CN115807005A

CN115807005A - 国兰花发育调控基因sep4编码序列及其应用

Info

Publication number: CN115807005A
Application number: CN202211116299.8A
Authority: CN
Inventors: 杨凤玺; 林增裕; 陆楚桥; 朱根发; 高洁; 魏永路; 金建鹏; 谢琦
Original assignee: Environmental Horticulture Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Environmental Horticulture Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-09-14
Filing date: 2022-09-14
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2042-09-14
Also published as: CN115807005B

Abstract

本发明公开了一种国兰花发育调控基因SEP4编码序列及其应用。本发明从中国兰花的墨兰品种‘白墨’的花器官cDNA中分离得到兰花花器官发育调控基因，提高其表达量后可造成拟南芥开花期显著提前，花器官形态明显改变，花瓣发育受阻，整朵花呈现花萼和心皮和雄蕊的结构，第二轮花器官缺失，但发育出更大而肥厚的心皮结构；在国兰中发现该基因表达量与合蕊柱发育显著正相关，在梅瓣化的变异体中表达量显著升高，表明该基因对国兰梅瓣花形成的促进作用。本发明国兰开花调控基因可用于兰科植物花器官发育分子机制的研究，以及植物开花性状的改良。

Description

国兰花发育调控基因SEP4编码序列及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及国兰花发育调控基因SEP4及其编码蛋白和应用。

背景技术

兰花是兰科植物的统称，是单子叶植物第一大科，801属约30000种，且多数兰科植物具有很高的观赏和食药用价值，在国内外市场广受欢迎。我国是兰花的原产地之一，兰花资源丰富，已有近2000年的栽培历史，并形成了中国特色的兰花文化，影响遍及日本、韩国以及东南亚等国家和地区，成为弘扬中国文化软实力的载体之一。

兰属中的地生种大多原产中国，因此又称国兰，是我国传统名贵花卉。一朵标准的国兰花由三轮花器官组成，最外轮由三片长的外花被片组成，称为萼片；第二轮由三片较短的内花被片组成，称为花瓣，在第二轮背面还有一片分化成具有艳丽斑点的唇瓣；最内轮由生殖结构组成，称之为合蕊柱，是由雄性和雌性生殖器官合在一起组成的柱状器官。再长期的驯化栽培过程发，发现国兰拥有梅瓣、荷瓣、水仙瓣、蝶瓣、奇花等多种花朵瓣型，已有1700多个不同瓣型栽培品种。瓣型育种成为重要的育种目标，然而目前国兰品种主要依靠野生资源驯化选育，适宜规模化、产业化的品种不多，杂交育种周期长、难度大且子代性状难以预期，现代分子生物技术育种手段严重滞后。而如何通过现代分子生物技术手段进行观赏性状改良，高效培育新品种，成为目前亟待解决的科学问题。

发明内容

本发明的目的在于：克服传统杂交育种存在的周期长、性状难以预期等问题，本发明通过运用最新的分子生物学手段，挖掘可运用于植物花型改良的基因资源，实现国兰开花的性状改良。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种国兰花发育调控基因，它是从中国兰花的墨兰品种‘白墨’(Cymbidium sinense)的花器官cDNA中分离得到，其核苷酸序列由744个碱基组成，如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二个目的是提供一种由上述的国兰花发育调控基因编码的蛋白，由247个氨基酸残基组成，如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个目的是提供一种包含上述的国兰花发育调控基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌或转基因材料。

本发明的第四个目的是提供上述的国兰花发育调控基因在植物开花性状改良中的应用。优选的，所述的植物开花性状改良是使植物开花期提前，和/或促进花瓣向心皮转变，和/或促进梅瓣花形成的改良。

本发明的第五个目的是提供上述的国兰花发育调控蛋白在植物开花性状改良中的应用。优选的，所述的植物开花性状改良是使植物开花期提前，和/或促进花瓣向心皮转变，和/或促进梅瓣花形成的改良。

本发明的第六个目的是提供上述的一种使植物开花期提前，和/或促进花瓣向心皮转变，和/或促进梅瓣花形成的方法，其包括以下步骤：构建过表达上述的国兰花发育调控基因的重组表达载体，将重组表达载体转化到植物中。

优选的，所述的将重组表达载体转化到植物中，是将重组表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染植物。

本发明通过基因工程技术发现，所述国兰花器官发育调控基因在拟南芥中过量表达，能改变植物开花性状，使得开花期显著提前，花器官形态明显改变，花瓣发育受阻，整朵花呈现花萼和心皮和雄蕊的结构，第二轮花器官缺失，但发育出更大而肥厚的心皮结构。因此，可将该基因及其编码的蛋白用于花器官发育和侧枝数量等开花性状调控途径的研究，以及植物开花性状的改良。

本发明的有益效果为：

本发明从中国兰花的墨兰品种‘白墨’(Cymbidium sinense)的花器官cDNA中分离得到兰花花器官发育调控基因，提高其表达量后可造成拟南芥开花期显著提前，花器官形态明显改变，花瓣发育受阻，整朵花呈现花萼和心皮和雄蕊的结构，第二轮花器官缺失，但发育出更大而肥厚的心皮结构；在国兰中发现该基因表达量与合蕊柱发育显著正相关，在梅瓣化的变异体中表达量显著升高，表明该基因对国兰梅瓣花形成的促进作用。本发明国兰开花调控基因可用于兰科植物花器官发育分子机制的研究，以及植物开花性状的改良。

附图说明

图1为本发明实施例1中，CsSEP4与其他物种来源的进化树分析。

图2为本发明实施例2中，CsSEP4在墨兰不同组织的表达模式分析。

图3为本发明实施例2中，CsSEP4在墨兰不同发育阶段的组织表达模式分析。FD1：花分生组织时期，FD2：花器官原基初期，FD3：花器官原基末期，FD4：花蕾期，FD5：开花期。

图4为本发明实施例3中，转基因拟南芥表型分析。WT表示野生型；35S:CsSEP4表示转基因拟南芥植株。

图5为本发明实施例4中，国兰不同瓣型变异体中SEP4基因表达谱。WT_1～WT_4分别表示普通花型的萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱1-4轮花器官；GPV_1～GPV_4分别表示墨兰‘珍珠梅’的萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱1-4轮花器官。

图6为本发明实施例4中，国兰不同瓣型变异体中SEP4基因表达验证。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1 CsSEP4基因的克隆以及序列分析

1、RNA的提取

取墨兰栽培品种‘白墨’花器官组织2g，利用植物Trizol(Invitrogen)试剂抽提其总RNA，并反转录成cDNA(Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesisKit)。

2、目的基因CsSEP4的获得

以CsSEP4-F1：5’-ATTATGGGAAGGGGAAGAGT-3’(SEQ ID NO:3)和CsSEP4-R1：5’-GCCTCACATCCATCCTGGAAG-3’(SEQ ID NO:4)为引物，以上步骤1所得cDNA为模板，利用Ex-Taq酶(TaKaRa Biotechnology Co.)进行PCR，按照下列条件：94℃4min，然后34cycles(94℃40s、59.5℃40s、72℃1.5min、72℃10min)。从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，然后连接pMD19-T载体(TaKaRa Biotechnology Co.)并送华大基因研究院进行测序。测序结果分析发现扩增片段含有目的基因CsSEP4的完整CDs序列，由744个碱基组成，核苷酸序列如SEQID NO:1所示，命名为墨兰花器官发育调控基因(CsSEP4基因)，其编码的蛋白的氨基酸序列由247个氨基酸残基组成，如SEQ ID NO:2所示，命名为墨兰花器官发育调控蛋白(CsSEP4蛋白)。获得的含有CsSEP4-pMD19-T的大肠杆菌目前保存于广东省农业科学院环境园艺研究所。

所述的CsSEP4基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：ATGGGAAGGGGAAGAGTGGAGCTGAAGATGATTGAGAACAAGATTAATCGACAAGTGACGTTTGCGAAGAGGAGGAATGGGTTACTGAAGAAGGCGTACGAGCTTTCAGTGCTCTGTGATGCTGAGGTTGCTCTCATCATCTTCTCCAACCGCGGCAGACTCTTTGAGTTCTGCAGTAGCTCAAGCATGATGAAGACACTTGAGAGATACCAAAAGTGCAGCTATAATTCATCAGAGACCACGATTCCATCCAAGGAGACGCAGAACAGTTATCAGGAATATTTAAAGCTGAAAGCAAGAGTTGAATATCTACAACGGTCACAGAGGAATCTTCTAGGAGAGGACCTAGGCCAGCTGACCACCAAGGAACTAGAACAACTAGAACACCAACTAGAAATGTCTCTCAAACAAATCAGATCAACAAAGAGCCAGCTTATGCTTGATCAACTGTGTGATCTCAAAAGAAAGGAGCAAATGCTGCAGGAAGCTAACAGAGCTCTCAGAATGAAGTTGCAAGAAGATGAGCCAGAAATTCCCCTCCAGCTCTCCTGGCCTGGTGGCGGCGGCAGTGGCAGAAATGGTCGCGGCCACTGCGAGAGTCATCCTCAATCAGAAGTATTCTTTCAGCCATTACCTTGCGATCCTTCTCTGCAAATTGGATATAATCCAGTCTGTTTAGAACAACAATTGAACACAGGATCATCCTCTCATAGTGTCAATGGCTTCCTTCCAGGATGGATGTGA。

所述的CsSEP4基因的编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，具体序列如下所示：MGRGRVELKMIENKINRQVTFAKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIIFSNRGRLFEFCSSSSMMKTLERYQKCSYNSSETTIPSKETQNSYQEYLKLKARVEYLQRSQRNLLGEDLGQLTTKELEQLEHQLEMSLKQIRSTKSQLMLDQLCDLKRKEQMLQEANRALRMKLQEDEPEIPLQLSWPGGGGSGRNGRGHCESHPQSEVFFQPLPCDPSLQIGYNPVCLEQQLNTGSSSHSVNGFLPGWM。

3、CsSEP4基因序列分析

将墨兰CsSEP4基因在NCBI中进行同源序列搜索，用软件MEGA进行同源序列得编码氨基酸比对并构建进化树。结果显示，CsSEP4在不同物种中得保守性较高，均具有MADS-box基因保守的MADS结构域和K结构域。SEP4在不同兰科植物中的同源基因序列较为保守，CsSEP4与另一类国兰春兰中SEP4(KX347449)有99％一致性，与文心兰MADS11(HM140847)、石斛兰CMB(XM_020823738)基因同源性为92％，与蝴蝶兰CMB1(XM_020717283)、SEP4(KF673858)有89％的一致性。而与其他植物中的SEP基因差异较大(图1)。

实施例2 CsSEP4在兰花中的表达模式

1、RNA的提取

取墨兰栽培品种‘白墨’不同花器官发育阶段以及开花时期的萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱四轮花器官等不同部位的植物组织各2g，利用植物Trizol(Invitrogen)试剂抽提其总RNA，取其中2μL采用反转录试剂盒Thermo Scientific RevertAid First StrandcDNASynthesis Kit反转录成cDNA。

2、定量PCR

利用引物CsSEP4QRT-F：5’-GCGGCAGACTCTTTGAGTTC-3’(SEQ ID NO:5)和

CsSEP4QRT-R：5’-TCTAGTTCCTTGGTGGTCAGC-3’(SEQ ID NO:6)，对兰花不同组织中CsSEP4基因表达量进行实时定量PCR检测。采用Actin QRT-F：5’-ATGTCGCCATCCAAGCTGTT-3’(SEQ ID NO:7)和Actin QRT-R：5’-CACGTCCAGCAAGGTCAAGA-3’(SEQ ID NO:8)作为引物，扩增Actin作为内参。按照下列程序：95℃预变性30s，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用iCycler IQ Real-time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)进行扩增，操作按照HiscriptⅡQRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(VazymeBiotech Co.,Ltd)试剂盒说明书进行。

3、表达分析

用icycler realtime detection system software(version 7.0)对PCR结果进行分析。将国兰花发育过程从茎尖分生组织转变为花分生组织开始到完全开花分为花分生组织时期(FD1)、花器官原基初期(FD2)、花器官原基末期(FD3)、花蕾期(FD4)和开花期(FD5)5个阶段，通过实时荧光定量PCR检测CsSEP4基因在花芽不同发育阶段的表达量，发现其在花芽开始发育到完全开花的五个阶段中各阶段表达量差异在2.5-5倍之间，再发育初期表达量较高，随着花芽发育成熟，表达量逐渐降低，而在盛开的花中，表达量有一定回升(图3)。进一步对开花期的墨兰萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱四轮花器官进行表达量检测，发现CsSEP4在萼片、花瓣、唇瓣表达量基本一致，合蕊柱中表达量升高约2.5倍(图2)。

实施例3拟南芥中CsSEP4基因的功能分析

1、转化拟南芥高表达载体构建

利用引物CsSEP4-F1：5’-ATTATGGGAAGGGGAAGAGT-3’(SEQ ID NO:3)和CsSEP4-R1：5’-GCCTCACATCCATCCTGGAAG-3’(SEQ ID NO:4)扩增出墨兰CsSEP4基因的CDs序列(即CsSEP4基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，并克隆至pMD19-Tvector(Takara)，送华大基因测序。测序无误之后，使用EcoRI和SacI双酶切(Thermo Fisher Scientific)，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的pBI121载体上命名为pBI-SEP4。

2、转化拟南芥植物

2.1农杆菌GV3101的转化

1)将-80℃保存的感受态细胞于冰上化冻，待细胞完全溶解后，加入约1μg质粒(pBI-SEP4)，轻柔混匀，冰上放置30min。

2)液氮速冻1min后37℃，5min化冻，重复一次。加入1mL LB于28℃恒温振荡培养4～6h，200rpm。

3)菌液摇浓后，4000rpm室温下离心5min。弃上清，用100μL的LB培养液重悬农杆菌沉淀。

4)把所有混合物涂板到含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL庆大霉素的LB板上，置于28℃恒温培养箱中培养48～72h，待长出群落后再挑菌重新划线以确保是单克隆，由此得到转化有pBI-SEP4的农杆菌。

2.2花序侵染法转化拟南芥。

用OD＝0.3～0.5的转化有pBI-CsSEP4的农杆菌液侵泡拟南芥花序2～3s后取出，避光密封16小时后，移至生长室中继续生长。大约3～4周后，收集种子贮藏于4℃，黑暗条件。

2.3拟南芥转化子筛选

1)配制质量分数0.1％的氯化汞溶液。

2)将收集的种子放到1.5mL的Eppendorf管中，加1mL的体积分数75％的酒精摇匀，在Blood Tube Rotator上旋转5min。用质量分数0.1％的氯化汞消毒5分钟。

3)离心，6000rpm，2min。弃上清液，加入1mL的灭菌水，混匀，在Blood TubeRotator上旋转2min。重复3次。

4)去上清液，用1mL的无菌水悬浮种子，平铺于含50μg/mL卡那霉素的1/2MS培养基表面。封板，于4℃黑暗春化3天后移入组织培养室(16h L/8h D)光照，23℃条件。

5)待苗长出绿色子叶后观察统计绿色子叶幼苗数目。并去除粘附在根上的培养基，移至基质中培养。

6)经60天左右的生活周期，得到转基因拟南芥第一代种子。收获T二代纯合种子(转基因植株)用于后续试验。

3、转基因拟南芥CsSEP4表达量分析

为了确定CsSEP4基因在拟南芥中的生物学功能，以拟南芥野生型和上步骤2所得转化子(T二代纯合种子生长后的转基因植株)cDNA为模板，采用引物CsSEP4QRT-F：5’-GCGGCAGACTCTTTGAGTTC-3’(SEQ ID NO:5)和CsSEP4QRT-R：5’-TCTAGTTCCTTGGTGGTCAGC-3’(SEQ ID NO:6)检测转基因拟南芥中CsSEP4基因的表达量。按照下列程序：95℃预变性30s，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用iCycler IQ Real-time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)进行扩增，操作按照HiscriptⅡQRT SuperMixfor qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒说明书进行。结果发现在获得的转基因植株中CsSEP4的表达量均提高，选取其中三个株系用于后续表型分析。

4、转基因拟南芥表型分析

收获的T3代纯合转基因植株种子经表面灭菌后铺在含50μg/mL卡那霉素的MS培养基上，4℃黑暗培养2天，转移到(16h L/8h D)光照，23℃条件下培养。对转基因植株进行表型分析，发现SEP4高表达后开花期显著提前，花器官形态明显改变，花瓣发育受阻，整朵花呈现花萼和心皮和雄蕊的结构，第二轮花器官缺失，但发育出更大而肥厚的心皮结构，推测SEP4促进第二轮花瓣向心皮转变(图4)。

实施例4国兰中CsSEP4基因表达与不同花朵瓣型关联分析

1、国兰不同瓣型材料

分别对普通花型以及花朵“梅瓣化”变异品种墨兰‘珍珠梅’的各个花器官(萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱)进行转录组测序分析。取新鲜植物材料2g，利用植物Trizol(Invitrogen)试剂抽提其总RNA，并检测RNA样品的纯度、浓度和完整性。样品检测合格后，进行文库构建，主要流程如下：

(1)用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；

(2)加入Fragmentation Buffer将mRNA进行随机打断；

(3)以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XPbeads纯化cDNA；

(4)纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XPbeads进行片段大小选择；

(5)最后通过PCR富集得到cDNA文库。

文库构建完成后，分别使用Qubit2.0和Agilent 2100对文库的浓度和插入片段大小(Insert Size)进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。

2、转录组测序

llumina Hiseq^TM得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)。在对数据进行碱基组成及质量值分析后，依据原始数据(Raw data)分析结果对数据进行过滤，去除接头序列、去除污染部分；再去除含有过多"N"碱基(>10％)及含有过多低质量碱基(质量值低于20的碱基占整条序列的20％以上)的序列。

3、基因表达分析

使用HISAT2将质控后的测序序列与参考基因组进行比对，并通过RSeQC统计比对结果对不同测序样本进行分组，通过所有基因的表达量分布图以及箱型图对不同组的基因表达水平进行比较。对于同一组下的重复样品，最终的表达量为所有重复数据的平均值。采用Bowtie将测序得到的Reads与Unigene库进行比对，根据比对结果，结合RSEM进行表达量水平估计。利用FPKM值表示对应Unigene的表达丰度。

FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)是每百万Reads中来自比对到某一基因每千碱基长度的Reads数目，是转录组测序数据分析中常用的基因表达水平估算方法。FPKM能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响。FPKM计算公式如下：

公式中，cDNA Fragments表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Fragments(Millions)表示比对到转录本上的片段总数，以10^6为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以10^3个碱基为单位。对转录组数据进行分析，集中关注其中与花器官发育密切相关的MADS-box基因家族，发现其中SEP4基因表达差异最为显著。在普通花型中SEP4主要集中在合蕊柱中表达，与之前的定量PCR结果一致。而在梅瓣花变异品种中，基因表达范围扩展到了花瓣中，表明SEP4基因表达可能与合蕊柱发育正相关(图5)。

4、基因表达验证

为了进一步确定SEP4基因在国兰中的表达模式，以国兰中普通品种‘小香’和花被片合蕊柱化的梅瓣型突变材料包括‘富贵红梅’‘南海神梅’‘珍珠梅’墨兰，整花cDNA为模板，采用引物CsSEP4QRT-F：5’-GCGGCAGACTCTTTGAGTTC-3’(SEQ ID NO:5)和CsSEP4QRT-R：5’-TCTAGTTCCTTGGTGGTCAGC-3’(SEQ ID NO:6)，检测兰花中CsSEP4基因的表达量。按照下列程序：95℃预变性30s，然后经40个循环(95℃10s、57℃10s、72℃26s)。同样的cDNA也作为模板，使用Actin QRT-F：5’-ATGTCGCCATCCAAGCTG TT-3’(SEQ ID NO:7)和Actin QRT-R：5’-CACGTCCAGCAAGGTCAAGA-3’(SEQ ID NO:8)扩增Actin作为内参。按照下列程序：95℃预变性30s，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用iCyclerIQ Real-time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)进行扩增，操作按照HiscriptⅡQRTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒说明书进行。结果表明SEP4基因在普通花型中特异性地在合蕊柱中积累。而在梅瓣花型品种中，SEP4的表达范围从合蕊柱扩展到花被片，且随着梅瓣化程度越高，表达量提高越明显，可能与花瓣向合蕊柱转变的调控密切相关(图6)。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims

1.一种国兰花发育调控基因，其特征在于，所述的国兰花发育调控基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种国兰花发育调控蛋白，其特征在于，所述的国兰花发育调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求2所述的国兰花发育调控蛋白，其特征在于，所述国兰花发育调控蛋白是由权利要求1所述的国兰花发育调控基因编码。

4.一种包含权利要求1所述的国兰花发育调控基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌或转基因材料。

5.权利要求1所述的国兰花发育调控基因在植物开花性状改良中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物开花性状改良是使植物开花期提前，和/或促进花瓣向心皮转变，和/或促进梅瓣花形成的改良。

7.权利要求2或3所述的国兰花发育调控蛋白在植物开花性状改良中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物开花性状改良是使植物开花期提前，和/或促进花瓣向心皮转变，和/或促进梅瓣花形成的改良。

9.一种使植物开花期提前，和/或促进花瓣向心皮转变，和/或促进梅瓣花形成的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建过表达权利要求1所述的国兰花发育调控基因的重组表达载体，将重组表达载体转化到植物中。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，是将重组表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染植物。