CN115806538A

CN115806538A - 马齿苋萜类组合物、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN115806538A
Application number: CN202211452572.4A
Authority: CN
Inventors: 顾葵; 庄泽林; 马锋潮; 陆宗宏; 许翔宇; 姚托
Original assignee: Nox Bellcow Cosmetics Co Ltd
Current assignee: Nox Bellcow Cosmetics Co Ltd
Priority date: 2022-11-21
Filing date: 2022-11-21
Publication date: 2023-03-17

Abstract

本发明公开了一种具有抗炎、舒缓功效的马齿苋萜类组合物的制备方法及应用。本发明还公开了一种具有抗炎、舒缓功效的马齿苋提取物的制备方法及应用。本发明所公开的马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物在抗炎、舒缓方面效果优秀，组合物中的马齿苋倍半萜表现出显著的协同作用，在抗炎、舒缓方面具有重要的应用价值。本发明公开的马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物及其制剂可广泛作为具有抗炎、舒缓类化妆品或药品的原料。

Description

马齿苋萜类组合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及马齿苋倍半萜及马齿苋提取物的制备方法及马齿苋提取物、马齿苋萜类组合物在抗炎、舒缓化妆品或药品中的应用。

背景技术

皮肤瘙痒症、湿疹及特应性皮炎等皮肤疾病多是在全身或局部皮肤有皮肤瘙痒症状，几乎伴有每日瘙痒及持续时间较长的皮肤疾病。针对皮肤瘙痒症、湿疹及特应性皮炎，西医主要用类肝素制剂、外用糖皮质激素、抗组胺药、阿片受体拮抗剂等治疗，虽药效良好、迅速，但副作用明显。

马齿苋(Portulaca oleracea L.)含有多种活性物质，主要包括：黄酮、萜类、有机酸等，具有抗炎、抑菌、抗氧化的作用。马齿苋作为一种传统中草药，具有清热解毒、消肿散结的疗效，临床上可多用于治疗妇科疾病、皮肤病等，多存在于食品、方剂和护肤品中。大量研究报道，马齿苋含有的黄酮及其苷类化合物具有抗氧化、抗炎活性，但马齿苋中含有的萜类化合物的抗炎、舒缓活性却鲜有研究及报道。

萜是一大类碳氢化合物，多为有香味的液体，主要是由植物产生的，尤其是裸子植物；但有些昆虫也可以产生萜类，如燕尾蝶。倍半萜类化合物分布较广，在木兰目(Magnoliales)、芸香目(Rutales)、山茱萸目(Cornales)及菊目(Asterales)植物中最丰富，其在植物体内常以醇、酮、内酯等等形式存在于挥发油中，是挥发油中高沸点部分的主要组成部分，多具有较强的香气和生物活性，是医药、食品、化妆品工业的重要原料。

因此，有必要基于活性追踪方法对马齿苋抗炎、舒缓类活性成分进行分离、提取，获得抗炎、舒缓类活性更佳马齿苋活性提取物，以开发具有重要应用价值的抗皮肤瘙痒、抗炎、舒缓类的化妆品或者药物。

发明内容

本发明的发明目的之一是提供利用活性(分析)追踪法制备的马齿苋倍半萜及其制备方法；本发明的另一发明目的是提供通过活性分析制备的马齿苋提取物；本发明的再一发明目的是提供马齿苋提取物、马齿苋倍半萜、以及马齿苋萜类组合物在制备抗炎、舒缓类化妆品或药品中的应用。

一方面，为了实现上述的发明目的，本发明提供了由马齿苋通过活性追踪法制备的、下述结构式中式I至式IV所示的马齿苋倍半萜，其中：

式I所示的马齿苋倍半萜命名为马齿苋倍半萜-1：

式II所示的马齿苋倍半萜命名为马齿苋倍半萜-2：

式III所示的马齿苋倍半萜命名为马齿苋倍半萜-3：

式IV所示的马齿苋倍半萜命名为马齿苋倍半萜-4：

另一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种制备马齿苋提取物以及上述马齿苋倍半萜的方法，其中，马齿苋倍半萜是在马齿苋提取物的基础上制得的。本发明中，马齿苋提取物是通过包括如下步骤的方法利用活性分析法制备的：

(1)将新鲜马齿苋粉碎；

(2)粉碎后的马齿苋用乙醇-水进行渗漉(渗漏)提取；

(3)合并减压浓缩步骤(2)所得的提取液，得到浸膏；

(4)用水混悬步骤(3)所得的浸膏，得到混悬液；

(5)步骤(4)所得的混悬液依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，萃取液浓缩后分别得石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物；

(6)将乙酸乙酯萃取物通过硅胶柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，得到若干馏分；

(7)构建2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的损伤模型，评价步骤(6)所得各馏分的活性；

(8)将步骤(7)中具有最佳保护活性的馏分进一步用凝胶柱分离，并采用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到若干馏分；

(9)基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价步骤(8)所得各馏分的保护活性；

其中，步骤(9)中具有最佳保护活性的馏分即为本发明的马齿苋提取物。

进一步地，本发明在制备出上述马齿苋提取物的基础上，制备出上述的马齿苋倍半萜，其方法包括：

A、提供上述的马齿苋提取物；

B、将步骤A中的马齿苋提取物用制备型HPLC分离纯化得式I所示的马齿苋倍半萜-1、式II所示的马齿苋倍半萜-2、式III所示的马齿苋倍半萜-3、以及式IV所示的马齿苋倍半萜-4。

更具体地，本发明的马齿苋倍半萜、马齿苋提取物是基于2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)损伤模型，采用活性评价追踪方法提取、分离得到的：

将新鲜马齿苋(全株)、粉碎后用不同浓度乙醇浸渍提取，将提取液浓缩后得到总浸膏；

基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价不同浓度乙醇-马齿苋提取物保护活性；

将具有最佳保护活性的乙醇-马齿苋提取物浸膏用适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩得石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物；

基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价马齿苋提取物石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物保护活性；

将具有最佳保护活性的马齿苋乙醇提取物-乙酸乙酯萃取物通过硅胶柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，得到Fr.1-11；

基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价Fr.1-11的保护活性；

将具有最佳保护活性的Fr.4采用Sephadex LH-20凝胶柱分离，采用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱，得到Fr.4-1-Fr.4-10；

基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价Fr.4-1-Fr.4-10的保护活性；

将具有最佳保护活性的Fr.4-5采用制备型HPLC(MeOH-H₂O)分离纯化得式I、式II、式III、式IV所示化合物。

其中，步骤(2)种马齿苋与渗漏提取所用乙醇的质量比可以为1:(10-50)；用于渗漏提取马齿苋所用酒精为含15％-75％乙醇的酒精(乙醇：水-V:V)，优选为含20％-50％乙醇的酒精(乙醇：水-V:V)，更优选为含25％-35％乙醇的酒精(乙醇：水-V:V)，最优选为含28％-32％乙醇的酒精(乙醇：水-V:V)。例如，所用酒精可以含30％的乙醇(乙醇：水-V:V)。

步骤(6)中，乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱分离时，选用硅胶为80-100目或200-300目或300-400目；优选的硅胶为200-300目。

步骤(8)中，对步骤(7)中具有最佳保护活性的馏分采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇(100∶10→10∶100)梯度洗脱，优选用氯仿-甲醇(100∶50→50∶100)梯度洗脱。

步骤B中，将步骤(9)中评价出的具有最佳保护活性的馏分(即本发明的马齿苋提取物)经制备型HPLC(MeOH-H₂O)分离纯化得式I、式II、式III、式IV所示化合物。

而马齿苋萜类组合物的制备则看将式I、式II、式III、式IV所示的马齿苋倍半萜化合物按比例混合即可。

本发明中，所提及的活性泛指能够提高皮肤成纤维细胞抗炎、抗氧化等方面的活性。

作为本发明制备方法的一种具体实施方式，可采用鲜马齿苋10kg，粉碎，用乙醇-水(30％)渗漏提取24小时，合并减压浓缩提取液，得浸膏。总浸膏用适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将各萃取液浓缩后分别得石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物；基于构建的2,4-二硝基氯苯暴露正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)损伤模型，评价石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物保护活性；将具有更佳保护活性的乙酸乙酯萃取物通过硅胶(200-300目)柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯(100:30→30:100)混合溶剂梯度洗脱，得到馏分Fr.1-11；基于前期构建的2,4-二硝基氯苯暴露正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)损伤模型，评价Fr.1-11保护活性；将具有最佳保护活性的Fr.4采用Sephadex LH-20凝胶柱分离，采用氯仿-甲醇(100∶50→50∶100)梯度洗脱，得到Fr.4-1-4-10；基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价Fr.4-1-Fr.4-10的保护活性；具有最佳保护活性的Fr.4-5组分即为本发明中的马齿苋提取物；该马齿苋提取物经制备型HPLC(MeOH-H₂O)分离纯化得式I所示化合物(223mg)、式II所示化合物(235mg)、式III所示化合物(326mg)、式IV所示化合物(279mg)。

在本发明中，马齿苋倍半萜可以从马齿苋中基于活性追踪法分离提取得到，为其制备提供了一个新的途径。

再一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了一种用于抗炎、舒缓的马齿苋萜类组合物，该组合物包括如式I至式IV所示的马齿苋倍半萜中的至少一种。

优选地，在本发明的马齿苋萜类组合物中，其包括式I至式IV所示的马齿苋倍半萜化合物，且式I至式IV所示的各马齿苋倍半萜化合物的质量比为1:(1-100):(1-100):(1-100)。因为发明人通过比较实验结果发现，同等浓度条件下马齿苋萜类组合物的保护活性强于马齿苋倍半萜单体的保护活性。发明人认为马齿苋萜类组合物可能存在协同效应，在同等浓度条件下对提高细胞的抗氧化剂抗炎活性强于同等浓度的单体倍半萜类化合物。

进一步优选地，在本发明的马齿苋萜类组合物中，式I至式IV所示的马齿苋倍半萜的质量比为1:(1-50):(1-50):(1-50)。例如，在本发明的马齿苋萜类组合物中，式I至式IV所示的马齿苋倍半萜的质量比大致为1:1:1:1，但此处并非是严格执行的比例，可以上下有一定的波动。

本发明中，马齿苋萜类组合物表现出协同增效作用。

又一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还提供了上述马齿苋提取物或上述马齿苋萜类组合物在制备抗炎、舒缓类化妆品或药品中的应用。

在本发明的应用中，该应用可通过提高NHDF细胞活力、抑制NHDF细胞内ROS含量、抑制NHDF细胞炎性细胞因子分泌、抑制NHDF细胞NLRP3炎症小体激活、抑制NHDF细胞NF-κB信号通路激活、和/或调控NHDF细胞Bcl-2家族蛋白表达及抑制细胞凋亡而得以实现。

在本发明的应用中，用于抗炎、舒缓类的化妆品或药品可为外用制剂，其形式可为喷剂、慕斯、膏剂、乳剂、或液体制剂等。

在本发明的应用中，抗炎所涉及的炎症是指皮肤炎症，包括皮肤干燥症、皮炎、荨麻疹、湿疹、和浅部真菌感染等。

在本发明的应用中，抗炎、舒缓的药品可以为复方制剂，其包括辅料以及上述的马齿苋萜类组合物或上述的马齿苋提取物。

在本发明的应用中，马齿苋萜类组合物或马齿苋提取物可以作为化妆品或护肤品的添加剂，加入至化妆品或护肤品中，作为抗炎、舒缓的有效成分。

本发明的马齿苋萜类组合物、马齿苋提取物能够抑制DCNB诱导的NHDF细胞炎性因子过度分泌及氧化应激，发挥抗炎、舒缓活性。

本发明的马齿苋萜类组合物、马齿苋提取物能够抑制皮肤瘙痒模型小鼠皮肤瘙痒，抑制炎性因子过度分泌及氧化应激，发挥抗炎、舒缓保护活性。因此本发明的马齿苋萜类组合物、马齿苋提取物可应用于制备抗炎、舒缓、缓解皮肤瘙痒类化妆品或药物。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明的马齿苋萜类组合物、马齿苋提取物能显著抑制皮肤瘙痒模型小鼠炎性细胞因子的过度分泌及炎性、氧化损伤；

(2)本发明的马齿苋萜类组合物、马齿苋提取物能显著减少皮肤瘙痒模型小鼠搔抓次数；

(3)本发明的马齿苋萜类组合物抗炎、舒缓活性强于马齿苋倍半萜单独使用，强于市售马齿苋提取物。

下面结合具体实施方式和附图对本发明技术方案进行清楚、完整描述。本领域技术人员可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅是本发明一部分的实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明的精神，本领域的普通技术人员可以在不作出创造性劳动的前提下进行相应的替换、变换、改变或改进，但这些替换、变换、改变或改进，仍属于本发明的保护范围。

附图说明

图1是马齿苋倍半萜-1的HR-ESI-MS谱图；

图2是马齿苋倍半萜-1的¹H-NMR谱图；

图是3马齿苋倍半萜-1的¹³C-NMR谱图；

图4是马齿苋倍半萜-1的HMBC谱图；

图5是马齿苋倍半萜-1的NOESY谱图；

图6是马齿苋倍半萜-2的HR-ESI-MS谱图；

图7是马齿苋倍半萜-2的¹H-NMR谱图；

图8是马齿苋倍半萜-2的¹³C-NMR谱图；

图9是马齿苋倍半萜-2的HMBC谱图；

图10是是马齿苋倍半萜-2的NOESY谱图；

图11是马齿苋倍半萜-3的HR-ESI-MS谱图；

图12是马齿苋倍半萜-3的¹H-NMR谱图；

图13是马齿苋倍半萜-3的¹³C-NMR谱图；

图14是马齿苋倍半萜-3的HMBC谱图；

图15是马齿苋倍半萜-3的NOESY谱图；

图16是马齿苋倍半萜-4的HR-ESI-MS谱图；

图17是马齿苋倍半萜-4的¹H-NMR谱图；

图18是马齿苋倍半萜-4的¹³C-NMR谱图；

图19是马齿苋倍半萜-4的HMBC谱图；

图20是马齿苋倍半萜-4的NOESY谱图；

图21是马齿苋萜类组合物增强DCNB诱导的NHDF细胞活力、抑制ROS过量产生的示意图；

图22是马齿苋萜类组合物抑制DCNB诱导的NHDF细胞炎性细胞因子过量分泌的示意图；

图23是马齿苋萜类组合物抑制DCNB诱导的NHDF细胞NLRP3炎症小体激活的示意图；

图24是马齿苋萜类组合物抑制DCNB诱导的NHDF细胞NF-κB信号通路激活的示意图；

图25是马齿苋萜类组合物调控DCNB诱导的NHDF细胞Bcl-2家族蛋白表达及抑制细胞凋亡的示意图；

图26是马齿苋萜类组合物调控DCNB诱导的小鼠炎性因子过量分泌的示意图。

具体实施方式

实施例1马齿苋提取物的分离、制备

新鲜马齿苋10kg，粉碎，30％乙醇(60L)的渗漏提取24h，合并减压浓缩提取液，得浸膏810g。用水溶解浸膏得混悬液，总浸膏用适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将各萃取液浓缩后分别得石油醚萃取物(123g)，乙酸乙酯萃取物(311g)。

构建的DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价马齿苋提取物石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物保护活性。

将具有最佳保护活性的马齿苋提取物乙酸乙酯萃取物通过硅胶柱(200-300目)层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯(100:30→30:100)混合溶剂梯度洗脱，得到Fr.1-11。

基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价Fr.1-11的保护活性。

将具有最佳保护活性的Fr.4采用Sephadex LH-20凝胶柱分离，采用氯仿-甲醇(100∶50→50∶100)梯度洗脱，得到Fr.4-1-4-10。

基于DNCB诱导的NHDF细胞损伤模型，评价Fr.4-1～4-10的保护活性。

具有最佳保护活性的Fr.4-5组分即为本发明中的马齿苋提取物。

实施例2马齿苋倍半萜分离、制备

将实施例1获得的马齿苋提取物经制备型HPLC(MeOH-H₂O)分离纯化得式I所示化合物(223mg)、式II所示化合物(235mg)、式III所示化合物(326mg)、式IV所示化合物(279mg)。

马齿苋倍半萜-1：

请参阅图1-图5。

白色粉末，HR-ESI-MS m/z 517.2412[M+Na]⁺(calcd.for C₂₆H₃₈O₉Na,517.2408)，推测其分子式为C₂₆H₃₈O₉。¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)图谱中，δ_H 5.45(1H,m,H-1)、5.80(1H,dd,J＝10.5,8.3Hz,H-6)、4.97(1H,dd,J＝9.7,3.2Hz,H-8)和5.35(1H,d,J＝3.2Hz,H-9)为四个连氧的次甲基或亚甲基的质子信号。δ_H 6.26(1H,d,J＝3.2Hz,H-13a)和5.85(1H,d,J＝3.2Hz,H-13b)为两个相互耦合的末端烯氢信号。δ_H 2.05(1H,dd,J＝16.2,7.0Hz,H-2″′a)和2.15(1H,dd,J＝16.2,7.0Hz,H-2″′b)为两个相互耦合的亚甲基偕质子信号，δ_H 0.90(3H,d,J＝6.7Hz,H-4″′)、0.91(3H,d,J＝6.7Hz,H-5″′)、1.26(3H,d,J＝7.1Hz,H-3″)、1.24(3H,d,J＝7.1Hz,H-4″)、1.29(3H,s,H-15)、1.81(3H,s,H-14)及1.97(3H,s,H-2′)处为七个甲基的氢信号。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)共有26个碳信号。δ_C 137.0(C-11)、123.7(C-13)为两个烯碳信号；δ_C 19.3(C-3″)、19.2(C-4″)、22.5(C-4″′)、21.9(C-5″′)、22.7(C-2′)、22.9(C-15)和28.5(C-14)为七个甲基碳信号。

HMBC图谱中，从δ_H 5.35(H-9)可找到与δ_C 176.9(C-1″′)酯羰基碳远程相关，推测3-甲基丁酯连接在化合物C-9位。

NOESY图谱中，δ_H 1.29(15-αCH₃)与δ_H 1.73(H-5)、3.41(H-7)、4.97(H-8)及5.35(H-9)相关，则确定5、7、8、9位的氢为α构型，δ_H 1.81(14-βCH₃)与δ_H 5.45(H-1)和5.80(H-6)相关，可确定1、6位的氢为β构型。

综上分析，化合物结构鉴定为式I所示化合物，本发明中命名为马齿苋倍半萜-1。

马齿苋倍半萜-2：

请参阅图6-图10。

白色无定形粉末，HR-ESI-MS m/z 515.2254[M+Na]⁺(calcd.for C₂₆H₃₆O₉Na,515.2252)，推测其分子式为C₂₆H₃₆O₉。¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)图谱中，δ_H 5.46(1H,t,J＝8.5Hz,H-1)、5.91(1H,m,H-6)、5.00(1H,dd,J＝9.8,3.1Hz,H-8)和5.43(1H,d,J＝3.1Hz,H-9)处为四个连氧的次甲基或亚甲基的质子信号。δ_H 1.73(1H,m,H-5)和3.42(1H,m,H-7)为两个次甲基的氢信号，δ_H 6.73(1H,m,H-3)、6.21(1H,d,J＝3.2Hz,H-13a)和5.56(1H,d,J＝3.2Hz,H-13b)为三个烯氢信号。δ_H 1.26(3H,s,H-14)、1.31(3H,s,H-15)、1.94(3H,s,H-2’)、1.23(3H,d,J＝6.9Hz,H-3”)、1.20(3H,d,J＝7.0Hz,H-4”)、1.75(3H,d,J＝4.6Hz,H-4”’)及1.74(3H,s,5”’)处有七个甲基质子信号，其中δH 1.26(3H,s,H-14)和1.31(3H,s,H-15)为C-14、C-15位甲基特征氢信号。

¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)共有26个碳信号。δ_C 136.0(C-11)和122.8(C-13)为双键碳信号；δ_C 68.7(C-1)、73.0(C-6)、73.5(C-8)及71.6(C-9)有四个连氧次甲基或亚甲基碳信号。

HMBC图谱中，δ_H 5.43(H-9)与酯羰基碳信号δ_C 166.2(C-1”’)远程相关，可确定2-甲基-2-丁烯酯连接在化合物C-9位。

NOESY图谱中，δ_H 1.31(H-15,β-CH₃)和δ_H 1.26(H-14)、5.43(H-9)、5.00(H-8)、3.42(H-7)、1.73(H-5)信号相关，确定H-14、H-9、H-8、H-7、H-5为β-取向；δ_H 5.46(H-1a)与δ_H5.91(H-6)相关，可确定6位为α-取向。

综上分析，化合物结构鉴定为式II所示化合物，本发明中命名为马齿苋倍半萜-2。

马齿苋倍半萜-3：

请参阅图11-图15。

白色粉末，HR-ESI-MS m/z 515.2252[M+Na]⁺(calcd.for C₂₆H₃₆O₉Na,515.2252)，推测其分子式为C₂₆H₃₆O₉。¹H-NMR(500MHz,Methanol-d6)，δ_H 5.48(1H,t,J＝8.8Hz,H-1)、5.31(1H,d,J＝2.9Hz,H-6)、δ_H 5.16(1H,dd,J＝9.7,2.6Hz,H-8)、6.08(1H,d,J＝2.6Hz,H-9)处是四个连氧次甲基的质子信号；δ_H 6.84(1H,m,H-3)、δ_H 5.58(1H,d,J＝3.2Hz,H-13a)和6.10(1H,d,J＝3.2Hz,H-13b)为三个烯氢信号。δ_H 1.34(3H,s,H-15)及1.35(3H,s,H-14)处为化合物C-14、C-15位甲基质子信号。

¹³C-NMR(125MHz,Methanol-d6)共有26个碳信号，δ_C 172.3(C-1”’)、171.5(C-12)、178.2(C-1’)及167.8(C-1”)为四个酯羰基碳信号。

HMBC图谱，δ_H 5.48(H-1)与δ_C 178.2(C-1’)羰基碳信号相关，δ_H 6.08(H-9)与δ_C172.3(C-1”’)相关，δ_H 5.31(H-6)与δ_C 167.8(C-1”)远程相关，确定化合物的平面结构。

NOESY图谱，δ_H 1.34(15-αCH₃)与δ_H 5.48(H-1)、1.84(H-5)、5.31(H-6)、3.53(H-7)、5.16(H-8)及6.08(H-9)相关，推测1、5、6、7、8、9位的H为α-取向。

综上分析，化合物结构鉴定为式III所示化合物，本发明中命名为马齿苋倍半萜-3。

马齿苋倍半萜-4：

请参阅图16-图20。

白色粉末，HR-ESI-MS m/z 475.1941[M+Na]+(calcd.for C₂₃H₃₂O₉Na,475.1939)，推测其分子式为C₂₃H₃₂O₉。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)谱图中，δ_H 5.26(1H,d,J＝4.7Hz,H-9)和4.92(1H,dd,J＝8.4,4.7Hz,H-8)为相互耦合的两个连氧次甲基或亚甲基的质子信号，δ_H5.79(1H,d,J＝3.3Hz,H-6)以及1.86(1H,d,J＝3.3Hz,H-5)为两个相互耦合的次甲基质子信号，δ_H 6.11(1H,m,H-3”a)和5.69(1H,m,H-3”b)处为两个末端烯氢信号，δ_H 1.34(3H,s,H-14)、1.39(3H,s,H-15)、1.44(3H,d,J＝7.3Hz,H-13)、1.98(3H,s,H-4”)、2.02(3H,s,H-2’)及2.03(3H,s,H-2”’)为五个甲基的质子信号。

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)共有23个碳信号。δ_C 11.8(C-13)、14.6(C-15)、18.5(C-4”)、20.7(C-2’)、21.2(C-2”’)和26.7(C-14)为6个甲基碳信号，其中δ_C 26.7(C-14)和14.6(C-15)是C-14、C-15位甲基碳信号。δC 166.8(C-1”)、169.3(C-1”’)、170.8(C-1’)和179.3(C-12)为四个酯羰基碳信号。

HMBC图谱中，δ_H 5.79(H-6)可以观察到与δ_C 166.8(C-1”)羰基碳信号远程相关，推测异丙烯酯连接在化合物C-6位。

化合物的相对构型通过偶合常数和NOE效应来确定，根据J_H-5/H-6为3.2Hz，显示两者为ax/eq取向，确定H-5和H-6位于同一面为β构型。

NOESY图谱中，δ_H 1.86(H-5)可观察到与δ_H 1.44(H-13)、4.68(H-1)和5.79(H-6)信号相关，确定13位为β-CH₃，1、6位的H为β-取向；15α-CH₃构型与δ_H 5.26(H-9)氢信号相关，可确定9位的H为α-取向。

综上分析，化合物结构鉴定为式IV所示化合物，本发明中命名为马齿苋倍半萜-4。

效果实验例1马齿苋萜类组合物抗炎活性评价

①、NHDF细胞5×10³细胞/孔接种于96孔板，培养24h。加入2,4-二硝基氯苯(DCNB，10μM)刺激12h。收集细胞并用PBS清洗2遍。然后，分别加入新的培养基并加入终浓度为1.0mg/mL的马齿苋倍半萜-1、马齿苋倍半萜-2、马齿苋倍半萜-3、马齿苋倍半萜-4或马齿苋萜类组合物(马齿苋倍半萜-1：马齿苋倍半萜-2：马齿苋倍半萜-3：马齿苋倍半萜-4质量比为1:1:1:1)、马齿苋提取物或普通市售马齿苋提取物，共培养24h，分离细胞及上清液备用。

②、NHDF细胞5×10³细胞/孔接种于96孔板，培养24h。加入2,4-二硝基氯苯(DCNB，10μM)刺激12h。收集细胞并用PBS清洗2遍。然后，分别加入新的培养基并加入终浓度为1.0mg/mL的马齿苋倍半萜-1或马齿苋萜类组合物(马齿苋倍半萜-1：马齿苋倍半萜-2：马齿苋倍半萜-3：马齿苋倍半萜-4质量比为1:1:1:1)、马齿苋提取物，共培养24h，分离细胞及上清液备用。

实验结果(图21-A)显示，相比于空白对照组(细胞活力，100％)，DCNB刺激使NHDF细胞活力降低22.7％，而马齿苋倍半萜-1、马齿苋倍半萜-2、马齿苋倍半萜-3、马齿苋倍半萜-4组细胞活力均高于DCNB组；说明马齿苋倍半萜-1、马齿苋倍半萜-2、马齿苋倍半萜-3、马齿苋倍半萜-4对DCNB诱导的细胞活力降低有抑制作用，对NHDF细胞有保护活性；同时，比较实验结果发现，同等浓度条件下马齿苋萜类组合物的保护活性强于马齿苋倍半萜的保护活性。同时，同等浓度条件下，本发明基于活性追踪方法获得的马齿苋提取物保护活性强于市售马齿苋提取物的保护活性。

细胞内高含量活性氧化物、超氧化物是诱导细胞氧化应激、氧化损伤的重要毒性因子。基于马齿苋倍半萜化合物的提高细胞活力的活性基本相同，我们以马齿苋倍半萜-1为代表化合物，继续研究马齿苋倍半萜化合物发挥保护活性的潜在分子机制。实验结果(图21-B)显示，DCNB刺激使NHDF细胞内ROS含量增加334％(p<0.01)；而相比于DNCB组，马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物组细胞内ROS含量降低；相比于DCNB组，马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物组细胞内ROS含量分别减少36.4％(p<0.01)，44.0％(p<0.01)，28.3％(p<0.01)。

细胞炎性因子是机体防御系统的重要组成部分，在免疫调节及炎症应答中具有重要作用。细胞炎性因子中，促炎性细胞因子能够促进炎症反应，主要包括IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α等，而抗炎性细胞因子能够抑制炎症反应，主要包括IL-4、IL-10等。

实验结果显示(图22)，DNCB刺激使NHDF细胞炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α)及NO、PGE2分泌显著增加，而IL-4、IL-10分泌显著减少，说明DCNB刺激诱发NHDF细胞炎症，进而导致细胞炎性损伤，细胞活力降低。而马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物处理后，DNCB刺激诱发的细胞炎性因子及NO、PGE2过度分泌被有效抑制，DNCB刺激诱发的NHDF细胞IL-4、IL-10分泌抑制也被有效逆转。其中马齿苋萜类组合物对DNCB诱导的炎性因子及NO、PGE2过度分泌及逆转DNCB刺激诱发的NHDF细胞IL-4、IL-10分泌抑制活性在同等浓度条件下显著优于马齿苋倍半萜-1及马齿苋提取物。同时，分析以上实验数据，我们认为马齿苋倍半萜类化合物可能存在协同效应，在同等浓度条件下对提高细胞的抗氧化剂抗炎活性强于同等浓度的单体倍半萜类化合物。

NLRP3炎症小体是由NLRP3、ASC和Caspase-1前体(pro-caspase-1)组成，是参与机体固有免疫的大分子、多蛋白复合体。NLRP3炎症小体组装、活化后，Pro-caspase-1自身酶解为活性状态，活化的Caspase-1可诱导促炎因子IL-1β和IL-18的惰性前体物质成熟并分泌至胞外，从而诱导炎症级联反应。

实验结果显示(图23)，DCNB刺激使NHDF细胞NLRP3、ASC-1及Caspase-1蛋白表达显著增加，而DCNB刺激后使NHDF细胞pro-caspase-1蛋白减少；我们推测，DCNB刺激使NHDF细胞NLRP3炎症小体激活进而加重对细胞的炎性损伤。而马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物处理后，DCNB刺激诱发的NHDF细胞NLRP3、ASC-1及caspase-1蛋白表达增加被有效抑制，DCNB刺激诱发的NHDF细胞pro-caspase-1蛋白表达抑制被有效扭转，我们推测，马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物发挥抗炎活性可能是通过抑制DCNB刺激诱导的NHDF细胞NLRP3炎症小体激活实现的。

NF-κB信号通路是介导炎症反应重要的转录因子，NF-κB信号通路激活会进一步促进炎性因子的表达，促进炎症。本研究中，DCNB刺激使NHDF细胞NLRP3炎症小体激活，同时，DCNB刺激诱发NHDF细胞炎性细胞因子分泌显著增加。

我们检测NF-κB信号通路相关蛋白的表达实验结果显示(图24)，DCNB刺激显著诱导了p65，IκBα蛋白磷酸化，同时，DCNB刺激使NHDF细胞NF-κB信号通路中p65，IκBα蛋白表达显著减少；此实验结果说明，DCNB刺激诱导了NHDF细胞NF-κB信号通路激活。而马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物处理后，尤其是马齿苋萜类组合物组，DCNB刺激诱导的NHDF细胞NF-κB信号通路p65，IκBα蛋白表达抑制被显著扭转，p65，IκBα蛋白磷酸化也被显著抑制。我们推测DCNB刺激诱导的NHDF细胞NF-κB信号通路激活抑制也是马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物促进NHDF细胞抗炎活性的潜在机制之一。类似的，马齿苋萜类组合物对DCNB刺激诱导的NHDF细胞NF-κB信号通路激活抑制活性强于马齿苋倍半萜-1或马齿苋提取物；说明，马齿苋倍半萜类化合物的协同作用发挥了重要功效。

超氧化物、活性氧的过量产生会激活Bcl-2家族蛋白表达及释放，诱发细胞凋亡。同时，大量超氧化物、活性氧会损伤细胞膜结构及其功能，诱发氧化损伤及炎症，最终也会导致细胞凋亡。我们检测发现(图25)，DCNB刺激诱导的NHDF细胞促凋亡Bax、Bid蛋白表达明显升高，而抑凋亡Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达被显著抑制；同时，流式细胞仪检测细胞凋亡发现，DCNB刺激使NHDF细胞凋亡显著增加。而马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物治疗后，DCNB刺激诱导的NHDF细胞促凋亡Bax、Bid蛋白表达升高被有效抑制，而DCNB刺激诱导的NHDF细胞抑凋亡Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达抑制；同时，DCNB刺激诱导的NHDF细胞凋亡被有效抑制。我们推测，马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物发挥抗DCNB刺激诱导的NHDF细胞氧化损伤及细胞凋亡活性与调控Bcl-2家族蛋白表达密切相关。分析此部分实验结果发现，同等浓度的马齿苋萜类组合物在调控Bcl-2家族蛋白表达及抑制细胞凋亡活性方面强于马齿苋倍半萜-1及马齿苋提取物。我们认为，马齿苋倍半萜类化合物可能是通过协同作用发挥其保护活性的。

效果实验例2马齿苋萜类组合物抗炎、舒缓活性评价

昆明种小鼠，SPF级，雄性，体重(21±2)g，恒温环境饲养，温度(20±2)℃，湿度50％，饲养环境为光照节律12h:12h，自由进食进水，适应性喂养1周。将小鼠随机分为5组，每组8只，分别为正常组、皮肤瘙痒模型组、马齿苋萜类组合物组(马齿苋倍半萜-1：马齿苋倍半萜-2：马齿苋倍半萜-3：马齿苋倍半萜-4质量比为1:1:1:1)、马齿苋倍半萜-1组、马齿苋提取物组。实验开始后，除正常组外，剃毛后，用200μL 2％DNCB溶液在1×1cm贴片上涂抹小鼠背部皮肤1周，并用200μL 0.2％DNCB溶液每周2次再次激发。

第21天开始，各用药组小鼠按1mg/cm²涂抹给药，于每日傍晚给药1次，连续14天(正常组、皮肤瘙痒模型组每日给予同等剂量蒸馏水)。实验过程中，小鼠颈背部剃毛，保持颈背部无毛。于第28天涂药30min后，记录小鼠搔抓表现；摘眼球取血，3000r/min离心10min，取血清，ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α及IL-4、IL-10含量。

表1马齿苋萜类组合物对小鼠瘙痒潜伏时间及瘙痒次数影响

与空白组比较^#p＜0.05,^##p＜0.01；与DCNB组比较^*p＜0.05,^**p＜0.01。

分析表1实验数据，与空白组比较，模型组小鼠瘙痒潜伏时间显著缩短，瘙痒次数显著增多。而马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物治疗后小鼠皮肤瘙痒潜伏时间有效延长，小鼠皮肤瘙痒次数减少；进一步分析实验数据发现，马齿苋萜类组合物组小鼠皮肤瘙痒潜伏时间延长最长，小鼠皮肤瘙痒次数减少最为显著，且效果高于同等剂量的马齿苋倍半萜-1及马齿苋提取物组。

进一步的，我们分析炎性因子检测实验结果(图26)，与正常空白组比较，瘙痒模型组小鼠IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α分泌显著增加而IL-4、IL-10分泌被显著抑制，IL-4、IL-10含量显著降低，说明模型组小鼠受到DCNB刺激后，DCNB诱导了严重的炎性损伤，炎性因子分泌显著增加。而马齿苋倍半萜-1、马齿苋萜类组合物及马齿苋提取物治疗后，与模型组比，DCNB刺激诱导的IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α过量分泌被有效抑制，进一步的，IL-4、IL-10分泌抑制被有效逆转。其中，马齿苋萜类组合物对IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α过量分泌的抑制，及逆转IL-4、IL-10分泌抑制活性高于同等浓度条件下的马齿苋倍半萜-1及马齿苋提取物。

Claims

1.由马齿苋通过活性追踪法制备的、下述结构式中式I至式IV所示的马齿苋倍半萜化合物之一：

2.一种马齿苋提取物，该马齿苋提取物是采用包括如下步骤的方法制备的：

(1)将新鲜马齿苋粉碎；

(2)粉碎后的马齿苋用乙醇-水进行渗漉提取；

(3)合并减压浓缩步骤(2)所得的提取液，得到浸膏；

(4)用水混悬步骤(3)所得的浸膏，得到混悬液；

其中，步骤(9)中具有最佳保护活性的馏分即为马齿苋提取物。

3.一种制备如权利要求1中所述的马齿苋倍半萜的方法，该方法包括：

A、提供如权利要求2所述的马齿苋提取物；

4.如权利要求2或3所述的制备方法，其中，步骤(2)中所采用的乙醇-水为20％-50％的乙醇，优选为25％-35％的乙醇，更优选为28％-32％的乙醇。

5.一种用于抗炎、舒缓的马齿苋萜类组合物，该马齿苋萜类组合物包括如权利要求1中所述的式I至式IV所示的马齿苋倍半萜中的至少一种。

6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述的马齿苋萜类组合物包括式I至式IV所示的马齿苋倍半萜化合物，且式I至式IV所示的各马齿苋倍半萜化合物的质量比为1:(1-100):(1-100):(1-100)，优选为1:(1-50):(1-50):(1-50)，最优选为1:1:1:1。

7.权利要求2中所述的马齿苋提取物或权利要求5-6之一中所述的马齿苋萜类组合物在制备抗炎、舒缓类化妆品或药品中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其中，所述的应用是通过提高NHDF细胞活力、抑制NHDF细胞内ROS含量、抑制NHDF细胞炎性细胞因子分泌、抑制NHDF细胞NLRP3炎症小体激活、抑制NHDF细胞NF-κB信号通路激活、和/或调控NHDF细胞Bcl-2家族蛋白表达及抑制细胞凋亡而实现的。

9.如权利要求7所述的应用，其中，所述的抗炎、舒缓类化妆品或药品为外用制剂，其形式为喷剂、慕斯、膏剂、乳剂、或液体制剂。

10.如权利要求7所述的应用，其中，抗炎所涉及的炎症是皮肤炎症，包括皮肤干燥症、皮炎、荨麻疹、湿疹、和浅部真菌感染。