CN115806584A

CN115806584A - 一种鸭肝源抗氧化功能肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115806584A
Application number: CN202211147251.3A
Authority: CN
Inventors: 潘道东; 范贤康; 夏强; 周昌瑜; 孙杨赢; 杜丽慧
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2022-09-19
Filing date: 2022-09-19
Publication date: 2023-03-17

Abstract

本发明公开了一种鸭肝源抗氧化功能肽及其制备方法和应用，特点是包括MYGAVTPVK、NWEKIR、APGIIPR和RWWQLR中的至少一种肽，其制备方法包括以下步骤：1)将纳豆芽孢杆菌接种到营养肉汤液体培养基中，培养制得纳豆芽孢杆菌菌悬液；2)将鸭肝接种纳豆芽孢杆菌发酵制得鸭肝发酵提取物；3)将鸭肝发酵提取物采用Sephadex G‑15凝胶色谱分离得到抗氧化肽分离物；4)将抗氧化肽分离物通过RP‑HPLC纯化得到鸭肝源抗氧化功能肽，经LC‑MS/MS鉴定为抗氧化功能肽，该功能肽具有在制备抗氧化药物和/或抗炎药物方面的应用；优点是具有抗氧化和抗炎功效。

Description

一种鸭肝源抗氧化功能肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抗氧化功能肽，尤其是涉及一种鸭肝源抗氧化功能肽及其制备方法和应用。

背景技术

鸭肝作为鸭肉加工的低价值副产品之一，富含氨基酸结构均衡的优质蛋白质，营养价值高，是一种良好的蛋白质来源。但它现在通常加工成饲料或者作为低附加值物品直接出售，作为饮食的直接消费仍然相当有限，甚至大部分都被丢弃而没有得到有效利用。在病理或极端环境条件下，往往会有过量的ROS生成，从而破坏细胞的天然抗氧化防御能力。特别是如果自由基长时间不受控制地产生和积累，这种高ROS浓度的不平衡就可能对关键细胞生物聚合物造成氧化损伤。这些生物大分子的持续氧化损伤可能是引发癌症、心血管疾病、阿尔茨海默氏症、关节炎以及帕金森氏症等慢性疾病的原因之一。但现存的多种合成药物，都有一定的副作用，不利于长期服用。因此使用生物活性肽来增强人体的自然抗氧化防御系统受到了较多的关注。因此，我们使用微生物发酵鸭肝开发具有抗氧化功能的生物活性肽。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗氧化能力强的鸭肝源抗氧化功能肽及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种鸭肝源抗氧化功能肽，包括MYGAVTPVK、NWEKIR、APGIIPR和RWWQLR中的至少一种肽。

上述鸭肝源抗氧化功能肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将纳豆芽孢杆菌接种到营养肉汤液体培养基中，培养制得纳豆芽孢杆菌菌悬液；

(2)将鸭肝接种纳豆芽孢杆菌发酵制得鸭肝发酵提取物；

(3)将鸭肝发酵提取物采用Sephadex G-15凝胶色谱分离得到抗氧化肽分离物；

(4)将抗氧化肽分离物通过RP-HPLC纯化得到鸭肝源抗氧化功能肽，经LC-MS/MS鉴定为MYGAVTPVK、NWEKIR、APGIIPR和RWWQLR。。

进一步，步骤(1)具体为：挑取纳豆芽孢杆菌接种到营养肉汤液体培养基中，在37℃、200r/min条件下摇床培养18h，连续传代三次，调整菌体浓度至1×10⁸CFU/mL，于4℃，5000rpm离心5min去上清，并用无菌生理盐水洗涤3次，再用无菌生理盐水恢复原浓度，制备得到纳豆芽孢杆菌菌悬液。

进一步，步骤(2)具体为：将鸭肝用清水洗净，用剪刀去除鸭肝结缔组织，按照料液比1g:3.83mL的比例加入水制成匀浆，121℃高温高压灭菌15min，按照体积百分数4.33％的接种量接种纳豆芽孢杆菌菌悬液，于37℃摇床200r/min培养发酵38.66h，发酵结束后，于4℃，10000rpm，离心10min，离心后将上清液过0.22μm滤膜，制得鸭肝发酵提取物。

进一步，步骤(3)具体为：将鸭肝发酵提取物采用Sephadex G-15凝胶色谱纯化分离，上样前使用超纯水平衡色谱柱，同时采用超纯水作为洗脱缓冲液，流速调节至2mL/min，样品检测吸光度设置为220nm，并使用自动馏分收集器收集馏分，收集第3个吸收峰得到抗氧化肽分离物。

进一步，步骤(4)具体为：将抗氧化肽分离物冻干样品用蒸馏水配置成5mg/mL的溶液，用0.22μm超滤膜过滤并超声脱气后，使用RP-HPLC进行纯化，柱温设置为40℃，流动相A为100％乙腈，流动相B为含0.1wt％三氟乙酸的水溶液，以线性梯度方式洗脱：1-5min，100％A；5–20min，1％–11％B；25-30min，100％A，检测波长为样220nm，收集第五个峰，经LC-MS/MS鉴定为MYGAVTPVK、NWEKIR、APGIIPR和RWWQLR。

上述鸭肝源抗氧化功能肽在制备抗氧化药物和/或抗炎药物方面的应用。

进一步，所述的鸭肝源抗氧化功能肽在制备H₂O₂氧化损伤抑制剂方面的应用、制备脂质氧化产物MDA抑制剂方面的应用和/或制备炎性细胞因子TNF-α和/或IL-1β抑制剂方面的应用。

进一步，所述的鸭肝源抗氧化功能肽在制备抗氧化酶系SOD、CAT和/或GSH-Px活性提高药物方面的应用。

上述肽MYGAVTPVK在制备细胞内CAT和GSH-Px的mRNA表达促进剂方面的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种发酵鸭肝制备抗氧化功能肽的方法和应用，利用纳豆芽孢杆菌发酵鸭肝获得小分子活性肽，进一步纯化并鉴定鸭肝肽，得到了4种新的抗氧化肽，通过计算机模拟、分子对接确认了肽的生物学功能，并在氧化损伤HepG2细胞探讨抗氧化肽的保护作用。不仅可以解决鸭肝副产物的高值化利用，增加经济效益，还解决了工业生产肽的得率低、特异性不强、质量不稳定等问题，提供了具抗氧化功能的肽高效生产方法。

附图说明

图1为纳豆芽孢杆菌发酵鸭肝单因素试验结果；其中(1)为发酵时间对鸭肝发酵物的多肽浓度和DPPH自由基清除率的影响。(2)为接菌量对鸭肝发酵物的多肽浓度和DPPH自由基清除率的影响。(3)为液料比对鸭肝发酵物的多肽浓度和DPPH自由基清除率的影响；

图2为制备鸭肝发酵提取物的响应面优化结果；左侧为三维曲面图，右侧为二维等高线图。(1)为以DPPH自由基清除率为响应值的响应面实验结果，其中(a)为液料比与接菌量的交互作用，(b)为发酵时间与接菌量的交互作用，(c)为发酵时间与液料比的交互作用，其中左侧为三维曲面图，右侧为二维等高线图；(2)为以多肽浓度为响应值的响应面实验结果，其中(a)为液料比与接菌量的交互作用，(b)发酵时间与接菌量的交互作用，(c)发酵时间与液料比的交互作用，其中左侧为三维曲面图，右侧为二维等高线图；

图3为鸭肝发酵提取物的抗氧化活性图；其中(1)为鸭肝发酵物和谷胱甘肽(GSH)的DPPH自由基清除能力；(2)为鸭肝发酵物和谷胱甘肽(GSH)的ABTS自由基清除能力；(3)为鸭肝发酵物和谷胱甘肽(GSH)的羟基自由基清除能力；

图4为鸭肝抗氧化肽分离纯化。其中(1)为鸭肝发酵粗提物Sephadex G-15凝胶色谱分离峰图；(2)为Sephadex G-15分离鸭肝肽各组分的抗氧化活性；(3)为反相高效液相色谱法分离纯化组分A3；(4)为反相高效液相色谱法分离纯化组分A3所得各组分抗氧化活性；

图5鸭肝抗氧化肽质谱图，其中(1)-(4)分别为肽MYGAVTPVK，NWEKIR，APGIIPR和RWWQLR的质谱图；

图6为分子对接，其中(1)为鸭肝抗氧化肽与ABTS的分子对接作用，其中(a)是MYGAVTPVK与ABTS的分子对接结果,(b)为NWEKIR与ABTS的分子对接结果,(c)为APGIIPR与ABTS的分子对接结果,(d)为RWWQLR与ABTS的分子对接结果；(2)为鸭肝抗氧化肽与DPPH的分子对接作用，(a)为MYGAVTPVK与DPPH的分子对接结果,(b)为NWEKIR与DPPH的分子对接结果,(c)为APGIIPR与DPPH的分子对接结果,(d)为RWWQLR与DPPH的分子对接结果。

图7为鸭肝肽对细胞氧化应激的保护作用；其中，(1)为H₂O₂浓度对细胞存活率的影响；(2)为鸭肝抗氧化肽对细胞存活率的影响。(3)为鸭肝抗氧化肽对H₂O₂处理后的细胞存活率的影响；(4)为不同条件处理后HepG2细胞内ROS相对含量；(5)抗氧化肽对细胞内TNF-α的影响；(6)抗氧化肽对细胞内IL-1β的影响；(7)为不同浓度P2处理后细胞内抗氧化酶mRNA相对表达量；(8)为鸭肝抗氧化肽的抗氧化调控机制。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明中的以下缩略语具体定义为：

LC-MS/MS，液相二级质谱；RP-HPLC，反相高效液相色谱；LPS，脂多糖；PCR，聚合酶链式反应；qPCR，实时荧光定量核酸扩增检测系统；ELISA，酶联接免疫吸附剂测定；DCFH-DA，活性氧ROS荧光探针；SOD，超氧化物歧化酶；DSS，葡聚糖硫酸钠盐。

一、具体实施例

一种发酵鸭肝制备抗氧化功能肽的方法，包括以下步骤：

1、菌悬液的制备

首先，挑取纳豆芽孢杆菌接种到营养肉汤液体培养基中，在37℃、200r/min条件下摇床培养18h，连续传代三次。然后，调整菌体浓度至1×10⁸CFU/mL，于4℃，5000rpm离心5min去上清，并用无菌生理盐水洗涤3次，并用无菌生理盐水恢复原浓度，制备得到纳豆芽孢杆菌菌悬液。

2、接种发酵

首先，将鸭肝用清水洗净，用剪刀去除鸭肝结缔组织，按照料液比1:3.83(g/mL)加入适量水制成匀浆，高温高压灭菌(121℃，15min)，按照4.33％(v/v)接种量接种纳豆芽孢杆菌菌悬液，37℃摇床200r/min培养发酵38.66h，发酵结束后离心(4℃，10000rpm，10min)，离心后将上清液过0.22μm滤膜制得鸭肝发酵提取物。

3、Sephadex G-15凝胶色谱分离小分子肽

选择使用Sephadex G-15填充色谱柱纯化发酵上清液。上样前使用超纯水平衡色谱柱，同时，超纯水用作洗脱缓冲液，流速调节至2mL/min。样品检测吸光度设置为220nm，并使用自动馏分收集器收集馏分，选择第三个峰即A3组分进行进一步的分离纯化。

4、反相高效液相纯化小分子肽

通过使用Advance Bio Peptide Map C18色谱柱(150mm×2.1mm，

2.7μm)的高效液相色谱系统(Palo Alto，CA，USA)纯化A3组分。柱温设置为40℃。将冻干样品以5mg/mL的浓度溶解在超纯水中。流动相A为100％乙腈，流动相B为含0.1wt％三氟乙酸的水溶液，以线性梯度方式洗脱：1-5min，100％A；5–20min，1％–11％B；25-30min，100％A，样品在220nm的紫外波长下监测，收集第五个峰即组分B5。

5、LC-MS/MS鉴定抗氧化肽

使用LC-MS/MS对具有强抗氧化活性的组分进行序列鉴定。HPLC流动相由溶液X(含0.1wt％三氟乙酸的水溶液)和Z(含84wt％乙腈和0.1wt％三氟乙酸的水溶液)组成。使用Proteome Discoverer提取数据并用于数据库搜索。组分B5为鉴四条尚未报道的新肽，分别为MYGAVTPVK、NWEKIR、APGIIPR和RWWQLR。

二、实验结果分析

1、鸭肝发酵提取物制备工艺

由图1可知，鸭肝发酵提取物的多肽浓度和DPPH自由基清除率随着发酵时间的延长、接菌量以及液料比的增加都呈现出先上升后下降的趋势，可以看出最适发酵时间在20-50h之间，最佳接菌量为3-5％之间，最佳液料比(m/m)为3:1-5:1之间。为了得到制备鸭肝发酵提取物的最佳发酵条件，在单因素实验结果的基础上，进一步选择接菌量(A)、液料比(B)、发酵时间(C)进行响应面优化试验，响应面方法是一组用于建立经验模型的数学和统计技术。表1为响应面法试验设计与试验结果。利用Design-Expert软件进行多元回归拟合，得到二次多项式回归方程为：y1＝85.89+4.90A+1.35B+2.05C-4.72AB-5.92AC-0.44BC-4.12A2-9.68B2-10.57C2

y2＝1.39+0.049A-0.13B+0.19C+0.040AB+0.038AC+0.13BC-0.14A2-0.053B2-0.15C2其中y1是DPPH自由基清除率，y2是多肽浓度，A、B和C分别是接菌量、液料比和发酵时间的实际独立变量。

通过回归分析将响应函数与实验数据拟合，两者的同时影响选取的变量进行检验，回归方程的方差分析结果如表2所示。在回归系数中，P值越小，F值越大，模型的显着性越高。DPPH自由基清除率模型的F值为86.92，p<0.0001，说明选择的二次多项式模型进行检验具有高度显着性，证明了方法的可靠性。模型误差失拟项中P＝0.4531>0.05,表明该模型“失拟”不显著，同时说明未知因素对实验拟合的干扰较小，实验误差主要来自随机误差。该模型的R-Squared决定系数经统计计算为0.9911，表明模型响应值的99.11％的变化来自所选因变量，并且预测值和实验值之间存在高度相关性。从以上分析得出该模型可以有效预测鸭肝发酵提取物的DPPH自由基清除率。同理可知多肽浓度模型也能够有效预测鸭肝发酵提取物的多肽含量。不同自变量对效应值的影响由方程的回归系数确定。从表2的数据分析可知，在DPPH自由基清除率模型中，方程的一次项和交互项对响应值的影响都极显著(P<0.01)；二次项中除接菌量作用不显著(P>0.05)，其它两项作用均为极显著(P<0.01)。在多肽浓度模型中，方程的一次项对响应值的影响都极显著(P<0.01)，二次项中液料比作用显著(P<0.05)，其他两项为极显著(P<0.01)，交互项中发酵时间和液料比交互作用极显著(P<0.01)。

表1试验设计总结及响应结果

表2响应面二次模型的方差分析

图2为方程中交互项的三维曲面图和二维等高线图，它们可以直观地反映两个因素的交互作用。响应面的坡度可以体现出各因素对响应值的影响程度，响应面的斜率越陡，就代表交互作用对响应值的影响越显著，反之则不显著。两个因素之间的交互作用是否显著则通过其二维等高线图形体现，若等高线呈现的图形越接近椭圆形，表明两因素间的交互作用越显著；而等高线呈现的图形越接近圆形，则表明两因素间的交互作用越不显著^[81]。由图2-(1)可以看出，在DPPH自由基清除率模型中，三个因素的两两交互作用显著(P<0.05)，通过比较等高线密度及比较F值可以得出，三个因素对DPPH自由基清除率的影响大小顺序依次为接菌量>发酵时间>液料比。由图2-(2)可知，在多肽浓度模型中，发酵时间和液料比交互作用显著(P<0.05)，同时通过比较等高线密度及比较F值可以得出三个因素对多肽浓度的影响大小顺序依次为发酵时间>液料比>接菌量。

得到最佳发酵条件：接种量为4.33％，液料比为3.83:1，发酵时间为38.66h。同时，鸭肝发酵提取物的DPPH自由基清除率为86.33％，肽含量为1.44mg/mL。在此最佳发酵条件下进行三次试验验证，测得鸭肝发酵提取物的DPPH自由基清除率为87.46％，肽浓度为1.39mg/mL，与理论值误差较小，说明该回归模型拟结果可靠。

2.鸭肝发酵提取物的抗氧化活性分析

肽的自由基清除活性可以反映其抗氧化活性。在这项研究中，我们通过测量其DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性和羟基自由基清除活性来评估鸭肝发酵提取物的抗氧化活性。我们通常在517nm处测量DPPH自由基清除活性，其中DPPH自由基显示出最大吸收。当DPPH自由基与质子供体底物(例如抗氧化剂)反应时，自由基被清除，导致吸光度下降。DPPH自由基清除活性已成为评估许多食品和天然提取物抗氧化性能的常用指标。鸭肝发酵提取物清除DPPH自由基的能力如图3-(1)所示，可以看到1.0mg/mL DFE的DPPH自由基清除活性接近61％，虽然低于相同浓度的GSH(80.23％)，但依然高于许多其他蛋白质水解物。ABTS的氧化反应会产生有色阳离子自由基，其在734nm处显示最大吸光度。当溶液中存在抗氧化剂时，ABTS的氧化作用就会受到抑制，抗氧化活性越强，抑制作用越明显。如图3-(2)所示，在本实验中我们测得1mg/mL GSH的ABTS自由基清除活性为90.87％。DFE也具有较强的ABTS自由基清除活性，在相同浓度下可达74.76％。活性最强的自由基之一是羟基自由基，它会对周围的生物分子造成严重的破坏，容易引发癌症、衰老等不良反应。由图3-(3)可知，1mg/mL DFE的羟基自由基清除能力(28.78％)低于相同浓度下的GSH(37.54％)，但鸭肝发酵提取物的羟基自由基清除能力强于已报道的几种水解产物。例如，在5mg/mL浓度下，从鸭胗中获得的肽的羟基自由基清除活性经测量为19.84％。可以看到本实验制备的发酵鸭肝提取物抗氧化性强于以上研究报导的通过酶解法制备得到的蛋白水解物。综上所述，鸭肝发酵提取物中的粗肽具有较好的抗氧化活性。因此，我们对鸭肝发酵提取物进行进一步的分离纯化，以获得特定的抗氧化片段。

3.鸭肝源抗氧化肽的分离纯化

首先，将鸭肝发酵后制备得到鸭肝发酵提取物经凝胶过滤色谱(GPC)分离后得到的分子量分布如表3所示。

表3鸭肝发酵物的分子量分布

从表中数据可知，鸭肝蛋白经纳豆芽孢杆菌发酵后大部分被分解为分子量较小的多肽，其中分子量小于1000Da的部分达到85.37％。已经有研究表明多肽分子量的大小与其生物学活性密切相关，相对来说分子量较小的多肽更加有利于机体的吸收，同时也能更好的发挥其生物学活性。

然后，根据鸭肝发酵提取物的分子量分布，我们选择使用填充有Sephadex G-15的色谱柱对其进行初步分离。结果如图4-(1)所示。DFE经分离后的得到四个组分，分别为A1、A2、A3和A4。分别收集四个组分然后冻干，随后测定各组分的自由基清除能力。各个组分的自由基清除能力测定结果如图4-(2)所示。可以看到，组分A3的DPPH自由基清除率最高，高于同浓度下的GGSH。此外，比较各组分的ABTS自由基清除活性，组分A3的活性同样高于其他三个组分。由羟基自由基清除活性测定结果可知，A3组分的羟基自由基清除活性略低于A4组分，但A3组分的活性仍显著(P<0.05)高于其他两个组分。根据以上结果综合分析可知，在四个组分中A3表现出最强的抗氧化活性，因此选择经Sephadex G-15分离后的A3组分进行进一步的分离纯化。

RP-HPLC由于具有高灵敏度和高速度，常被用来纯化小分子和生物活性物质，它对于小分子肽类有较好的分离效果，通常作为分离纯化的关键一步。在本研究中，我们使用RP-HPLC进一步纯化组分A3。如图4-(3)所示，组分A3被分成五个不同的馏分，即B1-B5。然后测定各个组分的自由基清除活性，结果如图4-(4)，可以看出，整体抗氧化活性最强的组分为B5，其DPPH自由基清除活性、羟基自由基清除活性和ABTS自由基清除活性分别为58.26％、34.26％和93.43％，活性均高于其他四个组分。B5的保留时间最长，这与You等人报道的结果相似，其研究表明反相柱洗脱保留时间最长的组分具有较强的抗氧化活性，这可能与组分中含有的疏水性氨基酸有关。为了继续研究组分B5的结构，使用LC-MS/MS进一步鉴定其氨基酸序列。

4.鸭肝源抗氧化肽氨基酸序列鉴定及活性验证

我们使用LC-MS/MS鉴定了具有最高抗氧化活性的组分B5来表征它们的氨基酸序列。根据数据库搜索和计算，鉴定出四条尚未报道的新肽，分别为MYGAVTPVK、NWEKIR、APGIIPR和RWWQLR，图5为这四种新肽的MS/MS谱图。为了研究它们的抗氧化活性测定了它们的DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性和总抗氧化能力(T-AOC)。测定结果如表4所示，可以看出四条多肽均具有一定的抗氧化活性。其中，NWEKIR和MYGAVTPVK抗氧化活性较强。它们的DPPH自由基清除率分别为87.44％和89.65％。其中，NWEKIR的DPPH自由基清除率接近阳性对照GSH(90.35％)。NWEKIR表现出最强的ABTS自由基清除能力，达到90.36％，高于阳性对照GSH(90.26％)。NWEKIR和MYGAVTPVK的T-AOC值为0.57432mmol/g pro和0.54345mmol/g pro，与阳性对照GSH(0.59095mmol/g pro)接近。同理，其余两种多肽也具有较好的抗氧化效果。已经有研究证明肽的抗氧化活性通常与其相对分子量、氨基酸序列和疏水性密切相关。由表4可以看出，从B5组分中分离鉴定出的四条抗氧化肽由6-9个氨基酸组成，其相对分子量范围为723.45-981.51Da，有研究表明食源性抗氧化肽的分子量大部分都集中在2000Da以下。正如Sarmadi等人的研究发现典型的抗氧化肽通常是由2-20个氨基酸残基组成的短链肽，这与我们的研究结果一致。在Lin等人的实验中，研究人员利用碱性酶水解蛋清得到酶解液。

表4鸭肝抗氧化肽的抗氧化能力

5.计算机评估多肽理化性质及其生物学活性

对4条新的鸭肝源抗氧化肽的理化性质及其生物活性进行计算机评估，以进一步探索其性质。计算机评估的多肽理化性质如表5所示，可以看到P1和P4为两亲性；P2和P3具有疏水性。除P4外，其他多肽(P1-P3)的不稳定系数均低于40，表明这些肽在体外是稳定的。P1-P4的脂肪族指数为65-125.71，说明这四条肽的热稳定性良好。P1-P4的净电荷为+1或+2，等电点的范围为9.58-12.48。计算机评估的多肽生物活性如表6所示，可以看到鉴定的四条肽都具有ACE抑制和抗氧化作用。使用SwissTargetPrediction工具分析多肽序列，其可以鉴定靶向表面抗原、膜受体和氧化还原酶。P3最可能的作用靶点是HLAⅠ类组织相容性抗原，其余三种肽最可能的作用靶点为神经降压素受体。

表5计算机模拟得到抗氧化肽的理化性质

表6计算机模拟得到抗氧化肽的生物学活性

6、4条多肽对自由基的分子对接作用研究

分子对接技术已广泛用于研究抗氧化肽与自由基的相互作用，该研究在抗氧化肽衍生物的设计和开发中具有许多潜在应用。我们使用AutoDockTools软件研究了四条抗氧化肽与自由基(DPPH和ABTS)的对接作用。以这四条肽作为抗氧化活性物质的靶分子，然后确定了靶分子与配体的活性对接构象之间的基本结合作用。

如图6-(1)和6-(2)所示，基于对接后的最小结合能，我们得到了四条肽和两种分子(DPPH和ABTS)的最佳结合构型。四条肽(MYGAVTPVK、NWEKIR、APGIIPR和RWWQLR)与DPPH的结合能分别为-3.3kcal/mol、-4.0kcal/mol、-3.9kcal/mol和-4.5kcal/mol；与ABTS的结合能分别为-4.1kcal/mol、-4.8kcal/mol、-4.6kcal/mol和-4.7kcal/mol。据报道，配体通过不同的分子间作用力与受体相互作用，如疏水相互作用、范德华力、氢键、π键和静电相互作用，其中氢键相互作用可能最强。分子对接结果如图所示，多肽与靶分子(DPPH和ABTS)之间存在氢键和疏水相互作用等多种作用力。如图6-(1)所示，MYGAVTPVK中的MET1残基与ABTS形成氢键，VAL残基与ABTS具有Pi-Sigma和烷基相互作用。同时，NWEKIR和ABTS之间也形成了氢键，NWEKIR中的APG6和ILE5残基与ABTS形成三个氢键，其他氨基酸残基与ABTS之间存在盐桥和Pi-烷基等相互作用。APGIIPR与ABTS之间存在氢键和Pi-烷基相互作用力，其中ARG7和GLY3残基与ABTS之间形成了氢键。RWWQLR的GLN4残基与ABTS也存在氢键作用。从图6-(2)可以看到，除了RWWQLR以外，其他三条多肽都与DPPH之间存在氢键作用。MYGAVTPVK的GLY2、TRY3和MET1残基与DPPH形成了四个氢键。MYGAVTPVK的VAL残基和DPPH之间存在Pi-烷基和pi-sigma相互作用。NWEKIR的TRP2、ILE和ARG6残基与DPPH形成四个氢键，并且其LYS4和ILE5残基与DPPH之间存在π-烷基相互作用。APGIIPR的GLY3残基与DPPH之间形成了两个氢键。Zheng等人的研究显示，色氨酸、蛋氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸的存在是影响多肽抗氧化特性的重要因素。可以看到这些氨基酸残基往往是多肽与靶分子的结合位点。非共价接触的存在可以最大限度地提高配体和靶标在体外或体内的结合亲和力。同时，氢键相互作用力在酶催化反应和对接复合物的稳定中起着至关重要的作用。以上分析结果表明，鸭肝抗氧化肽主要通过其氨基酸残基与自由基分子之间形成氢键发生相互作用。

7、4条鸭肝源抗氧化肽对细胞氧化应激的保护作用

肝脏作为人体重要的代谢场所，对于外源性物质的代谢和生物转化至关重要。肝毒性机制可能因线粒体功能障碍、线粒体膜电位丧失、ATP产生、ROS产生和DNA损伤而显现。HepG2细胞是从人类肝脏细胞瘤中分离出来的细胞株，具备高度分化、无病毒感染的特点，其生物转化活性与代谢等功能都与人原代肝细胞类似。并且HepG2细胞保留了外源代谢酶的全部补体，因此可以充当人类肝毒性的相关细胞模型。如今，HepG2细胞系已被广泛用作细胞模型来测量体外几种异生物质的细胞毒性。因此，使用不同浓度的H₂O₂溶液刺激细胞并测定其存活率，结果如图7-(1)所示。由结果可知经H₂O₂处理后的细胞存活率明显降低，表明H₂O₂对HepG2细胞的生长有抑制作用，并且随着其浓度的增加，对细胞生长的抑制作用就越强。使用浓度为600μM的H₂O₂溶液刺激4h后，测得细胞存活率降低至50.72％，接近半数抑制浓度。因此本实验选定浓度为600μM的H₂O₂刺激HepG2细胞构建氧化损伤模型。通常需要通过测定细胞存活率表示刺激物对细胞毒性的强弱。通过发酵鸭肝制备的抗氧化肽处理后的HepG2细胞存活率如图7-(2)所示。多肽的处理对细胞的生长有一定的抑制作用，但是可以看到经过多肽处理后的细胞存活率均超过90％，说明本实验合成的多肽对HepG2细胞没有产生毒害作用，可以进行后续实验。

测定经H₂O₂和不同多肽处理后的HepG2细胞存活率，结果如图7-(3)所示。经过H₂O₂处理的氧化损伤组的细胞存活率约为空白组的一半，说明细胞生长受到较强的抑制作用。使用鸭肝肽处理后的样品组细胞存活率与损伤组相比均有所升高，说明鸭肝肽对H₂O₂诱导的氧化损伤作用有一定的抑制作用，并且随着多肽浓度的增加抑制作用也逐渐增强。可以看到使用浓度为1mg/mL的P1和P2处理细胞后，细胞存活率分别提升至85.37％和83.27％，表明本实验合成抗氧化肽能够有效抑制H₂O₂的氧化损伤作用。

活性氧(ROS)，如超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧，是生物体细胞的重要组成部分，在涉及细胞信号传导和体内平衡的生理过程中发挥双重作用。在低浓度下，ROS可以作为生长因子和细胞内信号分子。当机体内过量的ROS积累会导致正常组织损伤并且影响正常的代谢和生理功能。经过不同处理的HepG2细胞内ROS含量如图7-(4)所示。可以看到经过H₂O₂处理的损伤组细胞内ROS的含量提高至空白组的1.58倍，说明细胞受到了较强的氧化损伤作用。添加了GSH的阳性对照组的细胞内ROS的含量较损伤组明显下降，仅为空白组的1.13倍。另外添加了抗氧化肽的样品组其细胞内ROS的含量也显著(P<0.05)下降，其中P1样品组ROS含量下降效果最显著(P<0.05)，仅为空白组的1.08倍。说明这四条鸭肝抗氧化肽均可以通过减少细胞内ROS的生成来有效抑制H₂O₂诱导的氧化损伤作用。与Wang等的研究结果一致，他们发现玉米蛋白肽组分在受氧化损伤的HepG2细胞中显示出较强的ROS清除能力。

为了对抗和预防氧化应激，细胞含有复杂的细胞内抗氧化防御系统。其中抗氧化酶系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)等。SOD通过消除氧自由基使机体抵抗氧化损伤作用，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，测定结果如表7所示，

表7抗氧化酶酶活及MDA含量

由表7可知，空白组细胞内SOD水平为55.22±0.96U/mg pro，而受到H₂O₂刺激的氧化损伤组细胞内SOD活性显著下降(P<0.05)至16.6±0.66U/mg pro。经过多肽处理后的样品组和阳性对照组细胞内SOD活性值均比损伤组显著升高(P<0.05)。其中P1组SOD水平升高的最多，测定为39.64±0.79U/mg pro，高于阳性对照组(37.37±0.76U/mg pro)。据报道，CAT是一种普遍存在于几乎所有生物体内的一种抗氧化酶，它可以通过将H₂O₂转化为H₂O有效降低机体内的氧化损伤作用。从表中数据可以看到，经过抗氧化肽(P1-P4)处理后的样品组相对于损伤组细胞内CAT的活性值(9.32±0.48U/mg prot)有显著提高(P<0.05)，四条抗氧化肽中P1和P2的作用效果更明显。GSH-Px可以通过清除脂类氢过氧化物和H₂O₂减轻氧化损伤作用对机体的伤害。从表中结果可知，细胞受到氧化损伤后GSH-Px活性对比空白组显著下降(P<0.05)。加入抗氧化肽处理后，各样品组细胞内GSH-Px活性值均显著上升(P<0.05)。

丙二醛(MDA)是机体发生脂质过氧化作用的产物，其具有细胞毒性、诱变性和致癌性。生物体组织中丙二醛的形成以及脂质氧化的规模和速率受到许多内源和外源因素的影响。本实验测定了经过不同处理后HepG2细胞内MDA的含量，可以在一定程度上反应细胞内抗氧化系统的变化情况。由表7中测定结果可知，经过氧化损伤处理的细胞其MDA含量较空白组显著上升(P<0.05)，而加入抗氧化肽处理后的样品组的细胞内MDA含量显著降低(P<0.05)。表明抗氧化肽可以有效抑制脂质过氧化作用的发生。这些抗氧化酶的活性水平已被用来量化细胞中的氧化应激反应。可以看到，本实验分离纯化的抗氧化肽能够提高抗氧化酶系SOD、CAT和GSH-Px的活性，同时抑制脂质氧化产物MDA的产生，有效抑制细胞内的氧化损伤作用。

8.抗氧化肽对HepG2细胞中细胞因子(TNF-α和IL-1β)含量的影响

由图7-(5)可知，经H₂O₂处理后的细胞内TNF-α含量高达313.37±3.33pg/mL，显著(P<0.05)高于空白组和样品组。经过鸭肝分离肽处理后的样品组细胞内TNF-α水平显著下降(P<0.05)，其中P2处理组抑制效果最好，TNF-α含量下降至130.38±2.84pg/mL。同样的，由图7-(6)可知，损伤组的IL-1β水平与空白对照组(23.37±1.85pg/mL)相比显著升高(P<0.05)，达到59.27±2.31pg/mL，经多肽处理过的样品组内IL-1β水平均显著下降(P<0.05)。其中P1处理后的样品组其IL-1β水平下降到28.38±1.95pg/mL，抑制效果显著(P<0.05)。因此可以看到，鸭肝肽能够有效减少炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生，从而起到一定的抗炎作用。

9、肽MYGAVTPVK处理后的细胞内抗氧化酶mRNA的表达

抗氧化酶的激活被认为在预防与氧化应激和炎症相关的疾病方面具有治疗潜力。MYGAVTPVK在本研究中被证明具有较好的抗氧化活性，因此，我们假设MYGAVTPVK通过激活抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-Px)来抑制H₂O₂诱导的氧化应激反应。为了测试这一点，使用MYGAVTPVK预处理HepG2细胞，然后再用H₂O₂刺激细胞4h，并通过RT-PCR检测SOD、CAT和GSH-Px的基因转录。结果如图7-(7)所示，单独使用H₂O₂处理的氧化损伤组其SOD、CAT和GSH-Px的mRNA水平最低，表明H₂O₂增加了氧化应激。然而，经过多肽MYGAVTPVK预处理能够以明显的浓度依赖性方式上调这些抗氧化酶的基因表达，结果与先前关于抗氧化剂的报道类似。与空白对照组相比，使用多肽处理后的样品组处理的细胞显示SOD、CAT和GSH-Px的mRNA水平显著增加(P<0.05)，这与抗氧化酶活性值测定实验结果相一致。可以看到，本实验通过发酵鸭肝制备的多肽通过增强细胞抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)的活性来抑制H₂O₂诱导的细胞氧化损伤作用。如图7-(8)所示，鸭肝抗氧化肽具有抗氧化作用，其通过上调细胞内CAT和GSH-Px的mRNA表达水平来抑制细胞内的氧化损伤作用。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种鸭肝源抗氧化功能肽，其特征在于：包括MYGAVTPVK、NWEKIR、APGIIPR和RWWQLR中的至少一种肽。

2.一种权利要求1所述的鸭肝源抗氧化功能肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)将鸭肝接种纳豆芽孢杆菌发酵制得鸭肝发酵提取物；

3.根据权利要求2所述的一种鸭肝源抗氧化功能肽的制备方法，其特征在于步骤(1)具体为：挑取纳豆芽孢杆菌接种到营养肉汤液体培养基中，在37℃、200r/min条件下摇床培养18h，连续传代三次，调整菌体浓度至1×10⁸CFU/mL，于4℃，5000rpm离心5min去上清，并用无菌生理盐水洗涤3次，再用无菌生理盐水恢复原浓度，制备得到纳豆芽孢杆菌菌悬液。

4.根据权利要求2所述的一种鸭肝源抗氧化功能肽的制备方法，其特征在于步骤(2)具体为：将鸭肝用清水洗净，用剪刀去除鸭肝结缔组织，按照料液比1g:3.83mL的比例加入水制成匀浆，121℃高温高压灭菌15min，按照体积百分数4.33％的接种量接种纳豆芽孢杆菌菌悬液，于37℃摇床200r/min培养发酵38.66h，发酵结束后，于4℃，10000rpm，离心10min，离心后将上清液过0.22μm滤膜，制得鸭肝发酵提取物。

5.根据权利要求2所述的一种鸭肝源抗氧化功能肽的制备方法，其特征在于步骤(3)具体为：将鸭肝发酵提取物采用Sephadex G-15凝胶色谱纯化分离，上样前使用超纯水平衡色谱柱，同时采用超纯水作为洗脱缓冲液，流速调节至2mL/min，样品检测吸光度设置为220nm，并使用自动馏分收集器收集馏分，收集第3个吸收峰得到抗氧化肽分离物。

6.根据权利要求2所述的一种鸭肝源抗氧化功能肽的制备方法，其特征在于步骤(4)具体为：将抗氧化肽分离物冻干样品用蒸馏水配置成5mg/mL的溶液，用0.22μm超滤膜过滤并超声脱气后，使用RP-HPLC进行纯化，柱温设置为40℃，流动相A为100％乙腈，流动相B为含0.1wt％三氟乙酸的水溶液，以线性梯度方式洗脱：1-5min，100％A；5–20min，1％–11％B；25-30min，100％A，检测波长为样220nm，收集第五个峰，经LC-MS/MS鉴定为MYGAVTPVK、NWEKIR、APGIIPR和RWWQLR。

7.一种权利要求1所述的鸭肝源抗氧化功能肽在制备抗氧化药物和/或抗炎药物方面的应用。

8.权利要求7所述的一种鸭肝源抗氧化功能肽在制备抗氧化药物和/或抗炎药物方面的应用，其特征在于：所述的鸭肝源抗氧化功能肽在制备H₂O₂氧化损伤抑制剂方面的应用、制备脂质氧化产物MDA抑制剂方面的应用和/或制备炎性细胞因子TNF-α和/或IL-1β抑制剂方面的应用。

9.权利要求7所述的一种鸭肝源抗氧化功能肽在制备抗氧化药物和/或抗炎药物方面的应用，其特征在于：所述的鸭肝源抗氧化功能肽在制备抗氧化酶系SOD、CAT和/或GSH-Px活性提高药物方面的应用。

10.一种权利要求1中肽MYGAVTPVK在制备细胞内CAT和GSH-Px的mRNA表达促进剂方面的应用。