳍出现了显著缩短的情况。鱼类的胸鳍印证了人类指/趾的发育情况，此外，斑马鱼的幼鱼出现了明显的心包水肿及背部血流信号异常的情况，符合短肋-多指(趾)综合征的主要症状。

本申请一实施方式还提供了一种构建纤毛发育异常的细胞模型的方法，该方法包括敲低或过表达正常细胞的ETS1的表达。

本申请通过抑制剂敲低或过表达正常细胞中ETS1表达，纤毛发育出现了异常，部分纤毛出现了弯曲、鼓包，长度缩短/延长等表现。

在一个具体示例中，所述正常细胞为hTERT RPE-1。

本申请将上述的构建纤毛发育异常的细胞模型的方法在制备构建纤毛疾病模型中的应用。

在一个具体示例中，纤毛疾病包括短肋-多指(趾)综合征。

具体实施例

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

本申请实施例中涉及的实验方法包括如下：

1.分离PBMCs

从纤毛疾病病人和正常对照者身上抽取5mL静脉血,在离心管中加入等体积的淋巴细胞分离液后，2,000rpm离心20min。用吸管吸取中间白色液相层后，加入两倍体积的1×PBS，1，000rpm离心5min后得到分离后的PBMCs。

2.转录组测序及数据分析

按照说明书的步骤，使用TRIzol试剂提取纤毛疾病病人和正常对照者PBMCs细胞的总RNA。利用安捷伦2100生物分析仪上检测RNA的完整性后送测序公司测序。测序平台为Illumina Hiseq-PE150，测序深度为1.5×10⁷reads。在获得原始数据后，利用FastQC进行质量控制后，对数据进行trimmomatic原始数据过滤，并使用BWA软件参考人类基因组hg38进行数据比对。为了量化基因表达，用HTseq-count对每个基因进行测序读数，并使用edgeR对计数进行标准化，并根据log₂FC大于1、p值小于0.05作为差异基因筛选的标准。

3.染色质开放性测序及数据分析

分别取5×10⁴个纤毛疾病病人和正常对照者新鲜的PBMCs细胞，用细胞裂解液在冰上裂解10分钟，1,000rpm离心收集细胞核。接下来利用TruePrep DNA Library Prep KitV2 for illumine(Vazyme,TD501)试剂盒，进行染色质开放性测序上游实验，具体为：在细胞核中加入Tn5转座酶及其反应缓冲液，37℃水浴30min。接下来，利用AMPure XP磁珠富集酶切后的片段，并根据试剂盒要求进行PCR实验扩增。扩增13个循环后获得纯化前的DNA文库。接下来利用AMPure XP磁珠对PCR产物进行片段筛选，并在安捷伦2100生物分析仪上检测片段分布情况，达标后送至测序公司测序。在数据下机后，对ATAC-Seq数据进行生物信息学分析：利用FastQC进行质量控制，并利用Trimmomatic去除adaptor序列获得过滤后的数据。接着使用BWA软件参考人类基因组hg38进行数据比对后，用MASCS2数据进行peakcalling，并根据log₂FC大于1、p值小于0.05作为差异基因的筛选原则，将peaks进行差异分类，从而定义CAAs和CIAs。接下来，采用R包clusterProfiler计算GO分类中基因富集的显著性水平，筛选出CAAs邻近基因显著富集的GO分类情况。在模体分析上，从CAAs Peak中按照p值大小选取前十的Motif，使用HOMER的findMotifsGenome.pl工具找到这些模体在Peak上的位置，分析这些Motif对应的转录因子的结合位点。对于转录因子足迹分析，首先比对基因组上的读段以反映出Tn5的切割位置，估计Tn5切割位点的偏差分布，用实验数据生成的读段分布减去偏差进行矫正，这里主要采用二核苷酸权重矩阵(Dinucleotide WeightMatrix，DWM)偏差分布，得到矫正后的读段覆盖度以反映每个位置足迹存在的可能性。

4.蛋白质免疫印迹

按照说明书的步骤，使用TRIzol试剂提取纤毛疾病病人和正常对照者PBMCs细胞的总蛋白样品。按照一定比例加入无菌去离子水、30％(丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺)、10％SDS、10％过硫酸铵、Tris-HCl和TEMED，按顺序制备浓缩胶和不同浓度的分离胶。取适量样品(10-100μg)，并根据比例加入5×SDS上样缓冲液，99℃水浴5min，充分离心后取上清上样。将已处理好的样品上样，接通电源，浓缩胶电泳时的电压为80V，分离胶电泳时的电压为120V。电泳结束后取出胶，放置在由两张同样大小的滤纸及一张同样大小的硝酸纤维素膜的夹层中，并在转膜缓冲液中静置5-10min。之后利用半干转膜仪进行转膜操作，条件是恒压18V，转膜时间根据蛋白大小进行调整，一般在2h左右。转膜后的硝酸纤维素膜用丽春红预染2min以观察转膜效果，双蒸水冲洗数次后剪下目的条带，放入5％脱脂奶粉(0.1％PBST配制)的封闭液中，室温封闭1h。加入特异一抗，4℃孵育过夜，用PBST洗膜3次，每次10min；加入相应来源的荧光二抗，避光室温孵育1.5h，用PBST洗膜3×10min；洗过二抗之后用Odessy扫膜仪在不同曝光强度条件下扫膜，即可显示出目的蛋白条带。

5.细胞敲低与过表达

在敲低实验中，hTERT RPE-1细胞汇集度达到40％左右，利用Lipofectamine3000将稀释后的siRNA转染进细胞中，siRNA与转染试剂的混合流程如下：①稀释lipo3000：125uL opti-MEM+5uL lipo3000，涡旋静置5min；②稀释siRNA：125uL opti-MEM+100pmolsiRNA；稀释的lipo3000与稀释的siRNA涡旋混合，静置15min，将转染体系加入细胞。细胞进行饥饿或者加药处理后，48-72小时后收样。

在回补实验中，siRNA以及质粒转染使用Lipofectamine 3000。siRNA以及质粒与转染试剂的混合流程如下：①稀释lipo3000：125uL opti-MEM+5uL lipo3000，涡旋静置5min；②稀释siRNA：125uL opti-MEM+P3000+100pmol siRNA+2μg质粒；稀释的lipo3000与稀释的siRNA以及质粒涡旋混合，静置15min，将转染体系加入细胞。细胞进行饥饿或者加药处理后，48-72小时后收样。

在过表达实验中，构建含有ETS1 cds序列的质粒，并将质粒转然到细胞中，其中，质粒转染使用Fugene 6转染试剂。质粒与转染试剂的混合流程如下：①稀释Fugene 6：125uL opti-MEM+5uL Fugene 6，涡旋静置5min；②稀释质粒：125uL opti-MEM+2μg质粒；稀释的Fugene 6与稀释的质粒涡旋混合，静置15min，将转染体系加入细胞。细胞进行饥饿或者加药处理后，48-72小时后收样。

靶向的ETS1的siRNA序列：

siETS1#1:5’-GAAAUGAUGUCUCAAGCAUTT-3’，SEQ ID NO.1；

siETS1#2:5’-CAGAAUGACUACUUUGCUATT-3’，SEQ ID NO.2。

过表达实验中的ETS1 cds序列，SEQ ID NO.3：

ATGAGCTACTTTGTGGATTCTGCTGGGAGCAGCCCCGTCCCTTACTCAGCGCCTCGTCCTGCAGTGGTGAGGCAAGGACCTAGCAACACTTATGAAGATCCTCGAATGAACTGTGGTTTCCAGTCCAATTATCACCAGCAAAGACCTTGCTACCCCTTTTGGGATGAGATGGCAACTCAGGAAGTTCCTACTGGTCTTGAACACTGTGTCTCAGATATGGAATGTGCAGATGTCCCACTATTAACTCCAAGCAGCAAAGAAATGATGTCTCAAGCATTAAAAGCTACTTTCAGTGGTTTCACTAAAGAACAGCAACGACTGGGGATCCCAAAAGACCCCCGGCAGTGGACAGAAACCCATGTTCGGGACTGGGTGATGTGGGCTGTGAATGAATTCAGCCTGAAAGGTGTAGACTTCCAGAAGTTCTGTATGAATGGAGCAGCCCTCTGCGCCCTGGGTAAAGACTGCTTTCTCGAGCTGGCCCCAGACTTTGTTGGGGACATCTTATGGGAACATCTAGAGATCCTGCAGAAAGAGGATGTGAAACCATATCAAGTTAATGGAGTCAACCCAGCCTATCCAGAATCCCGCTATACCTCGGATTACTTCATTAGCTATGGTATTGAGCATGCCCAGTGTGTTCCACCATCGGAGTTCTCAGAGCCCAGCTTCATCACAGAGTCCTATCAGACGCTCCATCCCATCAGCTCGGAAGAGCTCCTCTCCCTCAAGTATGAGAATGACTACCCCTCGGTCATTCTCCGAGACCCTCTCCAGACAGACACCTTGCAGAATGACTACTTTGCTATCAAACAAGAAGTCGTCACCCCAGACAACATGTGCATGGGGAGGACCAGTCGTGGTAAACTCGGGGGCCAGGACTCTTTTGAAAGCATAGAGAGCTACGATAGTTGTGATCGCCTCACCCAGTCCTGGAGCAGCCAGTCATCTTTCAACAGCCTGCAGCGTGTTCCCTCCTATGACAGCTTCGACTCAGAGGACTATCCGGCTGCCCTGCCCAACCACAAGCCCAAGGGCACCTTCAAGGACTATGTGCGGGACCGTGCTGACCTCAATAAGGACAAGCCTGTCATTCCTGCTGCTGCCCTAGCTGGCTACACAGGCAGTGGACCAATCCAGCTATGGCAGTTTCTTCTGGAATTACTCACTGATAAATCCTGTCAGTCTTTTATCAGCTGGACAGGAGATGGCTGGGAATTCAAACTTTCTGACCCAGATGAGGTGGCCAGGAGATGGGGAAAGAGGAAAAACAAACCTAAGATGAATTATGAGAAACTGAGCCGTGGCCTACGCTACTATTACGACAAAAACATCATCCACAAGACAGCGGGGAAACGCTACGTGTACCGCTTTGTGTGTGACCTGCAGAGCCTGCTGGGGTACACCCCTGAGGAGCTGCACGCCATGCTGGACGTCAAGCCAGATGCCGACGAG。

6.免疫荧光

细胞传代前，将适当大小的载玻片放入培养皿中，使细胞铺满载玻片。用镊子小心夹取载玻片置入6孔板中，用常温1×PBS洗细胞两次后，加入1mL 4％多聚甲醛，室温固定细胞，固定时间为10-15min。随后吸去多聚甲醛，用1×PBS洗三次，每次5min。再加入1mL0.5％的PBST(PBS+0.1％ Triton X-100)通透细胞，冰上放置10-15min。吸去PBST，1×PBS洗3次，每次5min。滴加100-200μL 1％ BSA，使1％ BSA覆盖整个载玻片，封闭30min。吸去1％ BSA后，将玻片转入湿皿，滴加稀释好的一抗，4℃孵育过夜或者室温孵育2h。吸去一抗后，将载玻片放入6孔板，并加入1mL 0.1％ PBST(PBS+0.1％ Tween 20)润洗3次，每次5-10min；之后，将玻片转入湿皿，避光滴加稀释好的200μL二抗，室温孵育1-2h。吸去二抗，将玻片夹入6孔板后，加入1mL 0.1％ PBST(PBS+0.1％ Tween 20)洗三至四次，每次5-10min；之后，滴加200μL浓度为1ng/μL DAPI，室温染3min即可。1×PBS洗玻片三次，每次5min，最后用水浸洗一次；将玻片小心盖在滴有10μL固定剂的载玻片上，避光，室温放置2h以上，等固定剂干燥后，荧光显微镜观察即可。

7.斑马鱼中敲低和过表达实验

在水温28.5℃，水体Ph值为7.0-8.0的环境下饲养AB品系的斑马鱼。通过自然产卵收集受精卵后，在持续光照下饲养斑马鱼胚胎。

对于敲低实验，本申请采用了morpholino修饰的反义寡核苷酸注射一胚胎时期的胚胎，MO序列为：TCATGGTCACGCATTCAAACGTACA，SEQ ID NO.4，注射量为2nL/一胚胎。

对于回补以及过表达实验，本申请克隆了斑马鱼ETS1的编码区序列并通过同源重组连入PCS2空载体，随后利用体外转录试剂盒合成了ETS1的全长mRNA，纯化后用于显微注射。对于拯救组，将0.125mM的MO与200ng/μl的mRNA混匀后，向每枚胚胎注射2nL的混合物。对于过表达组，将mRNA稀释至100ng/μl，注射剂量同样为每枚胚胎2nL。ETS1全长mRNA序列，SEQ ID NO.5：

ATGACGGCAGCTGTCGATATTAAGCCGTTAACTATAATAAAATCCGAAAAAGTAGACGATCTGGAGTGTGCTGATGTTCCTCTTCTGACTCCGGGAAGTAAGGAAATGATGTCACAAGCTCTTCTGGCCACATTCAGCGGCTTCACCAGAGAACAGCAGAGACTCTCCATCCCCAAAGACCCGCGTGAGTGGACAGAAGGCCATGTGAGGGAATGGTTGACCTGGACGGTGAATGAGTTCAGTCTGAAGAACGTGGACTTCCACAAGTTCAGTATGGACGGAGCGAGTCTCTGTGCGCTCGGCAAGGAGAGATTTCTGGACCTGGCACCAGACTTTGTGGGCGACATCCTCTGGGGGCATTTAGAGATGCTGCAGAAAGAAGACCCGAAGCACTTCCCCGTCAGCAGCCTGAGCTCCAGCTTCCAGGAGTCCCGCTATCCCTCCGAATATTTCTTCAACTATGGCATTGAGCATCCTCAGTGTGTCCCTCCGTCTGAATACTCTGAGCCGAGCTTCATCACAGAGTCCTATCAGACGCTTCACCCCATCAGTTCAGAAGACCTGCTGTCGCTCAAATACGAGAGCGAGTATCCCAACGTCATCCTGCGGGACGCGCCGCTCAACCCACTGCAGGGAGACTATTTCTCAGTCAAACAGGAAGTCGTGTCGCCTGACAACATGTGTGTGGGTCGCATTAGCAGAGGTAAGCTGGGTGGTCAGGACTCGTTTGAGAGCATCGACAGTTTCGAGAGCTGCGACAGACTCACGCAGTCGTGGAGCAGTCAGTCGTCCTTCAACAGCCTTCAGAGAGTCCCGTCCTATGACAGCTTCGACTCGGAGGATTACCCCAGTGCTCTGCATGCACACAAACCCAAGGGCACGTTTAAAGACTACGTGCGGGAACGCTCGGACCTGAGCAAAGACAAACCGGTCATCCCCGCGGCGGCTCTCGCTGGATACACAGGCAGTGGACCCATCCAGCTCTGGCAGTTCCTGTTGGAGCTCCTGACGGATAAATCCTGCCAGTCCTTCATCAGCTGGACTGGAGACGGCTGGGAGTTCAAGCTTTCTGACCCGGATGAGGTGGCCCGCAGATGGGGAAAGAGGAAAAACAAGCCCAAGATGAACTATGAAAAGCTGAGCCGCGGCCTGCGCTACTACTACGACAAGAACATCATCCACAAAACGTCCGGCAAGCGCTACGTCTACCGCTTCGTGTGCGACTTGAAAAGCCTGCTGGGATACACTCCCGAGGAGCTGCACACCATGTTAGACGTCAAGCCCGACACGGACGAGTAA。

8.斑马鱼形态观察与成像

将幼鱼用4％PFA固定15h后，使用配备Axiocam 506单目摄像机的体视显微镜对幼鱼进行目视检查，以观察其整体或器官形态(如背鳍、腹鳍、尾鳍和胸鳍等)。用ImageJ软件统计鳍的褶皱面积。

9.斑马鱼心脏与血流分析

使用MicroZebraLab系统记录心脏形态，并根据心肌收缩和心腔充盈相关的像素密度的变化，记录为以每分钟心跳(bpm)为单位的心肌收缩，确定不同的房室心跳频率；斑马鱼血流的分析则通过ZebraBlood软件生成线速度和血管直径的数据，统计检测血管直径像素密度的变化。

实施例1

1.病例收集与样品提取

多指畸形是临床上最容易发现的纤毛病畸形之一。本发明首先招募了来自于不同家庭的数个多指病人，并通过临床诊断，筛选出了四例以多指为表征、伴随不同程度牙齿骨骼异常、短肋等明显骨骼发育缺陷，以及胼胝体发育不全和先天性心脏病的等症状的纤毛疾病病人作为研究对象(图1中的A)。招募的4例纤毛疾病病人无肾脏异常的情况，被诊断为短肋-多指(趾)综合征。

抽血获得纤毛疾病病人的血液样本和正常人血液样品，并进一步分离血液中的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，提取PBMCs的RNA后送至测序公司进行转录组测序，并经过生物信息学分析得到纤毛疾病组和正常对照组的差异基因表达情况，如图1中的B所示，发现存在大量的纤毛基因表达上调，包括CEP131、NEK8等已经收录在SYSCILIA(收录目前已知纤毛相关基因的列表集)中的基因，该结果证明该纤毛疾病的纤毛基因调控网络发生了重组。差异表达基因GO分析显示纤毛疾病中上调的基因参与了纤毛免疫反应和代谢过程，如图1中的C所示。

2.基于染色质开放性测序技术筛选纤毛疾病中的差异peak区域

首先，提取纤毛疾病病人血液样品和正常人血液样品的PBMCs的细胞核，使用Tn5转座酶酶切并纯化，回收DNA片段，构建高通量测序文库后送至公司进行测序。经过数据质控-比对分析-peak calling-组间差异peak分析的流程，定义了两类在纤毛疾病病人中差异表达的peak集，如图2中的A所示，分别是与纤毛疾病激活相关的染色质开放区域(ciliopathy-activated accessibility regions，CAAs)和与纤毛疾病抑制相关的染色质开放区域(ciliopathy-inactivated accessibility regions,CIAs)，如图2中的B所示。

其次，经过对CAAs及CIAs邻近基因GO富集分析，如图2中的C所示,发现只有CAAs附近的基因与器官形态发育等相关纤毛疾病途径密切相关。进一步探究发现，如图2中的D所示，CAAs附近的基因存在大量表达上调的纤毛基因。这些数据表明了纤毛疾病中大量上调的纤毛基因的表达很有可能受到CAAs的调控。

3.模体分析筛选出ETS1参与调控纤毛基因表达

为了进一步揭示CAAs对纤毛疾病的调控作用，本发明对CAAs进行了HOMER介导的模体(motif)分析，如图3中的A所示，发现ETS转录因子家族可以显著性富集在CAAs。结合转录组数据及蛋白免疫印迹实验，发现ETS家族中，只有转录因子ETS1的表达在纤毛疾病中是显著上调的，揭示了ETS1在调控纤毛基因表达与纤毛疾病中发挥的潜在作用(图3中的B和C)。

4.细胞水平ETS1调控纤毛发育过程

为了验证ETS1在细胞水平对纤毛发育的影响，如图4中的A所示，本申请在hTERTRPE-1细胞中敲低了ETS1表达，免疫荧光实验显示纤毛发育出现了异常，部分纤毛出现了弯曲、鼓包，同时纤毛也出现长度缩短等情况，而在敲低ETS1的细胞中再次回补ETS1表达，纤毛发育异常的表型得到了恢复，提示ETS1参与纤毛发育调控。本申请也在正常细胞中过表达了ETS1基因，如图4中的B所示，免疫荧光实验也提示此时纤毛发育异常，表现为纤毛长度明显变长。以上数据显示ETS1在纤毛疾病的调控上具有重要作用。

5.个体(斑马鱼)水平ETS1调控纤毛疾病的作用

为了验证ETS1对个体水平发育的影响，本申请在斑马鱼一细胞的胚胎中敲低了ETS1的表达，如图5中的A所示，观察发现敲低ETS1幼鱼出现了胸鳍缩短的现象，鱼类的胸鳍印证了人类指/趾的发育情况，这一结果验证了在斑马鱼中ETS1的功能丧失引起的短鳍现象与人类纤毛疾病中的指/趾发育异常的情况类似。随后在敲低ETS1基因表达的斑马鱼中再次回补ETS1表达，发现其胸鳍异常的情况有所缓解。其次，为了探究ETS1对其他器官的影响，在斑马鱼幼鱼中敲低了ETS1，发现其出现了心包水肿及背部血流信号异常等表型，如图5中的B所示，而在敲低ETS1基因表达的斑马鱼中再次回补ETS1表达，其心包水肿以及背部血流异常的情况得到缓解。最后，本申请在斑马鱼一细胞中过表达了ETS1基因表达，如图5中的C所示，此时斑马鱼表型结果显示，异常高表达的ETS1会导致斑马鱼出现胸鳍、心脏及背部血管发育不良等表型，这都是纤毛疾病的主要症状，进一步证明ETS1参与调控纤毛疾病。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.检测ETS1表达的试剂在制备诊断纤毛疾病的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纤毛疾病为短肋-多指综合征。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：

特异性识别ETS1基因的探针；和/或

特异性扩增ETS1基因的引物；和/或

特异性识别ETS1蛋白的抗体。

4.抑制ETS1表达的抑制剂在制备治疗纤毛疾病的药物中应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制剂能抑制ETS1基因或蛋白水平，或降低ETS1的活性；所述抑制剂包括shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA和反义核酸中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为小干扰RNA和/或反义核酸。

7.根据权利要求6所述的抑制剂，其特征在于，所述小干扰RNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；所述反义核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

8.一种构建纤毛疾病的动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括敲低或过表达受试动物的ETS1的表达。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述动物为斑马鱼。

10.一种构建纤毛发育异常的细胞模型的方法，其特征在于，所述方法包括敲低或过表达正常细胞的ETS1的表达。

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