CN115803338A - C型利尿钠肽及其治疗急性肺损伤的方法 - Google Patents

C型利尿钠肽及其治疗急性肺损伤的方法 Download PDF

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Abstract

本披露涉及通过以下来治疗肺、肝和/或肾损伤：向有需要的受试者施用治疗有效量的(超)长效C型利尿钠肽(CNP)、CNP衍生物、(超)长效CNP衍生物、或(超)长效CNP受体(NPRB)激动剂。本披露还涉及使用其治疗非心血管原因的低血氧合、肺中炎性细胞水平升高、肺水肿、败血症、菌血症、一般纤维化和/或间质性肺病。

Description

C型利尿钠肽及其治疗急性肺损伤的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月12日提交的美国专利申请号63/038,595的权益，其披露内容通过引用以其整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并特此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称是74043_Sequence.txt。文本文件大小为16KB，创建于2021年6月11日。
背景技术
急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征
急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是急性发作的严重动脉低氧血症，其中ARDS的PaO2/FiO2小于或等于200托，ALI的PaO2/FiO2小于300托，双侧放射学浸润，并且没有左心房高压的证据(参见，例如，Bernard等人,J.Crit.Care[急危重症杂志],1994.9(1):第72-81页；Rubenfeld等人,N Engl J Med[新英格兰医学杂志],2005.353(16):第1685-93页；Brun-Buisson等人,Intensive Care Med[重症监护医学],2004.30(1):第51-61页；和Phua等人,Am J Respir Crit Care Med[美国呼吸与危重症医学杂志],2009.179(3):第220-7页)。如本文所用，PaO2是指动脉氧分压，FiO2是吸入空气中氧气的分数(室内空气的FiO2为约0.21，正常PaO2/FiO2为约500托)。ARDS是对以下的压倒性肺部炎症反应：某些原发性和继发性有害刺激，例如肺炎(例如，无菌性肺炎、病毒性肺炎、细菌性肺炎)、败血症、误吸、吸入性损伤、近乎溺死和肺切除手术(参见，例如，Alam等人,AnnThorac Surg[胸外科年鉴],2007.84(4):第1085-91页)。ARDS的特征是急发性呼吸衰竭，需要在重症监护病房(ICU)住院治疗和通气支持。如果患者在ALI/ARDS中存活下来，患者的长期生活质量通常会因肺瘢痕形成而受到不利影响(参见，例如，Rubenfeld等人,N Engl JMed[新英格兰医学杂志],2005.353(16):第1685-93页；Dowdy等人,Intensive Care Med[重症监护医学],2006.32(8):第1115-24页)。迄今为止，尚未鉴定出治疗急性肺损伤(ALI)和ARDS的有效药剂，因此非常需要这种药剂。
ALI的支持性护理包括氧疗以维持动脉氧分压(PaO2)高于55mmHg，或氧饱和度(SaO2)高于88％，以及液体管理。但是，必须注意不要提供过多的氧气(即，氧气应低于60％)，以避免氧中毒。此外，该措施并未解决潜在的肺泡炎性水肿。
先前在人临床试验中测试的用于治疗ALI的药剂，包括糖皮质激素、表面活性剂、N-乙酰半胱氨酸、吸入式一氧化氮、脂质体PGE1、酮康唑、利索茶碱、沙丁胺醇、丙半胱氨酸(procysteine)、活化蛋白C和吸入式沙丁胺醇，均已失败(参见，例如，Johnson ER和Matthay MA,J Aerosol Med Pulm Drug Deliv.[气溶胶医学和肺部递送杂志]2010,23(4):243-52)。ALI治疗对于本领域技术人员来说仍然是难以理解的。
肺或肺纤维化(PF)是指由许多病症引起的肺组织进行性瘢痕形成，这些病症包括慢性炎症过程(例如，结节病、韦氏肉芽肿病)、感染、环境因素(例如，石棉、二氧化硅、暴露于某些气体)、暴露于电离辐射(例如，治疗胸部肿瘤的放射疗法)、慢性病症(例如，狼疮、类风湿性关节炎)或某些药物。间质性肺病(ILD)是用于PF的另一个涵盖性术语，对于本说明书的目的在本说明书中是同义词。特发性肺纤维化(IPF)是一种原因不明的PF。PF或IPF是一种无法治愈类型的慢性瘢痕肺病，其特征是肺功能进行性和不可逆性下降，并伴有逐渐出现的呼吸短促和干咳，其影响全球500万人(参见，例如，Raghu等人,(2011)AmericanJournal of Respiratory and Critical Care Medicine.[美国呼吸与危重症医学杂志]183(6):788-824)，其中相关危险因素包括吸入化学物质，例如吸烟、病毒感染或家族病史。其他症状可能包括疲劳、手指甲和脚趾甲异常大且呈圆顶状(杵状指)。参见例如，nhlbi.nih.gov/health-topics/idiopathic-pulmonary-fibrosis；en.wikipedia.org/wiki/Idiopathic_pulmonary_fibrosis。并发症可能包括肺动脉高压、心力衰竭、肺炎或肺栓塞。
虽然C型利尿钠肽(CNP)如果在最终导致ALI或败血症的损伤之前或期间持续给予的话可以减轻ALI、败血症和IPF，但在损伤后使用它的有效性(例如，作为损伤后治疗)是未知的。按照惯例，CNP必须以低剂量连续给予，不能作为推注剂量给予，因为它的半衰期非常短而且因为推注剂量会导致血压急剧下降。如果以高推注剂量给予以补偿较短的半衰期并延长血液存在的持续时间，则会出现非常高的峰值血浆浓度(C最大)，这会导致危险的血压下降。为了减轻这些有害影响，CNP通常通过缓慢输注来递送。参见，例如，Kimura等人,J SurgRes.[外科研究杂志]2015,194(2)；631-637。
CNP和NPRB受体
CNP由Sudoh等人于1990年首次从猪脑中分离出并且是由22个氨基酸残基组成的肽。参见，例如，Sudoh等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]1989；159:1427-1434。CNP具有环状结构，在结构上与相关利尿钠肽、心房利尿钠肽(ANP)和B型利尿钠肽(BNP)相似，但缺少羧基末端延伸。参见，例如，Hunt等人,J.Clin.Endocrinol.Metab.[临床内分泌与代谢杂志]1994；78:1428-1435。CNP是各种物种中高度保守的利尿钠肽。参见，例如，Imura等人,Front.Neuroendocrinol.[神经内分泌学新领域]1992；13:217-249。例如，在人中，CNP基因(NPPC)位于2号染色体，而小鼠CNP基因位于1号染色体。CNP基因由两个外显子和一个内含子构成。参见，例如，Ogawa等人,TheJournal of Clinical Investigation.[临床研究杂志]1994；93:1911-192110；和Ogawa等人,Genomics[基因组学]1994；15(24):383-387。它作为前激素原或126个氨基酸残基的亲本-CNP肽产生，在去除羧基末端的23个氨基酸残基后转化为103个氨基酸残基的原-CNP，并由弗林蛋白酶进一步加工为含有53个氨基酸残基的CNP-53和含有22个氨基酸残基的CNP。参见，例如，Lumsden等人,Curr.Pharm.Des.[当前药物设计]2010；16:4080-4088；Wu等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2003；278:25847-25852；和Chopra等人,IndianJ.Endocrinol.Metab.[内分泌与代谢杂志]2013；17:83-90。较高分子量的CNP-53(CNP 51-103)在组织中占主导地位，而CNP-22(CNP 82-103)主要存在于血浆和脑脊液中，但两者都含有所有利尿钠肽共有的17个氨基酸残基的环结构。与ANP和BNP相比，CNP的血浆半衰期相对较短，在人中为约2至3分钟。参见，例如，Potter LR.FEBS J.[欧洲生化学会联合会杂志]2011；278:1808-1817。正常血浆CNP浓度(两种形式)在低飞摩尔/毫升范围内。参见，例如，Das B.B.和Solinger R.,Cardiovasc Hematol Agents Med Chem.[心血管血液药剂化学]2009,7,29-42。CNP主要由血管和男性生殖腺的内皮细胞产生和分泌并且作为松弛肽起作用。参见，例如，Suga等人,Endocrinology.[内分泌学]1998；139:1920-1926。
CNP肽有两种已知的膜受体，即利尿钠肽受体B(NPRB)和利尿钠肽受体C(NPRC)。NPRB接收来自CNP的信息并激活下游信号通路，而NPRC主要是一种清除受体，其主要参与CNP的清除或降解。参见，例如，Itoh H和Nakao K,Nihon Rinsho.[日本临床医学杂志]1997；55:1923-1936；Koller等人,Science.[科学]1991；252:120-123；Suga等人,Endocrinology.[内分泌学]1992；130:229-239；及Potter LR和Hunter T.J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2001；276:6057-6060。NPRB也有其他名称，例如鸟苷酸环化酶B(GC-B)或B型利尿钠肽受体2(NPR2)。
其余的利尿钠肽受体NPRA被心房利尿钠肽(ANP)和B型利尿钠肽(BNP)激活，但不被CNP激活。当ANP和BNP激活NPRA和NPRB时，CNP选择性地激活NPRB，并且所有三种利尿钠肽都与NPRC(其缺乏鸟苷酸环化酶活性)结合并进行清除和降解。参见，例如，Koller等人,Science.[科学]1991；252:120-123；Suga等人,Endocrinology.[内分泌学]1992；130:229-239；及Potter LR和Hunter T.J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2001；276:6057-6060。激活一种受体相比于NPRA和NPRB两受体的生理后果的差异仍不清楚。此外，因CNP半衰期短(2-13分钟)以及推注施用与血压的急剧下降有关的事实而难以简单推注施用，CNP的体内效果的测试是混杂的。参见，例如，Kimura等人,J Surg Res.[外科研究杂志]2015,194(2)；631-637。事实上，在本披露之前未知是否可以将任何NPRB激动剂、CNP或CNP衍生物作为推注给予以治疗ALI或ARDS而血压不会显著下降(例如，超过20％、超过15％、超过10％、或超过5％的血压下降)，同时显著增加环状GMP量(例如，基线血浆环状GMP水平的1.5x以上、2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)持续一段时间(即，持续6小时、8小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、84小时或168小时)。
CNP的表达和分泌还受肿瘤坏死因子(TNF)、脂多糖(LPS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素-1(IL-1)、转化生长因子β(TGFβ)以及参与血管重塑和炎症的凝血酶等多种细胞因子和生长因子的调节。参见，例如，Suga等人,Endocrinology.[内分泌学]1993；133:3038-3041；Suga等人,J.Clin.Invest.[临床研究杂志]1992；90:1145-1149；Woodard等人,Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.[美国生理调节、综合和比较生理学杂志]2002；282:R156-R165；Hama等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯]1994；198:1177-1182；和Okahara等人.FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]1995；373:108-110。在内皮损伤、败血症、缺氧和慢性肾功能衰竭期间，血液中的CNP水平升高。参见例如Hama等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯]1994；198:1177-1182。剪切应力还诱导CNP基因在人内皮细胞中的表达。参见例如Okahara等人,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]1995；373:108-110。CNP基因的启动子区域具有转录因子TSC-22的结合位点(参见，例如，Sellitti等人,Peptides.[肽]2011；32:1964-1971)，据信其参与造血前体细胞功能的调节，并且是推定的肿瘤抑制基因，该基因在T或NK LGL白血病中被高甲基化并且沉默。参见例如Yu等人,Blood.[血液]2009；113(22):5558-67。CNP基因启动子还具有转录因子例如NF-κB、STAT1、ATF6和E2F1的结合位点。参见例如Santhekadur等人,Biomed Pharmacother.[生物医药药理学]2017；92:826-835。然而，尚不清楚NPRB激动剂如CNP或其衍生物是否可用于治疗ALI或ARDS。事实上，一些炎症与CNP表达和分泌的增加有关。事实上，推注施用更多CNP、其衍生物或其他NPRB激动剂治疗ALI或ARDS的后果尚不清楚。生物系统的复杂性和不可预测性进一步混淆了这种不确定性。
之前对健康人志愿者进行的一项研究表明，CNP推注导致收缩压和舒张压短暂但显著降低，心率显著增加，血浆环状GMP仅有限和短暂增加不到90分钟。Igaki等人,Hypertens Res[高血压研究]1998；21:7-13。一般而言，所有CNP都会在小鼠、非人灵长类动物、大鼠、狗和人中产生血液动力学效果或类似的降血压活性。参见，例如，Wendt等人,JPharmacol Exp Ther[药理学和实验治疗学杂志]353:132-149,2015年4月。目前正在开发中性内肽酶(NEP)抗性增加的另一种CNP变体(BMN-111；序列PGQEHPNARK YKGANKKGLS KGCFGLKLDR IGSMSGLGC(SEQ ID NO.1))。BMN-111在动物和人体中的研究表明，随着剂量增加到所期望的治疗水平，动脉血压(BP)下降，心率(HR)增加。除了研究CNP的各种变体之外，还通过将CNP部分与PEG或蛋白质化合物缀合获得了不同的CNP缀合物。这些聚乙二醇化和嵌合的CNP表现出与非聚乙二醇化CNP变体所观察到的相似的血液动力学反应。先前研究的所有变体都显示出相似的降BP活性。参见，例如，Wendt,J.,Pharmacol Exp Ther[药理学与实验治疗学杂志]353:132-149,2015年4月。因此，不希望受理论的束缚，据信增加具有CNP活性的药物的推注剂量以增加药物暴露可能与不可接受的心血管副作用如低血压有关。
因此，需要更有效和更安全的ALI和/或ARDS治疗，其避免心血管副作用，如低血压，同时维持或提高CNP治疗剂的血浆水平。还需要半衰期长可以在血液中长期存在的CNP衍生物或CNP受体(NPRB)激动剂，它们可用于治疗ALI和/或ARDS。本披露试图满足这些需要并提供进一步的相关优势。
发明内容
提供该发明内容以简化形式介绍概念的选择，这些概念将在下面的具体实施方式中进一步描述。该发明内容并非旨在识别所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用来帮助确定所要求保护的主题的范围。
在一方面，本披露的特征在于一种治疗患有肺、肝和/或肾损伤；或与肺、肝和/或肾损伤相关的症状的受试者的方法，该方法包括：向该受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效CNP、长效CNP衍生物、长效NPRB激动剂、超长效CNP、超长效CNP衍生物、超长效NPRB激动剂，长效CNP激动剂、超长效CNP激动剂或其任何组合，其中该组合物不会使血压降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)，其中该基线血压测量值是施用该组合物之前的平均血压，其中该组合物在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1小时至24小时、2至24小时、4至24小时、1小时至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1小时至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，该基线血浆环状GMP水平是施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康受试者的平均血浆环状GMP水平(优选地为受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)，并且其中该肺、肝和/或肾损伤或与肺、肝和/或肾损伤相关的该症状选自急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺水肿、肺中炎性细胞水平升高、与健康肺相比肺中炎性细胞因子水平或表达增加、与健康肺相比肺泡空间中蛋白水平增加、低动脉血氧合，其中低动脉血氧合是低于60mm Hg的血液PaO2和/或低于90％的血液血红蛋白氧饱和度(SpO2)，肺炎、纤维化(例如肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化)、肾损伤以及其任何组合。
在另一方面，本披露的特征在于长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物，该长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]、GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.11]，或其任何组合；其中每个单独的大写字母，U除外，是由单字母氨基酸命名法表示的氨基酸残基，并且其中U是式(I)或(II)的部分，其中式(I)是
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中a是0或1(优选a是1)；脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接(例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合到X；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1，并且
式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中a是0或1(优选a是1)；聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或其衍生物；Y是：1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；含有氨基酸残基的接头，其中该氨基酸残基共价连接至(聚合物)a；或不同于1-10个氨基酸残基或肽序列的肽接头。在一些实施例中，Y是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
在另一方面，本披露的特征在于一种治疗患有ALI和/或ARDS或有发展为ALI和/或ARDS风险的受试者的方法，该方法包括：向该受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物，该长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]、或GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.11]、或其任何组合。U如上述式(I)或(II)中所定义。U可以共价结合至N末端G或C残基和/或K残基的ε氨基。该组合物不会使血压降低超过基线血压测量值的15％(例如，超过10％或超过5％)，其中该基线血压测量值是施用该组合物之前的平均血压；并且该组合物在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中该基线血浆环状GMP水平是施用该组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康受试者的平均血浆环状GMP水平(优选地为该受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
在一方面，本披露提供了包含长效CNP衍生物的组合物，该长效CNP衍生物包含下式的肽U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQ ID NO.30]，其中x是天然或非天然氨基酸残基，条件是x不是甲硫氨酸残基；并且U具有式(I)的部分：
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中a是0或1(优选a是1)；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接(例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合到X；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；并且
X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
附图说明
本披露的前述方面和许多附带优点将变得更容易理解，因为当结合附图参考以下详细描述时它们变得更好理解，其中：
图1A的图显示在皮下施用2.0mg/Kg天然CNP、CNP衍生物(dCNP)和超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)后的CD-1小鼠中血浆CNP[平均(SD)；n＝5]。插图是左下角的放大比例，以显示当施用天然CNP时CNP(菱形)的低血浆水平。误差棒表示n＝5个血浆样品的标准偏差。施用前的基线CNP水平为1.74(0.6)ng/mL[平均(SD)；n＝15]。图1A显示了在小鼠中推注施用后dCNP和VLA-dCNP在血浆中的持续存在。
图1B的图显示在皮下施用1.0mg/Kg天然CNP、CNP衍生物(dCNP)和超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)后，通过来自CisBio[Codolet，法国]的环状GMP试剂盒测量的雄性C57BL/6J小鼠中的血浆环状GMP。基线血浆环状GMP水平为20((3.7)平均值(SEM)；n＝8)pmol/mL或7((1.3)平均值(SEM)；n＝8)ng/mL；[n＝8]。在2小时及以后，与基线相比，天然CNP的皮下施用没有显著升高血浆环状GMP，而长效CNP(dCNP和VLA-dCNP)的类似施用显示环状GMP显著升高至少24小时。图1B显示了与天然CNP相比，在小鼠中推注施用dCNP和VLA-dCNP后环状GMP的持续存在。
图2A的图显示推注施用25μg/Kg超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)、超长效BNP衍生物(VLA-dBNP)和超长效ANP衍生物(VLA-dANP)后监测的血浆环状GMP相应增加[平均值(SEM)；n＝12]。基线血浆环状GMP水平为8(2)ng/mL[平均值(SD)；n＝12]，类似于健康人的水平。参见，例如，Igaki,等人,Hypertens Res[高血压研究]1998；21:7-13。所有超长效利尿钠肽配制品都将环状GMP增加超过8ng/ml的基线。环状GMP AUC值是VLA-dANP 3,483ng*h/mL、VLA-dBNP 2,585ng*h/mL、VLA-dCNP 2,627ng*h/mL。超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)增加血浆环状GMP达3天而没有相关联的血压下降。图2A显示与来自同一家族的另外两种超长效利尿钠肽相比，在推注施用VLA-dCNP之后环状GMP的持续存在。
图2B的图显示推注施用25μg/Kg超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)、超长效BNP衍生物(VLA-dBNP)和超长效ANP衍生物(VLA-dANP)后监测的狗中平均动脉压[平均值(SEM)；n＝12]。在以非常高的剂量施用后，VLA-dCNP不会导致血压从基线(0小时)显著下降。相比之下，其他超长效利尿钠肽如VLA-dBNP和VLA-dANP衍生物导致血压下降超过15％。对于VLA-dANP尤其如此，对于类似的环状GMP增加，血压下降可高达50％。与之形成鲜明对比的是，超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)增加血浆环状GMP达3天而没有相关联的血压下降。图2B显示在狗中推注施用高剂量VLA-dCNP后血压没有下降，而来自同一家族的另外两种超长效利尿钠肽显示尽管血浆环状GMP升高，但血压显著下降(图2A)。这表明血浆环状GMP不是血压下降的原因。
图3A是用于评估dCNP抑制的LPS诱导的急性肺损伤的方案的时间线。该方案包括用以下处理小鼠：LPS(0.05mg/kg气管内施用)和VLA-dCNP(L：0.1mg/kg s.c.；M：0.3mg/kgs.c.；H：1.0mg/kg s.c.)、dCNP(H 1.0mg/kg s.c.)、CNP(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽(ANP)(H 1.0mg/kg s.c.)、脑利尿钠肽(BNP)(H 1.0mg/kg s.c.)、抗小鼠TNFα(TNFαab)(克隆XT3.11；BioX细胞公司，西黎巴嫩，新罕布什尔州)1.0mg/Kg s.c.、或伐地那非(VDN)(开曼化学公司，安阿伯，密歇根州)1.0mg/Kg s.c.。在施用LPS后立即施用测试品。治疗24小时后，在异氟醚麻醉下处死小鼠，然后收获支气管肺泡灌洗液(BALF)。
图3B的柱状图显示ALI和ARDS中BALF中的细胞，尤其是中性粒细胞的增加，遵循图3A中所示的方案。细胞的减少表明ALI/ARDS的消退。统计分析基于使用GraphPad InStat 3执行的Dunnett检验(n＝15、23、7、7、7、7、7、7和9；NC、对照、CNP(H)、dCNP(H)、ANP(H)、BNP(H)、TNFαab、VDN、VLA-dCNP(H)。*P<0.01相比于VLA-dCNP(H))。图3B的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用改善了LPS诱导的肺泡空间细胞浸润。
图3C的柱状图显示BALF、ALI和ARDS中总蛋白，遵循图3A中所示的方案。总蛋白的减少表明ALI/ARDS的消退。统计分析基于使用GraphPad InStat 3执行的Dunnett检验(n＝15、23、7、7、7、7、7、7和9；NC、对照、CNP(H)、dCNP(H)、ANP(H)、BNP(H)、TNFαab、VDN、VLA-dCNP(H)。*P<0.01相比于VLA-dCNP(H))。
图4A的柱状图显示VLA-dCNP治疗改善了LPS诱导的MPO+细胞增加(即，MPO+细胞相对于对照减少)，这是标志性嗜中性粒细胞促炎细胞。统计分析基于使用GraphPad InStat3对照执行的Dunnett检验(n＝18、6、6、6、6、6、6和6；对照、CNP、dCNP、ANP、BNP、TNFαab、VDN、VLA-dCNP。*P<0.01相比于VLA-dCNP以及**P<0.05相比于VLA-dCNP)。
图4B的一系列照片h显示VLA-dCNP的推注施用或治疗改善了LPS诱导的炎性肺损伤。显示的是肺组织石蜡切片的苏木精-伊红(HE)染色的一系列显微照片，显示的强度表明有核细胞数量、细胞外基质和蛋白总体上的增加、瘢痕形成和/或肺泡空间中的蛋白渗透。HE染色所见的炎性细胞浸润表明肺中炎症(分图显示较深的染色，因为细胞数量表明存在炎症病理，蛋白增加表明蛋白渗漏到肺泡和/或细胞外基质中或瘢痕沉积)。对于这些研究，将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司；0.05mg/kg气管内施用)处理，并然后用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽(ANP)(1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kg s.c.)，抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kg s.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。在施用LPS后立即施用测试品。治疗后24小时，在异氟烷麻醉下处死小鼠，收获肺组织并用4％多聚甲醛固定。固定的肺组织的石蜡切片用抗MPO抗体和苏木精-伊红染色法染色。
图5A的柱状图显示VLA-dCNP和dCNP的推注施用或治疗减弱了BALF中炎性细胞因子(IL6)的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，并用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(1.0mg/kgs.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽(ANP)(1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kg s.c.)，抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kg s.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。治疗24小时后，收获支气管肺泡灌洗液(BALF)并测量IL-6细胞因子。统计分析基于学生t检验。(n＝15、23、7、7、7、7、7、7和9；NC、对照、CNP、dCNP、ANP、BNP、TNFαab、VDN和VLA-dCNP。*P<0.01相比于VLA-dCNP以及**P<0.05相比于VLA-dCNP)。
图5B的柱状图显示VLA-dCNP和dCNP的推注施用或治疗减弱了BALF中炎性细胞因子(TNFα)的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。该方案与图5A中描述的方案相同，除了收获支气管肺泡灌洗液(BALF)并测量TNFα细胞因子。
图5C的柱状图显示VLA-dCNP和dCNP的推注施用或治疗减弱了BALF中炎性细胞因子(MCP-1)的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。该方案与图5A中描述的方案相同，除了收获支气管肺泡灌洗液(BALF)并测量MCP-1细胞因子。
图6A-6D的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用或治疗减弱了肺组织中炎性细胞因子的LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，然后用VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)处理。处理后24小时，收获肺组织。使用ELISA试剂盒测量提取的肺蛋白中的每种细胞因子浓度。这些细胞因子是白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和巨噬细胞趋化蛋白1(MCP-1)。统计分析基于学生t检验(n＝10、10、9；NC、对照、VLA-dCNP。*P<0.05相比于对照)。
图6A的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用或治疗减弱了肺组织中IL-6的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。
图6B的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用或治疗减弱了肺组织中TNF-α的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。
图6C的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用或治疗减弱了肺组织中MCP-1的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。
图6D的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用或治疗减弱了肺组织中IL-1b的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。
图7A的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括通常受NFkb系统调节的IL-6(其是炎症系统的主要调节剂))表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者体内的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。ALI肺组织中炎症相关基因表达的测量。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，然后用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(1.0mg/kgs.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽或ANP(1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kg s.c.)，肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kg s.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。治疗24小时后，收获肺组织。从收获的肺组织中提取总RNA。统计分析基于学生t检验。(n＝15、22、6、6、6、6、6、5和9；NC、对照、CNP、dCNP、ANP、BNP、TNFαab、VDN和VLA-dCNP。*P<0.01相比于VLA-dCNP以及**P<0.05相比于VLA-dCNP)。
图7B的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括iNOS)表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者中的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。该方案如图7A所述。
图7C的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括MCP-1)表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者体内的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。该方案如图7A所述。
图7D的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括IL-1b)表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者体内的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。该方案如图7A所述。
图7E的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括IFNg)表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者体内的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。该方案如图7A所述。
图8的一系列柱状图显示VLA-dCNP的推注施用抑制了肺组织中的炎症水平以促进ARDS/ALI的消退。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，并且用VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)处理。处理后24小时，收获肺组织。使用抗体Elf-1、Tollip、IRAK-1、P-P38、P-P65和β-肌动蛋白(内标)进行蛋白质印迹分析。统计分析基于学生t检验(n＝5，*P<0.05相比于对照)。
图9的一系列柱状图显示VLA-dCNP的推注施用抑制了肺组织中的STAT水平以促进ARDS/ALI的消退。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，并且用VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)处理。处理后24小时，收获肺组织。使用抗体抗STAT-1、P-STAT-1、STAT-2、STAT-3、STAT-6和β-肌动蛋白(内标)进行蛋白质印迹分析。统计分析基于学生t检验(n＝5，*P<0.05相比于对照)。
图10的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用抑制人脐静脉内皮细胞中的Elf-1表达。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)保持在HuMedia-EG2中，并接种到12孔板中(1X 105个细胞/孔，2mL，在HuMedia-EG2中)。24小时后，用VLA-dCNP(0.07uM(0.21μg/mL)或0.7uM(2.1μg/mL))(在M199 1％BSA中)的每种浓度处理细胞6小时。使用抗Elf-1和β-肌动蛋白(内标)通过蛋白质印迹分析评估蛋白水平。统计分析基于学生t检验(n＝4，*P<0.05相比于对照)。
图11的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用抑制人脐静脉内皮细胞的细胞核中的Elf-1水平。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)保存在HuMedia-EG2中。将细胞以1X 105个细胞/孔的密度以2mL接种到玻璃底培养皿中的HuMedia-EG2中。24小时后，在补充有1％BSA(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的M199(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中用每种浓度的VLA-dCNP(0.07uM(0.21μg/mL))或CNP 0.1μM(0.21μg/mL)处理细胞6小时。将细胞用4％多聚甲醛固定，并用抗Elf-1 Ab(圣克鲁兹生物技术公司，达拉斯，德克萨斯州)处理，然后与Alexa Fluor 488标记的二抗(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和Hoechst 33342孵育。
图12的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用在人肺成纤维细胞系HFL1中引发Tollip表达。将人肺成纤维细胞HFL1(1.0x105个细胞/孔)用DMEM培养基培养16小时，然后用含有0.21μM(0.66ug/mL)VLA-dCNP且不含VLA-dCNP(N.C.)的1％BSA-M199培养基培养。孵育12小时后，用LPS(终浓度为1.0μg/mL)刺激细胞。再孵育2小时后，收获并裂解细胞。使用抗Tollip和β-肌动蛋白(内标)通过蛋白质印迹评估细胞中的蛋白表达量。统计分析基于学生t检验(n＝4，*P<0.05相比于对照)。
图13A的图显示VLA-dCNP的推注施用对LPS诱导的败血症致死率具有保护作用。将Balb/c(11周龄雄性)小鼠用LPS(10mg/kg i.p.)处理，并用以下每个剂量进行处理：VLA-dCNP(低0.1mg/kg s.c.；中等0.3mg/kg s.c.；高1.0mg/kg s.c)。每2小时观察存活。通过基于Graphpad Prism 6.0(n＝10、10、10、11)的对数秩检验进行统计分析。
图13B的图显示将C57BL/6J(6周龄雄性)小鼠用LPS(15mg/kgi.p.)处理，并用给定推注剂量的VLA-dCNP(低0.1mg/Kg s.c.；中等0.3mg/kg s.c.；高1.0mg/Kg s.c.)进行处理。每2小时观察存活。通过对数秩检验进行统计分析。(n＝11、10、11、11)。VLA-dCNP对LPS诱导的败血症具有保护作用。
图14A的柱状图显示在这种间质性肺病(ILD)或特发性肺纤维化(IPF)动物模型中VLA-dCNP的推注施用减少肺中纤维化区域。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用博来霉素(1.0mg/kg气管内施用)处理，并用每个剂量的VLA-dCNP(0.1mg/kg s.c.和0.3mg/kg s.c.)处理。VLA-dCNP在博来霉素施用后第7天施用(5次/周)。在第21天，处死小鼠，收获肺组织并进行马松三色染色。使用Image J(NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国)测量纤维化区域。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的Dunnett检验。(n＝5、8、9、7；阴性对照、对照、VLA-dCNP0.1和VLA-dCNP 0.3。*P<0.05相比于对照)。
图14B一系列显微照片显示图14A的马松三色染色肺组织样品。肺组织中的蓝色和淡蓝色表示晚期胶原蛋白/纤维化。
图15A的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用减少了来自特发性肺纤维化急性加重(IPF-AE)模型的BALF中的细胞数量。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用博来霉素(1.0mg/kg气管内施用)处理并且3周后将小鼠用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，并用每个剂量的VLA-dCNP(0.3mg/kg s.c.和1.0mg/kg s.c.)处理。VLA-dCNP在LPS施用后立即施用。处理24小时后，处死小鼠。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的学生t检验(n＝6、6、9、9、9；阴性对照、博来霉素、对照、VLA-dCNP 0.3和VLA-dCNP 1.0。*P<0.05相比于对照)。
图15B的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用减少了来自特发性肺纤维化急性加重(IPF-AE)模型的BALF中的蛋白水平。该方案如图15A所述。
图15C的柱状图显示VLA-dCNP减弱了来自特发性肺纤维化急性加重(IPF-AE)模型的BALF中的IL-6。该方案如图15A所述。
图15D的柱状图显示VLA-dCNP的推注施用减少特发性肺纤维化急性加重(IPF-AE)模型的BALF中的细胞数量和蛋白水平并减弱TNFα。该方案如图15A所述。
图16A是肾组织的一系列显微照片。
图16B的图显示急性肾损伤模型中肾小管损伤作为VLA-dCNP推注施用的函数。
图17A的柱状图显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时在饮食诱导的肝纤维化模型中肝酶天冬氨酸氨基转移酶(AST)显著降低。
图17B的柱状图显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时在饮食诱导的肝纤维化模型中肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)显著降低。
图17C的柱状图显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时在饮食诱导的肝纤维化模型中α平滑肌肌动蛋白(a-SMA)显著降低。
图17D的柱状图显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时在饮食诱导的肝纤维化模型中肿瘤坏死生长因子α(TNF-a)显著降低，TNF-a是炎症诱导纤维化的标志物。
图17E的柱状图显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时在饮食诱导的肝纤维化模型中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)显著减少，MCP-1是肝组织中巨噬细胞诱导的炎症的介质。
图18A的柱状图显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时基于血清肌酐降低的肾功能显著改善。
图18B是显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时基于降低的尿中白蛋白水平(通过计算白蛋白与肌酐比率)的肾功能显著改善。
图18C的柱状图显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时肾中纤维化区域％显著降低。使用Image J(NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国)测量纤维化区域；
图18D是肾马松三色(MT)染色的一系列代表性图像。放大倍数为X20。在这个马松三色染色中，细胞核被铁苏木精染色(图像中的棕色/黑色)，细胞质被酸性品红染色(图像中的粉红色/红色)，胶原纤维化区域被苯胺蓝染色(图像中的蓝色)。
图19A的柱状图显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时基于肺组织中胶原的主要组分羟脯氨酸的减少的纤维化显著减少。
图19B的柱状图显示当向受试者施用VLA-dCNP或长效CNP时肺中纤维化区域％显著减少，这是基于肺组织切片的组织学马松三色染色的量化评估。使用Image J(NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国)测量纤维化区域。
图19C显示了放大倍数为20倍的马松三色(MT)染色的肾的一系列代表性图像。
图20是在皮下施用2.0mg/Kg CNP衍生物s1(dCNP-s1)、和CNP衍生物s2(dCNP-s2)后CD-1小鼠中血浆CNP[平均值(SEM)；n＝5]的图。插图显示当施用天然CNP时CNP(菱形)的低血浆水平。误差棒表示n＝5个血浆样品的平均值的标准误差。施用前的基线CNP水平为0.391(0.02)ng/mL[平均值(SEM)；n＝10]。当以相似的剂量重量/Kg剂量给予时，长效dCNP-s1和dCNP-s2以持续方式(至少8小时)提供比天然CNP高10倍的CNP血液水平。
具体实施方式
本披露涉及通过以下来治疗肺、肝和/或肾损伤，或与肺、肝和/或肾损伤(例如急性肺损伤(ALI))相关的症状，并预防其恶化为更严重的形式，即急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和死亡或肺/肝/肾纤维化：向有需要的受试者施用治疗有效量的长效C型利尿钠肽(CNP)、CNP衍生物，长效CNP衍生物，或长效CNP受体(NPRB)激动剂。本披露还涉及使用其治疗非心血管原因的低血氧合、肺中炎性细胞水平升高、肺水肿、败血症、菌血症和/或纤维化(例如，非心血管原因的低血氧合、肺中炎性细胞水平升高、肺水肿和/或纤维化)。
本披露还涉及治疗一般纤维化，包括肺纤维化、肝纤维化、肝硬化和肾小球硬化，以及治疗肾损伤/保护免受肾损伤，包括作为推注施用治疗有效量的本披露的组合物，而不会使血压降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，并且在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1小时至24小时、2至24小时、4至24小时、1小时至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1小时至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中该基线血浆环状GMP水平是施用该组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康受试者的平均血浆环状GMP水平(优选地为该受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
与治疗ALI和败血症的常规方法不同，治疗有效量的本披露的组合物可以在会导致以下的损伤之前、期间和/或之后作为推注施用：急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺水肿、肺中炎性细胞水平升高、肺中炎性细胞因子水平或表达增加(与健康肺相比)、肺泡空间中蛋白水平增加(与健康肺相比)、低动脉血氧合(其中低动脉血氧合是低于60mm Hg的血液PaO2和/或低于90％的血液血红蛋白氧饱和度(SpO2))、败血症、菌血症、肺炎、肺/肺部纤维化、特发性肺纤维化(IPF)或间质性肺病(ILD)，而不会使血压降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)，其中该基线血压测量值是施用该组合物之前的平均血压。治疗有效量的本披露的组合物还可以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中该基线血浆环状GMP水平是施用该组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康受试者的平均血浆环状GMP水平(优选地为该受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。在一些实施例中，治疗有效量的本披露的组合物可以在会导致上述病症的损伤之后作为推注施用。在一些实施例中，治疗有效量的本披露的组合物可以在会导致上述病症的损伤之前作为推注施用。在一些实施例中，治疗有效量的本披露的组合物可以在会导致上述病症的损伤期间作为推注施用。与连续施用的常规方法不同，本文组合物的推注施用提供了诸如易于施用的优点，并且意外地减少了不希望的副作用(例如低血压)。
定义
在本说明书的多个地方，披露的化合物的取代基以组或范围披露。特别旨在本披露包括此类组和范围的成员的每个成员和每个单独的子组合。例如，术语“C1-6烷基”具体意在单独披露甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、和C6烷基。
本文使用氨基酸的单字母代码。例如丙氨酸是A，精氨酸是R，天冬酰胺是N，天冬氨酸是D，半胱氨酸是C，谷氨酸是E，谷氨酰胺是Q，甘氨酸是G，组氨酸是H，异亮氨酸是I，亮氨酸是L，赖氨酸是K，甲硫氨酸是M，苯丙氨酸是F，脯氨酸是P，丝氨酸是S，苏氨酸是T，色氨酸是W，酪氨酸是Y，缬氨酸是V，并且γE是谷氨酸，其中R基团(即，侧链)羧基(伽马，γ)是用于连接至肽的任何伯氨基基团或肽的N末端部分而不是α-羧基的部分。出于本申请的目的，氨基酸的单字母编码包括L和/或D氨基酸立体异构体。应当理解，当氨基酸组合形成肽时，氨基酸被称为去除了水元素的氨基酸残基。此外，当本披露涉及肽序列中的氨基酸时，应理解为氨基酸残基。
如本文所用，术语“脂肪族”是指含有以直链、支链或非芳香族环连接在一起的碳和氢的化合物或基团。脂肪族化合物或基团可以是饱和的(例如，烷烃如己烷和其他烷烃，烷基如己基和其他烷基)或不饱和的(例如，己烯和其他烯烃，以及炔烃、己烯基和其他烯基，以及炔基)。脂肪族化合物或基团(例如，烷基、烯基或炔基)可以被例如1、2、3、4、5、6、7或8个取代基例如(＝O)、羟基、羧基、羰基和/或酯基取代。例如，脂肪族基团可以具有羧基作为取代基，其作为侧基和/或在末端。当脂肪族基团是化合物的一部分时，应理解脂肪族基团可以通过化学连接(例如羰基(C＝O，也由C(O)或C(＝O)表示)(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合到化合物上。应当理解，脂肪链中的碳数包括化学连接中的主链碳。例如，包含C(＝O)连接的饱和C8脂肪族链，当线性时，可以表示为CH3(CH2)6C(＝O)。作为另一个实例，在第一末端具有羧基基团并且在第二末端包括C(＝O)连接的饱和C8脂肪族链，当线性时，可以表示为HOC(＝O)(CH2)6C(＝O)。例如，包含C(＝O)连接的饱和C18脂肪族链，当线性时，可以表示为CH3(CH2)16C(＝O)。作为另一个实例，在第一末端具有羧基基团并且在第二末端包括C(＝O)连接的饱和C18脂肪族链，当线性时，可以表示为HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)。脂肪族基团可衍生自脂肪酸和/或脂肪族基团可衍生自二酸。
如本文所用，术语“烷基”是指直链(例如，线性)或支链的饱和烃基。示例性烷基包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如正丙基和异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、叔丁基)、戊基(例如正戊基、异戊基、新戊基)等。烷基可含有1至约30、1至约24、2至约24、1至约20、2至约20、1至约10、1至约8、1至约6、1至约4或1至约3个碳原子。
如本文所用，术语“脂肪酸”是指被羧基取代的饱和或不饱和的脂肪族链。脂肪酸的实例包括辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸和/或木蜡酸。
如本文所用，术语“脂肪酸酯”是指在链的末端具有-C(＝O)O-部分的长脂肪族链(饱和或不饱和的)。
如本文所用，术语“脂肪酸酰胺”是指在链的末端具有-C(＝O)NR-部分的长脂肪族链(饱和或不饱和的)。
如本文所用，可互换使用的术语“个体”、“受试者”或“患者”是指任何动物，包括哺乳动物，优选地小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，并且最优选地人。
如本文所用，短语“治疗有效量”是指引起研究者、兽医、医师或其他临床医生在组织、系统、动物、个体或人中寻求的生物或药物反应的一定量的治疗剂(即药物，或治疗剂组合物)，该反应包括以下中一项或多项：
(1)预防疾病；例如，对易患疾病、病症或障碍但尚未经历或显示疾病的病理学或症状学的个体的疾病、病症或障碍进行预防；
(2)抑制疾病；例如，抑制正在经历或显示疾病、病症或障碍的病理学或症状学的个体的疾病、病症或障碍；以及
(3)改善疾病；例如，改善正在经历或显示疾病、病症或障碍的病理学或症状学的个体的疾病、病症或障碍(即，逆转病理学和/或症状学)，如降低疾病的严重性、延长存活时间和/或预防死亡。
如本文所用，术语“推注剂量”是指在短时间内(例如，少于10分钟(例如，少于8分钟，少于5分钟、少于3分钟或少于1分钟))给予或施用的药物或其他物质的单剂量。在一些实施例中，推注剂量在少于5分钟内施用。在一些实施例中，推注剂量在少于3分钟内施用。在一些实施例中，推注剂量在少于1分钟内施用。施用包括以下之一：身体任何部位的注射(包括但不限于血管、皮下、鞘内或皮内)，口服(作为剂型)，吸入(例如，通过气管内吸入施用，其中受试者暴露于高气溶胶浓度，使得活性药物成分直接沉积在下呼吸道)，或经鼻(例如，作为气溶胶、液体或粉末)。
如本文所用，术语“血压下降”、“血压的下降”或“低血压”可互换使用，指的是受试者血压在统计学上显著降低小于基线血压。基线血压是在治疗或向受试者施用任何药物之前测量的平均血压，或正常健康受试者的平均血压。大多数血压测量设备的标准偏差可能在5％-15％之间，具体取决于测量方法和位置、精神状态或测量过程中受试者的移动。为了本说明书的清楚起见，血压的变化将表示为在药物或测试品施用之前血压相对于平均/均值基线血压的统计学上显著的百分比增加、减少或下降。统计学上显著意味着P<0.05，如统计学领域的技术人员所知。
如本文所用，术语“C型利尿钠肽”或“CNP”是一种肽，包括22个氨基酸残基，具有由二硫键形成的17个氨基酸残基的环结构，以及在N末端延伸的另外5个氨基酸残基(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.10]；其中字母与常规氨基酸命名法一致，氨基酸残基C-6(位置6)和C-22(位22)通过二硫键连接)。参见，例如，Sudoh等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]1989；159:1427-1434。
如本文所用，术语“NPRB受体”、“利尿钠肽受体B(NPRB)”或“NPR2”、“鸟苷酸环化酶B(GC-B)”或“B型利尿钠肽受体2(NPR2)”可互换使用。在人中，NPRB受体由NPR2基因编码，该基因位于9号染色体上，在小鼠中位于4号染色体上。参见，例如，Nuglozeh等人,Genome.[基因组]1997；8:624-625。NPRB的表达在心脏、脑、子宫、卵巢、肾、肺、肝和脂肪细胞等多种器官以及某些癌症中都有报道。Schulz等人,Cell.[细胞]1989；58:1155-1162；Nagase等人,J.Hypertens.[高血压杂志]1997；15:1235-1243；Chrisman等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]1993；268:3698-3703。NPRB选择性地被CNP激活，而不是被ANP或BNP(其他已知的利尿钠肽)激活。NPRB的遍在表达表明它在许多生理功能中的作用。另一种利尿钠肽受体NPRA被生理浓度的ANP和BNP激活，NPRA不被CNP激活。NPRA和NPRB受体之一相比于两者的激活的生理后果的差异在本披露之前仍不清楚，使得本披露的方法是非显而易见的且具有创造性。
如本文所用，术语“长效C型利尿钠肽”或“长效CNP”是指CNP配制品，当作为单次推注剂量施用给哺乳动物受试者(人、非人灵长类动物、狗、大鼠、小鼠等)时，由此产生的血浆中CNP水平升高或血浆环状GMP水平升高高于基线将持续超过4小时或超过6小时的持续时间，具体取决于物种。长效C型利尿钠肽或长效CNP包括超长效C型利尿钠肽或超长效CNP。血浆环状GMP的升高是CNP结构活性本身的结果，或者来自CNP与含有CNP的配制品的一种或多种组分的组合。血浆中的存在(或升高)是指可检测到的存在超过和高于分析基线水平，其中基线水平是在不存在长效CNP配制品施用的情况下测量的水平。血浆环状GMP持续升高的持续时间长度是CNP配制品生物活性的持续时间。CNP配制品是指包含CNP肽与一种或多种赋形剂或载剂例如聚合物、蛋白质、糖、去污剂和/或缓冲剂的组合物。CNP配制品中的CNP可以共价连接或不连接至赋形剂或载剂。施用后可通过药代动力学/药效学分析评估血液中的持续存在。
如本文所用，含有“超长效C型利尿钠肽”或“超长效CNP”的配制品是指含有22个氨基酸残基CNP的长效CNP配制品，其配制方式如下：当作为单次推注剂量施用给受试者时，将在血浆中持续存在或使血浆环状GMP持续升高高于基线24小时或更长时间(例如，多达2-3天或多达1-4周)。因此，超长效C型利尿钠肽或超长效CNP是长效C型利尿钠肽或长效CNP的子集。血浆中的存在是指可检测到的存在超过或高于在不施用治疗性CNP配制品的情况下受试者通常产生的内源性天然激动剂或分析基线水平。血浆环状GMP升高或可检测的CNP的存在超过基线的持续时间(即，时间长度)可以是24至192小时，或24至48小时，或48至72小时，或72至96小时，或96至120小时，或120至144小时，144至168小时，或168至192小时。如上所述，CNP配制品是包含CNP肽与一种或多种赋形剂或载剂例如聚合物、蛋白质、糖、去垢剂和/或缓冲剂的组合物。CNP配制品中的CNP可以共价连接或不连接至赋形剂或载剂。施用后可通过药代动力学/药效学分析评估血液中的持续存在。
如本文所用，术语“长效CNP衍生物”是这样的CNP衍生物，当其作为单一推注剂量施用给哺乳动物受试者或患者时在血浆中持续存在或使血浆环状GMP持续升高高于基线超过4小时或超过6小时，具体取决于物种。长效CNP衍生物包括超长效CNP衍生物。长效性质可来自CNP衍生物结构本身，或来自CNP衍生物与含有CNP衍生物的配制品的一种或多种组分的组合。血浆或血液中的存在是指可检测到的存在超过哺乳动物通常产生的内源性天然激动剂或高于不施用治疗性化合物、肽、蛋白质或配制品的情况下的分析基线水平。施用后可通过药代动力学/药效学分析评估血液中的持续存在。在一些实施例中，CNP衍生物是经修饰的CNP，其与天然CNP具有至少72％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％)的序列同源性或同一性。在一些实施例中，CNP衍生物是添加型衍生物，其中天然CNP通过在CNP肽的N末端处、C末端处或任何氨基酸残基的R基团中共价添加化学部分(例如一种或多种另外的氨基酸和/或脂肪酸和/或任何一个和/或多个化学部分)进行修饰。在一些实施例中，CNP衍生物包括取代衍生物，其中天然CNP中的1至6个氨基酸残基(或5％至28％的氨基酸残基)被不同或非天然氨基酸残基替代。在某些实施例中，CNP衍生物包括减法衍生物，其中天然CNP中的1至6个氨基酸残基(或5％至28％的氨基酸残基)被缺失。在某些实施例中，CNP衍生物包括减法衍生物，其中天然CNP中的1至6个氨基酸残基(或5％至28％的氨基酸残基)被缺失和/或取代。CNP衍生物配制品是指含有CNP衍生物与一种或多种赋形剂或载剂如聚合物、蛋白质、糖、洗涤剂或缓冲剂的组合物。
如本文所用，术语“超长效CNP衍生物”是指长效CNP衍生物或CNP衍生物，当其作为单一推注剂量施用给哺乳动物受试者或患者时在血浆中持续存在或使血浆环状GMP持续升高高于基线，持续时间为24小时或更长时间。因此，超长效CNP衍生物是长效CNP衍生物的子集。超长效CNP衍生物可来自CNP衍生物结构本身，或来自CNP衍生物与含有CNP衍生物的配制品的一种或多种组分的组合。血浆中的存在是指可检测到的存在超过在不施用超长效CNP衍生物的情况下的分析基线血浆水平。血浆环状GMP升高或可检测的CNP衍生物的存在超过基线的持续时间可以是24至192小时，或24至48小时，或48至72小时，或72至96小时，或96至120小时，或120至144小时，144至168小时，或168至192小时。施用后可通过药代动力学/药效学分析评估血液中的持续存在。在一些实施例中，CNP衍生物包括与天然CNP具有72％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％)序列同一性的经修饰的CNP。在一些实施例中，CNP衍生物是添加型衍生物，其中天然CNP通过在CNP肽的N末端处、C末端处或任何氨基酸残基的R基团中共价添加化学部分(例如另外的氨基酸和/或脂肪酸和/或任何一个和/或多个化学部分)进行修饰。在一些实施例中，CNP衍生物是取代衍生物，其中天然CNP中的1-6个氨基酸残基(或5％-28％的氨基酸残基)被不同或非天然氨基酸残基替代。在某些实施例中，CNP衍生物是减法衍生物，其中天然CNP中的1-6个氨基酸残基(或5％-28％的氨基酸残基)被缺失。在某些实施例中，CNP衍生物包括减法衍生物，其中天然CNP中的1至6个氨基酸残基(或5％至28％的氨基酸残基)被缺失和/或取代。CNP衍生物配制品是含有CNP衍生物与一种或多种赋形剂或载剂如聚合物、蛋白质、糖、洗涤剂或缓冲剂的组合物。
如本文所用，术语“CNP配制品”或“CNP衍生物配制品”是指含有CNP肽或其衍生物的组合物，该CNP肽或其衍生物可以共价连接或不共价连接至赋形剂或载剂，例如聚合物、蛋白质和/或脂质。
如本文所用，术语“NPRB激动剂”或“NPR2激动剂”是指的以下任何化合物、肽或蛋白质：在其结构中不包含22个氨基酸残基CNP序列并且可以结合细胞催化受体NPRB，并且刺激其细胞内鸟苷酸环化酶活性以增加细胞内或血液中的环状GMP水平，但结合和刺激NPRA受体的能力有限或没有。由于并非所有细胞都表达相似水平的NPRB，因此NPRB激动剂经过专门设计以主要影响那些表达NPRB的细胞。通过测量表达NPRB的细胞中的活性，与表达NPRA的细胞中的活性相比，本领域技术人员可以容易地测量这种选择性。
如本文所用，术语“长效NPRB激动剂”是指上文定义的NPRB激动剂，当其作为单一推注剂量施用给哺乳动物受试者或患者时在血浆中持续存在或使血浆环GMP持续升高高于基线超过4小时或超过6小时，具体取决于物种。长效NPRB激动剂包括超长效NPRB激动剂。NPRB激动剂的长效特性可来自NPRB激动剂结构本身，或来自NPRB激动剂与含有NPRB激动剂的配制品的一种或多种组分的组合。血浆中的存在是指可检测到的存在超过在不施用长效NPRB激动剂的情况下的分析基线水平。长效NPRB激动剂的配制品或长效NPRB激动剂配制品是包含长效NPRB激动剂，或长效NPRB激动剂与一种或多种赋形剂或载剂(例如聚合物、蛋白质、糖、脂质、或缓冲剂)的组合物。长效NPRB激动剂可以共价连接或不连接至赋形剂或载剂。施用后可通过药代动力学/药效学分析评估血液中的持续存在。环状GMP在基线以上的持续血浆升高可以通过施用后的药效学分析来评估。
如本文所用，术语“超长效NPRB激动剂”是指长效NPRB激动剂，当其作为单一推注剂量施用给哺乳动物受试者或患者时将在血浆中持续存在或使血浆环状GMP持续升高高于基线24小时或更长时间。超长效NPRB激动剂是长效NPRB激动剂的子集。NPRB激动剂的超长效特性可来自NPRB激动剂结构本身，或来自NPRB激动剂与含有NPRB激动剂的配制品的一种或多种组分的组合。血浆中的存在是指其可检测到的存在超过在不施用超长效NPRB激动剂的情况下的分析基线水平。血浆环状GMP升高或可检测的NPRB激动剂的存在超过基线的持续时间可以是24至192小时，24至48小时，或48至72小时，或72至96小时，或96至120小时，或120至144小时，144至168小时，或168至192小时。超长效NPRB激动剂的配制品或超长效NPRB激动剂配制品是指包含超长效NPRB激动剂，或超长效NPRB激动剂与一种或多种赋形剂或载剂(例如聚合物、蛋白质、糖、脂质、或缓冲剂)的组合物。超长效NPRB激动剂可以共价连接或不连接至赋形剂或载剂。施用后可通过药代动力学/药效学分析评估血液中的持续存在。施用后可通过药代动力学/药效学分析评估血液中的持续存在。环状GMP在基线以上的持续血浆升高可以通过施用后的药效学分析来评估。
如本文所用，短语“对NPRA具有有限或无激动活性的NPRB激动剂”是指对NPRB具有比NPRA高5倍的结合亲和力(或更低的EC50)的NPRB激动剂。
如本文所用，术语“聚合物”是指主要或完全由共价键合在一起的许多相似重复单元形成的大分子。术语聚合物包括纤维素衍生物、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(N-乙烯基吡咯烷酮)及其衍生物。这些聚合物可以是支链的或直链的。如本文所用，聚合物可通过酰胺、酯、醚、硫醚、硫酯或氨基甲酸酯键或通过含有这些键之一的接头连接至肽、蛋白质或接头基团。聚合物也可以相互接枝以制成受保护的接枝共聚物赋形剂，当与活性药物成分混合时，可以通过延长活性药物成分在体内施用后在血液或血浆中的存在来增强活性药物成分的药代动力学和药效学性能。
本文所用的术语“氨基酸”是指分子量小于500Da，含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)官能团，以及特定于每个氨基酸的侧链(R基团)的有机化合物。氨基酸的关键元素是碳(C)、氢(H)、氧(O)和氮(N)，尽管在某些氨基酸的侧链中发现了其他元素。截至1983年，已知约有500种天然存在的氨基酸(虽然只有20种出现在哺乳动物遗传密码中，但这20种氨基酸在本文中也称为“天然氨基酸”)。氨基酸可以是α氨基酸，其中氨基基团直接键合至α碳。氨基酸可以是非α氨基酸，其中伯氨基基团与α位置以外的碳连接。α碳是直接与羧基相邻的碳。
本文所用的术语“衍生物”或“类似物”包括其核心结构与亲本化合物相同或非常相似，但具有化学或物理修饰，例如不同或额外的基团的化合物；该术语包括可以连接到其他原子或分子的亲本化合物的共聚物。该术语还包括与亲本肽或蛋白质具有至少72％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％)序列同一性的肽或蛋白质。该术语还包括与亲本肽相比附接有另外基团的肽，例如另外标记或标签。该术语还包括与亲本聚合物相比附接有另外基团的聚合物，例如烷氧基或甲氧基基团。
如本文所用，“添加型衍生物”或“扩展型衍生物”是指肽衍生物，其中肽的主要主链氨基酸序列保持不变，但是使用主氨基酸序列中的一个或多个反应性部分将额外的官能团和/或氨基酸残基添加到主氨基酸序列中提供了添加型衍生物或扩展型衍生物。添加型衍生物或扩展型衍生物不同于截短和/或取代肽衍生物，其中肽的主链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基已分别被去除和/或被不同的官能团和/或氨基酸替代。
如本文所用，术语“接头基团”或“连接基团”或“接头”是指将两个实体(例如，两个分子的部分)共价连接或键合在一起的原子或化学部分。例如，衍生自市售交联剂的接头前体例如氨基酸、肽或非氨基酸分子可以与两个实体反应，通过接头基团将两个实体连接在一起。一旦两个部分连接在一起，接头基团就是在最终连接的实体中从接头前体中保留下来的部分。例如，如果要将分子A连接到分子B，则接头基团可以具有两个化学官能团，其中一个官能团将与A反应，而另一个官能团将与B反应，从而产生“A-接头基团-B”。在这种情况下，接头基团是A和B共价连接后保留的接头前体的部分。
如本文所用，术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。
如本文所用，术语“肽”是指具有三个或更多个氨基酸通过α氨基和α羧基经由酰胺键共价连接在一起的多肽。肽中的氨基酸残基数量可以是3到约100个单元。
如本文所用，术语“蛋白质”是指大到足以具有三维结构的多肽，例如β-桶或α-螺旋。
如本文所用，术语“抗体”是指由识别特定抗原的免疫细胞产生的蛋白质。它是响应血液中特定抗原而产生并且抵消其的蛋白质。抗体与身体识别为异物(例如细菌、病毒和血液中的外来物质)的物质发生化学结合
如本文所用，术语“人源化抗体”是指来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加它们与人中天然产生的抗体变体的相似性。
如本文所用，术语“皮下施用”、“s.c.”、“s.c.施用”、“SC”或“SC施用”是指将通常为液体形式的药物直接递送到皮肤正下方的脂肪组织中。递送通常通过直接注射进行。这些注射比注射到肌肉组织中的注射要浅。提供者经常对适合缓慢而稳定地吸收到血液中的药物使用皮下注射，
如本文所用，术语“静脉内施用”、“IV施用”或“IV注射”是指将通常以液体形式的药物直接递送到动物或人的静脉中。递送方法通常是通过直接注射。静脉内施用途径可用于注射(使用高压注射器)；以及输注(例如，使用重力提供的压力)。
如本文所用，术语“肌内施用”、“IM施用”或“IM注射”是指将通常以液体形式的药物直接肌内递送至动物或人的肌肉中。递送通常通过直接注射进行。这样可以使药物迅速吸收到血液中。在某些情况下，个人也可以自行进行IM注射。在一些实施例中，可以使用IM注射代替静脉内注射，例如，当某些治疗剂刺激静脉时，或当无法定位合适的静脉时。
如本文所用，术语“经鼻施用”是指通过局部施用、以液体形式滴下、吹入(或吹或喷)动物或人的鼻子来递送治疗剂(例如，以凝胶、液体、气溶胶、气体或粉末的形式)。根据配制品的不同，这种施用形式可以用于例如将治疗剂递送至鼻腔或肺(取决于所使用的装置)，和/或可能不会被全身吸收(纯局部施用)，和/或可能完全被全身吸收(纯全身)，和/或更频繁地部分吸收(局部和全身)。鼻喷雾剂可以包括局部作用的药物，例如用于感冒和过敏治疗的减充血剂，其全身作用通常很小。可用作鼻喷雾剂的全身活性药物的实例包括，例如，偏头痛药物、尼古丁替代品和激素治疗。
如本文所用，术语“肠胃外”或“非胃肠”施用是指不通过肠内或胃肠途径的施用途径。肠胃外施用的实例包括皮下(皮肤下面)、静脉内(进入静脉)、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、腹膜内(输注或注射进入腹膜)、吸入(例如，通过气管内吸入施用，其中受试者暴露于活性药物成分的高气溶胶浓度，使得活性药物成分直接沉积在下呼吸道)、经鼻施用(通过鼻子)、舌下和口腔施用、鞘内(进入椎管)、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、皮内(进入皮肤本身)或任何其他不涉及胃肠道的施用途径。如本文所用，术语“肠内”是指施用至消化道的任何区域，包括嘴(口)、咽(喉)、食道、胃、小肠、大肠、直肠和肛门，或通过在这些区域中的任何一个区域中的人工开口。
如本文所用，术语“治疗剂”、“药物”或“活性药物成分”是指能够在疾病状态下产生治愈性效果的物质或分子。
如本文所用，术语“赋形剂”是指以下物质，该物质与活性药物成分一起配制或混合以达到长期稳定的目的，以使含有少量有效活性成分的配制品增重(因此通常称为作为“膨胀剂”、“填充剂”或“稀释剂”)，和/或给最终剂型中的活性药物成分赋予治疗增强作用，例如促进药物吸收和/或效力/剂量、降低粘度，提高溶解度，和/或延长活性药物成分在血液中的作用或存在时间。合适赋形剂的选择取决于施用途径和剂型、活性药物成分和其他因素。赋形剂可以包括例如糖、氨基酸、缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂、溶剂或媒剂，和/或在体外和/或体内结合和稳定活性药物成分的复合聚合物。尽管赋形剂曾一度被认为是“非活性”成分，但现在人们认为它们有时可以成为“剂型性能的关键决定因素”。换句话说，赋形剂对药效学和药代动力学的影响可能很重要并且可能需要进行广泛的研究和调查。赋形剂如何影响活性药物成分的递送通常是不可预测的。
如本文所用，术语“治疗”是指在病症诊断之后进行的程序。
如本文所用，术语“减轻”是指执行以预防预期伤害或疾病或降低预期伤害或疾病的可能性的程序。
如本文所用，术语“健康受试者”是指没有显著健康相关问题的参与研究的个体(人和/或哺乳动物)。出于本披露的目的，这些是没有肺、肝和/或肾疾病的个体，其与本领域技术人员(内科医生和/或临床医生)评估的患有肺、肝和/或肾疾病的个体的年龄范围相同。例如，具有健康肺的健康成人受试者将具有如通过肺活量测定法测量的约4.8-7.2L的平均肺活量、95-100％的动脉血血红蛋白饱和度和/或80-100mmHg的血氧水平以及约35-45mm Hg的动脉血二氧化碳。具有健康肝的健康人受试者的总血浆蛋白为约60至83g/L，白蛋白为约34至54g/L，成人的总胆红素为约0-12mg/L(18岁以下者为0-10mg/L)，直接胆红素(缀合)为约0-3mg/L，成人血清碱性磷酸酶(ALP)为约44-147国际单位/升(IU/L)或0.73-2.45微开特/升(μkat/L)但18岁以下儿童约两倍，天冬氨酸转氨酶(AST)为约5-40U/L，丙氨酸转氨酶(ALT)为约7-56U/L血清。具有健康肾的健康人受试者的肾组结果不会偏离以下参数：肾小球滤过率大于60mL/min/1.73sqm，血肌酐为约5.0至15mg/L(根据所使用的测定法变化约20％)，血尿素氮(BUN)70至240mg/L，BUN比肌酐为约6至25，血清钠为约135-145mM，血清钾为约3.6-5.2mM，氯化物为约98-112mM，碳酸氢盐为约17-29mM，阴离子间隙7-15，以及磷43-45mg/L。此外，一般正常的健康人受试者的静息脉率范围在50到90次/分钟之间，而对于人更宽的范围似乎可以接受，前提是没有甲状腺功能障碍或其他已知重大健康问题的迹象。
如本文所用，术语“肺中升高的总蛋白”或“BALF中升高的总蛋白”是指与来自正常健康对照的BALF相比，以同样的方式测量的支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白浓度增加至少1.5倍。与正常健康对照受试者相比，该水平可以高达4倍(例如，高达2倍，高达3倍，或高达4倍)。
如本文所用，术语“BALF中炎性细胞因子水平升高”是指与正常健康对照受试者的BALF相比，以同样的方式测量的BALF中炎性细胞因子(例如，IL-6、TNFα(TNF-a)、MCP-1、IL-1b浓度增加)增加至少4倍。与正常健康对照受试者的BALF相比，水平可以高达10倍到100倍(例如，高达20倍，高达30倍，高达40倍，高达50倍，高达60-倍、高达70倍、高达80倍、高达90倍或高达100倍)。
如本文所用，“液体”是在室温下自由流动的物质，因此其形状发生变化但其体积保持不变，例如，就像水或油一样。
如本文所用，“室温”表示约25℃的典型环境室内温度。
除非另有定义，否则本披露的任何方面或实施例中的任何特征可以与本发明的任何其他方面或实施例中的任何特征组合，并且这样的组合包含在本披露中。这也适用于但不排他地适用于本文披露的范围的端点。例如，如果给定物质被披露为以X％-Y％或A％-B％的浓度范围存在于组合物中，则本披露应理解为不仅明确披露了范围X％-Y％和A％-B％，而且还明确披露了范围X％-B％、A％-Y％以及尽可能以数字表示的Y％-A％和B％-X％。这些范围和范围组合中的每一个都被预期，并且应被理解为在本申请中被直接且明确地披露。
除非另有说明，否则本申请中使用连字符(“-”)分隔两个括号值X和Y或两个括号比率的范围的指定应理解为表示并披露指定的范围，其中两个端点值包括X和Y。这同样适用于表示为“从X到Y”的范围。因此，“X-Y”、“X到Y”、“从X到Y”、“X-Y”和“从X-Y”的范围的表述应被等同地理解为表示并披露涵盖末端值X、X和Y之间的所有值(包括小数)、以及末端值Y的范围。
如本文所用，术语“约”指的是特定值，例如，范围的一个或多个端点，除了具体列举的值本身之外，还涵盖并披露了围绕该具体列举的值的特定变化。例如，这种变化可能由正常测量可变性引起，例如通过本领域技术人员已知的方法称量或分配各种物质时的正常测量可变性。术语“约”应理解为涵盖和披露高于和低于指定的特定值的可变性范围，所述百分比值是相对于特定引用值本身，如下：术语“约”可涵盖并披露±5.0％的可变性。术语“约”可涵盖并披露±4.5％的可变性。术语“约”可涵盖并披露±4.0％的可变性。术语“约”可涵盖并披露±3.5％的可变性。术语“约”可涵盖并披露±3.0％的可变性。术语“约”可涵盖并披露±2.5％的可变性。术语“约”可涵盖并披露±2.0％的可变性。术语“约”可涵盖并披露±1.5％的可变性。术语“约”可涵盖并披露±1.0％的可变性。术语“约”可涵盖并披露±0.5％的可变性。术语“约”，指的是特定引用的值，可以涵盖并披露该确切的特定值本身，而不管任何明确提及包括该确切的特定值；即使没有明确指示术语“约”包括特定的确切的引用值，该确切的特定值仍包括在由术语“约”产生的变化范围内，因此在本申请中披露。除非另有说明，否则在数值范围的第一个端点之前而不是在该范围的第二个端点之前引用术语“约”时，该术语及其在范围和披露中暗示的可变性指的是范围的第一个端点和范围的第二个端点两者。例如，“约X到Y”的引用范围应该读作“约X到约Y”。这同样适用于列举的比率范围。例如，“约X:Y-A:B”的重量比的引用范围应理解为“(约X):(约Y)-(约A):(约B)”的重量比。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但是以下描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入本文。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并不旨在是限制性的。
易于理解的是，如在此总体所述的和在附图中示出的本披露的方面可以各种的不同构造方式进行布置、取代、组合、分隔和设计，所有这些都被明确地在本文中预期。
此外，图中所示的特定布置不应被视为限制性的。应当理解，其他实施例可以包括更多或更少的给定图中所示每个要素。此外，一些图示的要素可以组合或省略。此外，示例性实施例可以包括未在图中示出的要素。
治疗方法
本披露的特征在于治疗方法，包括治疗患有肺、肝和/或肾损伤或与肺、肝和/或肾损伤相关的病症或症状的受试者(例如哺乳动物受试者，有需要的患者)的方法。肺、肝和/或肾损伤或与肺、肝和/或肾损伤相关的病症或症状可包括例如急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺水肿、肺中炎性细胞水平升高、肺中炎性细胞因子水平或表达增加(与健康肺相比)、肺泡空间中蛋白水平增加(与健康肺相比)、低动脉血氧合(其中低动脉血氧合是低于60mmHg的血液PaO2和/或低于90％的血液血红蛋白氧饱和度(SpO2))、败血症、菌血症、肺炎、纤维化(例如，肺、肝或肾纤维化)和/或肾损伤。在一些实施例中，肺、肝和/或肾损伤或与肺、肝和/或肾损伤相关的症状可包括例如急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺水肿、肺中炎性细胞水平升高、肺中炎性细胞因子水平或表达增加(与健康肺相比)、肺泡空间中蛋白水平增加(与健康肺相比)、低动脉血氧合(其中低动脉血氧合是低于60mm Hg的血液PaO2和/或低于90％的血液血红蛋白氧饱和度(SpO2))、肺炎、纤维化和/或肾损伤。受试者可能具有低动脉血氧合，定义为血液PaO2低于60mm Hg和/或血液血红蛋白氧饱和度(SpO2)低于90％。
本披露的特征还在于一种治疗一般纤维化(包括例如肺纤维化、肝纤维化、肝硬化和肾小球硬化)以及治疗肾损伤或保护免受肾损伤的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效CNP、超长效CNP、长效CNP衍生物、超长效CNP衍生物、长效NPRB激动剂和/或超长效NPRB激动剂。治疗有效推注剂量是不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但该剂量可施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为推注剂量施用前的血浆水平、健康受试者的血浆水平，其在人中为4+/-1pmol/ml或约1.4mg/ml(但在物种之间可以变化)。参见，例如，Shotan等人,Plasma cyclic guanosine monophosphate in chronic heart failure:hemodynamic and neurohormonal correlations and response to nitrate therapy[慢性心力衰竭中的血浆环磷酸鸟苷：血液动力学和神经激素相关性以及对硝酸盐治疗的反应].Clin Pharmacol Ther[临床药理学与治疗学],1993.54(6):第638-44页，以其整体并入本文。在优选的实施例中，基线水平是对提供治疗的同一受试者在药物施用之前测得的水平，并且该水平可以从一个受试者到下一个受试者变化。在实施本披露时，用作参考参数以评价治疗效果的任何基线参数通过治疗前的测量建立。通常但不完全是，基线血浆环状GMP水平根据一天中的时间而变化，白天清醒时水平较低，就寝后不久水平较高，并且人全天可能在2-8pmol/ml之间变化。因此，在施用组合物之前测量的基线血浆环状GMP水平和在施用本披露的组合物之后测量的血浆环状GMP水平可以每天在相同的预定时间发生。在描述平均基线的情况下，平均基线可以是给定受试者在24小时期间内对给定参数以至少4小时的间隔进行至少3次的平均基线测量。这控制了受试者间或个体间的可变性。在患有充血性心力衰竭的患者中，基线血浆环状GMP水平可能高2至3倍，并且基线是在每个个体受试者或受试者组的治疗之前建立的。与血压类似，将在药物施用前测量基线水平，并用作评估治疗效果的参考。没有任何已知健康病症症状的健康小鼠的基线cGMP水平为20(3.7)pmol/mL[平均值(SEM)；n＝8]或7(1.3)ng/mL[平均值(SEM)；n＝8]。没有任何已知健康病症症状的狗的基线cGMP水平为5-12ng/ml。
在一些实施例中，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物进一步减少来自受试者的BALF样品中的细胞总数和总蛋白。在某些实施例中，与施用组合物之前的MPO相比，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物进一步降低来自受试者的肺组织中的MPO(激活的嗜中性粒细胞标志物)。在某些实施例中，与施用组合物之前的炎性细胞因子表达相比，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物进一步减弱受试者中的炎性细胞因子表达(例如，IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1和IFNg；其可能存在于例如ARDS中)。在某些实施例中，与施用组合物之前的纤维化区域相比，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物减少纤维化区域(例如，肺纤维化、肝纤维化、肝硬化和/或肾小球硬化中的纤维化区域)，或提供治疗肾损伤或保护免受肾损伤。在某些实施例中，与施用组合物之前相比，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物进一步减少患有特发性肺纤维化的受试者的肺中的纤维化区域。在一些实施例中，与施用组合物之前相比，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物进一步在患有特发性肺纤维化的受试者中降低细胞数量和蛋白质水平，并降低IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1和IFNg中任一种或其任何组合的表达。在一些实施例中，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物降低受试者的以下：AST、ALT、α-SMA、IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg、iNOS、Elf-1、Tollip、IRAK-1、P-P38、P-P65、β-act、STAT1、P-STAT1、STAT2、STAT3、STAT6中任一种的表达，纤维化区域，血清肌酐，尿液中的白蛋白/肌酐比率，肺中的羟脯氨酸，或其任何组合。
在一些实施例中，治疗有效推注剂量不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为推注剂量施用前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平。
在一些实施例中，治疗有效推注剂量不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的15％，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为推注剂量施用前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平。
在一些实施例中，治疗有效推注剂量不会使血压降低超过基线血压测量值的10％，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但该剂量在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为推注剂量施用前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平。
在一些实施例中，治疗有效推注剂量不会使血压降低超过5％，但该剂量在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为推注剂量施用前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平。
本披露的方法通过以下出人意料的发现而成为可能：CNP可以以如下方式被修饰、衍生化和/或配制，该方式使得它可以诱导/导致增加和/或最大化环状GMP产生而没有相关的不利的血压下降。特别是，CNP的血压影响可以在治疗推注剂量下最小化或消除，该剂量可使血浆环状GMP以持续的方式增加高于基线1.5倍或更多，持续时间超过4小时或6小时，具体取决于施用的肽。
在一些实施例中，本披露的特征在于治疗患有肺、肝和/或肾损伤或与肺、肝和/或肾损伤相关的病症或症状的受试者(例如哺乳动物受试者，有需要的患者)的方法，该肺、肝和/或肾损伤是例如：急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺水肿、肺中炎性细胞水平升高、肺中炎性细胞因子水平或表达增加(与健康肺相比)、肺泡空间中蛋白水平增加(与健康肺相比)、低动脉血氧合(其中低动脉血氧合是低于60mm Hg的血液PaO2和/或低于90％的血液血红蛋白氧饱和度(SpO2))、、败血症、菌血症、肺炎、纤维化(例如，肺/肺部纤维化、肝纤维化、肝硬化和/或肾小球硬化)和/或肾损伤。在一些实施例中，肺、肝和/或肾损伤，或与肺、肝和/或肾损伤相关的症状包括：急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺水肿、肺中炎性细胞水平升高、肺中炎性细胞因子水平或表达增加(与健康肺相比)、肺泡空间中蛋白水平增加(与健康肺相比)、低动脉血氧合(其中低动脉血氧合是低于60mm Hg的血液PaO2和/或低于90％的血液血红蛋白氧饱和度(SpO2))、肺炎、纤维化(例如，肺/肺部纤维化、肝纤维化、肝硬化和/或肾小球硬化)和/或肾损伤。在一些实施例中，受试者可能具有低动脉血氧合，定义为血液PaO2低于60mm Hg和/或血液血红蛋白氧饱和度(SpO2)低于90％。这些方法描述如下。
在一些实施例中，方法包括向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效CNP；其中治疗有效推注剂量不会使血压(或平均动脉压)降低或下降超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但足以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线是施用组合物之前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平(优选地，在给受试者施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。在一些实施例中，治疗有效推注剂量不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、或超过10％、或超过5％)，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但可以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为推注剂量施用前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平(优选地，在给受试者施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
在一些实施例中，方法包括向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含超长效CNP；其中治疗有效推注剂量不会使血压(或平均动脉压)降低或下降超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但足以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中环状GMP基线是施用组合物之前的平均血浆水平或健康哺乳动物受试者的平均血浆水平。在一些实施例中，治疗有效推注剂量不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％、或超过5％)，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但可以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为推注剂量施用前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平(优选地，在给受试者施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
在一些实施例中，方法包括向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效CNP衍生物；其中治疗有效推注剂量不会使血压(或平均动脉压)降低或导致血压(或平均动脉压)下降超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但足以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线是施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康哺乳动物受试者的平均血浆水平。治疗有效推注剂量是不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是施用组合物之前的平均血压；但该剂量可以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为施用推注剂量之前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平(优选地为该受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
在一些实施例中，方法包括向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含超长效CNP衍生物；其中治疗有效推注剂量不会使血压(或平均动脉压)降低或导致血压(或平均动脉压)下降超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但足以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线是施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康哺乳动物受试者的平均血浆水平。治疗有效推注剂量是不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但该剂量可施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为推注剂量施用前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平(优选地，在给受试者施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
在一些实施例中，方法包括向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效NPRB激动剂；其中治疗有效推注剂量不会使血压(或平均动脉压)降低或下降超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但足以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线是施用组合物之前的平均血浆水平或健康哺乳动物受试者的平均血浆水平。治疗有效推注剂量是不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是施用组合物之前的平均血压；但该剂量可以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为施用推注剂量之前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平(优选地为该受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
在一些实施例中，方法包括向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含超长效NPRB激动剂；其中治疗有效推注剂量不会使血压(或平均动脉压)降低或下降超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但足以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线是施用组合物之前的平均血浆水平或健康哺乳动物受试者的平均血浆水平。治疗有效推注剂量是不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是施用组合物之前的平均血压；但该剂量可以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为施用推注剂量之前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平(优选地为该受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
受试者可能具有低动脉血氧合，定义为血液PaO2低于60mm Hg和/或血液血红蛋白氧饱和度(SpO2)低于90％。该方法包括向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含超长效NPRB激动剂；其中治疗有效推注剂量不会使血压(或平均动脉压)降低或下降超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是组合物施用前的平均血压，但足以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线是施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康哺乳动物受试者的平均血浆水平。治疗有效推注剂量是不会降低或导致血压(或平均动脉压)降低超过基线血压测量值的20％(例如，超过15％、超过10％或超过5％)的剂量，其中基线血压测量值是施用组合物之前的平均血压；但该剂量可以在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，其中基线血浆环状GMP水平定义为施用推注剂量之前的平均血浆水平或健康受试者的平均血浆水平(优选地为该受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
长效NPRB激动剂或超长效NPRB激动剂可包括多肽，例如抗体。在一些实施例中，长效NPRB激动剂或超长效NPRB激动剂包括分子量小于2kDa的分子。
在一些实施例中，在任何一种上述方法中，组合物对NPRA具有有限的或没有激动活性和/或对NPRB受体具有比NPRA受体高5倍的结合亲和力(或低5倍的EC50)。
在一些实施例中，对于上述方法中的任何一种，向受试者施用包括诸如口服施用或肠胃外施用的施用方法。肠胃外施用的实例是皮下、静脉内、肌内、吸入、经鼻或其任何组合。在一些实施例中，上述方法可包括口服施用和/或皮下施用。在某些实施例中，上述方法包括静脉内施用。在一些实施例中，上述方法包括肌内施用。在一些实施例中，上述方法包括通过吸入施用(例如，通过气管内吸入施用，其中受试者暴露于高气溶胶浓度以使得活性药物成分直接沉积在下呼吸道中)。在某些实施例中，上述方法包括经鼻施用。在一些实施例中，上述方法包括口服施用。
在一些实施例中，对于上述方法中的任一种，向受试者施用基本上由以下组成或由以下组成：以推注剂量形式施用本披露的组合物。在一些实施例中，对于上述方法中的任一种，向受试者施用不包括在持续的时间段内通过输注施用本披露的组合物(例如，通过连续输注)。在一些实施例中，对于任何上述方法，向受试者施用不包括将本披露的组合物作为推注剂量施用然后在持续的时间段内输注。在一些实施例中，对于上述方法中的任一种，向受试者施用不包括口服施用本披露的组合物。
活性药物成分
对于上述任何方法，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物可包括U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]；U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]；GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]；和/或U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.11]，其中U连接到N末端G、C和/或K残基的ε氨基。
在一些实施例中，以上序列中的U是式(I)或(II)的部分，其中式(I)是
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中：
a是0或1(优选a是1)；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，
其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；
m是0、1、2或3；
n是0、1、2或3；并且
m和n之和至少为1，
并且式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中a是0或1(优选a是1)；
聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或其衍生物；
Y是：
1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；
含有氨基酸残基的接头，其中该氨基酸残基共价连接至(聚合物)a；或
不同于该1-10个氨基酸残基或肽序列的肽接头。
在一些实施例中，在上式(II)中，Y是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
在本披露中，小写字母“x”是指其出现的肽序列中的天然或非天然氨基酸残基。大写X是指式(I)和(II)中的接头。在一些实施例中，x不是甲硫氨酸残基(M)，不是天冬酰胺残基(N)，或既不是甲硫氨酸残基(M)也不是天冬酰胺残基(N)。在一些实施例中，x不是由哺乳动物基因组编码的20个天然氨基酸残基中的任何一个，例如氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、和Y。在一些实施例中，x是非天然氨基酸残基(即，不是由哺乳动物基因组编码的氨基酸残基)。在一些实施例中，x是高谷氨酰胺(本文也称为homoQ)。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]；其中U连接到GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC的N末端G，并且U是(脂肪族)a-(X)-；其中a是1；脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C10-18链，或任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接(例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合到X；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQ ID NO.12]其中x是天然或非天然氨基酸残基且U具有式(脂肪族)a-(X)-(式I)；其中0或1(优选a是1)；脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C10-18链，或任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接(例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合到X；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；并且X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQ ID NO.30]其中x是天然或非天然氨基酸残基且前提是x不是M(甲硫氨酸)；U具有式(脂肪族)a-(X)-(式I)；其中0或1(优选a是1)；脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C10-18链，或任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接(例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合到X；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；并且X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物可包括U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]；U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]；GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]；U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.12]，或其任何组合；
其中：
U是式(I)的部分，其中式(I)是
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中
a是0或1(优选a是1)；
脂肪族是任选地经取代的C10-24链(例如，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，
其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；
m是0、1、2或3；
n是0、1、2或3；并且
m和n之和至少为1。
在一些实施例中，U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQ ID NO.12]中的x不是甲硫氨酸残基，不是天冬酰胺残基，或既不是甲硫氨酸残基也不是天冬酰胺残基。在一些实施例中，x不是由哺乳动物遗传密码编码的20个天然氨基酸残基中的任何一个，例如氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、和Y。在一些实施例中，x是非天然氨基酸残基(即，不是由哺乳动物遗传密码编码的氨基酸残基)。在一些实施例中，x是高谷氨酰胺(本文也称为homoQ)。
在一些实施例中，X是4-7个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]，
其中：
U是(脂肪族)a-(X)-；
其中：
a是1；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQ ID NO.13]，x是高谷氨酰胺；U是(脂肪族)a-(X)-，其中a是0或1(优选a是1)，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或任选地经取代的通过与X的化学连接(例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合至X的C18链；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是Gly；m是0、1或2；并且n是1。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQ ID NO.14]，x是高谷氨酰胺；U是(脂肪族)a-(X)-，其中a是0或1(优选a是1)，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或任选地经取代的通过与X的化学连接(例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合至X的C18链；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是Gly；m是1；并且n是1。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQ ID NO.15]，x是高谷氨酰胺；U是(脂肪族)a-(X)-，其中a是0或1(优选a是1)，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或任选地经取代的通过与X的化学连接(例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合至X的C18链；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；m是1；并且n是0。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.12]，其中U是(脂肪族)a-(X)-；a是0或1(优选a是1)；脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基，或脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O))；X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。在一些实施例中，U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQID NO.12]中的x不是甲硫氨酸残基，不是天冬酰胺残基，或既不是甲硫氨酸残基也不是天冬酰胺残基。在一些实施例中，x不是由哺乳动物遗传密码编码的20个天然氨基酸残基中的任何一个，例如氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、和Y。在一些实施例中，x是非天然氨基酸残基(即，不是由哺乳动物遗传密码编码的氨基酸残基)。在一些实施例中，x是高谷氨酰胺(本文也称为homoQ)。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是高谷氨酰胺(homoQ)[SEQ ID NO.16]，U是(脂肪族)a-(X)-；其中a是0或1(优选a是1)；脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或任选地经取代的通过与X的化学连接(例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合至X的C18链；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是0，并且n是2。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是高谷氨酰胺(homoQ)[SEQ ID NO.17]，U是(脂肪族)a-(X)-；其中a是0或1(优选a是1)；脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或任选地经取代的通过与X的化学连接(例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合至X的C18链；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是1，并且n是2。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是高谷氨酰胺(homoQ)[SEQ ID NO.18]，U是(脂肪族)a-(X)-；其中a是0或1(优选a是1)；脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或任选地经取代的通过与X的化学连接(例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合至X的C18链；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-(Gly)，m是0并且n是1。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是高谷氨酰胺(homoQ)[SEQ ID NO.19]，U是(脂肪族)a-(X)-；其中a是0或1(优选a是1)；脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或任选地经取代的通过与X的化学连接(例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)共价结合至X的C18链；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-(Gly)，m是1并且n是1。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物U-CFGLKLDRIGSxSGLGC是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其具有半胱氨酸残基之间的二硫键(homoQ：高谷氨酰胺；Aeea：2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基；HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)：十八碳二烯酸与γE反应，使羰基(C(＝O))从原始十八碳二烯酸羧酸末端之一保留下来；γE：通过γ-羧基基团缀合的谷氨酸[SEQ ID NO.20]。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物U-CFGLKLDRIGSxSGLGC是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其具有半胱氨酸残基之间的二硫键(homoQ：高谷氨酰胺；Aeea：2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基；HOC(＝O)(CH2)16(CO)：十八碳二烯酸与Aeea的氨基末端反应，使羰基(C(＝O))从原始十八碳二烯酸羧酸末端保留下来；[SEQ ID NO.21]。
在一些实施例中，在本文的任何定义中，脂肪族不包括以下中的一个或多个：直链或支链的任选地经取代的C4-9链(例如，任选地经取代的C3-8链C(＝O)-部分和/或任选地经取代的C4-9链，其通过连接共价结合至该肽，该连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)。在某些实施例中，脂肪族不是直链或支链的C8链(例如，直链或支链的C8链通过连接共价结合到肽，该连接是例如羰基、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)。
在一些实施例中，如上所述的U包括CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGG-[SEQ ID NO.22]；CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGG-[SEQ ID NO.23]；CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGG-[SEQ ID NO.24]；CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGG-[SEQ ID NO.25]；或CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGG[SEQ ID NO.26]。
在一些实施例中，本披露的长效CNP衍生物包括CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.5]；CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]；CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.7]；CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.8]；CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.9]；HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，包括半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.20]；和/或HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，包括半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.21]。
在某些实施例中，本披露的长效CNP衍生物包括CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]，U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]、GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]，U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.27]，或其任何组合；
其中U是式(II)的部分，其中式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中a是0或1(优选a是1)；
该聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)；
Y是：
4-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；或
接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
在一些实施例中，长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包括U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]，U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]，或其任何组合；
其中U是式(II)的部分，其中式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中a是0或1(优选a是1)；
聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或其衍生物；
Y是：
1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；
含有氨基酸残基的接头，其中该氨基酸残基共价连接至(聚合物)a；
不同于1-10个氨基酸残基或肽序列的肽接头。
在一些实施例中，上式(II)中的Y是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
在一些实施例中，该聚合物不包括聚(乙二醇)、MPEG、或聚(乙二醇)和MPEG两者。
在一些实施例中，Y是4-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)；或接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
在一些实施例中，Y是4-10个氨基酸残基的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)。
在一些实施例中，Y是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
在一些实施例中，本披露的CNP或其衍生物不包括在SEQ ID NO.10的位置4和10处的赖氨酸残基处和/或在SEQ ID NO.10的CNP的N末端处经聚亚烷基二醇修饰的CNP。
在一些实施例中，包含本披露的长效CNP衍生物的配制品包括与聚合物赋形剂一起配制的一种或多种CNP或其衍生物，该聚合物赋形剂包括用聚乙二醇、脂肪酸和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)。该聚合物适于螯合或非共价结合一种或多种CNP衍生物。
在一些实施例中，包含本披露的超长效CNP衍生物的配制品包括与聚合物赋形剂一起配制的一种或多种长效CNP衍生物，该聚合物赋形剂包括用聚乙二醇、脂肪酸和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)。该聚合物适于螯合或非共价结合一种或多种CNP衍生物。
在一些实施例中，包含本披露的一种或多种长效NPRB激动剂的配制品包括与聚合物赋形剂一起配制的一种或多种CNP或其衍生物，该聚合物赋形剂包括用聚乙二醇、脂肪酸和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)。该聚合物适于螯合或非共价结合一种或多种NPRB激动剂。
在一些实施例中，包含本披露的超长效NPRB激动剂的配制品包括与聚合物赋形剂一起配制的一种或多种长效CNP衍生物，该聚合物赋形剂包括用聚乙二醇、脂肪酸和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)。该聚合物适于螯合或非共价结合一种或多种NPRB激动剂。
用聚乙二醇、脂肪酸和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)可包括可具有D-或L-手性或两者且为直链均聚物的聚(氨基酸)。在一个具体的实施例中，直链均聚物包括聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丝氨酸、聚酪氨酸或由氨基酸制成的任何其他酰胺连接的均聚物。在另一个优选的实施例中，直链疏水均聚物包括聚丙氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚甘氨酸或聚苯丙氨酸。在一些实施例中，聚(氨基酸)是聚赖氨酸。
制备活性药物成分的方法
本披露的肽，例如长效CNP、长效CNP衍生物和长效NPRB激动剂，可以使用本领域普通技术人员已知的方法通过固相肽合成(SPPS)进行合成。例如，起始固体支持物，如H-Cys(Trt)-2-Cl-Trt树脂(毕得医药科技股份有限公司(BLDPharm)，上海，中国)可用于肽合成仪中，如自动微波肽合成仪(例如，LibertyBlue HT12，CEM，马修斯(Matthews)，北卡罗来纳州)。可以使用本领域普通技术人员已知的Fmoc化学将每个氨基酸、脂肪酸或受保护的烷基羧(二)酸依次锚定到肽树脂上，从而产生与树脂连接的线性的受保护的肽。线性粗肽可以通过在碳正离子清除剂和乙醚沉淀存在下用三氟乙酸酸解来脱保护并从树脂释放。得到的线性肽可以环化，例如通过溶解在DMSO和乙腈水溶液中并反应形成二硫键。最后，肽可以通过反相HPLC纯化和表征(例如，1260Infinity II制备型LC系统，圣克拉拉，加利福尼亚州)。可以收集最终肽产品纯度>90％的级分并干燥为白色粉末。
在一些实施例中，包含本披露的活性药物成分(“API”)的配制品具有的聚合物赋形剂相对于API的重量比使得所得混合物是长效或超长效的。例如，聚合物赋形剂与总API的重量比可为5:1至100:1、10:1至50:1或20:1至5:1。聚合物赋形剂可以包括用聚乙二醇、脂肪酸和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)。聚合物赋形剂适于螯合或非共价结合API。聚合物赋形剂的实例在以下中有所描述：例如Castillo等人,Pharm.Res.[药学研究],(2012)29(1)；第306-18页；Castillo等人,PLoS One[公共科学图书馆·综合],(2017)12(2)；e0171703；和美国专利号10,507,248；10,035,885和10,010,613，其各自通过引用以其整体并入本文中。聚合物赋形剂可以是但不限于以下聚赖氨酸：在ε氨基处用PEG接枝，其水平在总ε氨基酸的10-55％水平(例如，10-35％或30-55％)，并且其余氨基基团接枝有烷基基团和/或阴离子部分，例如硫酸盐、磺酸盐、羧基、磷酸盐或膦酸盐。制备聚合物赋形剂的方法是本领域已知的。
简而言之，在一些实施例中，聚合物赋形剂是通过以下程序制备的聚合物。溶解聚-L-赖氨酸(20PL)、氢溴酸盐(21μmol或1g；西格玛公司(Sigma)，平均Mw＝26kDa；d.p.126)，并通过TNBS滴定法确定NH2-基团的量。使用NHSS和EDC将甲氧基聚乙二醇羧甲基(MPEG-CM；10g；Mw＝5kDa；2mmol；莱三生物公司(Laysan Bio))与聚赖氨酸偶联，以提供聚合物赋形剂中间体。剩余的氨基基团百分比由TNBS确定。流体动力学直径通过尺寸排阻色谱法确定。可以将粗产物冻干。通过用NHS激活硬脂酸制备硬脂酰-NHS(C18-NHS)。可以进行硬脂酰-NHS与聚合物赋形剂中间体的DCC偶联。过量的试剂和副产物可以通过标准技术去除。添加另外的C18-NHS(3.6mmol)并使其与聚合物中间体反应过夜。通过在真空下旋转蒸发来浓缩反应混合物以除去挥发性组分直至分离出油状物。该油状物可溶于酒精和水。可以将溶液过滤、反复洗涤以提供含有聚合物赋形剂(具有C18疏水侧链和MPEG亲水侧链的聚赖氨酸)的滞留物，收集、0.2um过滤(聚砜过滤器，耐洁公司(Nalgene)，罗切斯特(Rochester)，纽约州)并冻干，以提供干聚合物赋形剂。
虽然上文描述了具有C18疏水侧链的聚合物赋形剂，但应理解，其它疏水侧链长度(例如C10-24、C12-20、C12-18、C14-18、C16-18或C18)和亲水侧链(例如，PEG、mPEG)可适于制备具有其他疏水侧链和亲水性侧链的聚合物赋形剂。
用聚乙二醇、脂肪酸和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)可包括可具有D-或L-手性或两者且为直链均聚物的聚(氨基酸)。在一个具体的实施例中，直链均聚物包括聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丝氨酸、聚酪氨酸或由氨基酸制成的任何其他酰胺连接的均聚物。在另一个优选的实施例中，直链疏水均聚物包括聚丙氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚甘氨酸或聚苯丙氨酸。在一些实施例中，聚(氨基酸)是聚赖氨酸。
亲水性侧链的实例包括聚乙二醇，它可以被二羧酸酯化形成聚(乙二醇)单酯；甲氧基聚(乙二醇)单酯(MPEG)或聚(乙二醇)和聚(丙二醇)单酯以酯的形式与二羧酸的共聚物，该二羧酸给该共聚物的末端赋予羧基基团，该羧基基团可用于将该共聚物共价连接至聚(氨基酸)。其他形式包括聚(乙二醇)-羧基；甲氧基聚(乙二醇)-羧基；聚(乙二醇)-羧基甲基；甲氧基聚(乙二醇)-羧基甲基；聚(乙二醇)单胺；甲氧基聚(乙二醇)单胺；聚(乙二醇)酰肼；甲氧基聚(乙二醇)酰肼；甲氧基聚(乙二醇)咪唑啉；聚(乙二醇)和以聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯亚胺为代表的一种或几种聚合物的嵌段共聚物，其中这些嵌段交替以形成线性嵌段共聚物。在一个实施例中，保护链的总分子量可以大于300道尔顿但不超过10,000道尔顿。在一个实施例中，一条或多条保护链通过单个连接而连接至聚(氨基酸)主链。
不希望受理论的束缚，据信当将API组合物施用于受试者时，聚合物赋形剂与API的重量比越高，血浆中的存在越持久，并且血浆环状GMP高于基线的升高越持久。
在一些实施例中，包含本披露的长效CNP、长效CNP衍生物和/或长效NPRB激动剂的配制品具有的聚合物赋形剂相对于CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂的重量比使得所得混合物是长效CNP、长效CNP衍生物和/或长效NPRB激动剂。例如，聚合物赋形剂与CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂的重量比可为5:1至100:1、10:1至50:1或20:1至5:1。聚合物赋形剂可以包括用聚乙二醇、脂肪酸和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)。参见，例如，Castillo等人,Pharm.Res.[药学研究],(2012)29(1)；第306-18页；Castillo等人,PLoSOne[公共科学图书馆·综合],(2017)12(2)；e0171703；和美国专利号10,507,248；10,035,885；10,010,613，其各自通过引用以其整体并入本文中。聚合物赋形剂适于螯合或非共价结合CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂。聚合物赋形剂可以是但不限于以下聚赖氨酸：在ε氨基处用PEG接枝，其水平在总ε氨基酸的30-55％或10-35％水平，并且其余氨基基团接枝有烷基基团和/或阴离子部分，例如硫酸盐、磺酸盐、羧基、磷酸盐或膦酸盐。制备聚合物赋形剂的方法是本领域已知的。不希望受理论的束缚，据信当将CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂组合物施用于受试者时，聚合物赋形剂与CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂的重量比越高，血浆中CNP、CNP衍生物或NPRB激动剂的存在越持久，并且血浆环状GMP高于基线的升高越持久。
在一些实施例中，超长效CNP、超长效CNP衍生物和/或超长效NPRB激动剂配制品包括CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂和聚合物赋形剂，其中聚合物赋形剂相对于CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂的重量比使得所得混合物是超长效CNP、超长效CNP衍生物和/或超长效NPRB激动剂。例如，聚合物赋形剂与CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂的重量比可为5:1至100:1、10:1至50:1或20:1至5:1。聚合物赋形剂可以包括用聚乙二醇、脂肪酸和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)。参见，例如，Castillo等人,Pharm.Res.[药学研究],(2012)29(1)；第306-18页；Castillo等人,PLoS One[公共科学图书馆·综合],(2017)12(2)；e0171703；和美国专利号10,507,248；10,035,885；10,010,613，其各自通过引用以其整体并入本文中。聚合物赋形剂适于螯合或非共价结合CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂。聚合物赋形剂可以是但不限于以下聚赖氨酸：在ε氨基处用PEG接枝，其水平在总ε氨基酸的30-55％或10-35％水平，并且其余氨基基团接枝有烷基基团和/或阴离子部分，例如硫酸盐、磺酸盐、羧基、磷酸盐或膦酸盐。制备聚合物赋形剂的方法是本领域已知的。不希望受理论的束缚，据信当将CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂组合物施用于受试者时，聚合物赋形剂与CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂的重量比越高，血浆中CNP、CNP衍生物和/或NPRB激动剂的存在越持久，并且血浆环状GMP高于基线的升高越持久。
病症
在一些实施例中，本披露的任何方法包括治疗ALI。在某些实施例中，本披露的任何方法包括治疗ARDS。在一些实施例中，本披露的方法包括治疗肺水肿。在一些实施例中，本披露的方法包括治疗低动脉血氧合。在某些实施例中，本披露的方法包括治疗肺中升高水平的炎性细胞。在一些实施例中，本披露的方法包括治疗败血症。在一些实施例中，本披露的方法包括治疗菌血症。在又一些实施例中，本披露的方法包括治疗肺/肺纤维化。在一些实施例中，本披露的方法包括治疗一般纤维化(例如，肺/肺部纤维化、肝硬化和/或肾小球硬化)和/或肾损伤。
在一些实施例中，当治疗的病症是ALI或ARDS时，ALI或ARDS由以下中任一者引起或与其相关：(i)选自以下的全身性损伤：创伤、败血症(即，全身感染)、菌血症(即，血液中的细菌)、胰腺炎、休克、多次输注、弥散性血管内凝血、烧伤、药物过量或中毒、阿片类药物、阿司匹林、吩噻嗪类、三环类抗抑郁药、胺碘酮、化疗药剂、呋喃妥因、鱼精蛋白、血栓性血小板减少性紫癜、头部损伤和/或百草枯；和/或(ii)选自以下的肺损伤：胃内容物吸入、肺插管、栓塞(例如，来自血栓、脂肪、空气或羊水)、肺结核、病毒性肺炎(例如由冠状病毒或流感病毒引起的SARS)、细菌性肺炎、细胞源性机化性肺炎、气道阻塞、吸食游离碱可卡因、近乎溺死、有毒气体吸入、氧中毒、肺挫伤、辐射暴露、高海拔暴露、肺再膨胀和/或再灌注。
在一些实施例中，当所治疗的病症为ALI或ARDS时，ALI或ARDS可以由感染性疾病引起，其中感染性疾病由以下引起：冠状病毒或流感病毒、肺纤维化、败血症；菌血症；插管；和/或选自由氯气、烟雾、光气和/或浓氧组成的组的有毒气体。
在某些实施例中，当治疗的病症是ALI或ARDS时，ALI或ARDS由传染病引起(例如，其中传染病由冠状病毒或流感病毒引起)。
在某些实施例中，当治疗的病症是ALI或ARDS时，ALI或ARDS由肺纤维化引起。
在某些实施例中，当治疗的病症是ALI或ARDS时，ALI或ARDS由败血症引起。
在进一步的实施例中，当治疗的病症是ALI或ARDS时，ALI或ARDS由菌血症引起。
在进一步的实施例中，当治疗的病症是ALI或ARDS时，ALI或ARDS由插管引起。
在进一步的实施方式中，当治疗的病症是ALI或ARDS时，ALI或ARDS由有毒气体(例如氯气、烟雾、光气、浓氧或其任何组合)引起。
“急性肺损伤”/“急性呼吸窘迫综合征”(ALI/ARDS)是指一种危及生命的临床肺综合征，其28天死亡率为30％至50％。在美国，ALI/ARDS的患病率约为200,000例/年。参见例如，Johnson E.R.,和Matthay MA,J Aerosol Med Pulm Drug Deliv.[气溶胶医学和肺部递送杂志]23(4):243-52,2010。ALI是一种以肺泡损伤为特征的综合征或病症，肺泡损伤是由内皮和上皮屏障的破坏、中性粒细胞炎症反应、肺水肿以及肺血氧合、肺顺应性和气道阻力的显著功能障碍引起。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种更严重形式的ALI。如本文所用，ALI包括ALI和ARDS。出于人临床诊断目的，ALI由北美-欧洲共识分类(参见，例如，Henru等人,Intensive Care Med[重症监护医学](2013)39:2161-2170)基于上述病症或综合征的结局或总和结果(即在没有心力衰竭的情况下患者的血氧合减少)定义。这种减少是指在楔压小于18mg Hg(即，不是心血管原因)的情况下PaO2:FiO2(定义见下文)比率为200至300mg Hg，同时存在双侧浸润(医生阅读胸部X射线时使用的“浸润”术语)的放射照相存在(通过X射线确定)，与肺水肿一致。ARDS患者出现快速呼吸短促和血氧水平非常低，其中PaO2低于63mmHg或PaO2:FIO2比率低于300mg Hg，其中PaO2是动脉血中的氧分压，FIO2是吸入氧气分数浓度。可替代地，或此外，脉搏血氧仪，一种连接到手指或耳朵的使用光的传感器，可用于根据血红蛋白氧饱和度或SpO2确定血液氧合。氧合良好的血液的SpO2为96-99％，90及以下表明PaO2:FiO2比率低于300mg Hg。可以进行其他血液检查—包括肾功能、甲状腺功能和血细胞计数检查—以及排除心脏病发作(心电图/超声心动图)作为任何肺水肿的原因而不是ALI的检查。
ALI/ARDS可由多种损伤引起，包括败血症(全球ALI最常见的诱发原因，参见，例如，Leonard D.Hudson,Arthur S.Slutsky,在Goldman's Cecil Medicine[希氏内科学](第二十四版),2012)，胃内容物吸入、休克、感染、肺挫伤、非胸外伤、毒物吸入、近乎溺死和/或多次输血。流感或冠状病毒(例如，H1N1、SARS-Cov-1和2)引起的肺损伤可导致危及生命的ALI/ARDS。从机制上讲，这些损伤会导致肺泡内皮和上皮屏障的破坏，以及流体(肺水肿)、血浆蛋白和炎性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞)渗漏到肺/肺泡腔中，从而限制红细胞从肺泡空气中获取氧气导致严重的低氧血症，或极低的血红蛋白氧饱和度和呼吸窘迫。炎性细胞的积累被认为是通过这些细胞产生大量氧衍生自由基而促进和维持损伤的核心。细胞因子、生长因子和降解酶也由炎性细胞产生并释放到细胞外环境中。这些分子和蛋白会破坏发炎组织中的实质细胞，并可能导致细胞死亡。ALI的严重程度与肺泡空间中炎性细胞(激活的中性粒细胞)的数量呈正相关。ALI患者中性粒细胞的早期激活状态决定了该病的临床过程。参见例如Yang等人,Am.J.Respir.Crit.Care Med.[美国呼吸与危重症医学杂志]167:15671574,2003。许多ALI动物模型与中性粒细胞浓度升高有关。参见例如Abraham等人,Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.[美国生理与非细胞分子生理杂志]279:1137-1145,2000；Flick等人,Circ.Res.[循环研究]48:344-351,1981；Heflin A C Jr和Brigham K L.J.Clin.Invest.[临床研究杂志]68:1253-1260,1981；Shasby等人,Am.Rev.Respir.Dis.[美国呼吸系统疾病评论]125:443-447,1982。
因此，“急性肺损伤”(ALI)是指哺乳动物或人的肺障碍，导致在没有心力衰竭临床证据的情况下血氧水平非常低，PaO2(动脉氧分压)低于约60mmHg或PaO2:FiO2比率低于300mg Hg(如果PaO2:FiO2比率严重低于300mg Hg，则该病症进一步表现为呼吸短促)，双侧浸润在放射学上与肺水肿一致。术语ALI还包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，这是一种更严重形式的ALI。PaO2:FiO2比率是在没有心力衰竭临床证据情况下动脉血中氧分压(PaO2)与吸入氧分数浓度(FiO2)的比率。FiO2可以是大气中氧气的分数浓度0.21(或21％)，但在使用氧气作为支持性护理的医院环境中，这可能高达0.60。因为FIO2会根据吸入空气中氧气的使用而变化，PaO2单独低于60mm Hg是ALI的指标，PaO2从60mm Hg降低的程度表明ALI/ARDS更严重。
由于PaO2需要抽血，因此脉搏血氧仪也用于确定血氧合。脉搏血氧仪是一种无创方法，用于监测人的血液血红蛋白氧饱和度(SO2)，现在被称为“第五生命体征”。它使用两种波长的光(在四肢例如手指或耳朵中)的吸光度，一种用于氧合血红蛋白，另一种用于脱氧血红蛋白来确定SO2。特别是，脱氧血红蛋白在光谱的红色波段(600至750nm)中吸收最大，而氧合血红蛋白在红外波段(850至1000nm)中吸收最大。计算氧合血红蛋白与氧合血红蛋白加脱氧血红蛋白的吸光度总和之间的吸光度之比，并与先前校准的直接测量值进行比较。SO2低于90％的ALI患者与低于60mmHg的PaO2密切相关，可诊断为ALI。ALI的所有动物模型都与中性粒细胞浓度升高的存在相关联，并且对这些的测量表明ALI的严重性和消退。参见例如Abraham等人,Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.[美国生理与非细胞分子生理杂志]279:1137-1145,2000；Flick等人,Circ.Res.[循环研究]48:344-351,1981；HeflinA.C.Jr.和Brigham K L.J.Clin.Invest.[临床研究杂志]68:1253-1260,1981；Shasby等人,Am.Rev.Respir.Dis.[美国呼吸系统疾病评论]125:443-447,1982)。该模型被本领域技术人员广泛用于诊断哺乳动物受试者的ALI严重程度。
一旦患者出现指示低血氧合的生命体征证据，就可以诊断或确定ALI。这些体征包括呼吸短促、呼吸急促、皮肤呈蓝色/樱桃红色、咳嗽、喘息和出汗。通过脉搏血氧仪测量血氧合或通过抽血和血气分析测量动脉血氧分压(PaO2)来确认低血氧合。显示低血氧合的血气分析是PaO2为60mmHg及以下，或动脉氧分压与吸入氧分数之比(PaO2/FiO2比率)低于300mmHg。使用血氧仪，血液中的血红蛋白氧饱和度(SpO2)低于90％表明血氧合不足。脉搏血氧仪也可用于监测人的血液血红蛋白氧饱和度(SO2)。ALI患者的SO2低于90％(这与PaO2低于300mmHg密切相关)并且可以诊断ALI。低氧合是由于肺水肿(也是ALI的诊断)引起的，并且可以通过胸部X光检查确定，这可以确认肺水肿的诊断并排除其他可能导致呼吸短促的原因。
根据支气管肺泡灌洗液(BALF)确定，ALI还与肺中炎性细胞水平升高有关。获得BALF并分析炎性细胞的水平和大小。支气管肺泡灌洗(BAL)在可弯曲支气管镜检查期间进行，作为一种微创方法已获得广泛认可，可提供有关发生在肺泡水平的免疫、炎症和感染过程的重要信息。参见例如Harbeck RJ,Clin Diagn Lab Immunol.[临床诊断实验室免疫]1998,5(3):271-7]。简而言之，BAL技术通常涉及在患者处于半卧位时经鼻引入柔性纤维支气管镜。它通过咽和声带进入气管，然后到达肺的适当区域。通过支气管镜滴入等份的无菌生理盐水(一般为30至40ml)，然后立即轻轻取出。一百毫升盐水可以对约100万个肺泡或约1.5％到3％的肺进行成分取样，并可以回收大约1ml的上皮衬里液。整个过程不到15分钟。通过灌洗从肺中回收的细胞比从外周血中获得的细胞更加异质。通过流式细胞术检查，主要细胞群包括正常大小的巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞和淋巴细胞。在炎症和ALI期间，上皮细胞数量显著增加。除了数量增加外，肺巨噬细胞的大小范围可以从8到30mm或更大，而BAL液淋巴细胞可以比其外周血对应物更大，这取决于肺的状况，尤其是当它们被激活时。
败血症被定义为由于宿主对感染的反应失调而危及生命的器官功能障碍。共识文件将器官功能障碍描述为感染后序贯器官衰竭评估(SOFA)总分急剧增加两分。参见例如Gul等人,Turk J Anaesthesiol Reanim.[土耳其麻醉学杂志]2017年6月；45(3):129-138]。感染性休克发生在一部分败血症患者中并且包括与死亡率增加相关的潜在循环和细胞/代谢异常。感染性休克的定义是持续性低血压，需要血管加压药来维持65mm Hg或更高的平均动脉血压和血清乳酸水平大于2mmol/L(18mg/dL)，尽管进行了充分的容量复苏。参见例如Singer等人,JAMA 2016；315(8):801-810。该定义也称为败血症3，消除了对存在全身炎症反应综合征(SIRS)来定义败血症的要求，并去除了严重败血症的定义。以前称为严重败血症的是现在败血症的新定义。严重败血症是全球ALI最常见的诱发因素。参见例如Leonard D.Hudson,Arthur S.Slutsky,在Goldman's Cecil Medicine[希氏内科学](第二十四版),2012。败血症引起的炎症会导致ALI，因此必须尽早减轻ALI的进展，因为除了支持性护理外，没有其他治疗方法可用于ALI。内毒素，或更准确地称为细菌脂多糖(LPS)，被认为是败血症和感染性休克发病机制中最有效的微生物介质。参见例如Opal SM.ContribNephrol.2010；167:14-24。因此，在动物模型中使用LPS模拟败血症被广泛用于在人使用之前测试治疗的有效性。由于已知败血症与血压下降有关，而利尿钠肽通常会降低血压，因此将其用作治疗方法是违反直觉的。然而，如上所述，本披露的特征在于使用C型利尿钠肽(CNP)衍生物、长效CNP、长效CNP衍生物、超长效CNP、超长效CNP衍生物、长效NPRB激动剂，和/或超长效的NPRB激动剂治疗败血症，具有有益效果。
菌血症是血液中细菌的存在并且是本领域技术人员已知的。如果血液中的细菌存在时间足够长且数量足够多，特别是在免疫系统较弱的人群中，菌血症会导致其他感染，有时会引发严重的全身反应，称为败血症。菌血症可能由日常活动(如用力刷牙)、牙科或医疗程序或感染(如肺炎或尿路感染)引起。通常菌血症(特别是如果它发生在日常活动中)不会引起感染，因为细菌通常数量很少，并且会被免疫系统迅速从血液中清除。
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种更严重形式的ALI。它是一种发生在危重病患者身上的快速进展性疾病，流体渗漏到肺达到呼吸困难或无法呼吸的程度。
肺水肿是一种由肺本身引起的肺流体过多的病症，通过相当于肺水肿的双侧浸润(由阅读胸部x射线的医生和本领域技术人员使用的“浸润”术语)的放射照相存在(通过X射线)来定义和确诊。这种流体聚集在肺的无数气囊中，导致呼吸困难。与肺水肿一致的双侧浸润(“浸润”是医生阅读胸部X射线时使用的术语)的放射照相存在(通过X射线)。在大多数情况下，心脏问题会导致肺水肿。但流体可能会因其他原因而积聚，包括肺炎、暴露于某些毒素和药物、胸壁外伤以及在高海拔地区旅行或锻炼。突然发生的肺水肿(急性肺水肿)是一种需要立即护理的医疗急症。肺水肿有时可能是致命的，但如果及时治疗，前景会改善。肺水肿的治疗因病因而异，但通常包括补氧和药物治疗。
低动脉血氧合或低氧血症是血液中的氧气含量低于正常水平，氧分压低于60mmHg或脉搏血氧计读数低于90％。正常动脉氧分压为约75至100毫米汞柱(mm Hg)或10.5至13.5千帕(kPa)。正常的脉搏血氧仪读数通常在95％到100％之间，反映了血液中的血红蛋白饱和度。低氧血症是导致各种症状(例如呼吸急促)的问题的体征。
肺部炎性细胞水平升高是指肺中炎性细胞(巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)的水平或数量或数目与以同样方式测量的正常水平健康对照受试者相比增加至少3倍。与正常健康对照受试者相比，该水平可高达10倍。该水平是通过流式细胞术检查从支气管肺泡灌洗液(BALF)中确定的。BALF中的主要细胞群体包括正常大小的巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞和淋巴细胞。在炎症和ALI期间，肺巨噬细胞的数量和大小(8-30um或更大)随着上皮细胞数量的显著增加而增加。同样，淋巴细胞可能比它们的外周血对应物大，这取决于肺的状况并且尤其是当它们被激活时。
在一些实施例中，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物减少来自受试者的BALF样品中的细胞总数和总蛋白。在某些实施例中，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物减少来自受试者的肺组织中的MPO(激活的嗜中性粒细胞标志物)。在某些实施例中，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物减弱(即，减少或降低)炎性细胞因子表达(例如，IL-6，IL-1b、TNFα、MCP-1和IFNg)。在某些实施例中，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物减少患有特发性肺纤维化的受试者的肺中的纤维化区域。在某些实施例中，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物减少肺、肝或肾中的纤维化区域。在一些实施例中，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物在患有特发性肺纤维化的受试者中降低细胞数量和蛋白质水平，并减弱(即，减少或降低)IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1和IFNg中任一种或其任何组合的表达。在一些实施例中，向受试者施用治疗有效推注剂量的组合物降低受试者的以下：AST、ALT、α-SMA、IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg、iNOS、Elf-1、Tollip、IRAK-1、P-P38、P-P65、β-act、STAT1、P-STAT1、STAT2、STAT3、STAT6中任一种的表达，纤维化区域，血清肌酐，尿液中的白蛋白/肌酐比率，肺中的羟脯氨酸，或其任何组合。
提供以下实例以说明而非限制本披露。
实例
实例中使用的所有肽均通过固相肽合成(SPPS)以H-Cys(Trt)-2-Cl-Trt树脂(0.54mmol/g)作为起始固体支持物(毕得医药科技股份有限公司(BLDPharm)，上海，中国)在自动微波肽合成仪(LibertyBlue HT12，CEM，马修斯(Matthews)，北卡罗来纳州)中合成。使用本领域普通技术人员已知的Fmoc化学将肽的每个组成分子，例如氨基酸、脂肪酸或受保护的烷基二酸依次锚定到肽树脂上，从而产生与树脂连接的线性的受保护的肽。线性粗肽可以通过在碳正离子清除剂和乙醚沉淀存在下用三氟乙酸酸解来脱保护并从树脂释放。通过溶解在10％DMSO和20％乙腈水溶液中使所得线性肽环化，并使其反应至少两天以提供二硫键形成。最后，使用含0.1％三氟乙酸(TFA)的10％乙腈水溶液和含0.1％TFA的乙腈的梯度，通过反相HPLC(1260Infinity II制备型LC系统，圣克拉拉，加利福尼亚州)纯化和表征肽。该梯度在Waters 30x150mm XBridge C18柱(P/N 186003284)和Waters C18柱(P/N186006893)上以40mL/min在室温运行24分钟，并在214nm处采集。收集纯度>90％的肽级分并干燥为白色粉末，以提供最终的肽产品。
实例1：当作为推注施用时，长效CNP的体内性能优于天然CNP
用于该研究的所有小鼠都保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司(Oriental Yeast Co.,Ltd.)东京，日本或PicoLab啮齿动物饮食20，LabDiet公司，圣路易斯，密苏里州)。
对于药代动力学研究，雌性CD-1小鼠(6-8周龄，来自查尔斯河实验室(Charlesriver laboratory))用2.0mg/Kg天然人CNP(Chempep公司(Chempep Inc.)惠灵顿,佛罗里达州)、长效CNP衍生物(dCNP，Chempep公司.惠灵顿,佛罗里达州)或超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)通过肩胛骨之间的皮下施用进行处理。所有测试品均配制或溶解在100mM山梨糖醇、100mM甲硫氨酸、20mM组氨酸，pH 6.0中。不同时间(对于天然CNP为0、0.5、1、2、3、4、5和24；对于dCNP和VLA-dCNP为0、1、2、4、8、12、24、48和72)的血液采样是通过眼眶后抽血进行的，每只动物在两个不同的时间点抽血两次。血液样品在K2EDTA管中处理以获得血浆。通过来自凤凰制药公司(Phoenix Pharmaceuticals)(cat#EKE-012-03)的市售CNP ELISA试剂盒分析血浆。CNP是天然人CNP(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.10])并且dCNP是具有以下序列的人CNP的添加型衍生物之一：CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]。VLA-dCNP是dCNP与PK扩展聚合物赋形剂的共配制品，其中dCNP:赋形剂的重量比为1:10。聚合物的细节在Castillo等人,Pharm.Res.[药学研究],(2012)29(1)；第306-18页中有描述，其通过引用以其整体并入本文。
对于环状GMP反应研究的药效学研究，将雄性C57BL/6J小鼠(6周龄，来自Kyudo；佐贺，日本)用1.0mg/Kg的天然人CNP、长效CNP衍生物(dCNP)和超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)通过肩胛骨之间的皮下推注施用进行处理。所有测试品均配制或溶解在100mM蔗糖、100mM甲硫氨酸、50mM组氨酸，pH 7.4中。不同时间(对于天然CNP和dCNP为0、1、4、8、12和24小时；对于dCNP和VLA-dCNP为0、1、2、4、8、5、24和48小时)的血液采样是通过剖腹手术后腹主动脉采血进行的，每个时间点每只动物一次抽血。为了获得血浆，将EDTA(终浓度1.5mg/mL(Dojindo，熊本，日本))和抑肽酶(终浓度500KIU/mL(西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)，密苏里州圣路易斯))添加到血液中并离心(x 2,000g；15分钟，4C)。收获上清液后，将血浆样品储存在-80℃。通过来自CisBio(Codolet,法国)的市售环状GMP试剂盒分析血浆样品。CNP是天然人CNP(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.10])并且dCNP是具有以下序列的人CNP的添加型衍生物之一：CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]。VLA-dCNP是dCNP与PK扩展赋形剂的共配制品，其中dCNP:赋形剂的重量比为1:10。聚合物的细节在Castillo等人,Pharm.Res.[药学研究],(2012)29(1)；第306-18页中有描述，其通过引用以其整体并入本文。具体而言，PK扩展赋形剂如下制备：使用N-羟基磺基-琥珀酰亚胺试剂和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺来激活聚乙二醇(PEG)的羧基基团以连接到5kDa聚乙二醇(PEG)的线性聚赖氨酸的ε氨基(ε氨基:NHSS:EDC:PEG羧基基团摩尔比为0.2:1:1:0.3)将它们连接到分子量为15-40kDa(通过多角度激光散射或MALLS，聚赖氨酸平均分子量为25kDa)的线性聚赖氨酸主链的ε氨基上。产物在过程测定中用三硝基苯磺酸(TNBS)氨基表征。据估计，在PEG添加反应期间有55％的ε氨基基团用完，剩余的ε氨基在使用NHS-硬脂酸的硬脂酸添加反应期间用完。通过TNBS测量，在硬脂酸添加结束时仅存在痕量可测量的氨基基团(<5％)。PK扩展赋形剂通过本领域技术人员熟知的超滤过程纯化。用于有和没有PK扩展赋形剂时的推注施用的缓冲配制品是100mM蔗糖、100mM甲硫氨酸、50mM组氨酸。
参见图1A，显示了在皮下施用2.0mg/Kg天然CNP、CNP衍生物(dCNP)和超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)的量后的CD-1小鼠中的血浆CNP[平均(SD)；n＝5]。插图是左下角的放大比例，以显示当施用天然CNP时CNP(菱形)的低血浆水平。误差棒表示n＝5个血浆样品的标准偏差。施用前的基线CNP水平为1.74(0.6)ng/mL[平均(SD)；n＝15]。图1B的图显示在皮下施用1.0mg/Kg天然CNP、长效CNP衍生物(dCNP)和超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)的量后，使用来自CisBio[Codolet，法国]的环状GMP试剂盒测量的雄性C57BL/6J小鼠中的血浆环状GMP。基线血浆环状GMP水平为20(3.7)pmol/mL[平均值(SEM)；n＝8]或7(1.3)ng/mL[平均值(SEM)；n＝8]。在2小时及以后，与基线相比，天然CNP的皮下施用没有显著升高血浆环状GMP，而长效CNP(dCNP和VLA-dCNP)的类似施用显示环状GMP显著升高至少24小时。
实例2：推注施用高剂量超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)可增加血浆环状GMP，但出人 意料的是没有相应的血压下降
在这项研究中，针对三种不同的长效利尿钠肽评估了心血管和血液动力学效应(这三种不同的长效利尿钠肽是超长效ANP衍生物或VLA-dANP；以与dCNP类似的方式修饰的ANP，其中VLA-ANP是CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGG-SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY[SEQ IDNO.28]加上PK扩展赋形剂并且dANP是单独CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGG-SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY[SEQ ID NO.28]。PK扩展赋形剂是上述实例1和Castillo等人,Pharm.Res.[药学研究],(2012)29(1)；第306-18页(其通过引用以其整体并入本文)中描述的聚合物赋形剂。超长效BNP衍生物或VLA-dBNP是CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGG-SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH(dBNP)[SEQ ID NO.29]加上上述PK扩展赋形剂。dBNP、CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGG-SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH[SEQ ID NO.29]没有上述的PK扩展赋形剂。VLA-dCNP是如实例1中所述的dCNP加上上述PK扩展聚合物赋形剂。dCNP如实例1中所述且不含PK扩展赋形剂。将这些配制品(在100mM蔗糖、100mM甲硫氨酸、50mM组氨酸缓冲液中)施用于比格犬[n＝12只动物/测试品；在至少一周的清除期后，相同的动物用于其他测试品]。这些测试品通过包含25μg/Kg肽和1mg/KgPK扩展聚合物(2.5％负载)的单次皮下注射施用。12只动物之前使用国际数据科学公司(Data Sciences International)(圣保罗，明尼苏达州)遥测发射器进行连续记录心率、平均动脉压、收缩压、舒张压、PR间期、QRS持续时间、QT间期和体温。每个剂量后监测所有动物7天。在每个剂量后4、6、8、16、20、24、28、32、40、48、66、78、90、102、114、126、138、150、162和174小时后，在K3 EDTA收集管中采集3mL血液样品，然后储存在湿冰上，直到在冷冻离心机中旋转。收获血浆并用血浆保存试剂(去离子水中的磷酸，15:85，v/v)处理。将样品倒转几次，然后在干冰上冷冻。将样品储存在冰箱(-80C)中，然后在干冰上运输，用于环状GMP的LC-MS分析。
所有利尿钠肽都通过引起细胞质环状GMP生成增加来发挥作用，据信这会导致相应的血压下降。然而，当比较3种主要利尿钠肽的超长效形式的推注剂量时，出人意料地发现本披露的超长效CNP衍生物的高推注剂量(足以使血液环状GMP增加3天)可以增加血浆环状GMP，而不会引起危险的血压下降。而类似开发的长效ANP和BNP衍生物，当作为推注剂量给予时(足以增加血液环状GMP3天)，会导致血压显著下降。对于超长效ANP衍生物，血压下降高达45％，而对于超长效BNP衍生物，血压下降高达20％。对于所有3种长效利尿钠肽衍生物，环状GMP的增加超过基线的1.5倍并且多达6倍。环状GMP AUC是VLA-dANP 3,483ng*h/mL、VLA-dBNP 2,585ng*h/mL、VLA-dCNP 2,627ng*h/mL。
图2A显示推注施用25ug/Kg超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)、超长效BNP衍生物(VLA-dBNP)和超长效BNP衍生物(VLA-dANP)后监测的血浆环状GMP相应增加[平均值(SEM)；n＝12]。基线血浆环状GMP水平为8(0.2)ng/mL[平均值(SEM)；n＝12]，类似于健康人的水平。参见，例如，Igaki等人,Hypertens Res[高血压研究]1998；21:7-13。所有超长效利尿钠肽配制品都将环状GMP增加超过8ng/ml的基线。环状GMP AUC值是VLA-dANP 3,483ng*h/mL、VLA-dBNP 2,585ng*h/mL、VLA-dCNP 2,627ng*h/mL。超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)增加血浆环状GMP达3天而没有相关联的血压下降。
图2B显示了推注施用25ug/Kg超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)、超长效BNP衍生物(VLA-dBNP)和超长效BNP衍生物(VLA-dANP)后监测的狗中平均动脉压[平均值(SEM)；n＝12]。在以非常高的剂量施用后，VLA-dCNP不会导致血压从基线(0小时)显著下降。相比之下，其他超长效利尿钠肽如VLA-dBNP和VLA-dANP衍生物导致血压下降超过15％。对于VLA-dANP尤其如此，对于类似的环状GMP增加，血压下降可高达50％。超长效CNP衍生物(VLA-dCNP)增加血浆环状GMP达3天而没有相关联的血压下降。
实例3：推注施用超长效CNP衍生物抑制肺损伤
在ALI和ARDS中可见支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞增多，尤其是中性粒细胞增多。因此，测量了细胞数和总蛋白数量(图3)作为中性粒细胞标志物的MPO(图4)。MPO阳性细胞(中性粒细胞)和总蛋白数量的减少表明ALI/ARDS的消退。雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠用脂多糖(LPS)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；0.05mg/kg气管内施用)处理并用各种测试品处理。测试品是超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(如实例1中所述)(低(L)0.1mg/kg s.c.；培养基(M)0.3mg/kg s.c.；高(H)1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(高1.0mg/kg s.c.)、长效CNP衍生物或dCNP(如实例1中所述)(高1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽(ANP)(高1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(高1.0mg/kg s.c.)、抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(一种抗炎药)(克隆XT3.11；BioX细胞公司(BioXcell)西黎巴嫩，新罕布什尔州)(1.0mg/kg s.c.)，以及称为伐地那非(VDN，开曼化学公司(Cayman Chemicals)，安阿伯，密歇根州)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。在施用LPS后立即施用测试品。包括未经LPS处理的正常对照(NC)和未经测试品处理的LPS处理组(对照)。治疗24小时后，在异氟醚麻醉下处死小鼠，然后收获支气管肺泡灌洗液(BALF)。BALF中的总细胞数用计数室计数。BALF中的总蛋白浓度用PierceTMBCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))测量。统计分析基于使用GraphPad InStat 3执行的Dunnett检验(n＝15、23、7、7、7、7、7、7和9；NC、对照、CNP(H)、dCNP(H)、ANP(H)、BNP(H)、抗TNFαab、VDN、VLA-dCNP(H)。*P<0.01相比于VLA-dCNP(H))。在ALI和ARDS中可见BALF中的细胞增多(尤其是中性粒细胞)。因此，测量BALF中的细胞数量和作为激活的嗜中性白细胞标志物的MPO。
图3A是用于评估dCNP抑制的LPS诱导的急性肺损伤的方案的时间线。图3B显示ALI和ARDS中BALF中的细胞，尤其是中性粒细胞的增加，遵循图3A中所示的方案。细胞的减少表明ALI/ARDS的消退。统计分析基于使用GraphPad InStat 3执行的Dunnett检验(n＝15、23、7、7、7、7、7、7和9；NC、对照、CNP(H)、dCNP(H)、ANP(H)、BNP(H)、TNFαab、VDN、VLA-dCNP(H)。*P<0.01相比于VLA-dCNP(H))。图3C显示BALF、ALI和ARDS中总蛋白，遵循图3A中所示的方案。总蛋白的减少表明ALI/ARDS的消退。统计分析基于使用GraphPad InStat 3执行的Dunnett检验(n＝15、23、7、7、7、7、7、7和9；NC、对照、CNP(H)、dCNP(H)、ANP(H)、BNP(H)、TNFαab、VDN、VLA-dCNP(H)。*P<0.01相比于VLA-dCNP(H))。
实例4.使用dCNP和VLA-dCNP进行肺治疗
A)dCNP和VLA-dCNP减少了肺中的嗜中性粒细胞浸润，表明ALI/ARDS的消退
雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司；0.05mg/kg气管内施用)处理，并用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(如实例1中所述)(1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(如实例1中所述)(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽(ANP)(1.0mg/kgs.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kg s.c.)，抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(克隆XT3.11；BioX细胞公司西黎巴嫩，新罕布什尔州)(1.0mg/kg s.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(开曼化学公司，安阿伯，密歇根州)(1.0mg/kg s.c.)。在施用LPS后立即施用测试品。处理24小时后，在异氟烷麻醉下处死小鼠，收获肺组织并用4％多聚甲醛固定。将固定肺组织的石蜡切片用抗MPO兔多克隆抗体(安捷伦技术公司(AgilentTechnologies)圣克拉拉，加利福尼亚州)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG山羊多克隆抗体(日冷生物科学公司(Nichirei bioscience Inc.)东京，日本)和3,3'-二氨基联苯胺-4HCl(DAB)(安捷伦技术公司圣克拉拉，加利福尼亚州)进行免疫组织染色。计算每个视野的MPO阳性细胞数量。统计分析基于使用GraphPad InStat 3执行的Dunnett检验(n＝18、6、6、6、6、6、6和6；对照、CNP、dCNP、ANP、BNP、抗TNFαab、VDN、VLA-dCNP。*P<0.01相比于VLA-dCNP以及**P<0.05相比于VLA-dCNP)。在ALI和ARDS中可见BALF中的细胞增多(尤其是中性粒细胞)。因此，测量BALF中的细胞数量(图3B)和作为激活的嗜中性白细胞标志物的MPO(图4A)。HE染色所见的炎性细胞浸润表明肺中的炎症。
图4A显示VLA-dCNP处理减少了MPO阳性中性粒细胞的数量，MPO是标志性中性粒细胞促炎细胞。统计分析基于使用GraphPad InStat 3执行的Dunnett测试(n＝18、6、6、6、6、6、6和6；对照、CNP、dCNP、ANP、BNP、TNFαab、VDN、VLA-dCNP。*P<0.01相比于VLA-dCNP以及**P<0.05相比于VLA-dCNP)。
B)dCNP和VLA-dCNP减少肺中炎性细胞浸润或炎症
增加的H&E染色表明肺中的炎性细胞浸润或炎症。雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司；0.05mg/kg气管内施用)处理，并用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(如实例1中所述)(1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(如实例1中所述)(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽(ANP)(1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kgs.c.)，抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kg s.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。在施用LPS后立即施用测试品。处理24小时后，在异氟烷麻醉下处死小鼠，收获肺组织并用4％多聚甲醛固定。固定的肺组织的石蜡切片用苏木精-伊红染色法染色。苏木精和伊红(H&E)染色对于识别各种组织类型和形态变化至关重要。该染色显示了广泛的细胞质、细胞核和细胞外基质特征。苏木精将细胞核染成蓝色，反映细胞或多核细胞的数量，而伊红通常将蛋白染成粉红色，并显示细胞质蛋白和细胞外基质蛋白。增加H&E染色表明肺中的炎性细胞浸润或炎症。
图4B显示肺组织石蜡切片的苏木精-伊红(HE)染色的显微照片，显示肺泡空间中有核细胞、总体细胞数量、细胞外基质和蛋白质的增加、瘢痕形成和/或蛋白渗透。HE染色所见的炎性细胞浸润表明肺中的炎症(右分图显示随着细胞数量和蛋白的增加染色更深)。对于这些研究，将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司；0.05mg/kg气管内施用)处理，并用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kgs.c.)、CNP衍生物或dCNP(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽(ANP)(1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kg s.c.)，抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kg s.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。在施用LPS后立即施用测试品。治疗后24小时，在异氟烷麻醉下处死小鼠，收获肺组织并用4％多聚甲醛固定。将固定肺组织的石蜡切片经抗MPO抗体染色(棕色至深棕色)和苏木精-伊红染色(细胞核为蓝紫色，蛋白为粉红色)。实例5：VLA-dCNP和dCNP处理减弱了BALF中炎性细胞因子经LPS诱导 的上调
雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，保持12小时光照/12小时黑暗循环，自由获得水和标准小鼠饮食(MF饮食公司(MF diet)，东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司；0.05mg/kg气管内施用)处理，并用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(如实例1中所述)(1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(如实例1中所述)(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽(ANP)(1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kg s.c.)，抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kg s.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kgs.c.)。在施用LPS后立即施用测试品。治疗24小时后，在异氟醚麻醉下处死小鼠，然后收获支气管肺泡灌洗液(BALF)。每种细胞因子浓度，特别是白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)浓度均使用市售的时间分辨率FRET试剂盒(Cisbio公司，贝德福德，马萨诸塞州)进行测量。使用ELISA试剂盒(R&D系统公司(R&D SYSTEMS)，明尼苏达州明尼阿波利斯)测量巨噬细胞趋化蛋白1(MCP-1)。先前的研究显示了TNFα的作用(PLoSOne[公共科学图书馆·综合],2014年7月22日；9(7):e102967)以及非幸存者中TNFα、IL-6的升高(Chest[胸],1997:111:1306-21)和在发生ARDS/ALI的患者中的MCP-1的升高(International Journal of Molecular Sciences[国际分子科学杂志],2019:20(9):2218)。统计分析基于使用GraphPad执行的学生t检验。
图5A显示VLA-dCNP和dCNP处理减弱了BALF中炎性细胞因子(IL6)的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，并用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽(ANP)(1.0mg/kgs.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kg s.c.)，抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kgs.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。治疗24小时后，收获支气管肺泡灌洗液(BALF)并测量IL-6细胞因子。统计分析基于学生t检验。(n＝15、23、7、7、7、7、7、7和9；NC、对照、CNP、dCNP、ANP、BNP、TNFαab、VDN和VLA-dCNP。*P<0.01相比于VLA-dCNP以及**P<0.05相比于VLA-dCNP)。
图5B显示VLA-dCNP和dCNP处理减弱了BALF中炎性细胞因子(TNFα)的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。该方案与图5A中描述的方案相同，除了收获支气管肺泡灌洗液(BALF)并测量TNFα细胞因子。
图5C显示VLA-dCNP和dCNP处理减弱了BALF中炎性细胞因子(MCP-1)的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。该方案与图5A中描述的方案相同，除了收获支气管肺泡灌洗液(BALF)并测量MCP-1细胞因子。
实例6：VLA-dCNP处理减弱了肺组织中炎性细胞因子的经LPS诱导的上调
雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司；0.05mg/kg气管内施用)处理，并且用VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)处理。VLA-dCNP(如实例1中所述)在LPS施用后立即施用。处理24小时后，在处死前用异氟醚麻醉小鼠。在补充1mM PMSF、2μg/ml抑肽酶和1mM过钒酸盐的细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、50mM NaF、30mM Na4P2O7)中提取收获的肺组织中的蛋白。使用ELISA试剂盒(R&D系统公司，明尼苏达州明尼阿波利斯)测量提取的肺蛋白、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和巨噬细胞趋化蛋白1(MCP-1)中的每种细胞因子浓度。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的学生t检验。
图6A-6D显示VLA-dCNP处理减弱了肺组织中炎性细胞因子的经LPS诱导的上调以促进ARDS/ALI的消退。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，并且用VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)处理。处理后24小时，收获肺组织。使用ELISA试剂盒测量提取的肺蛋白、白细胞介素6(IL-6)(图6A)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(图6B)、白细胞介素1β(IL-1β)(图6C)和巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)中的每种细胞因子浓度(图6D)。统计分析基于学生t检验(n＝10、10、9；NC、对照、VLA-dCNP。*P<0.05相比于对照)。
实例7：VLA-CNP减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括通常受NFkb系统调节的IL- 6、TNFα、IL1b(其是炎症系统的主要调节剂))表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者体内的 炎症反应，以消退ARDS/ALI(图7)
雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司；0.05mg/kg气管内施用)处理，并用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(如实例1中所述)(1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(如实例1中所述)(1.0mg/kg s.c.)、心房利尿钠肽或ANP(1.0mg/kgs.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kg s.c.)，肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kgs.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。在施用LPS后立即施用测试品。处理24小时后，将小鼠用异氟醚麻醉并且然后处死，然后收获肺组织并在TRI试剂(分子研究中心公司(Molecular Research Center,Inc.)辛辛那提，俄亥俄州)中切碎，并保存在-80℃直至分析。通过氯仿-苯酚法从收获的肺组织中提取总RNA。用cDNA试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，希尔登(Hilden)，德国)从提取的mRNA合成互补DNA(cDNA)。通过预混试剂盒(宝生物工程株式会社(Takara bio)，志贺，日本)进行定量RT-PCR分析。几项研究表明，使用特定的iNOS抑制剂和/或iNOS敲除动物支持了以下论点，即NO/iNOS是内毒素引起的ARDS/ALI中的氧化应激和内皮损伤的原因(World Journal ofCritical Care Medicine[世界危重病医学杂志],2012 1(2):50-60)。统计分析基于使用GraphPad执行的学生t检验。
图7A显示VLA-dCNP减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括通常受NFkb系统调节的IL-6(其是炎症系统的主要调节剂))表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者体内的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。ALI肺组织中炎症相关基因表达的测量。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，然后用以下处理：超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(1.0mg/kgs.c.)、心房利尿钠肽或ANP(1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(1.0mg/kg s.c.)，肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kg s.c.)，以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。治疗24小时后，收获肺组织。从收获的肺组织中提取总RNA。统计分析基于学生t检验。(n＝15、22、6、6、6、6、6、5和9；NC、对照、CNP、dCNP、ANP、BNP、TNFαab、VDN和VLA-dCNP。*P<0.01相比于VLA-dCNP以及**P<0.05相比于VLA-dCNP)。
图7B显示VLA-dCNP减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括iNOS)表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者中的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。该方案如图7A所述。
参考图7C，VLA-dCNP减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括MCP-1)表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者体内的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。该方案如图7A所述。
参考图7D，VLA-dCNP减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括IL1b)表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者体内的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。该方案如图7A所述。
参考图7E，柱状图显示VLA-dCNP减弱了LPS引发的炎性细胞因子(包括IFNg)表达，表明VLA-dCNP广泛抑制了受试者体内的炎症反应，以促进ARDS/ALI的消退。该方案如图7A所述。
实例8：VLA-dCNP抑制肺组织中的炎症水平
Tollip是TLR依赖性炎症通路的负调节因子。该数据表明VLA-dCNP(如实例1中所述)上调TLR依赖性炎症通路的负调节因子，这可能有助于该化合物的抗炎作用(Journalof Biological Chemistry[生物化学杂志],2002；227:7059-7065)。测量了IRAK1、P-P38和P-P65，它们是Toll样受体4(TLR-4)依赖性炎症通路中众所周知的关键介质，在脂多糖(LPS)诱导的ALI中必不可少。TLR-4是LPS的受体并且在LPS诱导的炎症反应(包括ALI和败血症)中起着至关重要的作用。Tollip是一种内置的负调节因子，可以减弱TLR4依赖性信号传导，ELF-1抑制细胞中的Tollip表达。如果Elf-1被下调，Tollip的表达可能会被上调，这可能会抑制LPS引发的炎症。雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司；0.05mg/kg气管内施用)处理，并且用超长效CNP衍生物或VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)处理。VLA-dCNP在LPS施用后立即施用。处理24小时后，在处死前用异氟醚麻醉小鼠。在补充1mM PMSF、2μg/ml抑肽酶和1mM过钒酸盐的细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、50mM NaF、30mMNa4P2O7)中裂解肺组织，并向样品中添加2-巯基乙醇(富士公司，日本东京)和十二烷基硫酸钠(SDS)溶液和然后煮。使用SDS凝胶(伯乐公司(Bio-rad)，海格立斯，加利福尼亚州)和PVDF膜(默克密理博公司(Merck Millipore)，伯灵顿，马萨诸塞州)进行蛋白质印迹分析。在用2.5％BSA封闭步骤后，通过以下来检测膜：使用针对Elf-1(圣克鲁兹生物技术公司，达拉斯，德克萨斯州)、Tollip(蛋白技术公司，东京，日本)、IRAK-1(细胞信号传导技术公司，丹弗斯，马萨诸塞州)、P-P38(细胞信号传导技术公司，丹弗斯，马萨诸塞州)、P-P65(圣克鲁兹生物技术公司，达拉斯，德克萨斯州)和β-肌动蛋白(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的抗体，然后与二抗(艾博抗公司，剑桥，马萨诸塞州)孵育并用1％Tween TBS洗涤。通过图像分析仪(Vilber Lourmat公司，柯乐根(Collegien)法国)检测膜。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的学生t检验。
参考图8，VLA-dCNP抑制肺组织中的炎症水平以促进ARDS/ALI的消退。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，并且用VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)处理。处理后24小时，收获肺组织。使用针对Elf-1、Tollip、IRAK-1、P-P38、P-P65和β-肌动蛋白(内标)的抗体进行蛋白质印迹分析。统计分析基于学生t检验(n＝5，*P<0.05相比于对照)。
实例9：VLA-dCNP抑制肺组织中的STAT水平，表明炎症减弱
STAT1、P-STAT1、STAT2、STAT3也参与促成ARDS/ALI的iNOS表达。几项研究表明，使用特定的iNOS抑制剂和/或iNOS敲除动物支持了以下论点，即NO/iNOS是内毒素引起的ARDS/ALI中的氧化应激和内皮损伤的原因(World Journal of Critical Care Medicine[世界危重病医学杂志],2012 1(2):50-60)。此外，STAT6缺陷小鼠表现出气道炎症减弱(Journal of Immunology[免疫学杂志],2013,190:904-912)。雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司；0.05mg/kg气管内施用)处理，并且用VLA-dCNP(如实例1中所述)(1.0mg/kg s.c.)处理。VLA-dCNP在LPS施用后立即施用。处理24小时后，在处死前用异氟醚麻醉小鼠。在补充1mM PMSF、2μg/ml抑肽酶和1mM过钒酸盐的细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、50mM NaF、30mM Na4P2O7)中裂解肺组织，并向样品中添加2-巯基乙醇(富士公司，日本东京)和十二烷基硫酸钠溶液和然后煮。使用SDS凝胶(伯乐公司，海格立斯，加利福尼亚州)和PVDF膜(默克密理博公司(Merck Millipore)，伯灵顿，马萨诸塞州)进行蛋白质印迹分析。在用2.5％BSA封闭步骤后，通过以下检测膜：使用针对STAT-1(细胞信号传导技术公司(Cell signaling Technology)(CST)，丹弗斯，马萨诸塞州)、P-STAT-1(CST)、STAT-2(CST)、STAT-3(CST)、STAT-6(CST)和β-肌动蛋白(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的抗体，然后与二抗(艾博抗公司(Abcam)，英国剑桥)孵育，并用1％Tween TBS洗涤。通过图像分析仪(Vilber Lourmat公司，柯乐根(Collegien)法国)检测膜。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的学生t检验。
参考图9，VLA-dCNP抑制肺组织中的STAT水平以促进ARDS/ALI的消退。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用LPS(0.05mg/kg气管内施用)处理，并且用VLA-dCNP(1.0mg/kg s.c.)处理。处理后24小时，收获肺组织。使用抗体抗STAT-1、P-STAT-1、STAT-2、STAT-3、STAT-6和β-肌动蛋白(内标)进行蛋白质印迹分析。统计分析基于执行的学生t检验(n＝5，*P<0.05相比于对照)。
实例10.VLA-dCNP抑制了人脐静脉内皮细胞中的Elf-1表达，表明抑制了TLR依赖 性炎症(包括LPS)或TLR依赖性损伤相关分子模式(DAMP)/病原体相关分子模式(PAMP)引发 的炎症
Toll样受体(TLR4)是脂多糖(LPS)的受体，并且在LPS诱导的炎症反应(包括ALI和败血症)中起着至关重要的作用。Tollip是一种内置的负调节因子，可以减弱TLR4依赖性信号传导，ELF-1抑制细胞中的Tollip表达。如果Elf-1被下调，Tollip的表达可能会被上调，这可能会抑制LPS引发的炎症。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自宝生物工程株式会社(Takara Bio)(志贺，日本)。细胞维持在购自久保田公司(Kurabo)的HuMedia-EG2培养基中。将细胞以1X105个细胞/孔的密度以2mL接种到12孔板(能肯公司(Nunc)，罗斯基勒(Roskilde)，丹麦)的HuMedia-EG2中。24小时后，在补充有1％BSA(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的M199(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中用每种浓度的VLA-dCNP(如实例1中所述)处理细胞6小时。在补充1mM PMSF、2μg/ml抑肽酶和1mM过钒酸盐的细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、50mM NaF、30mM Na4P2O7)中裂解细胞，并向样品中添加2-巯基乙醇和十二烷基硫酸钠(SDS)溶液和然后煮。使用SDS凝胶(伯乐公司(Bio-rad)，海格立斯，加利福尼亚州)和PVDF膜(默克密理博公司(Merck Millipore)，伯灵顿，马萨诸塞州)进行蛋白质印迹分析。在用2.5％BSA封闭步骤后，通过以下检测膜：使用针对Elf-1(圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)，达拉斯(Dallas)，德克萨斯州)和β-肌动蛋白(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的抗体，然后与二抗(艾博抗公司，英国剑桥)孵育，并用1％Tween TBS洗涤。通过图像分析仪(Vilber Lourmat公司，柯乐根(Collegien)法国)检测膜。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的学生t检验。
参考图10，VLA-dCNP抑制了人脐静脉内皮细胞中的Elf-1表达。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)保持在HuMedia-EG2中，并接种到12孔板中(1X105个细胞/孔，2mL，在HuMedia-EG2中)。24小时后，用VLA-dCNP(0.07uM(0.21μg/mL)或0.7uM(2.1μg/mL))(在M199 1％BSA中)的每种浓度处理细胞6小时。使用针对Elf-1和β-肌动蛋白(内标)的抗体通过蛋白质印迹分析评估蛋白质水平。统计分析基于学生t检验(n＝4，*P<0.05相比于对照)。
实例11.VLA-dCNP抑制人脐静脉内皮细胞的细胞核中的Elf-1水平人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自宝生物工程株式会社(志贺，日本)。细胞维持在购自久保田公司(大阪，日本)的HuMedia-EG2培养基中。将细胞以1X105个细胞/孔的密度以2mL接种到玻璃底培养皿中的HuMedia-EG2中。24小时后，在补充有1％BSA(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的M199(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中用每种浓度的VLA-dCNP(如实例1中所述)处理细胞6小时。将细胞用4％多聚甲醛(富士公司，东京，日本)固定，并用抗Elf-1 Ab(圣克鲁兹生物技术公司，达拉斯，德克萨斯州)处理，然后与Alexa Fluor 488标记的二抗(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和Hoechst 33342孵育。照片由荧光显微镜(基恩士公司(Keyence)，大阪，日本)拍摄。评估了绿色(Elf-1)和蓝色(细胞核)的叠加层以及在蓝色处绿色的平均荧光强度。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的学生t检验。
参考图11，VLA-dCNP抑制人脐静脉内皮细胞的细胞核中的Elf-1水平。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)保存在HuMedia-EG2中。将细胞以1X105个细胞/孔的密度以2mL接种到玻璃底培养皿中的HuMedia-EG2中。24小时后，在补充有1％BSA(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的M199(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中用每种浓度的VLA-dCNP(0.07uM(0.21μg/mL))或CNP 0.1μM(0.21μg/mL)处理细胞6小时。将细胞用4％多聚甲醛固定，并用针对Elf-1的抗体Ab(圣克鲁兹生物技术公司，达拉斯，德克萨斯州)处理，然后与Alexa Fluor 488标记的二抗(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和Hoechst33342孵育。
实例12 VLA-dCNP在人肺成纤维细胞系HFL1中引发Tollip表达Tollip是TLR依赖性炎症通路的负调节因子。该数据表明VLA-dCNP(如实例1中所述)上调TLR依赖性炎症通路的负调节剂，这可能有助于体内抗炎作用。人肺成纤维细胞系HFL1购自ATCC公司(马纳萨斯老城(Old Town Manassas)，弗吉尼亚州)。细胞维持在补充有购自(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium)(富士公司，东京，日本)中。将细胞以1X105个细胞/孔的密度以2mL接种到12孔板(能肯公司(Nunc)，罗斯基勒(Roskilde)，丹麦)的10％FBS DMEM中。16小时后，将细胞用每种浓度的VLA-dCNP在补充有1％BSA(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的M199(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中处理12小时并且在添加LPS(最终浓度为1.0μg/mL)的M199中处理2小时。在补充1mM PMSF、2μg/ml抑肽酶和1mM过钒酸盐的细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、50mM NaF、30mMNa4P2O7)中裂解细胞，并向样品中添加2-巯基乙醇和十二烷基硫酸钠(SDS)溶液和然后煮。使用SDS凝胶(伯乐公司，海格立斯，加利福尼亚州)和PVDF膜(默克密理博公司，伯灵顿，马萨诸塞州)进行蛋白质印迹分析。在用2.5％BSA封闭步骤后，通过以下检测膜：使用针对Tollip(蛋白技术公司(Proteintech))和β-肌动蛋白(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的抗体，然后与二抗(艾博抗公司，英国剑桥)孵育，并用1％Tween TBS洗涤。通过图像分析仪(Vilber Lourmat公司，柯乐根(Collegien)法国)检测膜。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的学生t检验。
参考图12，VLA-dCNP在人肺成纤维细胞系HFL1中引发Tollip表达。将人肺成纤维细胞HFL1(1.0x105个细胞/孔)用DMEM培养基培养16小时，然后用含有0.21μM(0.66ug/mL)VLA-dCNP且不含VLA-dCNP(N.C.)的1％BSA-M199培养基培养。孵育12小时后，用LPS(终浓度为1.0μg/mL)刺激细胞。再孵育2小时后，收获并裂解细胞。使用针对Tollip和β-肌动蛋白(内标)的抗体通过蛋白质印迹评估细胞中的蛋白表达量。统计分析基于学生t检验(n＝4，*P<0.05相比于对照)。
实例13：VLA-dCNP对LPS诱导的败血症的致死率具有保护作用(表1)
雄性Balb/c小鼠(11周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠用LPS(西格玛奥德里奇公司10mg/kg i.p)处理并用以下每个剂量进行处理：VLA-dCNP(如实例1中所述)(低0.1mg/kg s.c.；中等0.3mg/kg s.c.；高1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(高1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(高1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(高1.0mg/kg s.c.)、抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kg s.c.)以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。在施用LPS后立即施用测试品。每2小时观察存活。
参考图13A，VLA-dCNP对LPS诱导的败血症具有保护作用。将Balb/c(11周龄雄性)小鼠用LPS(10mg/kg i.p.)处理，并用以下每个剂量进行处理：VLA-dCNP(低0.1mg/kgs.c.；中等0.3mg/kg s.c.；高1.0mg/kg s.c)。每2小时观察存活。通过基于Graphpad Prism6.0(n＝10、10、10、11)的对数秩检验进行统计分析。
参考图13B，将C57BL/6J(6周龄雄性)小鼠用LPS(15mg/kgi.p.)处理，并用给定剂量的VLA-dCNP(低0.1mg/Kg s.c.；中等0.3mg/kg s.c.；高1.0mg/Kg s.c.)进行处理。每2小时观察存活。通过对数秩检验进行统计分析。(n＝11、10、11、11)。VLA-dCNP对LPS诱导的败血症具有保护作用。
表1.VLA-dCNP对LPS诱导的败血症死亡率具有保护作用。显示的是按小时计算的存活％。将Balb/c(11周雄性)小鼠用LPS(10mg/kg i.p)处理并用以下每个剂量进行处理：VLA-dCNP(L；0.1mg/kg s.c.；M；0.3mg/kg s.c.；H；1.0mg/kg s.c.)、天然C型利尿钠肽或CNP(高1.0mg/kg s.c.)、CNP衍生物或dCNP(高1.0mg/kg s.c.)、B型利尿钠肽或BNP(高1.0mg/kg s.c.)、抗肿瘤坏死因子α抗体或TNFαab(1.0mg/kg s.c.)以及称为伐地那非(VDN)的环状GMP降解抑制剂或PDE5抑制剂(1.0mg/kg s.c.)。每2小时观察存活(图13A和13B)。第一次观察到的死亡率以斜体和粗体显示，最后一次观察到的存活％在表中以粗体显示。
表1.随着时间的推移，动物存活百分比显示VLA-dCNP对LPS诱导的败血症具有保护作用。
Figure BDA0003990506200000911
实例14.VLA-dCNP减少了肺中的纤维化区域，表明特发性肺纤维化(IPF)的消退
雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。用博来霉素(Nippon Kayaku公司，东京，日本；1.0mg/kg气管内施用)处理小鼠。VLA-dCNP(如实例1中所述)(0.3或0.1mg/kg，5次/周，皮下推注施用)从博来霉素施用后第7天开始施用。博来霉素处理21天后，在异氟醚麻醉下处死小鼠，收获肺组织并用4％多聚甲醛固定(富士公司，东京，日本)。将固定肺组织的石蜡切片用马松三色染色试剂(Kyodo Byori公司，神户，日本)染色(B)。马松三色染色显示肺组织中纤维化区域减少。使用Image J(NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国)测量纤维化区域(A)。统计分析基于使用GraphPad Prism 6(图板软件公司(GraphPad Software Inc.)，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)执行的Dunnett多重比较检验。
参考图14A，VLA-dCNP减少肺中的纤维化区域，表明特发性肺纤维化(IPF)或间质性肺病(ILD)的消退。将雄性C57BL/6J小鼠(6周)用博来霉素(1.0mg/kg气管内施用)处理，并用每个剂量的VLA-dCNP(0.1mg/kg s.c.和0.3mg/kg s.c.)处理。VLA-dCNP在博来霉素施用后第7天施用(5次/周)。在第21天，处死小鼠，收获肺组织并进行马松三色染色。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的Dunnett检验。(n＝5、8、9、7；阴性对照、对照、VLA-dCNP0.1和VLA-dCNP 0.3。*P<0.05相比于对照)。图14B显示了图14A的马松三色染色的肺组织样品。
实例15：VLA-dCNP减少特发性肺纤维化急性加重(IPF-AE)模型的BALF中的细胞数 量和蛋白水平并减弱TNFα和IL-6
考虑到IL-6在IPF-AE患者中上调(American Journal of Physiology[美国生理学杂志]；Lung Cellular and Molecular Physiology[肺细胞和分子生理学],2010 299:L3-L7)以及TNFα在IPF-AE患者中显示出统计学显著性趋势(PLoS One[公共科学图书馆·综合],2015 10(1):e0116775)。总之，VLA-dCNP对IPF-AE患者具有潜在的有益作用。雄性C57BL/6J小鼠(6周)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食，东方酵母有限公司，东京，日本)。用博来霉素(NipponKayaku公司，东京，日本；1.0mg/kg气管内施用)处理小鼠。3周后，将小鼠用LPS(0.05mg/kg气管内施用，西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州，美国)处理，并用每个剂量的VLA-dCNP(如实例1中所述)处理(培养基0.3mg/kg s.c.；高1.0mg/kg皮下推注施用)。VLA-dCNP在LPS施用后立即施用。治疗24小时后，在异氟醚麻醉下处死小鼠，然后收获支气管肺泡灌洗液(BALF)。BALF中的总细胞数用计数室计数。BALF中的总蛋白浓度用PierceTM BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))测量。白细胞介素6(IL-6)、组织坏死因子α(TNF-α)的每种细胞因子浓度均使用市售的时间分辨率FRET试剂盒(Cisbio，贝德福德，马萨诸塞州)进行测量。
参考图15A，VLA-dCNP减少了来自特发性肺纤维化急性加重(IPF-AE)模型的BALF中的细胞数量。参考图15B，VLA-dCNP降低了来自特发性肺纤维化急性加重(IPF-AE)模型的BALF中的蛋白水平。参考图15C，VLA-dCNP减弱了来自特发性肺纤维化急性加重(IPF-AE)模型的BALF中的IL-6。参考图15D，VLA-dCNP减少特发性肺纤维化急性加重(IPF-AE)模型的BALF中的细胞数量和蛋白水平并减弱TNFα。
实例16.VLA-dCNP减少了顺铂(CDDP)诱导的急性肾损伤(AKI)中的肾小管损伤。
参考图16A和16B，VLA-dCNP减少了顺铂(CDDP)诱导的急性肾损伤(AKI)中的肾小管损伤。
C57BL/6J小鼠(8周龄，雄性，n＝8、7、8/组)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食；东方酵母有限公司，东京，日本)。将小鼠在第2天、第9天和第16天用CDDP(TCI公司，东京，日本；6mg/kg b.w.IP盐水(大冢制药公司(Otsuka Pharmaceutical)，德岛，日本))进行处理并且用在缓冲液(甲硫氨酸100mM(东京化学工业有限公司，东京，日本)；蔗糖100mM(东京化学工业有限公司)；组氨酸50mM(东京化学工业有限公司)；在H2O(大冢制药公司(Otsuka Pharmaceutical)，德岛，日本)中)中的VLA-dCNP(如实例1中所述)(0.3mg/kg)或缓冲液(用于对照组)处理(异氟醚麻醉下皮下注射，5次/周)。第19天在异氟醚蒸汽下处死小鼠。多聚甲醛固定肾。将脱蜡的组织切片在0.5％原高碘酸中在室温浸渍7分钟，用纯化水洗涤2次，每次2分钟，并且将切片用席夫氏试剂在室温染色15分钟。之后，将切片在亚硫酸盐水(10％亚硫酸氢钠10mL，1N盐酸10mL，纯化水180mL)中在室温浸浸渍3次，每次2分钟，并用流水冲洗5分钟。最后，将切片在室温用Mayer苏木精溶液染色4分钟，并用流水冲洗5分钟，使用具有明场模式的荧光显微镜(BZ-X700，Keyence，东京，日本)评估肾损伤，放大倍数为x20。
实例17.VLA-dCNP和长效CNP抑制饮食诱导的肝纤维化中的肝酶和炎症/纤维化标 志物
该实例采用已知可快速诱导纤维化的胆碱缺乏的氨基酸确定的高脂肪饮食模型。参见例如Matsumoto等人,Int J Exp Pathol.[国际实验病理学杂志]2013年4月；94(2):93-103，通过引用以其整体并入本文。天冬氨酸转氨酶(AST)升高表明肝或其他可维持炎症和纤维化过程的器官受损。丙氨酸转氨酶(ALT)升高表明可以维持肝的炎症和纤维化过程的肝损伤。激活的肝星状细胞是肝纤维发生过程中主要的胶原蛋白生成细胞，在纤维发生过程中显示出α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的增加。此外，肝组织在纤维化过程中显示出肿瘤坏死因子α(TNFα)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)等炎症标志物的增加。当给予受试者高推注剂量(1mg/Kg)的长效CNP衍生物和中等推注剂量(0.3mg/Kg)和高推注剂量(1mg/Kg)的VLA-dCNP(如实例1中所述)时，所有这些标志物(AST、ALT、α-SMA、TNFα和MCP1)均被抑制。长效CNP衍生物和VLA-dCNP一起抑制组织损伤、炎症和纤维化过程。
参考图17A-17E，VLA-dCNP和长效CNP抑制饮食诱导的肝纤维化中的肝酶和炎症/纤维化标志物。图17A显示肝酶天冬氨酸氨基转移酶(AST)显著降低；图17B显示肝酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)显著降低；图17C显示α平滑肌肌动蛋白(a-SMA)显著降低，a-SMA是纤维化细胞的标志物；图17D显示肿瘤坏死生长因子α(TNF-a)显著降低，TNF-a是炎症诱导纤维化的标志物；以及图17E显示当向受试者施用长效CNP衍生物和/或VLA-dCNP时单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)显著降低，MCP-1是肝组织中巨噬细胞诱导的炎症的介质。
在这项研究中，C57BL/6J小鼠(6周龄，雄性，n＝10/组)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食；东方酵母有限公司，东京，日本)或胆碱缺乏的氨基酸确定的高脂肪饮食(CDAHFD)(科研饮食公司(Research Diet)，新不伦瑞克，新泽西州)。将小鼠用在缓冲液100mM(东京化学工业有限公司)；组氨酸50mM(东京化学工业有限公司)；在H2O(大冢制药公司，德岛，日本)中的VLA-dCNP(0.1、0.3或1.0mg/kg)、dCNP(0.1、0.3或1.0mg/kg)和CNP(0.1、0.3、1.0mg/Kg)或缓冲液(用于对照组)处理(在异氟醚麻醉下皮下推注，持续时间少于30秒，5次/周(仅限工作日施用)，从第5天开始进行两周)。在异氟醚下从心脏穿刺收获血液/血浆样品，并在第17天(8.5周龄)在穿刺后收获肝。使用酶底物测定法(富士公司，和光公司(Wako)，日本)评估AST和ALT。
实例18.长效CNP衍生物(dCNP)和VLA-dCNP在顺铂诱导的急性肾损伤中减少肾纤 维化并改善肾功能
顺铂是一种常见的有效化疗药剂，用于治疗癌症，但其剂量限制性副作用是导致急性肾损伤的肾毒性。血清肌酐可指示肾的工作情况。尿液中白蛋白与肌酐的比率可以更准确地指示有多少白蛋白被释放到尿液中。尿液中存在少量白蛋白可能是肾疾病的早期指标。
肾组织损伤会引发炎症和纤维化过程，这些过程会促进再生和修复。肾损伤后，受损组织释放细胞因子(TNF-α，肿瘤坏死因子-α；一种或多种IL，一种或多种白细胞介素；和TGF-β，转化生长因子-β)和趋化因子(SDF-1，基质细胞衍生因子-1；MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1；CCL2；CX3CL1，分形趋化因子(Fractalkine)；和CXCL10，C-X-C基序趋化因子10)，其刺激炎性细胞(中性粒细胞；单核细胞；Mφ，巨噬细胞；NK细胞，自然杀伤细胞；T细胞；B细胞)激活并浸润到肾。正常的组织修复过程与肌成纤维细胞的激活、胶原沉积和伤口愈合反应同时发生；然而，促炎和促纤维化细胞类型(一种/多种成纤维细胞、肌成纤维细胞/外膜细胞)的长时间激活会导致细胞外基质沉积过度(参见，例如，Black等人,RenalInflammation and Fibrosis:A Double-edged Sword[肾炎症和纤维化:一把双刃剑],Journal of Histochemistry&Cytochemistry[组织化学和细胞化学杂志]2019,卷67(9)663-681，通过引用以其整体并入本文)，导致慢性肾疾病(CKD)。参见例如Eoghainín
Figure BDA0003990506200000961
hAinmhire,Benjamin D.Humphreys；Fibrotic Changes Mediating Acute Kidney Injuryto Chronic Kidney Disease Transition[介导急性肾损伤向慢性肾疾病转变的纤维化改变]Nephron[肾单位]2017；137:264-267，通过引用以其整体并入本文。
用于癌症治疗的治疗剂会对主要器官系统造成损害，包括心脏(即，心脏毒性)、肺(例如，肺纤维化)和骨骼(例如，骨髓抑制)。癌症及其治疗会增加急性肾损伤的可能性，从而导致纤维化和慢性肾疾病。癌细胞可引起尿路梗阻，其导致急性肾损伤，引起炎症和纤维化(例如，前列腺癌或尿路上皮癌、子宫癌或卵巢癌、腹膜后淋巴结肿大压迫尿路、肿瘤块和/或腹膜后纤维化)。全身抗癌治疗可直接损害肾(例如，顺铂诱导的近端小管坏死)或间接损害肾(例如，甲氨蝶呤诱导的晶体肾病和肿瘤溶解综合征)，两者均导致炎症、纤维化和慢性肾疾病。急性肾损伤是常规细胞毒性化疗药剂的严重药物不良反应，可影响癌症治疗的功效和患者的存活。参见例如Perazella M.A.,Onco-nephrology:renal toxicities ofchemotherapeutic agents.[肿瘤肾脏病:化疗药剂的肾毒性]Clin J Am Soc Nephrol[美国肾病学会临床杂志]2012；7:1713-21；Malyszko等人,Kozlowska K,Kozlowski L,Malyszko J.Nephrotoxicity of anticancer treatment.[抗癌治疗的肾毒性]NephrolDial Transplant[肾脏透析移植]2017；32:924-36。顺铂用作多种不同癌症的化疗方案的一部分，由于活性氧引起的线粒体损伤在20-30％的病例中会导致急性肾损伤。参见例如Miller等人,Mechanisms of cisplatin nephrotoxicity.[顺铂肾毒性机制]Toxins(Basel)[毒素(巴塞尔)]2010；2:2490-518；和Brooks等人,Regulation of mitochondrialdynamics in acute kidney injury in cell culture and rodent models.[细胞培养和啮齿动物模型中急性肾损伤的线粒体动力学调节]J Clin Invest[临床研究杂志]2009；119:1275-85。顺铂积累在近端小管的S3段，促进谷胱甘肽耗减和大量线粒体活性氧。这种积累可能与顺铂通过活性基底外侧至顶端转运蛋白(例如CTR1和SLC22A2(以前称为OCT2)，它们都在S3段的基底外侧膜上表达)的选择性摄取有关。
顺铂的另一个显著副作用是听力丧失或耳毒性。耳毒性是由活性氧(ROS)引起的类似线粒体损伤引起的，活性氧(ROS)在暴露于顺铂时在内耳中发生，从而导致炎症。参见例如Yu等人,Current Strategies to Combat Cisplatin-Induced Ototoxicity[对抗顺铂诱导的耳毒性的当前策略]Front.Pharmacol.[药理学前沿],2020年7月3日。研究表明ROS可以刺激耳蜗炎症。内耳炎症可能通过诱导细胞凋亡的内质网应激、自噬和坏死性凋亡触发内耳细胞死亡。参见例如，Sheth等人,Mechanisms of Cisplatin-InducedOtotoxicity and Otoprotection[顺铂诱导的耳毒性及耳保护的机制],Frontiers inCellular Neuroscience[细胞神经科学前沿],2017年10月27日,第11卷。
图18A显示基于血清肌酐降低的肾功能的显著改善；图18B显示了通过计算白蛋白与肌酐的比率，基于尿中白蛋白水平降低的肾功能的显著改善；图18C显示肾纤维化区域％显著减少；使用Image J(NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国)测量纤维化区域；图18D是肾马松三色(MT)染色的一系列代表性图像。放大倍数为X20。在这个马松三色染色中，细胞核被铁苏木精染色(图像中的棕色/黑色)，细胞质被酸性品红染色(图像中的粉红色/红色)，胶原纤维化区域被苯胺蓝染色(图像中的蓝色)。
在这项研究中，将小鼠在第0天、第7天、第14天、和第21天用CDDP(TCI公司，东京，日本；10mg/kg b.w.IP生理盐水(大冢制药公司，德岛，日本))处理并且用在缓冲液(甲硫氨酸100mM(东京化学工业有限公司，东京，日本)；蔗糖100mM(东京化学工业有限公司)；组氨酸50mM(东京化学工业有限公司)；在H2O(大冢制药公司，德岛，日本)中)中的CNP(低剂量(L)：0.1mg/Kg；和高剂量(H)：1.0mg/Kg)、dCNP(如实例1中所述)(L：0.1mg/Kg；和H：1.0mg/Kg)或VLA-dCNP(如实例1中所述)(L：0.1mg/Kg；和H：1.0mg/kg)或缓冲液(用于对照组)处理(在异氟醚麻醉下皮下推注，持续时间少于30秒，5次/周，持续4周)。在这项研究中，阴性对照是没有CDDP诱导和施用缓冲液5次/周持续4周。在第28天在异氟醚下从心脏穿刺收集血液/血清样品。血清肌酐、BUN和尿肌酸分别通过比色法(安博测定公司(Arbor Assays)，安阿伯市(Ann Arbor)，密歇根州)、(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和(R&D系统公司，底特律，明尼苏达州)测量。收获尿液样品，用多聚甲醛固定肾。将肾切片用马松三色染色法染色，使用荧光显微镜(BZ-X700，Keyence公司，东京，日本)在明场模式下评估纤维化区域％，放大倍数为x20。在这个马松三色染色中，细胞核被铁苏木精染色(图像中的棕色/黑色)，细胞质被酸性品红染色(图像中的粉红色/红色)，胶原纤维化区域被苯胺蓝染色(图像中的蓝色)。如下进行纤维化区域％计算。首先，组织的区域由(总像素-空白区域(最高亮度区域)中的像素)计算，然后由Image J计算蓝光强度减去红光强度的差值以将其转换为像素。最后，纤维化区域(％)＝(纤维化区域/组织总区域)x 100。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的学生t检验。*P<0.05或**P<0.01相比于对照。
实例19.长效CNP衍生物(dCNP)和VLA-dCNP两者都抑制小鼠特发性肺纤维化(AE- IPF)急性加重模型中博来霉素诱导的纤维化
IPF急性加重(AE-IPF)定义为疾病的突然加速或病因不明的肺疾病的进行性形式。参见，例如，J Thorac Dis[胸部疾病杂志]2015 7(3)499-519。羟脯氨酸是胶原蛋白的主要组分，对胶原蛋白三螺旋的稳定性起着关键作用。在这项研究中，它被用来评估肺组织中的胶原蛋白含量。
图19A显示了基于肺组织中胶原的主要组分羟脯氨酸的减少的纤维化显著减少；图19B显示了肺中纤维化区域％的显著减少-基于肺组织切片的组织学马松三色染色的量化评估。使用Image J(NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国)测量纤维化区域；图19C显示了放大倍数为20倍的马松三色(MT)染色的肾的代表性图像。
在这项研究中，雄性C57BL/6J小鼠(6周龄，雄性，n＝6/组)购自Kyudo(佐贺，日本)，并保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可自由饮水和标准小鼠饮食(MF饮食；东方酵母有限公司，东京，日本)。用博来霉素(Nippon Kayaku公司，东京，日本；1.0mg/kg气管内施用)处理小鼠。2周后，将小鼠用LPS(0.05mg/kg气管内施用，西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州，美国)处理，并用在缓冲液(甲硫氨酸100mM(东京化学工业有限公司，东京，日本)；蔗糖100mM(东京化学工业有限公司)；组氨酸50mM(东京化学工业有限公司)；在H2O(大冢制药公司，德岛，日本)中)中的CNP(0.3mg/Kg)、dCNP(如实例1中所述)(0.3mg/Kg)或VLA-dCNP(如实例1中所述)(0.3mg/Kg)的每个推注剂量或缓冲液(用于对照组)处理(在异氟醚麻醉下皮下推注)。在LPS前一天施用测试品和对照，连续3天。最后一次处理后的第二天，动物被安乐死，收获肺的一部分，另一部分用多聚甲醛固定。将肺的该部分(20mg)均质化并测量提取物的羟脯氨酸(艾博抗公司，剑桥，英国)。将固定的肺切片用马松三色染色法染色并使用具有明场模式的荧光显微镜(BZ-X700，Keyence公司，东京，日本)进行评估，放大倍数为x20。在这个马松三色染色中，细胞核被铁苏木精染色(图像中的棕色/黑色)，细胞质被酸性品红染色(图像中的粉红色/红色)，胶原纤维化区域被苯胺蓝染色(图像中的蓝色)。如下进行纤维化区域％计算。首先，组织的区域由(总像素-空白区域(最高亮度区域)中的像素)计算，然后由Image J计算蓝光强度减去红光强度的差值以将其转换为像素。最后，纤维化区域(％)＝(纤维化区域/组织总区域)x 100。统计分析基于使用GraphPad Prism 6执行的学生t检验。*P<0.05相比于对照
实例20.来自推注施用的长效CNP衍生物s1(dCNP-s1)和CNP衍生物s2(dCNP-s2)的 药代动力学谱显示随着时间的推移在血液中的持续存在
参考图20，显示了在皮下推注施用2.0mg/Kg CNP衍生物s1(dCNP-s1)和CNP衍生物s2(dCNP-s2)后CD-1小鼠中血浆CNP[平均值(SEM)；n＝5]。为了进行比较，插图显示当施用天然CNP时CNP(菱形)的低血浆水平。误差棒表示n＝5个血浆样品的平均值的标准误差。施用前的基线CNP水平为0.391(0.02)ng/mL[平均值(SEM)；n＝10]。当以相似的剂量重量/Kg剂量给予时，长效dCNP-s1和dCNP-s2以持续方式(至少8小时)提供比天然CNP高10倍的CNP血液水平。
对于这项药代动力学研究，这项研究的所有动物(小鼠)都保持在12小时光照/12小时黑暗循环下，可以自由获取水和标准小鼠饮食(Lab Pico啮齿动物#5053；动物特食(Animal Specialties)，伍德伯恩(Woodburn)，俄勒冈州)。用2.0mg/Kg的CNP衍生物s1(dCNP-s1；法曼公司(PharmaIN Corp)，博瑟尔(Bothell)，华盛顿州)和CNP衍生物s2(dCNP-s2；法曼公司，博瑟尔，华盛顿州)通过肩胛骨之间的皮下施用处理雄性CD-1小鼠(6-8周龄；查尔斯河，霍利斯特(Hollister)，加利福尼亚州)。所有测试品均配制或溶解在100mM蔗糖、100mM甲硫氨酸、50mM组氨酸，pH 7.4中。通过眶后采血在不同时间(0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时)进行血液采样，每只动物在两个不同的时间点抽血两次。血液样品在K2EDTA管中处理以获得血浆。通过来自凤凰制药公司(PhoenixPharmaceuticals)(cat#EKE-012-03)的市售CNP ELISA试剂盒分析血浆。CNP是天然人CNP(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.10])并且dCNP-s1和dCNP-s2是具有以下序列的人CNP的衍生物：HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC[SEQ IDNO.21]和HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC[SEQ IDNO.20]，每个在2个半胱氨酸残基之间具有二硫键，其中homoQ：高谷氨酰胺残基；Aeea：2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，其中氨基和羧酸基团用于形成酰胺键以提供CNP衍生物；HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-衍生自十八碳二烯酸；γE：γ谷氨酸残基。
通过示例而非限制，根据以下列举的段落披露实施例：
A1.一种治疗患有肺、肝和/或肾损伤，或与肺、肝和/或肾损伤相关的症状的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效CNP、长效CNP衍生物、长效NPRB激动剂、超长效CNP、超长效CNP衍生物、超长效NPRB激动剂，长效CNP激动剂、超长效CNP激动剂或其任何组合，
其中该组合物不会使血压降低超过在施用该治疗有效推注剂量的该组合物之前测得的基线血压测量值的20％(例如，超过15％，超过10％，或超过5％)，
其中该组合物在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上，该基线血浆环状GMP水平是施用该组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康受试者的平均血浆环状GMP水平(优选地为该受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)，并且
其中该肺、肝和/或肾损伤，或与肺、肾和/或肾损伤相关的该症状选自
i)急性肺损伤(ALI)，
ii)急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，
iii)肺水肿，
iv)肺中炎性细胞水平升高，
v)与健康肺相比，肺中炎性细胞因子的水平或表达增加，
vi)与健康肺相比，肺泡空间中的蛋白水平增加，
vii)低动脉血氧合，其中低动脉血氧合是血液PaO2低于60mmHg和/或血液血红蛋白氧饱和度(SpO2)低于90％，
viii)肺炎，
ix)纤维化，
x)肾损伤，
及其任何组合(例如，i)至x)中的二、三、四、五、六、七、八、九或十个的组合)。
A2.如段落A1所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]、GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.11]、或其任何组合，
其中：
U是式(I)或(II)的部分，其中式(I)是
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中
a是0或1(优选a是1)；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，
其中B是1-8个氨基酸残基的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；
m是0、1、2或3；
n是0、1、2或3；并且
m和n之和至少为1，
并且式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中
a是0或1(优选a是1)；
聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或其衍生物；
Y是：
1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；
含有氨基酸残基的接头，其中该氨基酸残基共价连接至(聚合物)a；或
不同于该1-10个氨基酸残基或肽序列的肽接头。
A3.如段落A2所述的方法，其中Y是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
A4.如段落A1至A3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQID NO.3]、GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.12]、或其任何组合；并且；
其中：
U是式(I)的部分，其中式(I)是
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中
a是0或1(优选a是1)；
脂肪族是任选地经取代的C10-24链(例如，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，
其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；
m是0、1、2或3；
n是0、1、2或3；并且
m和n之和至少为1。
A5.如段落A2至A4中任一项所述的方法，其中X是4-7个氨基酸的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)，或
X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
A6.如段落A1至A5中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]，
其中：
U是(脂肪族)a-(X)-；
其中
a是1；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；并且
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
A7.如段落A2至A6中任一项所述的方法，其中脂肪族不包含直链或支链的任选地经取代的C4-9链(例如，任选地经取代的C3-8烷基C-(＝O)-部分和/或任选地经取代的C4-9烷基，其通过连接共价结合至该肽，该连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)。
A8.如段落A1至A7中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物选自
CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.5]；
CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]；
CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.7]；
CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.8]；
CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.9]；
HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.20]；以及
HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.21]。
A9.如段落A1至A8中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.5]。
A10.如段落A1至A8中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]。
A11.如段落A1至A8中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.7]。
A12.如段落A1至A8中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.8]。
A13.如段落A1至A8中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.9]。
A14.如段落A1至A8中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.20]。
A15.如段落A1至A8中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.21]。
A16.如段落A1至A3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQID NO.3]、GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.27]、或其任何组合；
其中：
U是式(II)的部分，其中式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中
a是0或1(优选a是1)；
该聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)；
Y是：
4-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；或
接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
A17.如段落A1至A3和A16中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]、或其任何组合；
其中：
U是式(II)的部分，其中式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中
a是1；
聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或其衍生物；
Y是：
1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；
含有氨基酸残基的接头，其中该氨基酸残基共价连接至(聚合物)a；
不同于该1-10个氨基酸残基或肽序列的肽接头；或
接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
A18.如段落A1至A3、A14和A15中任一项所述的方法，其中该聚合物不包括聚(乙二醇)、MPEG、或聚(乙二醇)和MPEG两者。
A19.如段落A1至A3和A16至A18中任一项所述的方法，其中Y是：
4-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)；或
接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
A20.如段落A1至A19中任一项所述的方法，其中该推注剂量的施用每天最多进行两次，并且施用途径包括皮下、静脉内、肌内、经鼻、吸入、肠内或其任何组合，或
其中该施用途径是皮下；或
其中该施用途径是静脉内；或
其中该施用途径是肌内；或
其中该施用途径是吸入；或
其中该施用途径是经鼻；或
其中肠内施用途径是口服。
A21.如段落A1至A20中任一项所述的方法，其中该受试者患有与以下相关的ALI或ARDS：肺水肿；低动脉血氧合；肺中炎性细胞水平升高；肺中炎性细胞因子的水平或表达增加；败血症；菌血症；肺炎、肺纤维化或其任何组合。
A22.如段落A1至A21中任一项上的方法，其中炎性细胞因子包括IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg或其任何组合。
A23.如段落A1至A22中任一项所述的方法，其中该肺炎包括细菌性肺炎、病毒性肺炎、无菌性肺炎。
A24.如段落A1至A23中任一项所述的方法，其中该ALI或ARDS由以下原因引起：
(i)选自以下的全身性损伤：创伤、败血症(即，全身感染)、菌血症(即，血液中的细菌)、胰腺炎、休克、多次输注、弥散性血管内凝血、烧伤、药物过量或中毒、阿片类药物、阿司匹林、吩噻嗪类、三环类抗抑郁药、胺碘酮、化疗药剂、呋喃妥因、鱼精蛋白、血栓性血小板减少性紫癜、头部损伤、百草枯及其任何组合；或
(ii)选自以下的肺损伤：胃内容物吸入、肺插管、栓塞、肺结核、病毒性肺炎、细菌性肺炎、细胞源性机化性肺炎、气道阻塞、吸食游离碱可卡因、近乎溺死、有毒气体吸入、氧中毒、肺挫伤、辐射暴露、高海拔暴露、肺再膨胀、再灌注及其任何组合。
A25.如段落A24所述的方法，其中该栓塞由血栓、脂肪、空气或羊水引起。
A26.如段落A23或A24所述的方法，其中该病毒性肺炎是由冠状病毒或流感病毒引起的SARS。
A27.如段落A1至A26中任一项所述的方法，其中：
ALI或ARDS由传染病引起，或
ALI或ARDS由PF引起，或
ALI或ARDS由败血症引起；或
ALI或ARDS由菌血症引起；或
ALI或ARDS由插管引起；或
ALI或ARDS由选自由氯气、烟雾、光气、浓氧及其任何组合组成的组的有毒气体引起。
A28.如段落A27所述的方法，其中该传染病由冠状病毒或流感病毒引起。
A29.如段落A1至A21中任一项所述的方法，其中该纤维化包括肺或肺部纤维化、肝纤维化、肝硬化和肾小球硬化。
A30.如段落A1至A29中任一项所述的方法，其中该组合物包含长效CNP组合物或超长效CNP组合物，该长效CNP组合物或超长效CNP组合物包含CNP、CNP衍生物或长效CNP衍生物和聚合物赋形剂，该聚合物赋形剂包含用聚乙二醇、脂肪酸、和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)；其中该聚合物赋形剂适于螯合或非共价结合这些CNP或CNP衍生物中的任何。
A31.如段落A1至A30中任一项所述的方法，其中该组合物包含超长效CNP衍生物组合物，该超长效CNP衍生物组合物包含长效CNP衍生物和聚合物赋形剂，该聚合物赋形剂包含用聚乙二醇、脂肪酸、阴离子部分或其任何组合接枝的聚(氨基酸)；并且其中该聚合物赋形剂适于螯合或非共价结合该长效CNP衍生物。
A32.如段落A1和A20至A30中任一项所述的方法，其中该长效NPRB激动剂或该超长效NPRB激动剂包含多肽。
A33.如段落A32所述的方法，其中该多肽包含抗体。
A34.如段落A1和A20至A32中任一项所述的方法，其中该长效NPRB激动剂或该超长效NPRB激动剂包含分子量小于2kDa的分子。
A35.一种治疗患有ALI或ARDS或有风险发展为ALI或ARDS的受试者的方法，该方法包括
向该受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物，该长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]、或GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.11]、或其任何组合，
其中：
U是式(I)或(II)的部分，其中式(I)是
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中
a是0或1(优选a是1)；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1；
并且式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中
a是0或1(优选a是1)；
聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或其衍生物；
Y是：
1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；
含有氨基酸残基的接头，其中该氨基酸残基共价连接至(聚合物)a；或
不同于该1-10个氨基酸残基或肽序列的肽接头；
其中该组合物不会使血压降低超过基线血压测量值的15％，其中该基线血压测量值是施用该组合物之前的平均血压；并且
其中该组合物在施用后1小时至12小时(例如，2至12小时、4至12小时、1至24小时、2至24小时、4至24小时、1至84小时、2至84小时、4至84小时、12至84小时、1至168小时、2至168小时、4至168小时或12至168小时)将血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上(例如，2x以上、3x以上、4x以上或5x以上)，并且该基线血浆环状GMP水平是施用该组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康受试者的平均血浆环状GMP水平(优选地为该受试者在施用组合物之前的平均血浆环状GMP水平)。
A36.如段落A35所述的方法，其中Y是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
A37.如段落A35或段落A36所述的方法，其中该长效CNP衍生物选自：
CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.5]；
CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]；
CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.7]；
CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.8]；
CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.9]；
HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.20]；以及
HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.21]。
A38.如段落A35至A37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.5]。
A39.如段落A35至A37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]。
A40.如段落A35至A37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.7]。
A41.如段落A35至A37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.8]。
A42.如段落A35至A37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.9]。
A43.如段落A35至A37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.20]。
A44.如段落A35至A37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.21]。
A45.如段落A35至A44中任一项所述的方法，其中该组合物包含超长效CNP衍生物组合物，该超长效CNP衍生物组合物包含长效CNP衍生物和聚合物赋形剂，该聚合物赋形剂包含用聚乙二醇、脂肪酸、阴离子部分或其任何组合接枝的聚(氨基酸)；其中该聚合物赋形剂适于螯合或非共价结合该长效CNP衍生物。
A46.如段落A1至A45中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物减少来自该受试者的BALF样品中的细胞总数和总蛋白。
A47.如段落A1至A46中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物减少来自该受试者的肺组织中的MPO。
A48.如段落A1至A47中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物减弱该受试者中的炎性细胞因子表达(例如，IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1和/或IFNg表达)。
A49.如段落A1至A48中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物减少患有特发性肺纤维化的受试者的肺中的纤维化区域。
A50.如段落A1至A49中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物在患有特发性肺纤维化的受试者中降低细胞数量和蛋白水平，并降低IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg中任一种或其任何组合的表达。
A51.如段落A1至A49中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物降低IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg中任一种或其任何组合的表达，并降低患有败血症的受试者的致死率。
A52.如权利要求A1至A51中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物降低该受试者的AST、ALT、α-SMA、IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg、iNOS、Elf-1、Tollip、IRAK-1、P-P38、P-P65、β-act、STAT1、P-STAT1、STAT2、STAT3、STAT6的表达，纤维化区域，血清肌酐，尿液中的白蛋白/肌酐比率，肺中的羟脯氨酸或其任何组合。
A53.一种包含长效CNP衍生物的组合物，该长效CNP衍生物包含式U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQ ID NO.30]，其中
x是天然或非天然氨基酸残基，条件是x不是甲硫氨酸残基；并且
U具有式(I)的部分：
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中a是0或1(优选a是1)；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
A54.如段落A53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；a是1；B是 Gly；m是0、1或2；并且n是1。
A55.如段落A53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；a是1；B是 Gly；m是1；并且n是1。
A56.如段落A53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；a是1；m是1；并且n是0。
A57.如段落A53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺(homoQ)[SEQ ID NO.16]，U是(脂肪族)a-(X)-；其中a是0或1(优选a是1)；脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是0，并且n是2。
A58.如段落A53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺(homoQ)[SEQ ID NO.17]，U是(脂肪族)a-(X)-；其中a是0或1(优选a是1)；脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是1，并且n是2。
A59.如段落A53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是CH3(CH2)16C(＝O)或HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是0，并且n是2。
A60.如段落A53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是CH3(CH2)16C(＝O)或HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是1，并且n是2。
A61.如段落A53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是CH3(CH2)16C(＝O)或HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；B是(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-(Gly)，m是1并且n是1。
A62.如段落A53所述的组合物，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其具有半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ IDNO.20]。
A63.如段落A53所述的组合物，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其具有半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ IDNO.21]。
A64.如段落A2至A52中任一项所述的方法，其中a是1。
A65.如段落A53至A63中任一项所述的组合物，其中a是1。
虽然已经说明和描述了说明性实施例，但是应当理解，在不脱离本披露的精神和范围的情况下可以在其中进行各种改变。
Figure IDA0003990506250000011
Figure IDA0003990506250000021
Figure IDA0003990506250000031
Figure IDA0003990506250000041
Figure IDA0003990506250000051
Figure IDA0003990506250000061
Figure IDA0003990506250000071
Figure IDA0003990506250000081
Figure IDA0003990506250000091
Figure IDA0003990506250000101
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Figure IDA0003990506250000121
Figure IDA0003990506250000131
Figure IDA0003990506250000141
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Claims (63)

1.要求专有财产或特许权的本披露的实施例定义如下：
一种治疗患有肺、肝和/或肾损伤，或与肺、肝和/或肾损伤相关的症状的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效CNP、长效CNP衍生物、长效NPRB激动剂、超长效CNP、超长效CNP衍生物、超长效NPRB激动剂，长效CNP激动剂、超长效CNP激动剂或其任何组合，
其中该组合物不会使血压降低超过在施用该治疗有效推注剂量的该组合物之前测得的基线血压测量值的20％，
其中该组合物在施用后1小时至12小时使血浆环状GMP水平增加至基线血浆环状GMP水平的1.5x以上，该基线血浆环状GMP水平是施用该组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康受试者的平均血浆环状GMP水平，并且
其中该肺、肝和/或肾损伤，或与肺、肝和/或肾损伤相关的该症状选自
i)急性肺损伤(ALI)，
ii)急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，
iii)肺水肿，
iv)肺中炎性细胞水平升高，
v)与健康肺相比，肺中炎性细胞因子的水平或表达增加，
vi)与健康肺相比，肺泡空间中的蛋白水平增加，
vii)低动脉血氧合，其中低动脉血氧合是血液PaO2低于60mm Hg和/或血液血红蛋白氧饱和度(SpO2)低于90％，
viii)肺炎，
ix)纤维化，
x)肾损伤，
及其任何组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]、GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.11]、或其任何组合，
其中：
U是式(I)或(II)的部分，其中式(I)是
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中
a是1；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，
其中B是1-8个氨基酸残基的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；
m是0、1、2或3；
n是0、1、2或3；并且
m和n之和至少为1，
并且式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中
a是1；
聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或其衍生物；
Y是：
1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；
含有氨基酸残基的接头，其中该氨基酸残基共价连接至(聚合物)a；或
不同于该1-10个氨基酸残基或肽序列的肽接头。
3.如权利要求2所述的方法，其中Y是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ IDNO.3]、GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.12]、或其任何组合；并且；
其中：
U是式(I)的部分，其中式(I)是
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中
a是1；
脂肪族是任选地经取代的C10-24链(例如，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，
其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；
m是0、1、2或3；
n是0、1、2或3；并且
m和n之和至少为1。
5.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中X是4-7个氨基酸的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)，或
X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]，
其中：
U是(脂肪族)a-(X)-；
其中
a是1；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
7.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中脂肪族不包含直链或支链的任选地经取代的C4-9链(例如，任选地经取代的C3-8烷基C-(＝O)-部分和/或任选地经取代的C4-9链，其通过连接共价结合至该肽，该连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等)。
8.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物选自
CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.5]；
CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]；
CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.7]；
CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.8]；
CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.9]；
HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.20]；以及
HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.21]。
9.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.5]。
10.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]。
11.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.7]。
12.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.8]。
13.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.9]。
14.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQID NO.20]。
15.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ IDNO.21]。
16.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQID NO.3]、GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.27]、或其任何组合；
其中：
U是式(II)的部分，其中式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中
a是1；
该聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)；
Y是：
4-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；或
接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
17.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物或该超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQID NO.3]、或其任何组合；
其中：
U是式(II)的部分，其中式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中
a是1；
聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或其衍生物；
Y是：
1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；
含有氨基酸残基的接头，其中该氨基酸残基共价连接至(聚合物)a；
不同于该1-10个氨基酸残基或肽序列的肽接头；或
接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基的序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
18.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该聚合物不包括聚(乙二醇)、MPEG、或聚(乙二醇)和MPEG两者。
19.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中Y是：
4-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)；或
接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
20.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该推注剂量的施用每天最多进行两次，并且施用途径包括皮下、静脉内、肌内、经鼻、吸入、肠内或其任何组合，或
其中该施用途径是皮下；或
其中该施用途径是静脉内；或
其中该施用途径是肌内；或
其中该施用途径是吸入；或
其中该施用途径是经鼻；或
其中肠内施用途径是口服。
21.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该受试者患有与以下相关的ALI或ARDS：肺水肿；低动脉血氧合；肺中炎性细胞水平升高；肺中炎性细胞因子的水平或表达增加；败血症；菌血症；肺炎、肺纤维化或其任何组合。
22.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中炎性细胞因子包括IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg或其任何组合。
23.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该肺炎包括细菌性肺炎、病毒性肺炎、无菌性肺炎。
24.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该ALI或ARDS由以下原因引起：
(i)选自以下的全身性损伤：创伤、败血症、菌血症、胰腺炎、休克、多次输注、弥散性血管内凝血、烧伤、药物过量或中毒、阿片类药物、阿司匹林、吩噻嗪类、三环类抗抑郁药、胺碘酮、化疗药剂、呋喃妥因、鱼精蛋白、血栓性血小板减少性紫癜、头部损伤、百草枯及其任何组合；或
(ii)选自以下的肺损伤：胃内容物吸入、肺插管、栓塞、肺结核、病毒性肺炎、细菌性肺炎、细胞源性机化性肺炎、气道阻塞、吸食游离碱可卡因、近乎溺死、有毒气体吸入、氧中毒、肺挫伤、辐射暴露、高海拔暴露、肺再膨胀、再灌注及其任何组合。
25.如权利要求24所述的方法，其中该栓塞由血栓、脂肪、空气或羊水引起。
26.如权利要求23所述的方法，其中该病毒性肺炎是由冠状病毒或流感病毒引起的SARS。
27.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中：
ALI或ARDS由传染病引起，或
ALI或ARDS由PF引起，或
ALI或ARDS由败血症引起；或
ALI或ARDS由菌血症引起；或
ALI或ARDS由插管引起；或
ALI或ARDS由选自由氯气、烟雾、光气、浓氧及其任何组合组成的组的有毒气体引起。
28.如权利要求27所述的方法，其中该传染病由冠状病毒或流感病毒引起。
29.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该纤维化包括肺或肺部纤维化、肝硬化和肾小球硬化。
30.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该组合物包含长效CNP组合物或超长效CNP组合物，该长效CNP组合物或超长效CNP组合物包含CNP、CNP衍生物或长效CNP衍生物和聚合物赋形剂，该聚合物赋形剂包含用聚乙二醇、脂肪酸、和/或阴离子部分接枝的聚(氨基酸)；其中该聚合物赋形剂适于螯合或非共价结合这些CNP或CNP衍生物中的任何。
31.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该组合物包含超长效CNP衍生物组合物，该超长效CNP衍生物组合物包含长效CNP衍生物和聚合物赋形剂，该聚合物赋形剂包含用聚乙二醇、脂肪酸、阴离子部分或其任何组合接枝的聚(氨基酸)；并且其中该聚合物赋形剂适于螯合或非共价结合该长效CNP衍生物。
32.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效NPRB激动剂或该超长效NPRB激动剂包含多肽。
33.如权利要求32所述的方法，其中该多肽包含抗体。
34.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该长效NPRB激动剂或该超长效NPRB激动剂包含分子量小于2kDa的分子。
35.一种治疗患有ALI或ARDS或有风险发展为ALI或ARDS的受试者的方法，该方法包括
向该受试者施用治疗有效推注剂量的组合物，该组合物包含长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物，该长效CNP衍生物或超长效CNP衍生物包含U-GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ IDNO.2]、U-GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.3]、GLSKGCFGLK(U)LDRIGSMSGLGC[SEQID NO.4]、U-CFGLKLDRIGSxSGLGC，其中x是天然或非天然氨基酸残基[SEQ ID NO.11]、或其任何组合，
其中：
U是式(I)或(II)的部分，其中式(I)是
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中
a是1；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；或
X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1；
并且式(II)是
(聚合物)a-(Y)-；
(II)
其中
a是1；
聚合物是纤维素、聚(乙二醇)(PEG)、甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)或其衍生物；
Y是：
1-10个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；
包含酯、酰胺、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分或其组合的非氨基酸接头；
含有氨基酸残基的接头，其中该氨基酸残基共价连接至(聚合物)a；或
不同于该1-10个氨基酸残基或肽序列的肽接头；
其中该组合物不会使血压降低超过基线血压测量值的15％；并且
其中该组合物在1小时至12小时使血浆环状GMP水平相比于基线血浆环状GMP水平增加，并且该基线血浆环状GMP水平是施用该组合物之前的平均血浆环状GMP水平或健康受试者的平均血浆环状GMP水平。
36.如权利要求35所述的方法，其中Y是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
37.如权利要求35或权利要求36所述的方法，其中该长效CNP衍生物选自CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.5]；
CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]；
CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.7]；
CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.8]；
CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.9]；
HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.20]；以及
HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.21]。
38.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)14C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.5]。
39.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)16C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.6]。
40.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)18C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.7]。
41.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)20C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.8]。
42.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是CH3(CH2)22C(＝O)KKKKGGGGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[SEQ ID NO.9]。
43.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ ID NO.20]。
44.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQID NO.21]。
45.如权利要求35至44中任一项所述的方法，其中该组合物包含超长效CNP衍生物组合物，该超长效CNP衍生物组合物包含长效CNP衍生物和聚合物赋形剂，该聚合物赋形剂包含用聚乙二醇、脂肪酸、阴离子部分或其任何组合接枝的聚(氨基酸)；其中该聚合物赋形剂适于螯合或非共价结合该长效CNP衍生物。
46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物减少来自该受试者的BALF样品中的细胞总数和总蛋白。
47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物减少来自该受试者的肺组织中的MPO。
48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物降低该受试者中的炎性细胞因子表达。
49.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物减少患有特发性肺纤维化的受试者的肺中的纤维化区域。
50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物在患有特发性肺纤维化的受试者中降低细胞数量和蛋白水平，并降低IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg中任一种或其任何组合的表达。
51.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物降低IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg中任一种或其任何组合的表达，并降低患有败血症的受试者的致死率。
52.如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该治疗有效推注剂量的该组合物降低该受试者的以下：AST、ALT、α-SMA、IL-6、IL-1b、TNFα、MCP-1、IFNg、iNOS、Elf-1、Tollip、IRAK-1、P-P38、P-P65、β-act、STAT1、P-STAT1、STAT2、STAT3、STAT6中任一种的表达，纤维化区域，血清肌酐，尿液中的白蛋白/肌酐比率，肺中的羟脯氨酸，或其任何组合。
53.一种包含长效CNP衍生物的组合物，该长效CNP衍生物包含式U-CFGLKLDRIGSxSGLGC[SEQ ID NO.30]，其中
x是天然或非天然氨基酸残基，条件是x不是甲硫氨酸残基；并且
U具有式(I)的部分：
(脂肪族)a-(X)-；
(I)
其中a是1；
脂肪族是任选地经取代的C4-24链(例如，任选地经取代的C10-24链，任选地经取代的C12-18链)，其通过与X的化学连接共价结合到X，该化学连接是例如羰基(例如，作为酰胺或酯连接的一部分)、硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选通过作为酰胺或酯连接的一部分的羰基；或更优选通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基；
X是接头(γE)m-(B)n，其中B是1-8个氨基酸残基或肽序列，其中每个氨基酸残基独立地选自2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基、Gly、Ala、Leu、Ser、Arg、和Lys；m是0、1、2或3；n是0、1、2或3；并且m和n之和至少为1。
54.如权利要求53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；a是1；B是 Gly；m是0、1或2；并且n是1。
55.如权利要求53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；a是1；B是 Gly；m是1；并且n是1。
56.如权利要求53所述的组合物，x是高谷氨酰胺，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；a是1；m是1；并且n是0。
57.如权利要求53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺(homoQ)[SEQ ID NO.16]，U是(脂肪族)a-(X)-；其中a是0或1(优选a是1)；脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是0，并且n是2。
58.如权利要求53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺(homoQ)[SEQ ID NO.17]，U是(脂肪族)a-(X)-；其中a是0或1(优选a是1)；脂肪族是支链或直链的任选地经取代的通过羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X的C18链或通过与X的化学连接共价结合至X的C18链，该化学连接是例如硫醚、醚、硫醚、氨基甲酸酯部分、键等；优选脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺或酯连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X；或更优选地，脂肪族是支链或直链的任选地经取代的C18链，其通过作为与X的酰胺连接的一部分的羰基(例如，CH3(CH2)16C(＝O))共价结合至X，或者脂肪族是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；X是接头(γE)m-(B)n；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是1，并且n是2。
59.如权利要求53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是CH3(CH2)16C(＝O)或HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是0，并且n是2。
60.如权利要求53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是CH3(CH2)16C(＝O)或HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；B是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸残基，m是1，并且n是2。
61.如权利要求53所述的组合物，其中x是高谷氨酰胺，脂肪族是CH3(CH2)16C(＝O)或HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)；B是(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-(Gly)，m是1并且n是1。
62.如权利要求53所述的组合物，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-γE-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ IDNO.20]。
63.如权利要求53所述的组合物，其中该长效CNP衍生物是HOC(＝O)(CH2)16C(＝O)-Aeea-Aeea-GCFGLKLDRIGShomoQSGLGC，其包含半胱氨酸残基之间的二硫键[SEQ IDNO.21]。
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