CN115803108A - 用于酶促多核苷酸合成的系统、设备和套件 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用无模板聚合酶在反应室阵列中自动合成多个多核苷酸的系统、设备和套件。在一些实施方案中，提供了适应元件和过程以监测和控制酶聚集对合成过程和流体运动的中断。

Description

用于酶促多核苷酸合成的系统、设备和套件
最近对多核苷酸合成的酶促方法的兴趣增加，这不仅是因为许多领域，如合成生物学、CRISPR-Cas9应用、高通量测序等对合成多核苷酸的需求增加，而且还因为多核苷酸合成的化学方法的局限性，如难以在惰性气氛和无水环境下进行多步合成反应、产物长度的上限、有机溶剂的使用和需要处置等，例如Jensen等人,Biochemistry,57:1821-1832(2018)；Sindalar等人,Nucleic Acids Research,23(6):982-987(1995)；Lashkari等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,92:7912-7915(1995)；Hargreaves等人,Nucleosides,Nucleotidesand Nucleic Acids,34:691-707(2015)。酶促合成不仅由于酶的特异性和效率具有吸引力，而且由于其使用简化操作并消除了有害试剂需要的温和水性反应条件而具有吸引力。
另一方面，酶的使用为在设备中自动化多步合成反应带来了另一组问题，包括但不限于酶粘附于表面、需要严格的温度和pH控制以保持酶活性、导致失活和/或阻塞孔或喷嘴的酶聚集、合成支持物中或附近的酶活性变化、酶比活性的批次间差异、抑制试剂转移和分离的泡沫或气泡的形成等。
鉴于上述情况，如果能获得解决在自动化合成设备中使用酶和水性反应混合物和试剂所引起的问题的方法和装置，则使用无模板聚合酶平行合成多核苷酸将得到推进。
发明概述
本发明涉及用于在单独的反应室或位点中平行酶促合成多个多核苷酸的系统、设备和套件。在一些实施方案中，本发明的系统、设备和套件实现多核苷酸的自动化合成，所述多核苷酸是聚-2’-脱氧核糖核苷酸(或DNA)；在其它实施方案中，本发明的系统、设备和套件实现多核苷酸的自动化合成，所述多核苷酸是聚核糖核苷酸(或RNA)。
在一个方面，本发明包括用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的系统和设备，其包括以下元件：(a)多个反应室，每个反应室具有连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述反应室中，所述反应溶液包含3’-O-保护的核苷三磷酸、去保护溶液和无模板聚合酶；(d)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列；和(e)在操作上与所述用户界面、所述反应室、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统将每个多核苷酸的预定序列分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下，将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中以预定速率去除去保护溶液。
在一些实施方案中，上述系统和设备还包括用于测量每个所述反应室中的液位的一个或多个液位传感器，并且其中所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶输送至引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中以预定速率去除去保护溶液，以及(iv)用所述一个或多个液位传感器测量每个所述反应室中的液位，并且每当鉴定出液位在预定边界之外的反应室时，在随后的试剂输送步骤中绕过鉴定的反应室。
在一些实施方案中，用于酶促合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的系统和设备包括以下元件：(a)多个反应室，每个反应室具有连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述反应室中，所述反应溶液包含3’-O-保护的核苷三磷酸、去保护溶液、无模板聚合酶和蛋白酶溶液；(d)一个或多个液位传感器，其用于测量各个反应室中液位的变化率，(e)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列；和(f)在操作上与所述用户界面、所述反应室阵列、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统将每个多核苷酸的预定序列分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下，将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生预定的压差以从所述反应室中去除去保护溶液，(iv)将洗涤溶液输送至所述反应室中，(v)在所述反应室与所述废物歧管之间产生预定的压差以从所述反应室中去除洗涤溶液，以及(vi)用所述一个或多个液位传感器测量一部分所述反应室的每一个中的液位的变化率，并且每当检测到液体去除速率低于预定速率的反应室时，启动校正动作；其中在反应室中在步骤(i)中接触的3’-保护的核苷三磷酸的种类由分配至所述反应室的预定序列确定。在一些实施方案中，所述控制系统(iv)在所述去保护溶液的去除期间或在所述洗涤溶液的去除期间进一步指导所述液位的变化率的测量。在一些实施方案中，校正动作包括将蛋白酶溶液输送至液体去除速率低于所述预定速率的反应室的其它步骤。在一些实施方案中，所述校正动作包括在随后的试剂输送步骤中绕过液体去除速率低于所述预定速率的反应室的其它步骤。在一些实施方案中，所述校正动作包括增加用于抽空所述反应室的真空强度。
在许多所示的实施方式和应用中举例说明本发明的这些上文表征的方面以及其他方面，其中一些在附图中示出并且在随后的权利要求部分中表征。然而，以上概述并非旨在描述本发明的每个所示实施方案或每个实施方式。
附图的简要说明
图1示出了酶促合成多核苷酸的基本步骤。
图2A示出了在平面基板中96个反应孔的直线排列形式的反应室的平面阵列，其中，例如，出于输送试剂的目的，每个反应孔是可寻址的。
图2B和2C示出了在96孔阵列的反应孔的总数的部分上的液位测量。
图3A-3H示出了本发明的设备的各种实施方案。
图4A-4B示出了本发明的设备的一个实施方案，所述设备用于在相同的反应室中使用正交保护-去保护化学来合成多种寡核苷酸、包含RNA和DNA的组合的多核苷酸或分支寡核苷酸。
图5A-5G示出了本发明的在设备内使用单独的站用于合成、产物切割、分离和产物定量的一个实施方案。
图6A-6E示出了用于本发明的用户界面的特征。
发明详述
本发明的一般原理在本文中更详细地公开，特别是通过实例的方式，如附图中所示和详细描述的那些。然而，应当理解，意图不是将本发明限制于所描述的特定实施方案。本发明适用于各种修改和替代形式，其细节针对若干实施方案示出。意图是涵盖落入本发明的原理和范围内的所有修改、等效物和替代物。用于选择材料和组件以执行特定功能的指导可以见于关于科学仪器的可用论文和参考文献，包括但不限于Moore等人,BuildingScientific Apparatus,第三版(Perseus Books,Cambridge,MA)；Hermanson,Bioconjugate Techniques,第三版(Academic Press,2013)，以及类似的参考文献。
一方面，本发明涉及使用无模板聚合酶在可寻址反应室阵列中平行酶促合成多个预定序列的多核苷酸的系统和设备。也就是说，本发明的系统和设备对每个多核苷酸使用图1所示的合成方案来自动合成多个预定序列的多核苷酸。应当理解，关于多核苷酸序列的术语“预定的”包括在预定位置放置随机序列，例如在随机序列标签或条形码的合成中。在一些实施方案中，本发明的系统包括本发明的设备，其实践包括具体方法步骤的实现。在一些实施方案中，本发明的系统和设备可以进一步进行合成的多核苷酸从它们的合成支持物上的切割或释放以及切割或释放的多核苷酸产物的分离。在一些实施方案中，本发明的系统和设备包括(i)多个反应孔，每个反应孔能够通过入口或开口接受反应物、洗涤溶液、合成支持物，将这些反应物、洗涤溶液和合成支持物保持预定的孵育时间，以及通过与保留合成支持物的过滤器在操作上关联的出口去除这些反应物和洗涤溶液，其中所述多个反应室通常以规则的例如直线平面阵列提供，(ii)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，用于在所述反应室和所述废物歧管之间建立正压力差时接收从所述反应室去除的反应物和洗涤溶液，使得所述反应室中的流体通过所述反应室出口流到所述废物歧管，(iii)流体输送系统，其用于在控制系统的控制下将试剂储存和输送至反应室，(iv)用户界面，其用于例如经由用户直接输入或从另一装置(例如个人计算机、手机等)传输来接受多核苷酸序列，并用于向用户显示过程选项、建议和警告，(v)控制系统，其用于控制流体输送系统、废物歧管和反应室的操作以在反应室中实现多核苷酸合成，此外，基于过程数据分析，收集和存储过程数据、错误管理，以及实现自适应过程，即校正动作，以及(vi)也在控制系统控制下的液位传感器，其用于在合成循环期间监测从反应孔的流体去除，并检测去除流体失败或不充分的流体去除。在一些实施方案中，本发明的设备还可以包括用于进行初步(即，合成前)聚合酶活性测定的组件。基于测定的结果，控制系统可以调节偶联反应的孵育时间和温度以优化产率，或者在极端情况下可以经由用户界面向用户推荐应更换试剂。在一些实施方案中，本发明的设备和系统可以包括用于从它们的合成支持物切割多核苷酸产物和分离切割的产物的元件。这些实施方案可以根据所用的切割机制和所用的分离方法而广泛地变化。在一些实施方案中，在切割之后，通过常规的纯化技术实现分离，所述技术包括凝胶过滤或吸附到硅基材料，如玻璃上。因此，在这样的实施方案中，可以使用与合成板(包括多个反应室)相容的市售DNA分离板，并通过设备的常规板移动器或其它机器人组件定位。示例性的市售分离板可从Invitek Molecular(Berlin)、Enzymax(Lexington,KY)、Qiagen(San Diego)或类似供应商获得。这种市售的分离板通常根据制造商推荐的方案使用。在本发明中使用的示例性板移动器可以包括简单定制的板夹持组件，该板夹持部件与在轨道上的运动相结合，以便在站之间进行运输，或者板移动器可以包括市售的机器人，如Spinnaker Microplate Robot(ThermoFisher)等。这种板移动器移动合成板和/或DNA分离板，使得它们彼此适当相关，以便进行切割和分离。在一些实施方案中，切割的多核苷酸产物可以通过色谱法分离，例如在使用96孔合成板的实施方案中，通过使用具有合适填充材料的Repligen’s
Figure BDA0004000217330000061
板等。
由本发明的设备合成的多个多核苷酸的大小可以广泛地变化。在一些实施方案中，多个的范围可以是2至10000、或2至5000、或2至2000、或2至500、或2至100。在其它实施方案中，多个的范围可以是100至2000、或100至500。在一些实施方案中，多个多核苷酸等于或小于标准市售多孔板(如24孔、48孔、96孔、384孔或1536孔板)中的孔数。在一些实施方案中，多个多核苷酸与平面阵列中的反应室或反应孔的数目相同或小于平面阵列中的反应室或反应孔的数目。多个多核苷酸的长度可以相同或不同，并且在一些实施方案中，可以在10至1000个核苷酸变化。在其它实施方案中，通过本发明的系统和设备合成的多核苷酸的长度可以在10-500个核苷酸、或者10-200个核苷酸、或者10-100个核苷酸变化。
多个反应室中的每个反应室具有入口和出口以及在操作上与所述出口关联的过滤器，每当液体试剂通过所述出口从所述反应室中去除时，所述过滤器能够将合成支持物材料保留在所述反应室中。在一些实施方案中，用于本发明的反应室阵列可以是市售的24孔、48孔、96孔、384孔或1536孔过滤板，例如可从Pall、Agilent、ThermoFisher或类似公司获得。在一些实施方案中，反应室的体积范围可以是0.5μL至10mL、或1.0μL至5mL、或2.0μL至5mL、或5μL至5mL、或1.0μL至400μL。反应室的典型工作反应体积在反应室体积的50％至75％的范围内。在一些实施方案中，反应室形成在平面基板中，所述平面基板包含在暴露于酶合成方法的试剂和条件下是惰性的且稳定的材料。示例性的材料包括但不限于尼龙、聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)等。图2A示出了以直线阵列布置的反应室(在这种情况下，孔(202))的阵列或板(200)，其中阵列或板中的每个孔是可寻址的，特别是在控制系统可以被编程以将预定的试剂精确地输送至阵列中的任何预定孔(S1,S2…Sn)的意义上。在其它实施方案中，反应室的阵列可以具有不同的布置，如六边形、同心形等。在一些实施方案中，在不同的反应室中合成多个各自不同的多核苷酸。
每个反应室含有合成支持物材料，该合成支持物材料具有连接的引发剂，在合成过程中单体偶联到该引发剂上。如下文更全面描述的，系统和设备所使用的合成支持物的类型可以在尺寸和组成上广泛地变化。在一些实施方案中，合成支持物可以包括反应室的过滤器。在一些实施方案中，合成支持物可以与反应室分开并设置在反应室中。例如，在一些实施方案中，合成支持物是固体颗粒或珠粒。这种固体颗粒或珠粒可以包括无孔固体颗粒或珠粒，其中合成发生在合成支持物材料的表面；或者多孔固体颗粒或珠粒，如凝胶颗粒或树脂，其中合成发生在合成支持物材料的表面和内部。在一些实施方案中，多个反应室可以是包括孔阵列的合成板的形式，例如常规的96孔或384孔形式，每个孔含有预定量的连接有引发剂的合成支持物。如下文更全面描述的，在一些实施方案中，这种合成板可以包括设置在沉积在孔中的预定体积的粘性湿润剂溶液中的合成支持物。粘性湿润剂保护孔中的合成支持物免于变干并固定或定位支持物，从而使孔内的移动最小化或消除。在一些实施方案中，这种合成支持物以真空包装的形式提供给用户，例如真空包装在塑料、聚酯薄膜、金属箔或其它保护材料中。用于生产这种真空包装的合成板的器具包括诸如Kitchenboss的简单装置或类似器具。在一些实施方案中，湿润剂选自甘油、醇糖、乙基己基甘油、泛醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、己二醇、丁二醇、乳酸钠、透明质酸、聚右旋糖等。在一些实施方案中，这种湿润剂的粘度相当于甘油/水溶液中范围为40-60％(v/v)甘油：水。在一些实施方案中，所述湿润剂是50％(v/v)甘油：水溶液。如本文所用，“湿润剂”是吸引和保留水分的任何吸湿物质。在一些实施方案中，合成板可以包含两种或更多种湿润剂的混合物或者在不同的孔中具有不同的湿润剂。在一些实施方案中，与粘性湿润剂分开或与粘性湿润剂一起，合成支持物也可以固定或定位在可溶解的凝胶中，如可溶解的水凝胶中，如二硫化物稳定的水凝胶中，例如Chong等人,Small,5(22):2601-2610(2009)；Lu等人,Burns&Trama,6:35(2018)；Konieczynska等人,Acc Chem Res,50(2):151-160)；等。
与反应室或反应室阵列关联的过滤器可以是结合到或密封地连接到反应室的一个或多个出口的过滤材料平面薄片。通常，过滤器由对酶促合成过程的试剂和条件呈惰性且稳定的材料制成。例如，这种过滤膜可以包括聚醚砜、聚砜、纤维素、尼龙、聚丙烯、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚四氟乙烯(PTFE)、玻璃纤维、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚氯乙烯、丙烯酸共聚物、氧化铝、聚酯等。在一些实施方案中，过滤材料是疏水的或者已经被处理为疏水的，例如，以防止孵育期间水性试剂通过过滤器渗漏。在一些实施方案中，过滤器包括PTFE、PVDF或聚丙烯。
选择反应室的过滤材料的孔径、孔径分布、孔密度和类似特性，使得其在反应室和废物歧管之间施加压差时保留合成支持物材料，但允许蛋白质和其它试剂通过。因此，在一些实施方案中，选择的孔径部分取决于合成支持物材料的性质。在一些实施方案中，当合成支持物是常规的固体或凝胶颗粒或珠粒(例如直径>40μm)时，可以使用具有平均直径范围为0.1μm至10.0μm的孔的过滤器；或者在其它实施方案中，可以使用具有平均直径范围为0.1μm至1.0μm的孔的过滤器。在一些实施方案中，可以使用具有0.45μm孔或1.2μm孔的市售96孔和384孔滤板。在一些实施方案中，使用的过滤器具有范围为1-106个孔/cm2的孔密度。在例如其中使用可溶性合成支持物，如聚合物支持物的一些实施方案中，可以使用纳滤。纳滤可以例如使用平均孔径(或直径)范围为1nm至50nm或1nm至10nm的过滤器来实现。
在一些实施方案中，许多所述多个反应室可以专用于测量无模板聚合酶的活性，例如，在合成开始之前。用于此目的的反应室的数目取决于几个因素，包括(i)是否使用单一的无模板聚合酶或者是否使用两种或多种无模板聚合酶，(ii)是否需要重复测量，(iii)无模板聚合酶是否作为单独的试剂输送至反应室或者无模板聚合酶是否作为也包括3’-O-保护的dNTP的混合物储存和输送。在一些实施方案中，用于测量无模板聚合酶活性的反应室的数目范围为1至12、或1至8、或1至4；在其它实施方案中，多个反应室的一部分用于测试无模板聚合酶活性；在其它实施方案中，这种部分可以是多个反应室的高达10％、或多个反应室的高达5％、或多个反应室的高达2％。在一些实施方案中，用于测量无模板聚合酶活性的反应室与相同数量的其他反应室或合成板相同。不同之处在于控制系统指定用于进行活性测定的反应室的数目和位置或地址。
在一个实施方案中，在本发明的系统和设备中使用的无模板聚合酶活性测定提供了光学读数，例如与活性具有单调关系的荧光强度，如荧光强度和活性之间的线性关系。可用于本发明的用于活性的特定光学读出测定是由Batule等人,Artificial Cells,Nanomedicine,and Biotechnology,47(1):256-259(2019)公开的。简而言之，Batule等人公开了BODIPY标记的dATP单体，其被Fe(III)淬灭直到其被末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)掺入到引发剂中。Lin等人,Biosensors and Bioelectronics,77:242-248(2016)描述了dATP类似物的合成。在掺入后，基于Fe(III)的淬灭停止，并且BODIPY部分以与掺入量成比例的强度发荧光。因此，为了进行测定，只需要将要测试的无模板聚合酶和BODIPY标记的dATP输送至含有引发剂的指定反应室。在本发明的其中无模板聚合酶与3’-O-保护的单体的混合物的形式输送的实施方案中，如果测试所有四种无模板聚合酶混合物的活性，则将需要使用至少四个反应室。
本发明的设备和系统包括至少一个废物歧管，其在操作上与多个反应室和控制系统关联，用于在所有反应室和废物歧管之间同时产生正压力差，该正压力差使反应室中的流体通过反应室的过滤器流到废物歧管(并且随后流到废物容器)。正压力差可以通过向反应室施加压头(例如，如skold等人的美国专利5273718所述)或通过向废物歧管室施加真空(例如，如Sindelar等人,Nucleic Acids Research,23(6):982-987(1995)所述)来产生。用于本发明的示例性真空歧管包括MilliporeHTSTM真空歧管、BioTek ELx405TM真空过滤模块等。示例性的合成板包括用于96孔或384孔形式的这些歧管的过滤板。在采用真空的实施方案中，废物歧管包括真空传感器和调节器，其允许施加到反应室的真空强度由控制系统控制。在一些实施方案中，废物歧管还包括用于调节多个反应室的温度的组件和用于搅拌反应室中的反应混合物的振动器。废物歧管和多个反应室之间的操作关联包括在包括反应室的基板和废物歧管之间建立密封，从而可以控制废物歧管室和反应室之间的压力差。这种操作关联还包括由控制系统产生和发送到流体输送系统和废物歧管的指令的定时，用于输送试剂，确定孵育时间和试剂去除的定时，以便实现基于酶的方法的合成步骤。在一些实施方案中，这种操作关联还可以包括根据无模板聚合酶的测量活性来改变反应的温度、孵育时间。在一些实施方案中，废物歧管可以包括真空传感器、真空调节器、温度传感器和温度调节装置，以控制安装在歧管上的板的温度。这种传感器和调节器在操作上与控制系统关联，并且每当液位传感器指示从反应室去除的流体不充分时，可以由控制系统用来实现校正动作。这种校正动作可以包括增加施加到合成板的真空强度、增加施加真空的持续时间、或两者。对于常规的96孔和384孔滤板，真空的范围可以是100-600mmHg，并且可以施加真空5-40秒的时间。用于操作常规96孔和384孔过滤板的真空歧管的指导见于Goodrich,TechNote,“Tips for optimizing microplate vacuum filtration results,”Rev.10/26/2011。
流体输送系统包括(i)用于储存进行合成反应以及在一些实施方案中进行切割反应和产物分离所需的试剂的储器，和(ii)用于在适当的时间将试剂从储器输送至反应室的组件，其可以包括基于移液管的输送或导管、管道、连接器、阀、泵、喷嘴等的系统。流体输送系统还可以包括在各种位置的温度传感器(例如储器、阀、喷嘴等)，温度控制元件(例如加热器和/或制冷单元)以将试剂保持在使它们的稳定性和有效性最大化的温度，用于储器的体积水平传感器等。这种传感器在操作上与控制系统关联，并且可以用于监测设备中的错误或异常状态。各种各样的流体输送设备和组件可以被构造或改造用于实现本发明的流体输送要求。在自动化化学合成和分析的文献中获得了针对此目的的广泛指导，例如Miertus等人编,Combinatorial Chemistry and Technologies:Methods and Applications,第二版(CRC Press,2005)；West等人,美国专利9103809；Butendeich等人,J.LaboratoryAutomation,18(3):245-250(2013)；Fluent Automated Workstations(Tecan Group)；Tisone等人,美国专利6063339；Cathcart等人,美国专利5443791；Ingenhoven等人,美国专利7529598；Glauser等人,美国专利8580197；Sindalar等人,Nucleic Acids Research,23(6):982-987(1995)；Cheng等人,Nucleic Acids Research,30(18):e93(2002)；Skold等人,美国专利5273718等。在一些实施方案中，本发明的流体输送系统可以部分地包括常规的流体输送机器人。在其他实施方案中，本发明的设备可以部分地包括喷墨流体输送系统。在一些实施方案中，流体输送系统可以包括试剂筒，其可以是一次性的，并且其可以方便地连接或安装在设备的兼容接收站中。这种筒可以含有必要量的试剂以合成预定量的预定数目的各自具有低于预定最大值的长度的多核苷酸中的每一个。在一些实施方案中，这种预定量的范围为1至1000皮摩尔、或1至200皮摩尔。在一些实施方案中，这种预定数目的多核苷酸范围为1至96、或在1至384。在一些实施方案中，这种预定长度的范围为25至600个核苷酸、或50至200个核苷酸。
用户界面为用户提供了用于将信息传达到设备并从设备接收关于设备的状态(例如，试剂温度、反应室温度、阀/泵温度等)，试剂水平，合成状态，切割和分离状态，定量和定性产量信息等的信息的工具。用户界面还可以为用户提供与因特网上的网站通信的工具，以便订购产品和服务，例如诸如寡核苷酸设计服务、设备诊断服务等。由用户提供给设备的主要信息包括要合成的多个多核苷酸的序列。其它信息可以包括合成规模、用户确定的反应室对特定顺序的分配、用户确定的反应条件(如，反应时间和温度)等。用户界面可以包括各种不同的通信装置，如，具有图形用户界面的计算机、移动电话、专用硬件和软件或上述的组合。提供全部或部分用户界面的计算机可以与本发明的设备集成在一起，或者它可以与仅通过通信链路(例如电缆，蓝牙等)连接到设备的本发明的设备物理分离。用户界面软件可以包括构成控制系统的一部分或全部的常规实验室软件，诸如例如LabView或者可以是以上的一部分。
在一些实施方案中，本发明的仪器和系统可以包括图6A-6E中公开的图形用户界面(GUI)。生成GUI的特征的软件可以位于仪器上或远程网站上。通常，这种GUI提供能够在单个对象中表示多个数据值的字形或图形对象。在本发明的仪器和系统中，阵列的每个反应室与至少一个字形关联，并且在一些实施方案中，与单个字形关联。通常，GUI产生至少一个屏幕，该屏幕显示字形的阵列视图，其中字形被布置成阵列，在该阵列中，字形相对于彼此的相对位置对应于反应室的物理阵列。在一些实施方案中，GUI的另一个特征是可以点击阵列中的每个字形来打开窗口，该窗口向字形的放大视图提供另外的数据和用户选择。
在一些实施方案中，字形提供多核苷酸序列信息，所述多核苷酸序列信息被编码为沿着作为几何形状如圆形或多个嵌套圆形的一部分的线或曲线的彩色或图案化形状(代表不同的核苷酸)的序列。在一些实施方案中，序列表示可以布置在嵌套的圆形组或规则的多边形(如嵌套的正方形组)中，或者布置在连续的曲线，如螺线中。这种几何图形在以下意义上是紧凑的，即无论显示什么样的序列信息，它都被显示在对每个字形都相同的有界区域内。在一些实施方案中，这种有界区域与序列长度无关，从而可以以具有恒定总面积的阵列格式来显示多个字形，如图6A中字形(602)的6×4阵列(600)所例示的。字形本身并不相同，甚至在阵列格式中由于不同的多核苷酸序列产生的不同模式，也可以在视觉上区分；然而，通过提供如图6B所示的点击可访问窗口，可以在GUI中访问特定反应室的更容易辨别的序列信息和另外的数据，该窗口含有图6A的字形的放大。如本文所用的，“点击可访问的”意指这样的特征，其中用户控制的光标可以被放置在GUI屏幕上，例如字形上的位置，然后启动单独的控件，例如在鼠标或键盘上，以使得GUI执行与该位置相关的一些预定功能，例如创建窗口。在图6B中，在点击字形(603)之后，生成包括放大的字形(604)和另外的信息的窗口(605)。在放大的字形中，序列信息被包含在两个同心圆(外圆606和第二内圆608)中，每个同心圆包含一系列灰色、斑点、黑色和白色填充的空格以分别代表A、C、G和T核苷酸的序列。两个圆的序列的开始可以由符号(620)或类似的手段来指示。第一内圆(610)显示与正在合成的多核苷酸相关的信息(表示为填充的圆(或环)的比例)。这种长度信息可以包括但不限于多核苷酸相对于最大长度的相对长度、合成的多核苷酸的分数(与合成循环数成比例)、自起始的时间(例如循环数×循环时间)、完成的时间或类似的量。中心盘(612)可以显示与反应室相关的关键信息和/或警告，例如产率、产物的浓度、体积或产物等(其可以以数字或以梯度或灰度格式提供)。可以在GUI中提供按钮(616和618)，以允许在不同数量和格式的显示之间进行切换。也就是说，定量数据，如浓度，可以以灰度(或梯度)格式或数字格式显示。图6C和6D提供了用于短序列(6C，其中序列代码仅占据第二圆的一部分(630))和长序列(6D，其中序列代码占据整个内圆(632)和外圆的一部分(634))的这种类型的字形的例示。图6E示出了包含正方形格式和代表多核苷酸序列的连续曲线(即螺线)的符号(灰色、斑点，黑色和白色正方形)的字形。另外，字形可以包括指示起点的符号(例如，图6C中的条形(631)和三角形(633))。
在一些实施方案中，多核苷酸序列的一个或多个部分以字形表示。例如，字形可以包括两个同心圆(例如，如图6B所示)，每个同心圆包含编码的序列信息，其中，例如，内部同心圆代表多核苷酸5’端的多达24个核苷酸，以及外部同心圆代表多核苷酸3’端的多达36个核苷酸。
在更进一步的实施方案中，字形可以包括螺线中的序列信息，如图6E所例示的。螺线可以包括曲率连续变化的曲线，使得当沿着螺线采取路径时，如阿基米德线，距原点的距离连续增加。或者，在一些实施方案中，如图6E所示，螺线可以包括限定连续路径的一系列区段(642)，所述连续路径绕诸如正方形(640)的规则多边形缠绕或包裹，如图6E所示。
根据以上所述，用于合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的设备可以包括以下元件：(a)多个反应室的阵列，每个反应室具有合成支持物，其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并且在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述阵列的反应室；(d)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列并提供空间紧凑字形的图形显示，每个所述字形代表多核苷酸序列的全部或者一个或多个部分，其中这种字形布置在阵列中，其中反应室的阵列中多核苷酸的反应室的相对位置与所述多核苷酸的字形在所述字形阵列中的相对位置相同；以及(e)在操作上与所述用户界面、所述反应室的阵列、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统将每个多核苷酸的预定序列分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下将核苷酸单体输送至每个反应室中的合成支持物或延长片段，以允许每个合成支持物或延长片段被核苷酸单体延长，从而根据其预定序列形成延长片段，以及(ii)在反应室和废物歧管之间产生压差以从反应室中去除未偶联的核苷酸单体。在一些实施方案中，这种字形将序列的全部或者一个或多个部分表示为曲线或符号串，其在限定或有界区域内包括闭合圆或多边形的嵌套集合或连续曲线，如螺线。
在一些实施方案中，用于合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的本发明的设备可以包括以下元件：(a)多个反应室的阵列，每个反应室具有连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并且在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述阵列的反应室，所述反应溶液包含3’-O-保护的核苷三磷酸、去保护溶液和无模板聚合物；(d)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列并提供空间紧凑字形的图形显示，每个所述字形代表多核苷酸序列的全部或者一个或多个部分，其中这种字形布置在阵列中，其中反应室的阵列中多核苷酸的反应室的相对位置与所述多核苷酸的字形在所述字形阵列中的相对位置相同；以及(e)在操作上与所述用户界面、所述反应室的阵列、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统将每个多核苷酸的预定序列分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下，将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中以预定速率去除去保护溶液。如上所述，在一些实施方案中，这种字形将序列的全部或者一个或多个部分表示为曲线或符号串，其在限定或有界区域内包括闭合圆或多边形的嵌套集合或连续曲线，如螺线。
在一些实施方案中，空间紧凑字形意指在空间有限或限定的区域中的序列信息的表示，其中的多个可以被布置为阵列。在一些实施方案中，限定的区域包括圆形、正方形或六边形。序列是不同对象的确定顺序，例如，在要合成的多核苷酸中的不同种类的核苷酸的顺序。在一些实施方案中，不同的对象，如不同种类的核苷酸(A、C、G或T)可以由不同的形状(例如圆形、曲线段、正方形、字母、星形等)、不同的颜色或两者来表示。字形中的核苷酸序列可以通过在有限区域中这些符号的排序来表示。
控制系统包括计算机和软件，其用于接受要合成的多核苷酸的序列，关于设备状态和合成状态的信息(例如，来自用户界面、液位传感器、温度传感器、试剂级传感器等)，然后产生信号并将其发送到控制器，该控制器启动各种装置(例如，阀、泵、用户界面、废物歧管、定位喷嘴用于流体分配的马达等)用于进行与合成相关的具体功能。所述控制系统还可以(i)监测来自传感器的过程和设备数据，以确定是否出现异常数据模式或错误(例如，从孔中去除流体不充分、孔中反应混合物的体积不充分等)，以及(ii)基于数据和错误信号的分析来实现校正动作(例如，通过用户界面向用户发送警告和建议)。普通技术人员将认识到用于控制系统的硬件和软件在很大程度上取决于设备的特定实施方案。
Figure BDA0004000217330000161
测量和/或监测反应室中液位的液位传感器提供了对反应室的过滤器或出口中的障碍物的间接测量，其主要原因是蛋白质粘附和积聚在过滤器孔或出口通道中。由液位传感器收集的数据被传输到控制系统，由控制系统存储和分析。考虑到所有合成试剂通过入口进入反应室并通过其出口离开反应室，由蛋白质粘附或积聚引起的任何阻塞都可能导致试剂从阻塞的室中溢出，并由于溢出而在反应室之间交叉污染。即使不发生溢出，流体去除速率的改变也可能使一些排空的反应室留有残余反应物或洗涤溶液，这可能不利地改变反应条件。例如，由于不充分的流体去除，在随后的反应中反应体积可能增加。此外，如果由于不充分的流体去除而保留了来自先前偶联循环的痕量反应混合物，则错掺的可能性可能增加。在一些实施方案中，在每个偶联循环期间或之后测量每个反应室的液位。在一些实施方案中，液位传感器在已经排空反应室之后立即测量液位；在其它实施方案中，液位传感器在将试剂或洗涤溶液已经分配至反应室之后立即测量液位；在其它实施方案中，液位传感器在流体从反应室排空期间在反应室中进行多次液位测量，从而可以计算反应室的流体去除速率。在后一个实施方案中，在试剂去除步骤期间，一组液位传感器可以定位在反应室的全部或一部分或子集上。例如，每当多个反应室包括96孔合成板时，一组液位传感器可以包括4个传感器、或8个传感器、或16个传感器。也就是说，在一些实施方案中，可以在每个偶联循环期间对反应室的一部分(但不是全部)进行这种速率测量，使得每个反应室具有每六个循环测量的其排空速率。对于一组16个传感器，这种概念示出在图2B和2C中，每六个偶联循环对96孔合成板(250)的16个反应室(循环i的阴影孔(252)和循环i+1的阴影孔(254))的组进行顺序测量。在其它实施方案中，液位传感器可以测量在每个偶联循环中预定百分比的反应室中的液位或流体去除速率。例如，这种预定百分比的范围可以为2-50％、或者2-25％、或者2-10％。在一些实施方案中，液位传感器可以容纳在与试剂输送喷嘴和/或移液管相同的台架头中(在试剂在板之间或在同一板的孔之间转移的实施方案中)。在一些实施方案中，可以将一组液位传感器容纳在单独的台架头中，例如类似于美国专利9103809中描述的双台架装置。
液位传感器的选择部分地受到设备的物理约束(例如，孔的间隔和尺寸)和传感器的响应速率的限制。在一些实施方案中，使用多个传感器在多个反应室中同时进行测量。这种多个传感器可以布置在一个组中，该组在反应室的平面阵列上作为单个单元移动，其中传感器在该组中间隔开，使得它们可以与它们下面的反应室对齐，例如，如图5H中所示，具有1×4组超声波水平传感器。在一些实施方案中，用于本发明的水平传感器是非接触式传感器。在一些实施方案中，这种非接触式传感器或者是基于光学的、或者是基于声学的。在后者中，超声波液位传感器是特别令人感兴趣的，部分是因为它们可以小型化以维护小的反应室尺寸，并且它们具有快速的测量时间，例如低至10毫秒。使用图像分析的示例性的基于光学的液位测量技术公开在Thurow等人,J.Automated Methods and Management inChemistry,2011(文章ID 805153)中。用于96孔板的示例性超声波液位传感器是Baumer(Southington,CT)型号09T9114/D1。
在一些实施方案中，本发明包括使用多孔颗粒树脂和TdT变体酶促合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的系统，所述TdT变体被工程化为具有最小的回转半径和降低的对表面(如反应室壁和过滤器)的粘附。在一些实施方案中，这种系统包括(a)多个反应室，每个反应室具有连接有引发剂的多孔树脂颗粒，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述多孔树脂颗粒并且在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述阵列的反应室中，所述反应溶液包含3’-O-保护的核苷三磷酸、去保护溶液和被工程化为具有最小回转半径的TdT变体；(d)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列；和(e)在操作上与所述用户界面、所述反应室的阵列、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统将每个多核苷酸的预定序列分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下将3’-O-保护的核苷三磷酸和TdT变体输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中以预定速率去除去保护溶液。在一些实施方案中，本发明的系统还包括：一个或多个液位传感器，其用于测量每个反应室中的液位，并且其中所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下将3’-O-保护的核苷三磷酸和TdT变体输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中以预定速率去除去保护溶液，以及(iv)用所述一个或多个液位传感器测量每个所述反应室中的液位，并且每当鉴定出液位在预定边界之外的反应室时，在随后的试剂输送步骤中绕过鉴定的反应室。在一些实施方案中，选择具有最小回转半径的TdT变体以更有效地通过多孔树脂颗粒传输。在一些实施方案中，这种TdT变体选自以下的TdT变体，其具有与经历突变Q4E/S/D/N和表2的那些突变的SEQIDNO:16至50至少90％同一性的氨基酸序列，或者具有与SEQIDNO:51至71至少90％同一性的氨基酸序列。
在图3A中例示了本发明的一个实施方案的基本元件的操作，该实施方案在滤板孔内的固体支持物上进行多核苷酸的酶促合成、多核苷酸产物从固体支持物上的切割和多核苷酸产物从切割反应组分的分离。具有多个反应室或孔(301)的合成板(300)以具有废物歧管(302)的分解视图(309)示出。反应室(301)的入口是合成板(300)顶部上的孔口。出口(从视图中隐藏)和过滤器(也从视图中隐藏)在合成板(300)的底部。在操作中，合成板(300)密封地连接到废物歧管(302)(例如通过夹紧)，使得每当通过管线(307)将真空(306)施加到废物歧管(302)的室(304)时，流体(试剂、洗涤溶液等)从反应室(301)通过过滤材料和出口被抽吸到废物歧管室(304)中，然后被抽吸到废物储库(308)中。包含多个反应室(301)的合成板(300)可以是例如可从商业制造商如Pall Corp.,Port Washington,NY获得的24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔或类似格式的常规过滤板。这种过滤板典型的反应体积可以用于本发明，例如对于96孔板为10-50μL，对于384孔板为3-10μL，对于1536孔板为0.5-3.0μL。流体输送系统(340)(由虚线矩形包围)通过在控制系统(350)的控制(351)下的泵和阀(330)的系统和位于流体输送和传感器台架(312)中的输送喷嘴(未示出)(也在控制系统(350)的控制(349)下)将试剂(331-339)输送至合成板(300)的反应室(301)。台架(312)中的液体输送喷嘴通过允许台架(312)在合成板(300)上移动的柔性管线(329)从阀和泵系统(330)接收试剂。在其它实施方案中，台架(312)可以具有移动到设备中不同位置处的不同站的能力，例如，用于在与另外废物歧管关联的另外反应板中进行反应。此外，在一些实施方案中，歧管(302)和合成板(301)可相对于台架(312)移动。台架(312)可以相对于合成板(300)的表面在x、y和z方向上移动(如图3A中的粗箭头所示)，或者合成板(300)也可以在x和y方向上移动，或者两个元件可以在x和y方向上彼此相对移动。
在一些实施方案中，液位传感器(未示出)位于流体输送和传感器台架(312)中。在一些实施方案中，在台架(312)中的喷嘴将预定量的流体输送至反应室(301)(其可以是偶联试剂(331-334)、去保护试剂(335)、洗涤溶液(337-338)、切割试剂(338)或分离试剂(339))之后，液位传感器简单地立即确认反应室(301)中的液位。如下文更全面描述的，可以通过多种技术实现切割的多核苷酸产物的分离。每种这样的技术可能需要不同的试剂来实施，所述试剂在本文中被称为“分离试剂”。例如，一些技术需要多核苷酸产物的沉淀，这可以用分离试剂异丙醇来完成。另一种分离试剂可以是水或Tris EDTA(TE)缓冲液，其可以用于从二氧化硅吸附剂洗脱吸附的DNA沉淀。在一些实施方案中，液位测量可以在完成到所有反应室(301)的试剂输送之后发生，或者检测可以与流体输送发生时同时发生但在不同的反应室发生。例如，在一些实施方案中，液位传感器的数目和位置以及台架(312)中流体输送喷嘴的数目和位置允许它们同时定位在同一合成板的不同组的反应室上方。在本发明的系统和设备的一些实施方案中，可以实施合成过程中的单独步骤，其中在施加真空以去除流体的同时，液位传感器测量一部分反应室中的流体去除速率。在这样的实施方案中，在一个循环内，在进行排空的每个反应室中进行多次液位测量，从而可以计算流体去除速率。如果速率低于预定水平，则控制系统(350)可以启动校正动作，如用低于预定水平的排空速率标记反应室并停止向其输送流体，或启动下文所述的其它补救动作。
在控制系统(350)的控制下，上述元件对多个多核苷酸中的每一个进行预定数量的合成步骤循环。控制系统(350)实施以下重复步骤：(i)启动流体输送系统(340)以在偶联条件下将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶(取决于多核苷酸的序列，331、332、333或334)输送至反应室(301)中的引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过3’-O保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段；(ii)启动流体输送系统(340)以将去保护溶液(335)输送至反应室(301)，使得3’-O-保护的延长片段去保护；以及(iii)启动废物歧管(302)以在反应室(301)和废物歧管(302)之间产生压差，以从反应室(301)中以预定速率(例如，由压差的大小确定)去除去保护溶液(335)。在一些实施方案中，可以通过经由废物歧管(302)施加真空以从反应室“拉动”流体，或通过在反应室的入口处施加正压以从反应室“推动”流体，或两者来获得压差。对于使用常规96孔合成板的实施方案，通常施加真空10-30秒以从孔中排空流体。在一些实施方案中，如使用96孔板的那些实施方案，流体去除的预定速率范围可以为1至100μL/sec、或者1至50μL/sec、或者0.5至30μL/sec。
在合成板(300)中合成多核苷酸之后，图3A的系统和设备进行从它们的合成支持物切割多核苷酸产物和从切割反应混合物分离切割的多核苷酸产物的步骤。图3B-3D示出了对于该实施方案如何完成这些步骤。图3B示出了在合成过程中但在切割和分离步骤之前合成板300的位置。也就是说，合成板(300)密封地安装在废物歧管(302)上，使得每当施加真空时，反应室(301)中的流体经由废物歧管(302)去除。在该实施方案中，切割发生在反应室(301)中，分离发生在DNA分离板(320)中。选择或设计DNA分离板，使得分离室(或孔)(321)与合成板(300)的反应室(301)空间对齐。在合成之后，该设备使用机器人装置将DNA分离板(320)放置在合成板300下方，使得合成板(300)和DNA分离板(320)都密封地安装在废物歧管302上。如下所述，切割和分离步骤可以以多种方式实现，其中的每一种可能需要本领域技术人员容易提供的稍微不同的设备组件。在一些实施方案中，可以在合成板(300)中实施切割，然后可以将板(300)的每个室的反应混合物移液至不同位置的分离板上，并且可以在不同位置或站实施DNA分离。在设备内不同位置的不同板中的这种分离可以(例如)根据所使用的特定DNA分离方案提供更好的产率或其它优点。在一些实施方案中，DNA分离板(320)可以基于Boom等人的美国专利5234809开发的分离技术，其中切割的多核苷酸用异丙醇沉淀并吸附到二氧化硅化合物如玻璃上。在这样的实施方案中，在切割之后，异丙醇被输送至反应室(101)，孵育，然后施加轻度真空以将每个反应室的反应混合物转移至DNA分离板(320)中紧邻其下方的分离室中。分离室的二氧化硅捕获沉淀的DNA，在洗涤之后，捕获的DNA可以从二氧化硅上洗脱下来，例如，与设备分开。
回到图3C，在控制系统(350)的控制(357)下的轨道(356)上的板移动器(354)抓住站A(310)处的废物歧管上的合成板(300)，并将其放置(360)在站B(360)处的DNA分离板(320)的顶部，之后，其抓住合成板(300)和来自站B(360)的分离板(320)，并将两个板放置(362)回到站A(310)处的废物歧管(302)上，如图3D所示，其中进行切割和分离步骤。板移动器(354)可以是包括板抓取器功能和板传送功能的常规实验室机器人，例如可以从诸如Hudson Robotics(NJ),Hamilton Microlab,TPA Motion,Beckman Coulter等的几个不同的制造商获得。板移动器(354)可以是通用机器人臂或具有限制移动的专用板移动器，如图所示。然后，台架(312)将切割试剂输送至合成板(300)的反应室(301)，并且在孵育之后，将异丙醇输送至反应室(301)以沉淀切割的多核苷酸产物。在孵育之后，通过废物歧管(302)施加轻度真空，以将含异丙醇的产物从反应室(301)抽吸到分离板(320)的对齐的分离室中。如上对于合成试剂，可以通过施加真空或通过施加正压使切割试剂和/或分离试剂移动通过分离板。
在一些实施方案中，系统和设备实施进一步的步骤，包括(i)测量反应产率，(ii)在测量产率之后，例如通过调节产物浓度，例如通过选择性稀释，使产物浓度正常化，(iii)测量反应室过滤器的堵塞或阻塞，并基于这样的测量采取补救动作，以及(iv)测量无模板聚合酶活性，并基于这样的测量采取补救动作，包括调节偶联反应的孵育时间和温度。
在与(iii)(监测过滤器堵塞)相关的一些实施方案中，可以通过控制系统(350)实施许多不同的校正动作，包括(a)在进行异常液位测量之后，可以绕过特定的反应室用于任何未来的试剂输送，(b)对于预定的循环数，可以永久地或暂时地增加真空强度或反应室和废物歧管之间的压差，(c)可以用蛋白水解酶溶液，如蛋白酶K处理反应室和/或其它流体通道以去除堵塞的蛋白质聚集体，或(d)可以采取校正动作的组合。关于(c)，控制系统(350)在进行合成循环期间监测液位传感器数据，并且如果液位传感器数据指示流体去除不充分(例如，如通过去除速率、排空或流体添加之后的最终水平等测量的)，则控制系统(350)可以(作为校正动作)插入一个或多个蛋白酶处理步骤。插入的蛋白酶处理步骤包括将蛋白酶溶液(370)分配至反应室(301)中，将反应室孵育预定的持续时间，例如30分钟、或1小时、或2小时(取决于蛋白酶、浓度和其它条件)，去除蛋白酶溶液，洗涤反应室。在蛋白酶处理步骤之后，重新开始合成循环。控制系统(350)可以被编程为每当在任何反应室中进行异常液位测量时插入蛋白酶处理步骤，或者它可以实施校正动作的组合。例如，第一校正动作可以是插入一个或多个蛋白酶处理步骤，第二校正动作可以是如果异常状态持续，则绕过具有异常液位测量值的反应室。示例性的蛋白酶处理步骤可以包括输送浓度范围为0.01至1.0mg/mL的蛋白酶K的溶液。
在与(i)和(iv)(浓度测量和活性测定)相关的一些实施方案中，每当测量的聚合酶活性低于预定水平时，偶联反应孵育时间可自动增加直至预定最大值。图3E-3H示出了一个实施方案，其中提供了用于测量聚合酶活性的其它试剂，并且其中在合成和分离之后测量多核苷酸产率。图3E显示了另外的组件，包括含有活性测定试剂的试剂储器(371)，提供用于保持和操作多孔板的位置的站C(374)和D(373)以及用于通过在260nm处的吸收来光学测量DNA浓度的分光光度计(375)。在合成完成之后，合成板(300)从站A移动到站B(在图3E中示出)。DNA分离板(320)和测量板(376)可以分别在站D(373)和站C(374)具有起始位置。测量板(376)可以是常规的板，其孔与分离板(320)的孔对齐，并且其被设计成从分离板(320)接收流体，特别是洗脱的DNA，并且允许对这种接收的DNA的浓度进行基于光学的测量。示例性的测量板可商购自例如Greiner Bio-One(Frickenhausen,DE)。在站A处的分离板(320)中已经切割和分离多核苷酸产物之后，将合成板(300)从站A(310)移动到站B(360)，并将分离板(320)从站A(310)移动到站D(373)，之后将测量板(376)从站C(374)移动(377)到站A(如图3F所示)，之后，将分离板(320)放置在测量板(376)的顶部(如图3G所示)。在从分离板(320)的分离孔中洗脱分离的DNA之后，将其移动(378)到站C(374)，并将测量板(376)移动到站D(373)，在那里将其随后插入(380)到分光光度计(375)中，在那里测量每个孔的浓度。用于测量DNA浓度或荧光发射的示例性分光光度计或荧光计(375)是Epoch微板分光光度计(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,VT)、Tecan infinite 200(Mannedorf,CH)或类似的仪器。这种仪器通常设计用于96孔板和384孔板。在一些实施方案中，测量板(376)可以返回到站A(310)，在那里可以测量液位，从而可以从测量的浓度确定DNA量。
如上所述，在一些实施方案中，本发明的系统和设备在合成多个多核苷酸之前测量无模板聚合酶的核苷酸偶联活性。在一些实施方案中，这种测定可以使用图3E-3H的实施方案在控制系统(350)的任选程序的控制下在标准合成板的反应室的子集(即，在每个反应室中包含合成支持物和引发剂)中进行。在多核苷酸合成之前，将合成板(300)放置在站A(310)处的废物歧管(302)上，使得台架(312)能够将活性测定试剂(371)输送至一个或多个预定反应室(“测定孔”)中。在聚合酶与单体混合输送的实施方案中，然后每种混合物使用至少一个反应室，使得至少四个反应室专用于活性测量。在测量活性之后，用于测量的反应室不用于多核苷酸合成。对于使用基于BODIPY-ATP/Fe(III)的测定的实施方案，将包含BODIPY化合物和缓冲液的单个试剂输送至每个测定孔，之后输送含有聚合酶的dATP试剂(331)、dCTP试剂(332)、dGTP试剂(333)和dTTP试剂(334)。在预定的孵育之后，将合成板移动至用于荧光测量的分光光度计/荧光计，所述荧光测量被报告给控制系统(350)。如果测量的活性水平在预定范围内，则控制系统(350)将合成板返回到站A(310)以在非测定孔反应室中开始合成。如果一种或多种聚合酶活性低于预定水平，则控制系统(350)可以将偶联反应时间的持续时间延长直至预定的最大持续时间，以使合成过程中偶联产率最大化。或者，如果一个或多个活动低于预定水平，则控制系统(350)可以通过用户界面(352)向用户发出警告。
在本发明的其它实施方案中，可以为引发剂和单体提供正交的3’-O-保护基团，从而可以在同一个反应室中合成两种或更多种不同的多核苷酸，可以合成分支的多核苷酸，或者可以合成RNA-DNA嵌合多核苷酸。在图4A中示出了这种平行合成的一个实施方案。对应于不同寡核苷酸的两种不同的引发剂(471和472)以预定的比例连接到固体支持物(473)上，所述比例将导致合成所需比例的寡核苷酸。在一些实施方案中，引发剂的最3’的核苷酸可以是可切割的核苷酸。不同的3’-O-封闭基团表示为“x”(474)和“y”(476)。两种寡核苷酸可以一次一种地合成(如图4A所示)，或者它们可以通过在每隔一个延长步骤中交替延长寡核苷酸而同时合成。如图4A所示，使用“y”封闭基团的寡核苷酸整体被延长(478)以产生仍具有其3’-羟基封闭的第一延长产物(470)，之后(475)，使用“x”封闭基团的寡核苷酸被延长以产生第二延长产物(484)。在两个合成完成之后，可以去除两种封闭基团，并且通过切割可切割的核苷酸“Z”(485)从固体支持物(473)释放寡核苷酸。在一些实施方案中，用于在同一反应容器中合成两种或更多种寡核苷酸的方法可以通过以下步骤实施：(a)提供具有两种或更多种引发剂群体的一种或多种支持物，其中每一群体的引发剂通过可切割的连键或可切割的核苷酸终止，所述可切割的核苷酸具有通过与每种其它引发剂群体的3’-O-封闭基团的解封闭条件正交的解封闭条件能去除的群体特异性的3’-O-封闭基团；(b)解封闭引发剂群体或延长片段的群体特异性封闭基团以形成具有游离3’-羟基的引发剂或延长片段；(c)在延长条件下使具有游离3’-羟基的引发剂群体或其延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和模板非依赖性DNA聚合酶接触，使得通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸来延长所述引发剂或延长的片段以形成3’-O-封闭的延长片段；以及(d)对每个引发剂群体重复步骤(b)和(c)，直到形成具有多种寡核苷酸的核苷酸序列的延长片段。多核苷酸产物可以从如下所述的引发剂中切割下来。在一些实施方案中，上述方法还包括以下步骤：(d)解封闭所述延长片段；以及(e)切割所述可切割的核苷酸或可切割的连键以释放延长的片段和/或两种或更多种寡核苷酸。
图4B中示出了用于在同一反应室中合成一种或两种多核苷酸的本发明的系统和设备的实施方案。如容易注意到的，该实施方案与图3A-3D的实施方案之间的关键区别在于对于每个正交保护化学物质存在两组合成试剂。下文描述了几对这种正交保护化学物质。图4B的实施方案的组件以与图3A-3D的实施方案的组件相同的方式起作用。即，具有包含具有两种不同引发剂(而不是一种)的合成支持物的反应室(401)的合成板(400)安装在废物歧管(402)上。在控制系统(450)的指令下的流体输送系统(440)根据上述循环经由阀和泵模块(430)以及流体输送和传感器台架(422)来输送合成试剂(411-415和416-420)，直到完成两种不同的多核苷酸。为了合成RNA-DNA嵌合多核苷酸，合成试剂(416-420)可以是RNA单体，并且可以与对RNA-DNA或RNA-RNA偶联具有特异性的无模板聚合酶组合。可以共用一些试剂，例如洗涤溶液、切割试剂和分离试剂(436-439)。在合成完成时，DNA分离板(432)和板移动器(454)如图3A-3D的实施方案所述起作用。
在图5A-5G中描述了本发明的系统和设备及其组件的另一个实施方案。图5A示出了本发明的设备的实施方案(500)中组件的布置。在该实施方案中，处理如下进行：在站A处合成之后，通过移液管(例如用于96孔合成板的96移液管库)将连接有多核苷酸产物的合成支持物转移至分离站C，在那里发生切割反应，之后使用相同的移液管库将切割反应混合物转移回站A，并沉积到DNA分离板中，在站A处该DNA分离板已经替换了合成板。同时，测量板已经安装在站B处的真空歧管上。在捕获切割的多核苷酸产物之后，将DNA分离板移动并安装在站B处测量板的顶部，在那里捕获的多核苷酸产物被洗脱到测量板中。然后将测量板移动并插入至分光光度计中，在那里测量浓度，然后将测量板移回站A，在那里，如果需要，将浓度标准化。
在其它实施方案中，站C可用于从站A处的合成板的预定反应孔汇集合成支持物，例如，用于增加选定多核苷酸的最终产物浓度。站C也可以用于汇集来自合成板的多核苷酸产物，用于使用分离-混合合成策略(split-and-mix synthesis strategy)在多核苷酸产物上合成随机寡核苷酸标签。
在图5A中，包含多个反应室的合成板(502)位于安装在废物歧管(504)顶部的站A(503)，每个反应室包含具有引发剂的合成支持物。与站A相邻的是包含真空歧管(506)的站B(505)，在该实施方案中，真空歧管(506)用于从分离板的孔中释放分离的或捕获的多核苷酸产物，并将其转移至安装在真空歧管(506)上其下方的测量板。在例如通过用户界面触摸屏(520)输入多核苷酸序列之后，在站A(503)处的合成板(502)中进行所有的合成循环，其中容纳在台架头(508)中的流体输送喷嘴(未示出)将偶联试剂、去保护试剂和洗涤溶液输送至反应室，之后也容纳在台架头(508)中的液位传感器测量每个孔中的液位。除了试剂输送喷嘴和液位传感器之外，台架头(508)还容纳96移液管库，用于将具有多核苷酸产物的合成支持物转移至站C(510)，然后将切割混合物从站C(510)转移回站A(503)。台架头(508)安装在台架(509)上并且能够在台架(509)上来回移动，如白色箭头(511)所示。台架(509)继而能够如轨道(515a)和(515b)上的白色箭头(512)所示来回移动，使得台架头(508)可以进入站A(503)、B(505)和C(510)。
在控制系统的控制下，通过由柔性管线(由PTFE(Teflon)或类似材料制成)连接到台架头(508)的储器、阀和泵的系统进行流体运动和输送。试剂储存柜(516)容纳偶联试剂、洗涤试剂、切割试剂、洗脱试剂和在设备上实施的合成方法的任何实施方案中使用的其它试剂。如其它附图所示，来自试剂储器的流体通过由控制系统控制的一系列的阀(未示出)和泵(518)传送，并被输送至流体输送喷嘴(未示出)用以分配至反应室中。这种阀组可以包括温度控制元件，以确保试剂在反应室中处于用于所需反应条件的预定温度。如上所述，在一个实施方案中，在台架头(508)中的移液管组将连接有多核苷酸产物的洗涤的合成支持物转移至站C(510)处的切割板(522)，之后通过台架头(508)的喷嘴将切割试剂分配至切割板(522)的反应室。在孵育之后，每当分离技术基于Boom(上文引用的)的沉淀/吸附方法时，然后加入异丙醇，使反应混合物中切割的多核苷酸产物沉淀。在实施切割反应时，板移动器(524)沿着轨道(526)移动，并在站A(503)和D(528)重新排列板，使得DNA分离板被放置在站A(503)，以及测量板被放置在站B(505)的真空歧管(506)的顶部。来自切割板(522)的孔的切割反应混合物通过台架头(508)的移液管组转移至现在安装在站A(503)处的废物歧管(504)上的DNA分离板的孔。在那里，将切割反应混合物通过DNA分离板的二氧化硅吸附材料抽吸，并将多核苷酸产物沉淀吸附到二氧化硅材料上。然后，板移动器(524)将DNA分离板移动到站B(505)，并将其放置在测量板的顶部。然后，台架(508)将洗脱溶液(例如水或TE)输送至DNA分离板的孔中，并将吸附的多核苷酸产物洗脱到测量板的孔中。在洗脱之后，板移动器(524)在站A(503)、B(505)和D(528)重新排列板，使得测量板被转移至站D(528)，在那里它被插入分光光度计(533)中以测量每种多核苷酸产物的浓度。在这种测量之后，将测量板从分光光度计(533)转移至台A(503)，在那里，根据需要将另外的流体(例如洗脱缓冲液)加入至孔中以使所有孔中的浓度标准化或调节浓度以满足不同多核苷酸产物的用户指定的浓度值。
图5B中示出了设备(500)的俯视图。站A(503)、B(505)和C(510)相对于台架头(508)以及轨道(515a)和(515b)显示。组件(532)是冲洗站，流体分配喷嘴可以定位到该冲洗站以冲洗流体输送系统的管线。在试剂柜(516)中显示试剂瓶或储器(530)。显示了安装在试剂储器(530)和台架(508)之间的八个泵(518)的组。在图5C中显示了用于该实施方案的试剂储器分配。
图5D-5G显示了与台架头(508)关联的流体输送系统的组件的细节。图5D以侧视图(541)和俯视图(543)显示了分配歧管(536)以及八个泵与包括32个喷嘴(548)的分配喷嘴库(538)的关联。在该实施方案中，液位传感器库(540)与分配喷嘴库(538)刚性地安装在一起，作为容纳在台架头(508)中的单个单元(542)。分配歧管(536)的输出管线(549)被分组为对应于图5A和5B的八个泵(518)的八个组。图5E是分配歧管(536)的透视图，其显示了与出口(552)一一对应的32个阀(550)的组。分配歧管(536)和喷嘴(548)由刚性的、机械稳定且化学惰性的材料如聚醚醚酮(PEEK)或类似材料制成。图5F显示了如何在整个合成和随后的切割、分离和标准化步骤中将泵1-8分配给各种试剂。图5G是台架头(508)的横截面，其显示了分配歧管(536)、液位传感器库和喷嘴库(542)以及移液管库(556)的位置。
无模板酶促合成的方法
本发明的系统、设备和套件允许实施无模板酶促合成具有预定序列的多个多核苷酸的多种方法。普通技术人员有能力以明显的方式调整设备的组件，以适应多核苷酸的无模板酶促合成方法的不同实施方案。通常，无模板(或等效地，“不依赖模板的”)酶促多核苷酸合成的方法包括重复的步骤循环，如图1所示，在每个循环中，预定的核苷酸与引发剂或生长链偶联。以下参考文献中描述了无模板酶促合成的一般要素：Ybert等人,国际专利公开WO/2015/159023；Ybert等人,国际专利公开WO/2017/216472；Hyman,美国专利5436143；Hiatt等人,美国专利5763594；Jensen等人,Biochemistry,57:1821-1832(2018)；Mathews等人,Organic&Biomolecular Chemistry,DOI:0.1039/c6ob01371f(2016)；Schmitz等人,Organic Lett.,1(11):1729-1731(1999)。
提供了例如，连接到合成支持物(120)的具有游离3’-羟基(130)的引发剂多核苷酸(100)。如下文更充分描述的，合成支持物可以是可溶性支持物或固体支持物，如平面固体表面或珠粒，如磁珠、琼脂糖珠等。在有效地将3’-O保护的dNTP酶促掺入到引发剂多核苷酸(100)(或延长的引发剂多核苷酸)的3’端的条件(140)下，向引发剂多核苷酸(100)(或后续循环中的延长的引发剂多核苷酸)添加3’-O保护的dNTP和无模板聚合酶，如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或其变体(例如Ybert等人,WO/2017/216472；Champion等人,WO2019/135007)。该反应产生延长的引发剂多核苷酸，其3’-羟基被保护(160)。如果延长的序列未完成，则实施另一添加循环(180)。如果延长的引发剂多核苷酸含有竞争序列，则可以去除或去保护3’-O保护基团，并且可以从原始引发剂多核苷酸(182)切割所需序列。这种切割可以使用多种单链切割技术中的任何一种来进行，例如，通过在原始引发剂多核苷酸内的预定位置处插入可切割的核苷酸。示例性的可切割核苷酸可以是被尿嘧啶DNA糖基化酶切割的尿嘧啶核苷酸。如果延长的引发剂多核苷酸不包含完整的序列，则去除3’-O保护基团以暴露游离的3’-羟基(130)，并使延长的引发剂多核苷酸经历另一核苷酸添加和去保护循环。
如本文所用，“引发剂”(或等同术语，如“引发片段”、“引发剂核酸”、“引发剂寡核苷酸”等)通常是指在其末端具有游离3’-羟基的短寡核苷酸序列，其可以通过无模板聚合酶，如TdT进一步延长。在一个实施方案中，引发片段是DNA引发片段。在替代实施方案中，引发片段是RNA引发片段。在一些实施方案中，引发片段具有3-100个核苷酸，特别是3-20个核苷酸。在一些实施方案中，引发片段是单链的。在替代实施方案中，引发片段可以是双链的。在一些实施方案中，引发剂寡核苷酸可以通过其5’端连接至合成支持物；并且在其它实施方案中，引发剂寡核苷酸可以通过与直接连接至合成支持物的互补寡核苷酸形成双链体，例如，通过共价键而间接连接至合成支持物。在一些实施方案中，合成支持物是固体支持物，其可以是固体平面固体的离散区域，或者可以是珠粒。
在一些实施方案中，引发剂可以包括具有游离羟基的非核酸化合物，TdT可以将3’-O保护的dNTP偶联到该游离羟基上，例如Baiga,美国专利公开US2019/0078065和US2019/0078126。
在合成完成之后，可以通过切割从引发剂和合成支持物上释放具有所需核苷酸序列的多核苷酸。
为此目的可以使用多种可切割的连键或可切割的核苷酸。在一些实施方案中，切割所需多核苷酸在切割链上留下天然游离5’-羟基；然而，在替代实施方案中，切割步骤可留下部分，例如5’-磷酸，其可以在后续步骤中例如通过磷酸酶处理而去除。切割步骤可以以化学方法、热方法、酶促或通过光化学方法进行。在一些实施方案中，可切割的核苷酸可以是核苷酸类似物，如脱氧尿苷或8-氧代-脱氧鸟苷，它们被特定的糖基化酶(例如分别为尿嘧啶脱氧糖基化酶接着是核酸内切酶VIII和8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶)识别。在一些实施方案中，可以通过提供具有脱氧肌苷作为倒数第二个3’核苷酸的引发剂来完成切割，其可以在引发剂的3’端被核酸内切酶V切割，在释放的多核苷酸上留下5’-磷酸。在一些实施方案中，引发剂可以含有末端尿苷，使得在合成之后，通过用KOH或类似碱处理可以将所需的多核苷酸从引发剂上切割下来。用于切割单链多核苷酸的其它方法在以下参考文献中公开，这些参考文献通过引用并入：第5,739,386号、第5,700,642号和第5,830,655号美国专利；以及第2003/0186226号和第2004/0106728号美国专利公开；以及在Urdea和Horn的美国专利5367066中。
回到图1，在一些实施方案中，在每个合成步骤中，在3’-O保护的dNTP存在下，使用无模板聚合酶如TdT将有序序列的核苷酸偶联至引发剂核酸。在一些实施方案中，合成寡核苷酸的方法包括以下步骤：(a)提供具有游离3’-羟基的引发剂；(b)在3’-O保护的核苷三磷酸存在下，在延伸条件下使引发剂或具有游离3’-羟基的延伸中间体与无模板聚合酶反应，以产生3’-O保护的延伸中间体；(c)对延伸中间体去保护，以产生具有游离3’-羟基的延伸中间体；以及(d)重复步骤(b)和(c)，直到合成多核苷酸。(有时术语“延伸中间体”或“延长片段”或“生长链”可互换使用)。在一些实施方案中，引发剂提供为例如通过其5’端连接至固体支持物的寡核苷酸。上述方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及在去保护步骤之后的洗涤步骤。例如，反应步骤可以包括在预定的孵育期或反应时间之后例如通过洗涤去除未掺入的核苷三磷酸的子步骤。在一些实施方案中，这种预定的孵育期或反应时间的范围可以是30秒至30分钟、或1分钟至30分钟、或1分钟至15分钟、或1分钟至10分钟。
在一些实施方案中，在图1的合成循环完成之后，可以进行进一步的步骤以从固体支持物上切割完成的多核苷酸并纯化它们以供应用。这些进一步的步骤可以在阵列的反应室中进行，或者仍然连接至固体支持物上的多核苷酸可以转移到其它反应容器中以进行这些进一步的步骤。另外，一些切割方法可导致释放的产物，其仍需要修饰才能将其转化为可用的产物。例如，在“核酸内切酶V-肌苷”中，切割(如下所述)会留下5’-磷酸，对于一些应用必须将其去除。因此，可能需要进一步的磷酸酶处理步骤。
在一些实施方案中，合成循环可以表示如下：
合成循环的步骤
Figure BDA0004000217330000321
*这些仅是反应或洗涤时间。流体排空或去除可能需要另外的10-30秒。
如上所示，在一些实施方案中，偶联反应溶液保留在反应室中，并且在步骤(ii)中将解封闭溶液简单地加入其中。在一些实施方案中，洗涤步骤可以在偶联步骤之后和去保护步骤之前进行。
在特定实施方案中，可以在合成过程期间每个循环中或周期性地执行进一步的步骤。例如，如上所述，不时地，如果例如通过无模板聚合酶粘附到表面，如反应室壁、过滤器表面或孔而出现酶积累，从而导致抑制流体转移的阻塞，可以使用蛋白酶处理的步骤。反应时间或持续时间t1、t2和t3可根据特定实施方案广泛变化，其中例如使用不同的无模板聚合酶、反应温度、反应缓冲液、单体、去保护溶液等。
当合成支持物上的多核苷酸的预定序列包括反向互补子序列时，可以通过在反向互补区之间形成氢键来产生二级分子内或分子间结构。在一些实施方案中，选择环外胺的碱基保护部分以使受保护氮的氢不能参与氢键合，从而防止此类二级结构的形成。也就是说，可以使用碱基保护部分来防止氢键的形成，如在正常碱基配对中，例如核苷A和T之间以及G和C之间形成的氢键。在合成结束时，可以去除碱基保护部分并且可以将多核苷酸产物从固体支持物上切割下来，例如，通过将其从其引发剂上切割下来。
除了提供具有碱基保护基团的3’-O封闭的dNTP单体外，延长反应还可以使用热稳定的无模板聚合酶在较高的温度下进行。例如，可以使用在高于40℃具有活性的热稳定的无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以使用在范围为40-85℃具有活性的热稳定的无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以使用在范围为40-65℃具有活性的热稳定的无模板聚合酶。
在一些实施方案中，延长条件可以包括向延长反应混合物中添加抑制氢键合或碱基堆积的溶剂。这样的溶剂包括具有低介电常数的水混溶性溶剂，如二甲亚砜(DMSO)、甲醇等。同样，在一些实施方案中，延长条件可以包括提供离液剂，其包括但不限于正丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、尿素等。在一些实施方案中，延长条件包括存在二级结构抑制量的DMSO。在一些实施方案中，延长条件可以包括提供抑制二级结构形成的DNA结合蛋白，其中此类蛋白包括但不限于单链结合蛋白、解旋酶、DNA乙二醇酶等。
当使用碱基保护的dNTP时，图1的上述方法可以进一步包括去除碱基保护部分的步骤(e)，在酰基或脒保护基团的情况下，这可以(例如)包括用浓氨水处理。
上述方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及在去保护步骤之后的加帽步骤以及洗涤步骤。如上文提及的，在一些实施方案中，可以包括加帽步骤，其中未延伸的游离3’-羟基与防止加帽链的任何进一步延伸的化合物反应。在一些实施方案中，此类化合物可以是双脱氧核苷三磷酸。在其它实施方案中，具有游离3’-羟基的非延伸链可以通过用3’-核酸外切酶活性，例如Exo I处理它们来降解。例如，参见Hyman，美国专利5436143。同样，在一些实施方案中，可以处理未能解封闭的链以去除链或使其对进一步延伸呈惰性。
在一些实施方案中，延长步骤(有时也称为延伸步骤或偶联步骤)的反应条件可以包括以下：2.0μM纯化的TdT；125-600μM 3’-O封闭的dNTP(例如3’-O-NH2封闭的dNTP)；约10至约500mM二甲胂酸钾缓冲液(6.5至7.5的pH)和约0.01至约10mM二价阳离子(例如C℃12或MnC12)，其中延长反应可在50μL反应体积中在范围为RT至45℃的温度下进行3分钟。在其中3’-O封闭的dNTP是3’-O-NH2封闭的dNTP的实施方案中，解封闭步骤的反应条件可以包括以下：700mM NaNO2；1M乙酸钠(用乙酸调节pH值在4.8-6.5范围内)，其中解封闭反应可以在50μL体积中在范围为RT至45℃的温度下进行30秒至数分钟。可以用不含偶联反应组分(例如酶、单体、二价阳离子)的二甲胂酸盐缓冲液进行洗涤。
在一些实施方案中，RNA合成可以通过与上述类似的步骤完成，但是使用专门选择用于RNA合成的无模板聚合酶和单体，例如如Heinisch等人，国际专利公开WO2021/018919中所述。例如，本发明的系统、设备和套件可以实施合成具有预定序列的多核糖核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供具有3’-末端核苷酸的引发剂，所述3’-末端核苷酸具有游离3’-羟基；以及b)重复以下循环直到形成多核糖核苷酸：(i)在延长条件下使具有游离3’-羟基的引发剂或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和无模板聚合酶接触，使得通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸来延长所述引发剂或延长的片段，以形成3’-O-封闭的延长片段，以及(ii)解封闭所述延长片段以形成具有游离3’-羟基的延长片段；其中所述无模板聚合酶是聚(A)聚合酶(PAP)或聚(U)聚合酶。在进一步的实施方案中，引发剂可以通过5’端连接到支持物上，所述支持物可以是固体支持物，并且上述方法可以包括从引发剂切割多核苷酸的步骤。在一些实施方案中，使用PAP或PUP进行延伸或延长步骤的反应条件可以包括以下：反应条件1(对于引物+AM-RATP)：250μM AM-rATP，0.1μM ATTO488-(rA)5，1μM PAP，1×ATP缓冲液(20mM Tris-HCl,0.6mM MnCl2,0.02mM EDTA,0.1％BSA,10％甘油，100mM咪唑，pH7-8)，37℃，30分钟。反应条件2(对于引物+AM-rGTP)：250uM rGTP,0.1uM ATTO488-(rA)5,1uM PAP,1x GTP缓冲液(0.6mM MnCl2,0.1％ BSA,10mM咪唑,pH 6),37℃,30分钟。在上文中，“AM-rNTP”是指3’-叠氮基甲基-O-核糖核苷三磷酸。用于本发明的许多3’-O-封闭的rNTP可以购自商业供应商(例如Jena Bioscience,MyChemLabs等)或使用公布的技术合成，例如美国专利7057026；国际专利公布WO2004/005667、WO91/06678；Canard等人，Gene(上文引用)；Metzker等人，Nucleic Acids Research,22:4259-4267(1994)；Meng等人，J.Org.Chem.,14:3248-3252(3006)；美国专利公布2005/037991；Zavgorodny等人,Tetrahedron Letters,32(51):7593-7596(1991)。在进一步的特定实施方案中，3’-封闭的核苷三磷酸被3’-O-炔丙基、3’-O-叠氮基甲基、3’-O-NH2或3’-O-烯丙基封闭。在其它实施方案中，本发明的3’-O-封闭基团包括3’-O-甲基、3’-O-(2-硝基苄基)、3’-O-烯丙基、3’-O-胺、3’-O-叠氮基甲基、3’-O-叔丁氧基乙氧基、3’-O-(2-氰基乙基)和3’-O-炔丙基。
合成支持物
在由本发明的系统和设备实现的方法中可以使用多种合成支持物。当诸如在洗涤步骤中去除不希望的反应物时，通过提供保留连接的前体的手段，合成支持物允许在所需多核苷酸产物的中间体或前体上进行多个反应，特别是偶联反应的循环。合成支持物的一个重要特征是在流体去除步骤期间，支持物和连接的前体或产物被反应室的过滤器保留。合成支持物的其它有用特征包括无模板聚合酶对连接的产物前体的可及性、不与反应物或前体(物理地，例如通过吸附，或化学地)相互作用的组合物、允许引发剂容易连接的组合物、在所用试剂中的良好溶解度等。合成支持物包括但不限于可溶性支持物，如聚合物支持物，包括聚乙二醇(PEG)支持物、树状物支持物等；不可溶胀的固体支持物，如聚苯乙烯颗粒，Dynabeads等；可溶胀的固体支持物，如树脂或凝胶，包括琼脂糖。合成支持物也可以形成反应室的一部分，如滤膜。用于选择可溶性支持物的指导见于参考文献Bonora等人,Nucleic Acids Research,212(5):1213-1217(1993)；Dickerson等人,Chem.Rev.102:3325-3344(2002)；Fishman等人,J.Org.Chem.,68:9843-9846(2003)；Gavert等人,Chem.Rev.97:489-509(1997)；Shchepinov等人,Nucleic Acids Research,25(22):4447-4454(1997)和类似的参考文件。用于选择固体支持物的指导见于Brown等人,Synlett 1998(8):817-827；Maeta等人,美国专利9045573；Beaucage和Iyer,Tetrahedron,48(12):2223-2311(1992)等。用于将寡核苷酸连接到固体支持物的指南见于Arndt-Jovin等人,Eur.J.Biochem.,54:411-418(1975)；Ghosh等人,Nucleic Acids Research,15(13):5353-5372(1987)；Integrated DNA Technologies,“Strategies for attachingoligonucleotides to solid supports,”2014(v6)；Gokmen等人,Progress in PolymerScience 37:365-405(2012)和类似的参考文献。
在一些实施方案中，固相支持物通常由树脂或凝胶形式的小多孔珠粒或颗粒组成。许多材料适合作为合成多核苷酸的固相支持物。如上文提及的，这种支持物应该提供良好的进出其孔的传质，是化学惰性的，受试剂和溶剂的影响最小，并且允许多核苷酸、引发剂和多核苷酸产物的衍生、连接和去除。如本文所用，术语“颗粒”包括但不限于“微粒”或“纳米颗粒”或“珠粒”或“微珠”或“微球体”。可用于本发明的颗粒或珠粒包括，例如，直径测量为10至300微米、或20至300微米、或30至300微米的珠粒，或者直径测量大于300微米的珠粒。颗粒可以由玻璃、塑料、聚苯乙烯、树脂、凝胶、琼脂糖、琼脂糖凝胶和/或其它合适的材料制成。特别感兴趣的是多孔树脂颗粒或珠粒，如琼脂糖珠。示例性的琼脂糖颗粒包括SepharoseTM珠粒。在一些实施方案中，直径范围为40-165μm的溴化氰活化的4％交联的琼脂糖珠可以用于本发明实施的方法中。在其它实施方案中，直径范围为200-300μm的溴化氰活化的6％交联的琼脂糖珠可以用于本发明实施的方法中。在后两个实施方案中，具有5’-氨基连接子的寡核苷酸引发剂可以偶联到SepharoseTM珠粒上，以用于本发明。用于琼脂糖珠的其它所需连接子包括硫醇和环氧连接子。
颗粒可以被官能化以共价连接分子、细胞、其它颗粒或其它材料。可以连接的示例性分子包括合成反应的中间体化合物(或最终化合物)。如本领域技术人员将理解的，颗粒的官能化将取决于要进行的合成反应。固体支持物表面，如具有化学反应性基团如硫醇、胺、羧基等的某些聚合物的官能化在本领域中通常是已知的。用于在合成反应期间随后添加结构单元的这些表面化学的一些实例包括但不限于氨基，包括脂肪族胺和芳香族胺，羧酸，醛，酰胺，氯甲基，酰肼，羟基，磺酸盐和磷酸盐。通常使用已知的化学方法，包括但不限于使用氨基官能化支持物、巯基连接子等，可以将这些官能团用于将任何数目的不同结构单元部分加入至颗粒中。有许多本领域已知的巯基反应性连接子，如SPDP、马来酰亚胺、o-卤代乙酰基和吡啶基二硫化物等。类似地，可以使用连接子连接结构单元上和表面上的氨基；例如，大量稳定的双官能基团是本领域熟知的，包括同双官能和异双官能连接子(例如参见Hemanson(上文引用的))。在另一个实施方案中，羧基(来自表面或来自结构单元)可以使用熟知的连接子衍生。例如，碳二亚胺活化羧基以被良好的亲核试剂如胺攻击(参见Torchilin等人,Critical Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems,7(4):275-308(1991))。
在一些实施方案中，多孔树脂支持物的平均孔径为至少10nm、或至少20nm、或至少50nm。在其它实施方案中，多孔树脂支持物的平均孔径范围为10nm-500nm、或50nm-500nm。
在一些实施方案中，如在图3A-3H和5A-5G中描述的那些实施方案，使用96孔合成板和琼脂糖珠作为合成支持物，切割的20-60mer多核苷酸产物的每孔产率范围可以为引发剂加载量的50-70％。因此，如果合成支持物包含100pmole引发剂，则切割产物的范围为50-70pmole。
3’-O-保护的核苷三磷酸
取决于特定的应用，解封闭和/或切割的步骤可以包括多种化学或物理条件，例如光、热、pH、特定试剂的存在，如能够切割特定化学键的酶。选择3’-O封闭基团和相应的解封闭条件的指导可以见于以下参考文献，这些参考文献通过引用并入：Benner,美国专利7544794和8212020；美国专利5808045；美国专利8808988；国际专利公开WO91/06678；以及下文引用的参考文献。在一些实施方案中，切割剂(有时也称为解封闭剂或试剂)是化学切割剂，诸如例如二硫苏糖醇(DTT)。在替代实施方案中，切割剂可以是酶切割剂，诸如例如磷酸酶，其可以切割3’-磷酸封闭基团。本领域技术人员将理解，解封闭剂的选择取决于所使用的3’-核苷酸封闭基团的类型、是否使用一个或多个封闭基团、引发剂是否连接至活细胞或有机体或者连接至固体支持物等，其使得需要温和处理。例如，膦，如三(2-羧乙基)膦(TCEP)可用于切割3’O-叠氮基甲基，钯络合物可用于切割3’O-烯丙基，或者亚硝酸钠可用于切割3’O-氨基。在特定实施方案中，切割反应涉及TCEP、钯络合物或亚硝酸钠。
如上所述，在一些实施方案中，希望使用两个或更多个封闭基团，这些封闭基团可以使用正交解封闭条件来去除。以下示例性的封闭基团对可用于平行合成实施方案中。应当理解，其它封闭基团对或含有多于两个的基团可获得而用于本发明的这些实施方案中。
Figure BDA0004000217330000381
在一些实施方案中，特定的酶促可去除的封闭基团需要特定的酶来去除。例如，基于酯或酰基的封闭基团可以用酯酶如乙酰酯酶或类似酶去除，并且磷酸封闭基团可以用3’磷酸酶如T4多核苷酸激酶去除。例如，可以通过用100mM Tris-HCl(pH 6.5)、10mM MgCl2、5mM 2-巯基乙醇和一个单位的T4多核苷酸激酶的溶液处理来去除3’-O-磷酸。反应在37℃的温度下进行一分钟。
3’-O-酯保护的dNTP或3’-O-磷酸保护的dNTP的合成和酶促去保护的其它实例在以下参考文献中描述：Canard等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,92:10859-10863(1995)；Canard等人,Gene,148:1-6(1994)；Cameron等人,Biochemistry,16(23):5120-5126(1977)；Rasolonjatovo等人,Nucleosides&Nucleotides,18(4&5):1021-1022(1999)；Ferrero等人,Monatshefte fur Chemie,131:585-616(2000)；Taunton-Rigby等人,J.Org.Chem.,38(5):977-985(1973)；Uemura等人,Tetrahedron Lett.,30(29):3819-3820(1989)；Becker等人,J.Biol.Chem.,242(5):936-950(1967)；Tsien,国际专利公开WO1991/006678。
在一些实施方案中，修饰的核苷酸包含修饰的核苷酸或核苷分子，其包含嘌呤或嘧啶碱基和具有与其共价连接的可去除的3’-OH封闭基团的核糖或脱氧核糖糖部分，使得3’碳原子连接有一组结构：
-O-Z
其中–Z是–C(R’)2-O-R”、-C(R’)2-N(R”)2、-C(R’)2-N(H)R”、-C(R’)2-S-R”和–C(R’)2-F中的任一个，其中每个R”是可去除的保护基团或者是可去除的保护基团的一部分；每个R’独立地是氢原子、烷基、取代的烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰氨基，或通过连接基团连接的可检测标记物；条件是在一些实施方案中，此类取代基具有多达10个碳原子和/或多达5个氧或氮杂原子；或(R’)2表示一组式＝C(R”’)2，其中每个R”’可以相同或不同，并且选自氢和卤素原子以及烷基，条件是在一些实施方案中，每个R’”的烷基具有1-3个碳原子；并且其中所述分子可以反应以产生中间体，其中每个R”被交换为H，或者，其中Z是–(R’)2-F，F被交换为OH、SH或NH2，优选OH，所述中间体在水性条件下解离以得到具有游离3’-OH的分子；条件是其中Z是–C(R’)2-S-R”，两个R’基团都不是H。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的R’是烷基或取代的烷基，条件是这样的烷基或取代的烷基具有1-10个碳原子和0-4个氧或氮杂原子。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的-Z具有式–C(R’)2-N3。在某些实施方案中，Z是叠氮基甲基。
在一些实施方案中，Z是分子量为200或更小的具有或不具有杂原子的可切割有机部分。在其它实施方案中，Z是分子量为100或更小的具有或不具有杂原子的可切割有机部分。在其它实施方案中，Z是分子量为50或更小的具有或不具有杂原子的可切割有机部分。在一些实施方案中，Z是分子量为200或更小的具有或不具有杂原子的酶促可切割的有机部分。在其它实施方案中，Z是分子量为100或更小的具有或不具有杂原子的酶促可切割的有机部分。在其它实施方案中，Z是分子量为50或更小的具有或不具有杂原子的酶促可切割的有机部分。在其它实施方案中，Z是具有200或更小的分子量的酶促可切割的酯基团。在其它实施方案中，Z是被3’-磷酸酶可去除的磷酸基团。在一些实施方案中，以下3’-磷酸酶中的一种或多种可以与制造商推荐的方案一起使用：T4多核苷酸激酶、小牛肠碱性磷酸酶、重组虾碱性磷酸酶(例如可从New England Biolabs,Beverly,MA获得的)。
在其它实施方案中，3’-封闭的核苷三磷酸被3’-O-叠氮基甲基、3’-O-NH2或3’-O-烯丙基封闭。
在其它实施方案中，本发明的3’-O封闭基团包括3’-O-甲基、3’-O-(2-硝基苄基)、3’-O-烯丙基、3’-O-胺、3’-O-叠氮基甲基、3’-O-叔丁氧基乙氧基、3’-O-(2-氰基乙基)和3’-O-炔丙基。
在一些实施方案中，3’-O保护基团是电化学不稳定的基团。也就是说，保护基团的去保护或切割是通过改变导致切割的保护基团附近的电化学条件来完成的。电化学条件的这种变化可以通过改变或施加物理量如电压差或光以激活辅助物质而引起，所述辅助物质继而会导致保护基团位点处电化学条件的变化，如pH升高或降低。在一些实施方案中，电化学不稳定的基团包括例如pH敏感保护基团，每当pH改变至预定值时切割所述pH敏感保护基团。在其它实施方案中，电化学不稳定的基团包括保护基团，每当例如通过增加或减少保护基团位点处的电压差改变还原或氧化条件时，直接切割所述保护基团。
没有碱基保护的3’-O封闭的dNTP可以从商业供应商处购买或使用公开的技术合成，例如美国专利7057026；Guo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,105(27):9145-9150(2008)；Benner,美国专利7544794和8212020；国际专利公开WO2004/005667、WO91/06678；Canard等人,Gene(本文引用的)；Metzker等人,Nucleic Acids Research,22:4259-4267(1994)；Meng等人,J.Org.Chem.,14:3248-3252(2006)；美国专利公开2005/037991。可以按如下所述合成具有碱基保护的3’-O封闭的dNTP。
无模板聚合酶
多种不同的无模板聚合酶可用于本发明的系统和设备的合成实施的方法中。无模板聚合酶包括但不限于例如以下参考文献中描述的polX家族聚合酶(包括DNA聚合酶β、λ和μ)、聚(A)聚合酶(PAP)、聚(U)聚合酶(PUP)、DNA聚合酶θ等：Ybert等人,国际专利公开WO2017/216472；Champion等人,美国专利10435676；Champion等人,国际专利公开WO2020/099451；Yang等人,J.Biol.Chem.,269(16):11859-11868(1994)；Motea等人,Biochim.Biophys.Acta,1804(5):1151-1166(2010)。特别地，末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)及其变体可用于无模板DNA的合成。在一些实施方案中，基于诸如偶联反应效率、可制造性、保存期、最小回转半径和缺乏自聚集和对表面的粘附的特性来选择无模板聚合酶。在一些实施方案中，无模板聚合酶是针对偶联效率、最小回转半径和缺乏自聚集和对表面的粘附而特异性选择的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，如M96(SEQIDNO:68或69)和M103(SEQIDNO:70或71)。
在一些实施方案中，酶促合成方法使用TdT变体，相对于3’-O-修饰的核苷三磷酸，所述TdT变体显示增加的掺入活性。例如，这样的TdT变体可以使用Champion等人,美国专利10435676中描述的技术产生，该专利通过引用并入本文中。在一些实施方案中，使用TdT变体，其具有与SEQ ID NO:2至少60％相同或至少80％相同的氨基酸序列以及在位置207处的第一个精氨酸的取代和在位置325处的第二个精氨酸的取代，或者其功能上等效的残基。在一些实施方案中，使用TdT变体，其具有与选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，相对于SEQ ID NO2、3、4、6、7、9、12和13在位置207处，相对于SEQ ID NO 5在位置206处，相对于SEQ ID NO8和10在位置208处，相对于SEQ ID NO 11在位置205处，相对于SEQ ID NO 14在位置216处，以及相对于SEQ ID NO15在位置210处具有精氨酸(“第一精氨酸”)的取代；以及相对于SEQ ID NO2、9和13在位置325处，相对于SEQ ID NO3和4在位置324处，相对于SEQ ID NO 320在位置320处，相对于SEQID NO6和8在位置331处，相对于SEQ ID NO 11在位置323处，相对于SEQ ID NO12和15在位置328处以及相对于SEQ ID NO 14在位置338处的精氨酸(“第二精氨酸”)的取代；或者其功能上等效的残基；其中所述TdT变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，并且(ii)能够在核酸片段的游离3’-羟基上掺入3’-O修饰的核苷酸。在一些实施方案中，上述同一性值百分比为与所示SEQ ID NO至少80％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为与所示SEQ ID NO至少90％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为与所示SEQ IDNO至少95％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为至少97％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为至少98％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为至少99％相同。如本文所用，用于比较参考序列与变体序列的同一性值百分比不包括明确指定的含有变体序列取代的氨基酸位置；也就是说，同一性关系百分比是在参考蛋白质的序列和在变体中包含取代的明确指定位置之外的变体蛋白质的序列之间。因此，例如，如果参考序列和变体序列各自包含100个氨基酸并且变体序列在位置25和81处具有突变，则同源性百分比将是关于序列1-24、26-80和82-100。
关于(ii)，此类3’-O修饰的核苷酸可以包含3’-O-NH2-核苷三磷酸、3’-O-叠氮基甲基-核苷三磷酸、3’-O-烯丙基-核苷三磷酸、3’O-(2-硝基苄基)-核苷三磷酸或3’-O-炔丙基-核苷三磷酸。
在一些实施方案中，上述TdT变体在第一和第二精氨酸处具有取代，如表1中所示。
表1
Figure BDA0004000217330000431
在一些实施方案中，用于本发明的方法的其它TdT变体包括甲硫氨酸、半胱氨酸或谷氨酸的取代中的一种或多种，如表1中所示。
本发明系统的一些实施方案包括使用在截短序列的N-末端具有稳定突变的N-末端截短的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体。也就是说，在一些实施方案中，本发明的系统使用具有最小化尺寸和回转半径的紧凑TdT变体，这允许TdT变体比野生型TdT或现有的TdT变体更容易地进入多孔固体支持物和树脂的内部空间。在一些实施方案中，N-末端截短的TdT变体的稳定突变位于位置Q152(其中氨基酸位置号是相对于全长小鼠TdT(SEQID NO:1))，或位于其它TdT氨基酸序列中功能上等同的位置。在一些实施方案中，用于本发明的TdT变体包含末端或内部亲和标签，以促进纯化并最小化其回转半径。在一些实施方案中，用于本发明的设备的这种稳定的截短的TdT具有与SEQ ID NO:16-30、32、35、37、39、41、43、45、46、49或50的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且经受表2的进一步突变。
表2
Figure BDA0004000217330000441
在另外的实施方案中，用于本发明设备的TdT变体选自具有SEQ ID NO:31、33、34、36、38、40、42、44、47、48或51-71的氨基酸序列的TdT变体。在一些实施方案中，这种TdT变体具有SEQ ID NO 56、57、68、69、70或71的氨基酸序列。
如上所述的本发明的TdT变体各自包含与经受指定取代存在的指定SEQ ID NO具有序列同一性百分比的氨基酸序列。在一些实施方案中，以这种方式描述的本发明的TdT变体与指定的SEQ ID NO之间的序列差异的数目和类型可能是由于取代、缺失和/或插入，并且取代、缺失和/或插入的氨基酸可以包括任何氨基酸。在一些实施方案中，此类缺失、取代和/或插入仅包括天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，取代仅包括保守的或同义的氨基酸变化，如Grantham,Science,185:862-864(1974)中所述。也就是说，氨基酸的取代只能发生在其同义氨基酸组的成员中。在一些实施方案中，可以使用的同义氨基酸组列于表3A中。
表3A
氨基酸的同义组I
Figure BDA0004000217330000451
在一些实施方案中，可以使用的同义氨基酸组列于表3B中。
表3B
氨基酸的同义组II
Figure BDA0004000217330000461
用于在自动合成仪上实施多个多核苷酸的酶促合成的套件
在一个方面，本发明的套件包括适用于本发明的系统和设备的特定实施方案的消耗品。在一些实施方案中，本发明的套件包含多个反应室的平面阵列，每个反应室具有常规96孔或384孔过滤板形式的连接有引发剂的合成支持物，其中沉积在每个孔中的是在粘性湿润剂溶液中的预定量的合成支持物。在一些实施方案中，这种合成支持物进一步真空包装在塑料、箔或其它气密不可渗透的包装材料中。在一些实施方案中，湿润剂溶液的粘度等于40-60％(v/v)甘油：水溶液。在一些实施方案中，湿润剂溶液包含选自以下的湿润剂：甘油、醇糖、乙基己基甘油、泛醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、己二醇、丁二醇、乳酸钠、透明质酸和聚右旋糖。在一些实施方案中，包含这种多个反应室的平面阵列的套件还包含用于测量合成试剂的TdT活性的活性测定试剂，所述合成试剂包括由所述设备实施的方法中使用的TdT和3’-O-保护的dNTP中的每一种的混合物。在一些实施方案中，活性测定试剂包含通过Fe(III)淬灭的BODIPY标记的dATP单体。
在另一个方面，本发明的套件包含试剂筒，其在多个不同的隔室或储器中含有合成试剂，用于实施预定数目的偶联反应循环，以产生预定的多个多核苷酸，每个多核苷酸达到最大产量和最大长度。在一些实施方案中，这种试剂筒还可以包括蛋白酶溶液，用于在液位传感器检测到一个或多个反应室中的异常液位或液位的变化率时实施蛋白酶处理步骤。在一些实施方案中，这种试剂筒包含至少四个储库，每个储库包含偶联试剂，所述偶联试剂包含TdT和3’-O-保护的-dATP、TdT和3’-O-保护的-dCTP、TdT和3’-O-保护的-dGTP，以及TdT和3’-O-保护的-dTTP。在一些实施方案中，每个储库含有足够的偶联试剂，以合成产率为100pmol或更少的至少96个多核苷酸，其中每个多核苷酸具有高达200个核苷酸的长度，并且其中所有多核苷酸中每种核苷酸的核苷酸组成范围为20-30％。在一些实施方案中，这种试剂筒包含至少五个储器，每个储器包含含有TdT和3’-O-保护的-dATP、TdT和3’-O-保护的-dCTP、TdT和3’-O-保护的-dGTP和TdT、3’-O-保护的-dTTP的偶联剂试剂以及一个储器含有去保护试剂。在一些实施方案中，这种偶联试剂包含TdT和3’-O-氨基-dATP、TdT和3’-O-氨基-dCTP、TdT和3’-O-氨基-dGTP以及TdT和3’-O-氨基-dTTP。在其它实施方案中，这种偶联试剂包含TdT和3’-O-叠氮基甲基-dATP、TdT和3’-O-叠氮基甲基-dCTP、TdT和3’-O-叠氮基甲基-dGTP以及TdT和3’-O-叠氮基甲基-dTTP。
在一些实施方案中，这种试剂筒包含至少6个储器，每个储器包含含有TdT和3’-O-保护的-dATP、TdT和3’-O-保护的-dCTP、TdT和3’-O-保护的-dGTP以及TdT，3’-O-保护的-dTTP的偶联试剂，一个储器含有去保护试剂以及一个储器含有蛋白酶溶液。在一些实施方案中，这种偶联试剂包含TdT和3’-O-氨基-dATP、TdT和3’-O-氨基-dCTP、TdT和3’-O-氨基-dGTP、TdT和3’-O-氨基-dTTP，氨基去保护试剂和蛋白酶溶液。在其它实施方案中，这种偶联试剂包含TdT和3’-O-叠氮基甲基-dATP、TdT和3’-O-叠氮基甲基-dCTP、TdT和3’-O-叠氮基甲基-dGTP、TdT和3’-O-叠氮基甲基-dTTP、叠氮基甲基去保护试剂和蛋白酶溶液。在一些前述实施方案中，蛋白酶溶液包含蛋白酶K。
定义
除非本文另有具体定义，否则本文使用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论文和教科书的那些，例如Kornberg和Baker,DNAReplication,第二版(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry,第二版(Worth Publishers,New York,1975)；Strachan和Read,Human Molecular Genetics,第二版(Wiley-Liss,New York,1999)。
关于两种或更多种不同TdT中的氨基酸位置的“功能上等效的”意指(i)各个位置处的氨基酸在TdT的活性中发挥相同的功能作用，并且(ii)氨基酸出现在各个TdT的氨基酸序列中的同源氨基酸位置处。基于序列比对和/或分子建模，可以鉴定两种或更多种不同TdT的氨基酸序列中位置上等效的或同源的氨基酸残基。在一些实施方案中，功能上等效的氨基酸位置属于在进化相关物种，例如，属、科等的TdT的氨基酸序列中保守的低效率基序。此类保守的低效率基序的实例描述于Motea等人,Biochim.Biophys.Acta.1804(5):1151-1166(2010)；Delarue等人,EMBO J.,21:427-439(2002)以及类似参考文献中。
“套件”是指用于输送用于实施由本发明的系统或设备实施的方法的材料或试剂的任何输送系统，如包装。在一些实施方案中，消耗品材料或试剂在本文称为“套件”的包装中被输送至本发明的系统或设备的用户。在本发明的系统和设备的上下文中，这种输送系统通常包括包装方法和材料，其允许储存、运输或输送可能具有容易损坏或污染的组件(如合成支持物)的诸如合成板的材料，。例如，套件可以包括一个或多个含有合成板和/或支持材料的外壳(例如盒子)。这种内容物可以一起或分开输送至预期的接受者。例如，第一个容器可以在保护性塑料材料中真空包裹的每个孔包含具有合成支持物的合成板，而第二个或更多个容器包含3’-O-可逆封闭的dNTP和无模板聚合酶及缓冲液。
可互换使用的“突变体”或“变体”是指来源于本文所述的天然或参考TdT多肽，并且在一个或多个位置处包含修饰或改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。变体可以通过本领域熟知的各种技术获得。特别地，用于改变编码野生型蛋白质的DNA序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变、序列改组和合成寡核苷酸构建。诱变活性在于缺失、插入或取代蛋白质，或者在本发明的情况下聚合酶序列中的一个或几个氨基酸。以下术语用于指定取代：L238A表示参考或野生型序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，L)变为丙氨酸(A)。A132V/I/M表示亲本序列的位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，A)被下列氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或蛋氨酸(M)。取代可以是保守或非保守取代。保守取代的实例位于以下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用并且各自意指核苷酸单体的线性聚合物或其类似物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用的规则模式，如Watson-Crick类型的碱基配对、碱基堆叠、Hoogsteen或反向Hoogsteen类型的碱基配对等特异性结合天然多核苷酸。此类单体及其核苷间连键可以是天然存在的或可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包括PNA、硫代磷酸酯核苷间连键、含有允许连接标记物如荧光团或半抗原的连接基团的碱基等。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶促加工，如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等时，普通技术人员将理解在那些情况下寡核苷酸或多核苷酸将不包含在任何或一些位置处的核苷间连键的某些类似物、糖部分或碱基。多核苷酸的大小范围通常从一些单体单元开始，例如5-40，此时它们通常被称为“寡核苷酸”，到几千个单体单元。每当多核苷酸或寡核苷酸由字母序列(大写或小写)表示时，如“ATGCCTG”，应理解核苷酸从左到右按5’-3’的顺序排列，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷，除非另有说明或从上下文中显而易见。除非另有说明，否则术语和原子编号约定将遵循Kornberg和Baker,DNA Replication,第二版(W.H.Freeman,1992)或类似参考文献中公开的那些。通常多核苷酸包含通过磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如对于DNA为脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷，或对于RNA为它们的核糖对应物)；然而，它们也可以包含非天然核苷酸类似物，例如包括修饰的碱基、糖或核苷间连键。本领域技术人员清楚，酶对活性具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物要求，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，然后针对寡核苷酸或多核苷酸底物选择合适的组成完全在普通技术人员的知识范围内，尤其是在来自论文的指导下，如Sambrook等人,Molecular Cloning,第二版(ColdSpring Harbor Laboratory,New York,1989)和类似参考资料。同样，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸及其相应互补物的双链体)。从术语使用的上下文中普通技术人员将清楚旨在是哪种形式或是否为两种形式。
“序列同一性”是指两个序列，如两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的匹配(例如，相同的氨基酸残基)的数量(或分数，通常表示为百分比)。序列同一性是通过在比对时比较序列来确定的，以使重叠和同一性最大化，同时使序列空位最小化。特别地，序列同一性可以使用许多数学全局或局部比对算法中的任何一种来确定，这取决于两个序列的长度。相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch,1970)比对，所述全局比对算法在整个长度上最佳地比对序列，而基本上不同长度的序列优选使用局部比对算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman,1981)或Altschul算法(Altschul等人,1997；Altschul等人,2005))进行比对。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可在互联网网站如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或ttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/上获得的公开可用的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，氨基酸序列同一性％值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle生成的值，该程序使用Needleman-Wunsch算法创建两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数都设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开头(Gap open)＝10，空位延长＝0.5，末端空位罚分＝错误，末端空位开头＝10和末端空位延长＝0.5。
“取代”意指一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。优选地，术语“取代”是指一个氨基酸残基被选自以下的另一个氨基酸残基取代：天然存在的标准20个氨基酸残基、罕见天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟基赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和非天然存在的氨基酸残基，通常是合成的，(例如环己基丙氨酸)。优选地，术语“取代”是指一个氨基酸残基被选自天然存在的标准20个氨基酸残基的另一氨基酸残基取代。符号“+”表示取代的组合。根据以下命名法，氨基酸在本文中通过它们的单字母或三字母代码表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：蛋氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。在本申请文件中，以下术语用于指定取代：L238A表示亲本序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，L)变为丙氨酸(A)。A132V/I/M表示亲本序列的位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，A)被下列氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或蛋氨酸(M)。取代可以是保守或非保守取代。保守取代的实例位于以下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
序列表
<110> DNA斯克瑞普特公司(DNA Script)
<120> 用于酶促多核苷酸合成的系统、设备和套件
<130> B3312PC00
<150> 20 180224.6
<151> 2020-06-16
<160> 71
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 510
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 1
Met Asp Pro Leu Gln Ala Val His Leu Gly Pro Arg Lys Lys Arg Pro
1 5 10 15
Arg Gln Leu Gly Thr Pro Val Ala Ser Thr Pro Tyr Asp Ile Arg Phe
20 25 30
Arg Asp Leu Val Leu Phe Ile Leu Glu Lys Lys Met Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Arg Ala Phe Leu Met Glu Leu Ala Arg Arg Lys Gly Phe Arg Val Glu
50 55 60
Asn Glu Leu Ser Asp Ser Val Thr His Ile Val Ala Glu Asn Asn Ser
65 70 75 80
Gly Ser Asp Val Leu Glu Trp Leu Gln Leu Gln Asn Ile Lys Ala Ser
85 90 95
Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Ile Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met Gly
100 105 110
Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Met Gly Arg His Gln Leu Val Val Asn
115 120 125
Arg Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala
130 135 140
Pro Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
145 150 155 160
Leu Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala
165 170 175
Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met
180 185 190
Arg Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met
195 200 205
Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile
210 215 220
Ile Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val
225 230 235 240
Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
245 250 255
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg
260 265 270
Thr Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met
275 280 285
Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val
305 310 315 320
Thr Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg
325 330 335
Gly Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu
340 345 350
Ala Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe
355 360 365
Trp Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr
370 375 380
Phe Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His
385 390 395 400
Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His
405 410 415
Ser Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg
420 425 430
Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu
435 440 445
Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
450 455 460
Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg
465 470 475 480
Thr Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala
485 490 495
His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
500 505 510
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 2
Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn Arg
165 170 175
Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala
210 215 220
Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe Trp
225 230 235 240
Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His Ser
275 280 285
Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg Thr
340 345 350
Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 3
<211> 380
<212> PRT
<213> 牛科动物(bovine)
<400> 3
Asp Tyr Ser Ala Thr Pro Asn Pro Gly Phe Gln Lys Thr Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Ser Glu Phe Lys Glu Asn Glu Val Ser Tyr Val Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Lys Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Ala Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu
225 230 235 240
Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu
245 250 255
Lys Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln
260 265 270
Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser
275 280 285
Lys Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp
290 295 300
Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp
305 310 315 320
Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Thr His
325 330 335
Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys
340 345 350
Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu
355 360 365
Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 4
<211> 380
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 4
Asp Tyr Ser Asp Ser Thr Asn Pro Gly Pro Pro Lys Thr Pro Pro Ile
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Gln Ile Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Cys Val Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Ser Lys Val Lys Gly Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Gln Lys Val Met Asn Leu Trp Glu
225 230 235 240
Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu
245 250 255
Lys Leu Arg Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln
260 265 270
Lys Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Pro Arg Gln Arg Val Asp Ser Asp
275 280 285
Gln Ser Ser Trp Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp
290 295 300
Leu Val Leu Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp
305 310 315 320
Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His
325 330 335
Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys
340 345 350
Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu
355 360 365
Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 5
<211> 376
<212> PRT
<213> 鸡(chicken)
<400> 5
Gln Tyr Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Glu Val Ser Ser Phe Thr
1 5 10 15
Ala Ser Lys Val Ser Gln Tyr Ser Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn
20 25 30
Asn Cys Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Met Ala Glu Asn
35 40 45
Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Glu Ile Phe Cys Leu Glu Phe Leu Arg Ala
50 55 60
Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Val Thr Arg Met Lys Asp
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Pro Cys Met Gly Asp Arg Val Arg Asp Val Ile Glu
85 90 95
Glu Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Arg Ala Lys Asp Val Leu Asn
100 105 110
Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Glu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
115 120 125
Gly Val Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Leu Arg Thr Val
130 135 140
Glu Glu Val Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Ser Lys Met Gln Arg
145 150 155 160
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ser Lys Ala
165 170 175
Glu Ala Asp Ala Val Ser Ser Ile Val Lys Asn Thr Val Cys Thr Phe
180 185 190
Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys
195 200 205
Lys Ile Gly His Asp Ile Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Gln Arg
210 215 220
Glu Asp Asp Glu Leu Leu His Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile
225 230 235 240
Ile Glu Ser Thr Phe Val Lys Glu Gln Ile Pro Ser Arg His Val Asp
245 250 255
Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Leu Tyr Gln
260 265 270
Pro Arg Val Asp Asn Ser Ser Tyr Asn Met Ser Lys Lys Cys Asp Met
275 280 285
Ala Glu Val Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Ile Thr
290 295 300
Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg
305 310 315 320
Gln Phe Gly Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met
325 330 335
Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Arg Lys Arg Val Phe Leu
340 345 350
Lys Ala Gly Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr
355 360 365
Val Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 6
<211> 387
<212> PRT
<213> 负鼠(possum)
<400> 6
Ser Ala Asn Pro Asp Pro Thr Ala Gly Thr Leu Asn Ile Leu Pro Pro
1 5 10 15
Thr Thr Lys Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Ile
20 25 30
Asn Asn His Asn Gln Arg Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Asp Asp Thr Cys Leu Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Leu Pro Trp Ile Gly Asp Glu Val Lys Gly Ile Met
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Gln Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Asn Lys Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Leu Cys Tyr Tyr Glu Asp Leu Ile Asp Cys Val Ser Lys
165 170 175
Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Leu Leu Val Gln Asp Ala Val Trp Thr
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Glu Phe Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala
210 215 220
Glu Lys Glu Gln Glu Asp Gln Leu Leu Gln Lys Val Thr Asn Leu Trp
225 230 235 240
Lys Lys Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Asp Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Ile Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr His His Lys Glu Asp Lys
275 280 285
Arg Lys Trp Glu Met Pro Thr Gly Ser Asn Glu Ser Glu Ala Lys Ser
290 295 300
Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Asp Arg Tyr
305 310 315 320
Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp
325 330 335
Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His
340 345 350
Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Lys Ser Glu
355 360 365
Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Gln Pro Ser Glu
370 375 380
Arg Asn Ala
385
<210> 7
<211> 381
<212> PRT
<213> 鼩(shrew)
<400> 7
Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser Ala
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala
210 215 220
Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe Trp
225 230 235 240
Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp Asp
275 280 285
Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 8
<211> 381
<212> PRT
<213> 犬(dog)
<400> 8
Asp Tyr Thr Ala Ser Pro Asn Pro Glu Leu Gln Lys Thr Leu Pro Val
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn Asn Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Phe Ser Leu Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Gln Val Lys Cys Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Lys Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Pro Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Asp Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp
225 230 235 240
Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly
275 280 285
Gly Lys Cys Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 9
<211> 382
<212> PRT
<213> 鼹鼠(mole)
<400> 9
Gly Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Leu Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala
35 40 45
Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met
50 55 60
Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met
65 70 75 80
Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val
85 90 95
Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val
100 105 110
Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
115 120 125
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg
130 135 140
Thr Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met
145 150 155 160
Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr
165 170 175
Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp
180 185 190
Ala Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg
195 200 205
Gly Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu
210 215 220
Ala Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe
225 230 235 240
Trp Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr
245 250 255
Phe Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His
260 265 270
Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp
275 280 285
Asp Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg
290 295 300
Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu
305 310 315 320
Gly Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
325 330 335
Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys
340 345 350
Thr Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala
355 360 365
His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 10
<211> 379
<212> PRT
<213> 鼠兔(pika)
<400> 10
Glu Tyr Ser Ala Asn Pro Ser Pro Gly Pro Gln Ala Thr Pro Ala Val
1 5 10 15
Tyr Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn
20 25 30
His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr
35 40 45
Glu Phe Lys Glu Asn Glu Gly Cys Tyr Val Thr Tyr Met Arg Ala Ala
50 55 60
Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Val Ser Met Lys Asp Thr
65 70 75 80
Glu Gly Ile Pro Cys Leu Glu Asp Lys Val Lys Ser Ile Met Glu Glu
85 90 95
Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Ser Asp
100 105 110
Glu Arg Tyr Gln Cys Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly
115 120 125
Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Ser
130 135 140
Asn Ile Arg Leu Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala
145 150 155 160
Gly Phe Arg Tyr Tyr Glu Asp Ile Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu
165 170 175
Ala Glu Ala Val Asp Val Leu Val Asn Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu
180 185 190
Pro Asp Ala Phe Ile Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys
195 200 205
Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Glu Asp Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Met Asn Leu Trp Glu Lys
225 230 235 240
Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
245 250 255
Leu Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys
260 265 270
Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Tyr His Glu Arg Val Gly Gly Asp Arg
275 280 285
Cys Arg Gln Pro Glu Gly Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
290 295 300
Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys His Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
305 310 315 320
Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser His Glu
325 330 335
Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
340 345 350
Val Phe Leu Gln Ala Glu Asn Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
355 360 365
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 11
<211> 384
<212> PRT
<213> 刺猬(hedgehog)
<400> 11
Asp Ala Ser Phe Gly Ser Asn Pro Gly Ser Gln Asn Thr Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ala Ile Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Ser Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn His Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Ser Cys Val Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Lys Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Ala Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Ile Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Asn Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys
165 170 175
Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Val Leu Val Gln Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Met Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Leu Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala
210 215 220
Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Phe Trp
225 230 235 240
Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Leu Gln His Val Asn Gly
275 280 285
Val Gly Asn Ser Lys Thr Gly Gln Gln Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ala
290 295 300
Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala
305 310 315 320
Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg
325 330 335
Phe Ala Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr
340 345 350
Asp Lys Thr Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile
355 360 365
Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Asp Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 12
<211> 381
<212> PRT
<213> 树鼩(tree shrew)
<400> 12
Asp His Ser Thr Ser Pro Ser Pro Gly Pro Gln Lys Thr Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Arg Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Thr Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Ser Val Ile Phe Leu Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Arg Ser Leu Pro Phe Thr Ile Thr Ser Met Arg
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Leu Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Asn Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu His Leu Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Gln Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Glu Glu Lys Glu Glu Glu Leu Leu Gln Lys Val Leu Asn Leu Trp
225 230 235 240
Glu Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Thr Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Pro Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly
275 280 285
Asp Lys Pro Ser Gln Gln Glu Gly Lys Ser Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg His Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 13
<211> 394
<212> PRT
<213> 鸭嘴兽(platypus)
<400> 13
Leu Thr Asn Ser Ala Pro Ile Asn Cys Met Thr Glu Thr Pro Ser Leu
1 5 10 15
Ala Thr Lys Gln Val Ser Gln Tyr Ala Cys Glu Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys
35 40 45
Asp Phe Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ile Cys Leu Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Arg Met Lys
65 70 75 80
Asp Ile Glu Gly Val Pro Trp Leu Gly Asp Gln Val Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Ser Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Arg Ser Phe Gln Leu Phe Asn Ser Val Phe Glu
115 120 125
Val Gly Leu Thr Asp Asn Gly Glu Asn Gly Ile Ala Arg Gly Phe Gln
130 135 140
Thr Leu Asn Glu Val Ile Thr Asp Glu Asn Ile Ser Leu Thr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Leu Ser Thr Ser Leu Trp Asn Tyr Leu Pro Gly Phe Leu Tyr Tyr
165 170 175
Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys Glu Glu Ala Asp Ala Val Tyr
180 185 190
Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu Pro Glu Ala Leu Val
195 200 205
Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val
210 215 220
Asp Phe Leu Ile Ser Asp Pro Glu Ser Gly Gln Asp Glu Gln Leu Leu
225 230 235 240
Pro Asn Ile Ile Lys Leu Trp Glu Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr
245 250 255
Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Thr Lys Ile Pro Ser Arg Lys
260 265 270
Val Asp Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu
275 280 285
His His Gln Lys Val Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Pro Pro Pro Glu Ser
290 295 300
Lys Asn His Glu Ala Lys Asn Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
305 310 315 320
Met Cys Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
325 330 335
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys
340 345 350
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile
355 360 365
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Thr His Leu Gly Leu
370 375 380
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
385 390
<210> 14
<211> 384
<212> PRT
<213> 跳鼠(jerboa)
<400> 14
Ser Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Val Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met
1 5 10 15
Gly Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Thr Gly Arg His Gln Leu Val Lys
20 25 30
Gln Thr Phe Cys Leu Pro Gly Phe Ile Leu Gln Asp Ala Phe Asp Ile
35 40 45
Leu Ala Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Ala Ser Cys Val Glu
50 55 60
Phe Met Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Ile
65 70 75 80
Ser Val Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Trp Leu Gly Gly Lys Val Lys
85 90 95
Cys Val Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys
100 105 110
Ala Leu Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser
115 120 125
Val Phe Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Arg Trp Phe Arg Met Gly
130 135 140
Phe Arg Thr Leu Ser Thr Val Lys Leu Asp Lys Ser Leu Thr Phe Thr
145 150 155 160
Arg Met Gln Lys Ala Gly Phe Leu His Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys
165 170 175
Val Thr Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Gln Gln Ala
180 185 190
Val Val Ala Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Ser Met Thr Gly Gly Phe
195 200 205
Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser
210 215 220
Pro Glu Ala Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr
225 230 235 240
Asn Phe Trp Glu Gln Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp His Val Glu
245 250 255
Ser Thr Phe Glu Lys Cys Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu
260 265 270
Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Arg
275 280 285
Val Asp Ser Val Lys Ser Ser Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala
290 295 300
Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala
305 310 315 320
Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg
325 330 335
Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met Arg Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr
340 345 350
Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile
355 360 365
Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Pro Leu Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 15
<211> 364
<212> PRT
<213> 美洲狮(puma)
<400> 15
Val Val Lys Lys Ile Pro Leu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
1 5 10 15
Asn Asn Phe Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu
20 25 30
Asn Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Glu Ile Ser Ser Ala Thr Phe Met Arg
35 40 45
Ala Ala Ser Val Leu Lys Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp
50 55 60
Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile Glu
65 70 75 80
Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn
85 90 95
Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
100 105 110
Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu
115 120 125
Ser Lys Ile Lys Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Gln Met Gln Lys
130 135 140
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala
145 150 155 160
Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe
165 170 175
Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys
180 185 190
Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ile Pro Gly Ser Thr
195 200 205
Asp Glu Glu Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Gln
210 215 220
Arg Lys Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu
225 230 235 240
Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln
245 250 255
Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Gly
260 265 270
Lys Cys Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp
275 280 285
Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp
290 295 300
Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His
305 310 315 320
Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys
325 330 335
Lys Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu
340 345 350
Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 16
<211> 362
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 16
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile Ile Glu Gly Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Ser Lys
115 120 125
Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn Arg Pro Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Met Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe Trp Lys Gln Gln
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe
225 230 235 240
Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His Ser Glu Lys Ser
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg Thr Lys Arg Val
325 330 335
Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 17
<211> 361
<212> PRT
<213> 牛科动物(bovine)
<400> 17
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Ser Glu
20 25 30
Phe Lys Glu Asn Glu Val Ser Tyr Val Thr Phe Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Ser Lys
115 120 125
Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Arg Gln Phe Glu Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 18
<211> 361
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 18
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Cys
1 5 10 15
Asn Gln Ile Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu Asn Cys Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Cys Val Thr Phe Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Ser Lys Val Lys Gly Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Ser Lys
115 120 125
Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Ser Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Met
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Thr Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Gln Lys Val Met Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu Arg
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Phe Lys Leu Pro Arg Gln Arg Val Asp Ser Asp Gln Ser Ser
260 265 270
Trp Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Leu
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Ile Phe
325 330 335
Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 19
<211> 358
<212> PRT
<213> 鸡(Chicken)
<400> 19
Lys Val Ser Gln Tyr Ser Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn Asn Cys
1 5 10 15
Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Met Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Lys Glu Asn Glu Ile Phe Cys Leu Glu Phe Leu Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Val Thr Arg Met Lys Asp Ile Gln
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Met Gly Asp Arg Val Arg Asp Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Arg Ala Lys Asp Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Glu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Val
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Leu Arg Thr Val Glu Glu
115 120 125
Val Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Ser Lys Met Gln Arg Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Asp Ala Val Ser Ser Ile Val Lys Asn Thr Val Cys Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Ile Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Gln Arg Glu Asp
195 200 205
Asp Glu Leu Leu His Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Ile Glu
210 215 220
Ser Thr Phe Val Lys Glu Gln Ile Pro Ser Arg His Val Asp Ala Met
225 230 235 240
Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Leu Tyr Gln Pro Arg
245 250 255
Val Asp Asn Ser Ser Tyr Asn Met Ser Lys Lys Cys Asp Met Ala Glu
260 265 270
Val Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Ile Thr Pro Phe
275 280 285
Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe
290 295 300
Gly Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu
305 310 315 320
Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Arg Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala
325 330 335
Gly Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Val Glu
340 345 350
Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355
<210> 20
<211> 368
<212> PRT
<213> 负鼠(possum)
<400> 20
Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Ile Asn Asn His
1 5 10 15
Asn Gln Arg Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Lys Glu Asn Asp Asp Thr Cys Leu Thr Phe Met Arg Ala Ile Ser
35 40 45
Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Trp Ile Gly Asp Glu Val Lys Gly Ile Met Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Gln Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ala Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Asn Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Leu Cys Tyr Tyr Glu Asp Leu Ile Asp Cys Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Asp Ala Val Ser Leu Leu Val Gln Asp Ala Val Trp Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Glu Phe
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala Glu Lys Glu
195 200 205
Gln Glu Asp Gln Leu Leu Gln Lys Val Thr Asn Leu Trp Lys Lys Gln
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe Glu Asp Leu
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ser Arg Lys Ile Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr His His Lys Glu Asp Lys Arg Lys Trp
260 265 270
Glu Met Pro Thr Gly Ser Asn Glu Ser Glu Ala Lys Ser Trp Lys Ala
275 280 285
Ile Arg Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Asp Arg Tyr Ala Phe Ala
290 295 300
Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg
305 310 315 320
Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr
325 330 335
Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Lys Ser Glu Glu Glu Ile
340 345 350
Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Gln Pro Ser Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 21
<211> 362
<212> PRT
<213> 鼩(shrew)
<400> 21
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn His
1 5 10 15
Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Cys Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg Thr Leu Ser Gly
115 120 125
Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Val
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala Thr Glu Glu
195 200 205
Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe Trp Glu Lys Glu
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp Asp Gly Thr Ser
260 265 270
Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Lys
325 330 335
Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 22
<211> 362
<212> PRT
<213> 犬(dog)
<400> 22
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Asn Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Val Phe Ser Leu Thr Phe Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Gln Val Lys Cys Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Ser Lys
115 120 125
Ile Lys Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Pro Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Met
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Thr Asp Glu
195 200 205
Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Arg Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly Gly Lys Cys
260 265 270
Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile
325 330 335
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 23
<211> 362
<212> PRT
<213> 鼹鼠(MOLE)
<400> 23
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn His
1 5 10 15
Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Cys Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg Thr Leu Ser Gly
115 120 125
Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Val
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala Thr Glu Glu
195 200 205
Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe Trp Glu Lys Glu
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp Asp Gly Thr Ser
260 265 270
Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Lys
325 330 335
Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 24
<211> 362
<212> PRT
<213> 鼠兔(Pika)
<400> 24
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn His
1 5 10 15
Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Lys Glu Asn Glu Gly Cys Tyr Val Thr Tyr Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Val Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Glu Asp Lys Val Lys Ser Ile Met Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Ser Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Cys Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Ser Asn
115 120 125
Ile Arg Leu Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Arg Tyr Tyr Glu Asp Ile Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Asp Val Leu Val Asn Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Ile Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Leu Thr Glu Glu
195 200 205
Asp Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Met Asn Leu Trp Glu Lys Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Phe Lys Leu Tyr His Glu Arg Val Gly Gly Asp Arg Cys
260 265 270
Arg Gln Pro Glu Gly Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Cys His Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val
325 330 335
Phe Leu Gln Ala Glu Asn Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 25
<211> 365
<212> PRT
<213> 截短的刺猬(TRUNC HEDGEHOG)
<400> 25
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Ser Leu Asn Asn Cys
1 5 10 15
Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn His Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Val Ser Cys Val Ala Phe Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Lys
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Ala Lys Cys Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Asn Lys
115 120 125
Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Arg Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Asp Ala Val Ser Val Leu Val Gln Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Met Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Leu
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala Thr Glu Glu
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Phe Trp Glu Arg Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Leu Gln His Val Asn Gly Val Gly Asn
260 265 270
Ser Lys Thr Gly Gln Gln Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ala Ile Arg Val
275 280 285
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
290 295 300
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Phe Ala Thr
305 310 315 320
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
325 330 335
Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
340 345 350
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Asp Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 26
<211> 362
<212> PRT
<213> 树鼩(tree shrew)
<400> 26
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Cys
1 5 10 15
Asn Arg Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Thr Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Ser Val Ile Phe Leu Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Arg Ser Leu Pro Phe Thr Ile Thr Ser Met Arg Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Asn Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Ser Arg
115 120 125
Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu His Leu Thr Arg Met Gln Gln Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Thr Glu Glu
195 200 205
Lys Glu Glu Glu Leu Leu Gln Lys Val Leu Asn Leu Trp Glu Lys Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Lys Thr Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Pro Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly Asp Lys Pro
260 265 270
Ser Gln Gln Glu Gly Lys Ser Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Arg His Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val
325 330 335
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 27
<211> 375
<212> PRT
<213> 截短的鸭嘴兽(TRUNCATED PLATYPUS)
<400> 27
Gln Val Ser Gln Tyr Ala Cys Glu Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Cys
1 5 10 15
Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys Asp Phe Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ile Cys Leu Ala Phe Met Arg Ala Ile Ser
35 40 45
Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Arg Met Lys Asp Ile Glu
50 55 60
Gly Val Pro Trp Leu Gly Asp Gln Val Lys Ser Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Ser Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Arg Ser Phe Gln Leu Phe Asn Ser Val Phe Glu Val Gly Leu
100 105 110
Thr Asp Asn Gly Glu Asn Gly Ile Ala Arg Gly Phe Gln Thr Leu Asn
115 120 125
Glu Val Ile Thr Asp Glu Asn Ile Ser Leu Thr Lys Thr Thr Leu Ser
130 135 140
Thr Ser Leu Trp Asn Tyr Leu Pro Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu
145 150 155 160
Val Ser Cys Val Ala Lys Glu Glu Ala Asp Ala Val Tyr Leu Ile Val
165 170 175
Lys Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu Pro Glu Ala Leu Val Thr Leu Thr
180 185 190
Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu
195 200 205
Ile Ser Asp Pro Glu Ser Gly Gln Asp Glu Gln Leu Leu Pro Asn Ile
210 215 220
Ile Lys Leu Trp Glu Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val
225 230 235 240
Glu Ser Thr Phe Glu Lys Thr Lys Ile Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala
245 250 255
Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln
260 265 270
Lys Val Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Pro Pro Pro Glu Ser Lys Asn His
275 280 285
Glu Ala Lys Asn Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro
290 295 300
Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln
305 310 315 320
Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met
325 330 335
Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Lys
340 345 350
Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Thr His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile
355 360 365
Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 28
<211> 365
<212> PRT
<213> 金丝雀(Serinus canaria)
<400> 28
Lys Val Ser Gln Tyr Ser Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Met Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Lys Glu Asn Glu Ile Phe Cys Leu Glu Phe Leu Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Leu Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Val Thr Arg Met Lys Asp Ile Gln
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Met Gly Asp Gln Val Arg Asp Val Ile Glu Ile Ile
65 70 75 80
Glu Glu Gly Glu Ser Ser Arg Val Lys Glu Val Leu Asn Asp Glu Arg
85 90 95
Tyr Lys Ala Phe Lys Gln Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Val Lys
100 105 110
Thr Ser Glu Lys Trp Tyr Arg Met Gly Leu Arg Thr Val Gly Glu Val
115 120 125
Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Ser Lys Met Gln Lys Ala Gly Phe
130 135 140
Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ser Lys Ala Glu Ala Asp
145 150 155 160
Ala Val Ser Leu Ile Val Lys Asn Thr Val Cys Thr Phe Leu Pro Asp
165 170 175
Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Asn Ile Gly
180 185 190
His Asp Ile Asp Phe Leu Ile Thr Asn Pro Gly Pro Arg Glu Asp Asp
195 200 205
Glu Leu Leu His Lys Val Ile Asp Leu Trp Lys Lys Gln Gly Leu Leu
210 215 220
Leu Tyr Cys Asp Ile Ile Glu Ser Thr Phe Val Lys Glu Gln Leu Pro
225 230 235 240
Ser Arg Lys Ile Asp Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala Ile
245 250 255
Leu Lys Leu Tyr Gln Pro Arg Val Asp Asn Ser Thr Cys Asn Thr Ser
260 265 270
Lys Lys Leu Glu Met Ala Glu Val Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val
275 280 285
Asp Leu Val Ile Thr Pro Phe Glu Gln Tyr Ser Tyr Ala Leu Leu Gly
290 295 300
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Gly Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ala
305 310 315 320
His Glu Arg Arg Met Ile Leu Asp Asn His Gly Leu Tyr Asp Arg Thr
325 330 335
Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Gly Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
340 345 350
Leu Gly Leu Asp Tyr Val Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 29
<211> 366
<212> PRT
<213> 黄冠霸娇鹟(Neopelma chrysocephalum)
<400> 29
Lys Val Ser Gln Tyr Ser Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Met Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Lys Glu Asn Glu Ile Phe Cys Leu Glu Phe Leu Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Leu Leu Lys Tyr Leu Pro Phe Pro Val Thr Arg Met Lys Asp Ile Gln
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Ile Gly Asp Gln Val Arg Asp Val Ile Glu Gly Ile
65 70 75 80
Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Arg Val Lys Glu Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Gln Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Val
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Tyr Arg Met Gly Leu Arg Thr Val Glu Glu
115 120 125
Leu Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Ser Lys Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Asp Ala Val Thr Leu Ile Val Lys Asn Thr Val Ser Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Met
180 185 190
Gly His Asp Ile Asp Phe Leu Ile Thr Asn Pro Gly Pro Arg Glu Asp
195 200 205
Asp Glu Leu Leu His Lys Val Val Asp Leu Trp Lys Lys Gln Gly Leu
210 215 220
Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Ile Glu Ser Thr Phe Val Glu Glu Gln Leu
225 230 235 240
Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Met Asp Asn Phe Gln Lys Cys Phe Thr
245 250 255
Ile Leu Lys Leu Tyr Gln Pro Gly Val Asp Asn Ser Ser Tyr Asn Met
260 265 270
Ser Lys Lys Ser Asp Met Ala Glu Val Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg
275 280 285
Val Asp Leu Val Ile Thr Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu
290 295 300
Gly Trp Thr Gly Ser Arg Glu Phe Gly Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
305 310 315 320
Ser His Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Gly Leu Tyr Asp Arg
325 330 335
Arg Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Gly Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala
340 345 350
His Leu Gly Leu Asp Tyr Val Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 30
<211> 366
<212> PRT
<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)
<400> 30
Lys Val Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Cys Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Arg Leu Gly Cys Leu Glu Phe Leu Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Phe Leu Pro Phe Pro Ile Val Lys Met Lys Asn Ile Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Met Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Leu Glu Glu Gly Glu Ser Cys Gln Ala Lys Glu Ile Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Thr Glu Lys Trp Tyr Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Lys Thr Leu Lys Leu Ser Arg Met Gln Ile Ala Gly
130 135 140
Phe Leu His Tyr Glu Asp Ile Ile Ser Tyr Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Asp Ala Val Ser Leu Leu Ile Lys Asp Thr Val Cys Met Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Asn Pro Gly Pro Glu Glu Glu
195 200 205
Lys Glu Leu Leu His Lys Val Val Asp Leu Trp Glu Lys Gln Gly Leu
210 215 220
Leu Leu Tyr Tyr Asp Val Ile Glu Ser Thr Phe Glu Lys Glu Lys Arg
225 230 235 240
Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala
245 250 255
Ile Leu Lys Leu His Gln Gln Arg Arg Gly Asn Ser Asn Ser Asn Ile
260 265 270
Ser Lys Glu Ser Asp Lys Ala Glu Val Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg
275 280 285
Val Asp Leu Val Ile Ser Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu
290 295 300
Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
305 310 315 320
Ser Arg Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys
325 330 335
Thr Lys Arg Thr Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala
340 345 350
His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 31
<211> 366
<212> PRT
<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)
<400> 31
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Asn Glu Asn Lys Gly Phe Cys Leu Ala Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Phe Leu Pro Phe Thr Ile Val Arg Met Asn Asp Ile Gln
50 55 60
Gly Leu Pro Trp Met Gly Asp Gln Val Lys Arg Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Leu Glu Glu Gly Glu Ser Ser Lys Val Lys Glu Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Lys Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Tyr Arg Met Gly Leu Arg Thr Leu Glu Glu
115 120 125
Val Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ile Ser Arg Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Asp Ala Val Ser Leu Ile Val Lys Asp Thr Val Trp Lys Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Met
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Thr Pro Gly Pro Glu Glu Glu
195 200 205
Glu Glu Leu Leu His Lys Val Ile Asp Leu Trp Lys Lys Gln Gly Leu
210 215 220
Leu Leu Tyr Tyr Asp Ile Ile Glu Ser Thr Phe Glu Lys Thr Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser Arg Thr Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala
245 250 255
Ile Leu Lys Leu His Lys Gln Arg Val Asp Asn Gly Asn Ser Asn Gln
260 265 270
Ser Lys Glu Phe Asp Lys Glu Glu Thr Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg
275 280 285
Val Asp Leu Val Ile Thr Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu
290 295 300
Gly Trp Thr Gly Ser Ala Phe Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
305 310 315 320
Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys
325 330 335
Thr Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala
340 345 350
His Leu Gly Leu Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 32
<211> 363
<212> PRT
<213> 非洲爪蟾(Xenopus laevis)
<400> 32
Lys Val Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Cys Thr Thr Leu Gln Asp Thr
1 5 10 15
Asn Arg Ile Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu His Phe Glu
20 25 30
Phe Cys Glu Asn Lys Gly Arg Thr Val Ala Phe Leu Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Leu Ile Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ala Met Lys Glu Leu Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Trp Leu Gly Asp Gln Met Lys Gly Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Leu Glu Glu Gly Lys Ser Tyr Lys Val Leu Glu Val Met Asn Glu Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Gln Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Asp Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Glu
115 120 125
Ile Lys Asn Glu Lys Glu Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln Lys Cys Gly
130 135 140
Leu Leu Tyr Tyr Glu Asp Ile Thr Ser Tyr Val Ser Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Thr Thr Glu Gln Leu Ile Lys Ser Ile Val Trp Lys Phe Val Pro
165 170 175
Asp Ala Ile Val Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Lys
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Ile Leu Ile Thr Cys Ala Arg Lys Gly Lys Glu
195 200 205
Lys Asn Ile Leu His Asn Thr Met Ser Val Leu Lys Asn Arg Gly Leu
210 215 220
Leu Leu Phe Tyr Asn Ile Ile Glu Ser Thr Phe Asp Glu Thr Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser Arg His Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Thr
245 250 255
Ile Leu Lys Leu Pro Lys Arg Gln Met Asp Ile Gly Asn Ile Ile Asp
260 265 270
Pro His Glu Cys Glu Arg Lys Asn Trp Lys Ala Val Arg Leu Asp Leu
275 280 285
Val Ile Thr Pro Tyr Glu Gln Tyr Pro Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr
290 295 300
Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu
305 310 315 320
Lys Arg Met Met Leu Asp Asn His Gly Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Asn
325 330 335
Asn Phe Leu Lys Ala Asn Asn Glu Glu Asp Ile Phe Lys Gln Leu Gly
340 345 350
Leu Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 33
<211> 363
<212> PRT
<213> 爪蟾属(Xenopus)
<400> 33
Lys Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Gln Asp Thr
1 5 10 15
Asn Arg Ile Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Asn Glu Asn Lys Gly Pro Cys Val Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Val Ala Met Lys Asp Leu Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Trp Leu Gly Asp Gln Met Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Leu Glu Glu Gly Lys Ser Ser Lys Val Val Glu Val Met Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Glu
115 120 125
Ile Lys Ser Asp Lys Glu Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Leu Leu Tyr Tyr Glu Asp Ile Thr Ser Ala Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Glu Gln Leu Ile Lys Ser Ile Val Trp Lys Phe Val Pro
165 170 175
Asp Ala Ile Val Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Met
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Ile Leu Ile Thr Thr Pro Arg Lys Gly Glu Lys
195 200 205
Glu Glu Ile Leu His Lys Thr Ile Asn Val Leu Lys Lys Arg Gly Leu
210 215 220
Leu Leu Phe Tyr Asn Ile Ile Glu Ser Thr Phe Asp Glu Thr Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser Arg His Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Thr
245 250 255
Ile Leu Lys Leu Gln Lys Gln Gln Leu Asp Asn Gly Asn Ser Asn Glu
260 265 270
Pro Phe Glu Thr Glu Lys Lys Asn Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
275 280 285
Val Ile Thr Pro Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr
290 295 300
Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu
305 310 315 320
Lys Arg Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Asn
325 330 335
Ile Phe Leu Lys Ala Asn Ser Glu Glu Asp Ile Phe Thr His Leu Gly
340 345 350
Leu Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 34
<211> 367
<212> PRT
<213> 虎蛇属(Notechis)
<400> 34
Ser Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Asn Glu Asn Lys Gly Phe Cys Leu Ala Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Phe Leu Pro Phe Thr Ile Val Arg Val Asn Asp Ile Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Trp Met Gly Glu Gln Val Lys Arg Ile Ile Glu Asp Ile
65 70 75 80
Leu Glu Glu Gly Glu Ser Ser Lys Val Lys Ala Val Leu Asn Asn Glu
85 90 95
Asn Tyr Arg Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Tyr Arg Met Gly Leu Arg Thr Leu Glu Glu
115 120 125
Val Lys Ala Asp Lys Asn Leu Lys Leu Thr Arg Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu His Tyr Glu Asp Leu Ile Ser Arg Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Asp Ala Ala Ser Leu Ile Val Lys Asp Thr Val Trp Lys Phe Leu Pro
165 170 175
Asn Ala Leu Val Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Met
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Val Pro Gly Ser Arg Gln Glu
195 200 205
Glu Glu Glu Leu Leu His Thr Val Ile Asp Leu Trp Lys Lys Gln Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe Glu Lys Thr Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Ala Ile Leu Lys Leu His Lys Glu Arg Val Asp Lys Gly Asn Ser Ile
260 265 270
Gln Ser Lys Ala Phe Ala Glu Glu Glu Thr Lys Asp Trp Lys Ala Ile
275 280 285
Arg Val Asp Leu Val Val Thr Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Phe Ala Leu
290 295 300
Leu Gly Trp Thr Gly Ser Pro Phe Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr
305 310 315 320
Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp
325 330 335
Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Glu Ile Phe
340 345 350
Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 35
<211> 363
<212> PRT
<213> 褐鳟(Salmo trutta)
<400> 35
Asn Val Ser Gln Tyr Ala Cys Leu Arg Arg Thr Thr Thr Glu Asn His
1 5 10 15
Asn Lys Ile Phe Thr Asp Val Leu Glu Glu Leu Ala Glu Asn Ser Glu
20 25 30
Phe Asn Glu Ser Lys Gly Pro Cys Leu Ala Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Ser Ala Val His Cys Leu Gly Ala Ile Gln
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Leu Gly Glu His Thr Lys Ala Val Met Glu Glu Ile
65 70 75 80
Leu Ile Phe Gly Arg Ser Phe Lys Val Glu Glu Val Gln Ser Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ala Leu Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Pro
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Tyr Arg Arg Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
115 120 125
Ile Leu Ala Glu Pro Asn Ile Gln Leu Asn Arg Met Gln Arg Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Arg Asp Ile Ser Lys Ala Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Lys Ala Leu Ser Ser Ile Ile Glu Glu Thr Ala His Trp Ile Ala Pro
165 170 175
Asp Ser Ile Leu Ala Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Glu Tyr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Leu Thr Met Pro Glu Met Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Gly Leu Leu Leu Arg Val Ile Asp Arg Leu Arg Asp Gln Gly Ile
210 215 220
Leu Leu Tyr Cys Glu His Gln Asp Ser Thr Phe Asp Met Ser Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser His Arg Phe Glu Ala Met Asp His Phe Glu Lys Cys Phe Leu
245 250 255
Ile Leu Arg Leu Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Asp Gly Gly Leu Gln
260 265 270
Lys Asp Pro Gly Glu Ser Arg Gly Trp Arg Ala Val Arg Val Asp Leu
275 280 285
Val Ala Pro Pro Val Asp Arg Tyr Ala Phe Val Leu Leu Gly Trp Thr
290 295 300
Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Phe Ala Ser Lys Glu
305 310 315 320
Arg Gly Met Cys Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys
325 330 335
Leu Phe Leu Pro Ala Thr Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His Leu Gly
340 345 350
Leu Glu Tyr Val Glu Pro Trp Gln Arg Asn Ala
355 360
<210> 36
<211> 363
<212> PRT
<213> 褐鳟(Salmo trutta)
<400> 36
Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Met Glu Asn His
1 5 10 15
Asn Lys Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu Asn Ser Glu
20 25 30
Phe Asn Glu Ser Lys Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Ser Ala Val Arg Ser Leu Gly Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Leu Gly Glu His Thr Lys Arg Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Leu Glu Tyr Gly Arg Ser Ser Lys Val Glu Asp Ile Leu Ser Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Thr Met Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Pro
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Tyr Arg Arg Gly Leu Arg Ser Leu Glu Glu
115 120 125
Val Arg Ala Glu Pro Ser Ile His Leu Asn Arg Met Gln Arg Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Arg Asp Ile Ser Lys Arg Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Lys Ala Leu Gly Asn Ile Ile Glu Glu Thr Val His Ala Ile Ala Pro
165 170 175
Asp Ala Ile Val Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Glu Phe
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Ile Leu Thr Thr Pro Glu Met Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Gly Leu Leu Pro Arg Val Ile Asp Arg Leu Arg Asn Gln Gly Ile
210 215 220
Leu Leu Tyr Cys Asp Tyr Gln Glu Ser Thr Phe Asp Met Ser Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser Arg Thr Phe Glu Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu
245 250 255
Ile Ile Lys Leu Lys Glu Gly Leu Val Glu Gly Glu Gly Gly Leu Gln
260 265 270
Ser Asp Pro Gly Asp Arg Arg Gly Trp Arg Ala Val Arg Val Asp Leu
275 280 285
Val Ala Pro Pro Val Asp Arg Tyr Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
290 295 300
Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Phe Ala Arg Leu Glu
305 310 315 320
Arg Arg Met Leu Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys
325 330 335
Ile Phe Leu Pro Ala Lys Thr Glu Glu Asp Ile Phe Ala His Leu Gly
340 345 350
Leu Glu Tyr Ile Glu Pro Trp Gln Arg Asn Ala
355 360
<210> 37
<211> 360
<212> PRT
<213> 电鳗(Electrophorus electricus)
<400> 37
Thr Val Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asp Asn His
1 5 10 15
Asn Lys Val Phe Thr Asp Ala Leu Glu Val Leu Ile Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Ser Asp Asn Lys Gly Ala Cys Val Gly Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Lys Pro Leu Arg Cys Leu Lys Asp Met Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Leu Gly Asp Asp Thr Lys Ala Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Cys Gly Ser Ser Ser Arg Val Glu Asn Ile Leu Ser Asp Glu
85 90 95
Lys Tyr Gln Thr Leu Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Pro
100 105 110
Lys Thr Gly Glu Lys Trp Tyr Arg Arg Gly Leu Arg Ala Leu Glu Gln
115 120 125
Val His Ser Glu Pro Ser Ile Gln Leu Asn Lys Met Gln Ala Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Ile Ser Lys Pro Val Ser Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Lys Ala Val Gly Cys Ile Ile Glu Glu Val Ala Ser Cys Phe Ser Ser
165 170 175
Ser Val Thr Ile Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Glu Phe
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Leu Ser Ile Pro Glu Pro Gly Lys Glu
195 200 205
Asp Gly Leu Leu Pro Ala Val Ile Asp Arg Leu Arg Lys Gln Gly Ile
210 215 220
Leu Leu Tyr Ser Asp Leu Gln Glu Ser Thr Leu Gln Gln Trp Lys Arg
225 230 235 240
Pro Ser Arg Cys Phe Asp Ser Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu
245 250 255
Ile Val Lys Leu Trp Thr Arg Leu Val Glu Gly His Arg Glu Asp Pro
260 265 270
Ser Ser Gln Arg Asp Trp Lys Ala Val Arg Val Asp Leu Val Val Pro
275 280 285
Pro Val Asp Cys Tyr Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ser Thr
290 295 300
Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Phe Ala Arg Leu Glu Arg Arg Met
305 310 315 320
Leu Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Thr Asn Thr Phe Leu
325 330 335
Gln Ala Lys Thr Glu Glu Asp Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr
340 345 350
Ile Glu Pro Trp Gln Arg Asn Ala
355 360
<210> 38
<211> 360
<212> PRT
<213> 电鳗(Electrophorus electricus)
<400> 38
Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asp Asn His
1 5 10 15
Asn Lys Ile Phe Thr Asp Ala Leu Glu Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Ser Asp Ser Lys Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Thr Pro Leu Arg Ser Leu Gln Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Leu Gly Glu Glu Thr Lys Arg Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Phe Glu Glu Gly Ser Ser Ser Arg Val Glu Asp Ile Leu Ser Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Thr Leu Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Pro
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Tyr Arg Arg Gly Leu Arg Ser Leu Glu Gln
115 120 125
Val Arg Ser Asp Pro Ser Ile His Leu Asn Arg Met Gln Thr Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Ile Ser Lys Pro Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Lys Ala Leu Gly Asn Ile Ile Glu Glu Thr Ala Ser Ala Phe Ser Pro
165 170 175
Ser Val Thr Ile Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Glu Phe
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Leu Thr Val Pro Glu Pro Gly Lys Glu
195 200 205
Asp Gly Leu Leu Pro Ala Val Ile Asp Arg Leu Arg Ser Gln Gly Ile
210 215 220
Leu Leu Tyr Ser Asp Phe Gln Glu Ser Thr Phe Asp Leu Ser Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser Arg Arg Phe Glu Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu
245 250 255
Ile Val Lys Leu Lys Ala Gly Leu Val Glu Gly Glu Gly Ala Asp Pro
260 265 270
Gly Asp Arg Arg Asp Trp Arg Ala Val Arg Val Asp Leu Val Ala Pro
275 280 285
Pro Val Asp Arg Tyr Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ser Ala
290 295 300
Phe Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Phe Ala Arg Leu Glu Arg Gly Met
305 310 315 320
Leu Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Thr Asn Thr Phe Leu
325 330 335
Gln Ala Lys Thr Glu Glu Asp Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr
340 345 350
Ile Glu Pro Trp Gln Arg Asn Ala
355 360
<210> 39
<211> 361
<212> PRT
<213> 龟壳攀鲈(Anabas testudineus)
<400> 39
Thr Val Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Thr Glu Asn Asn
1 5 10 15
Asn Lys Ile Leu Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu Ser Tyr Glu
20 25 30
Leu Asn Gln Leu Glu Gly Pro Cys Leu Ala Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Trp Ala Val Gln Cys Leu Gly Ala Thr Gln
50 55 60
Gly Leu Pro Cys Leu Gly Glu His Thr Lys Ala Leu Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Leu Gln Tyr Gly His Ser Phe Glu Val Glu Lys Ile Leu Ser Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Thr Leu Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Pro
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Tyr Arg Arg Gly Leu Arg Ser Phe Ser Asp
115 120 125
Ile Leu Ala Glu Pro Ser Ile Gln Leu Asn Arg Met Gln Gln Ser Gly
130 135 140
Phe Leu His Tyr Gly Asp Ile Ser Arg Ala Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Arg Ala Leu Gly Asn Ile Ile Asp Glu Ala Val His Ala Ile Thr Pro
165 170 175
Asp Gly Ile Leu Ala Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Glu Phe
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Ile Val Thr Thr Pro Glu Gln Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Thr Leu Leu Pro Asn Ile Ile Asp Arg Leu Lys Glu Gln Gly Ile
210 215 220
Leu Leu Tyr Ser Asp Tyr Gln Thr Ser Thr Phe Asp Ile Ser Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser His Lys Phe Glu Ala Met Asp His Phe Ala Lys Cys Phe Leu
245 250 255
Ile Leu Arg Leu Glu Gly Ser Leu Val Asp Arg Gly Leu Asn Ser Thr
260 265 270
Glu Gly Asp Ser Arg Gly Trp Arg Ala Val Arg Val Asp Leu Val Ser
275 280 285
Pro Pro Met Glu Arg Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Phe Ala Arg Leu Glu Gln His
305 310 315 320
Met Leu Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Glu Phe
325 330 335
Leu Ala Ala Thr Thr Glu Arg Asp Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Glu
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Gln Arg Asn Ala
355 360
<210> 40
<211> 361
<212> PRT
<213> 龟壳攀鲈(Anabas testudineus)
<400> 40
Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Thr Glu Asn Asn
1 5 10 15
Asn Lys Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu Ser Tyr Glu
20 25 30
Phe Asn Glu Met Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Trp Ala Val Gln Ser Leu Gly Ala Thr Gln
50 55 60
Asp Leu Pro Cys Leu Gly Glu His Thr Lys Arg Val Met Glu Glu Ile
65 70 75 80
Leu Gln Tyr Gly Arg Ser Phe Glu Val Glu Lys Ile Leu Ser Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Thr Leu Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Pro
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Tyr Arg Arg Gly Leu Arg Ser Phe Glu Asp
115 120 125
Ile Arg Ala Glu Pro Ser Ile His Leu Asn Arg Met Gln Gln Ser Gly
130 135 140
Phe Leu His Tyr Gly Asp Ile Ser Arg Ala Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Arg Ala Leu Gly Asn Ile Ile Asp Glu Ala Val His Ala Ile Thr Pro
165 170 175
Asp Ala Ile Leu Ala Leu Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Glu Phe
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Ile Val Thr Thr Pro Glu Leu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Ser Leu Leu Pro Asn Ile Ile Asp Arg Leu Lys Lys Gln Gly Ile
210 215 220
Leu Leu Tyr Ser Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Phe Asp Met Ser Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser His Arg Phe Glu Ala Met Asp His Phe Ala Lys Cys Phe Leu
245 250 255
Ile Leu Arg Leu Glu Gly Ser Gln Val Glu Gly Gly Leu Asn Ser Ala
260 265 270
Glu Gly Asp Ser Arg Gly Trp Arg Ala Val Arg Val Asp Leu Val Ser
275 280 285
Pro Pro Met Asp Arg Tyr Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Ala Phe Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Phe Ala Arg Met Glu Arg Arg
305 310 315 320
Met Leu Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Glu Phe
325 330 335
Leu Ala Ala Thr Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Glu
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Gln Arg Asn Ala
355 360
<210> 41
<211> 361
<212> PRT
<213> 孔雀鱼(Poecilia reticulate)
<400> 41
Lys Val Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Val Glu Asn Asn
1 5 10 15
Asn Arg Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Asn Glu Ile Glu Gly Arg Cys Leu Ala Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Trp Ala Val Arg Ser Val Gly Ala Thr Leu
50 55 60
Asp Leu Pro Cys Leu Gly Glu His Thr Thr Ala Val Met Lys Glu Ile
65 70 75 80
Leu Gln Tyr Gly Arg Ser Phe Glu Val Glu Lys Ile Leu Ser Asp Glu
85 90 95
Arg Cys Gln Thr Leu Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Pro
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Tyr Arg Arg Gly Leu Arg Ser Phe Ser Asp
115 120 125
Val Leu Ala Gln Pro Gly Ile His Leu Asn Arg Met Gln Gln Ser Gly
130 135 140
Phe Leu His Tyr Gly Asp Ile Ser Arg Ala Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Arg Ala Val Gly Asn Ile Ile Asp Glu Ala Val His Val Ile Thr Pro
165 170 175
Asn Ala Ile Leu Ala Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Asp Phe
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Ile Val Thr Thr Thr Glu Leu Gly Lys Glu
195 200 205
Lys Asn Leu Leu Ile Ser Val Ile Glu Ser Leu Lys Lys Gln Gly Leu
210 215 220
Leu Leu Phe Ser Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Phe Asp Ile Ser Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser His Arg Phe Glu Ala Met Asp His Phe Ala Lys Cys Phe Leu
245 250 255
Ile Leu Arg Leu Glu Gly Ser Arg Val Glu Gly Gly Leu Gln Arg Ala
260 265 270
Gln Ala Asp Gly Arg Gly Trp Arg Ala Val Arg Val Asp Leu Val Ser
275 280 285
Pro Pro Ala Asp Arg Phe Ala Phe Thr Met Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Arg Met Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Phe Ala Arg Leu Glu Arg Gln
305 310 315 320
Met Leu Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Glu Phe
325 330 335
Leu Thr Ala Ala Thr Glu Lys Asp Ile Phe Asp His Leu Gly Leu Glu
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Gln Arg Asn Ala
355 360
<210> 42
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F57截短的新(孔雀鱼)古比鱼[
通过NCBI BLASTP计算与wt具有56.66的同一性百分比]
<400> 42
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Asn Glu Asn Lys Gly Phe Cys Leu Ala Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Phe Leu Pro Phe Thr Ile Val Arg Met Asn Asp Ile Gln
50 55 60
Gly Leu Pro Trp Met Gly Asp Gln Val Lys Arg Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Leu Glu Glu Gly Glu Ser Ser Lys Val Lys Glu Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Lys Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Tyr Arg Met Gly Leu Arg Thr Leu Glu Glu
115 120 125
Val Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ile Ser Arg Val Ser Lys Ala Glu Ala
145 150 155 160
Asp Ala Val Ser Leu Ile Val Lys Asp Thr Val Trp Lys Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Met
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Thr Pro Gly Pro Glu Glu Glu
195 200 205
Glu Glu Leu Leu His Lys Val Ile Asp Leu Trp Lys Lys Gln Gly Leu
210 215 220
Leu Leu Tyr Tyr Asp Ile Ile Glu Ser Thr Phe Glu Lys Thr Lys Leu
225 230 235 240
Pro Ser Arg Thr Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala
245 250 255
Ile Leu Lys Leu His Lys Gln Arg Val Asp Asn Gly Asn Ser Asn Gln
260 265 270
Ser Lys Glu Phe Asp Lys Glu Glu Thr Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg
275 280 285
Val Asp Leu Val Ile Thr Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu
290 295 300
Gly Trp Thr Gly Ser Ala Phe Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
305 310 315 320
Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys
325 330 335
Thr Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala
340 345 350
His Leu Gly Leu Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 43
<211> 362
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 43
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn His
1 5 10 15
Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Val Ser Cys Leu Pro Phe Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Ser Phe Pro Ile Val Ser Met Lys Asp Ile Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile Glu Gly Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Ser Lys
115 120 125
Ile Lys Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr His Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Met Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala Thr Glu Glu
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asn Phe Trp Arg Gln Gln
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Ile Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Gly Leu Val Arg Ser Glu Glu Ser
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Gly Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val
325 330 335
Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 44
<211> 366
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 44
Ser Val Val Glu Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
1 5 10 15
Leu Asn Asn His Asn Glu Val Phe Thr Arg Ala Phe Asp Ile Leu Ala
20 25 30
Glu Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg
35 40 45
Arg Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Ile Ser Met
50 55 60
Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Val
65 70 75 80
Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val
85 90 95
Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
100 105 110
Gly Val Gly Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg
115 120 125
Thr Leu Glu Lys Ile Lys Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met
130 135 140
Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Glu Arg Val Asn
145 150 155 160
Arg Ala Glu Ala Glu Ala Ile Glu Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val
165 170 175
Ala Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu
180 185 190
Gly Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu
195 200 205
Ala Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe
210 215 220
Trp Arg Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Ile Glu Ser Thr
225 230 235 240
Phe Glu Lys Phe Lys Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Ala Leu Asp His
245 250 255
Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gly Arg Val Val
260 265 270
Ser Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg
275 280 285
Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu
290 295 300
Gly Trp Thr Gly Ser Pro Phe Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
305 310 315 320
Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys
325 330 335
Thr Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala
340 345 350
His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 45
<211> 362
<212> PRT
<213> 乌干达红疣猴(Piliocolobus tephrosceles)
<400> 45
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Cys
1 5 10 15
Asn Gln Ile Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu Asn Cys Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Cys Val Thr Phe Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Ser Lys Val Lys Cys Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Ser Lys
115 120 125
Val Arg Ser Asp Glu Ser Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln Arg Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Ser Ala Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Met
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Thr Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu Gln Lys Val Met Asn Leu Trp Glu Lys Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Arg Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gln Arg Val Asp Ser Asp Gln Ser
260 265 270
Ser Trp Gln Gly Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Ile
325 330 335
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 46
<211> 362
<212> PRT
<213> 野猪(Sus scrofa)
<400> 46
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Cys
1 5 10 15
Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Thr Phe Cys Leu Ala Phe Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Arg Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Ser Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gln Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Met
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Thr Asp Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu Pro Lys Val Val Asn Leu Trp Glu Arg Glu
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Val Glu Ser Thr Leu Glu Lys Ser
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ser Arg Asn Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Gly Met Ser
260 265 270
Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Leu Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Ile
325 330 335
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 47
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> N27截短的新[通过NCBI BLASTP计算与wt具有88.13的同一性百分比]猪
<400> 47
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Ile Phe Thr Arg Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Tyr Val Thr Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Arg Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Ser Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Thr Glu Glu
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Gly Ser Gly Lys Ser
260 265 270
Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Ile
325 330 335
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 48
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> N35截短的新的(trunc new)
<400> 48
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Ile Phe Thr Arg Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Tyr Val Thr Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Glu Arg Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Ser Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Thr Glu Glu
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Arg Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Gly Ser Gly Lys Ser
260 265 270
Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Ala Phe Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Ile
325 330 335
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 49
<211> 361
<212> PRT
<213> 水牛(Bubalus bubalis)
<400> 49
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Ser Glu
20 25 30
Phe Lys Glu Asn Glu Val Ser Tyr Val Thr Phe Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Gln
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Ser Lys
115 120 125
Ile Thr Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Ile Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Gly Arg Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Arg Gln Phe Glu Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 50
<211> 362
<212> PRT
<213> 黄腹旱獭(Marmota flaviventris)
<400> 50
Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Cys
1 5 10 15
Asn Arg Val Phe Thr Asp Ala Phe Asp Val Leu Ala Glu Asn Tyr Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Ser Cys Ser Val Val Phe Met Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Arg Asp Leu Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Glu Gly Lys Ala Lys Ser Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Ser Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr His Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Ser Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Ile Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Asn Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Ala Glu Ala Thr Glu Glu
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asn Leu Trp Glu Lys Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Leu
225 230 235 240
Lys Thr Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Asp Lys Ala
260 265 270
Ser Gln Gln Gly Gly Lys Asn Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Ile
325 330 335
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 51
<211> 362
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 51
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Glu Arg Val Asn Arg Pro Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Ile Arg Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Met Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe Trp Lys Gln Gln
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe
225 230 235 240
Lys Gln Pro Ser Arg Thr Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Pro Arg Val His Ser Val Lys Ser
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val
325 330 335
Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 52
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (没有His标签&连接子的M57)牛科动物(bovine)-小鼠(mouse)嵌合体
<400> 52
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 53
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (没有His标签和连接子的M59)牛科动物(bovine)-小鼠(mouse)嵌合体
<400> 53
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Glu Arg Val Asn Arg Pro Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Ile Arg Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Met Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 54
<211> 362
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 54
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Cys Leu Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile Ile Glu Gly Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Ser Lys
115 120 125
Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Asn Arg Pro Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Met Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe Trp Lys Gln Gln
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe
225 230 235 240
Lys Gln Pro Ser Arg Thr Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Pro Arg Val His Ser Val Lys Ser
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val
325 330 335
Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 55
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M54 (来自822)
<400> 55
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Ile Phe Thr Arg Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Ser Glu
20 25 30
Phe Lys Glu Asn Glu Glu Ser Tyr Val Thr Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Ala Phe Phe Asn Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Arg Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 56
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 没有His标签的M77
<400> 56
Lys Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn
1 5 10 15
Tyr Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp
20 25 30
Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser
35 40 45
Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr
50 55 60
Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp
85 90 95
Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly
100 105 110
Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu
115 120 125
Lys Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala
130 135 140
Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu
145 150 155 160
Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu
165 170 175
Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys
180 185 190
Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu
195 200 205
Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser
260 265 270
Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val
325 330 335
Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 57
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有His标签的M77
<400> 57
Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Glu Lys
1 5 10 15
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
20 25 30
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
35 40 45
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
50 55 60
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
65 70 75 80
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
85 90 95
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
100 105 110
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
115 120 125
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
130 135 140
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
145 150 155 160
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
165 170 175
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
180 185 190
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
195 200 205
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
225 230 235 240
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
245 250 255
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
260 265 270
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
275 280 285
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
290 295 300
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
325 330 335
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
355 360 365
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 58
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 没有His标签的C1-40
<400> 58
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 59
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有His标签的C1-40
<400> 59
Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Glu Lys
1 5 10 15
Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr Asn
20 25 30
Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu Phe
35 40 45
Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser Val
50 55 60
Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile Ile
85 90 95
Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu Arg
100 105 110
Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg Lys
115 120 125
Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys Ile
130 135 140
Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala Glu
165 170 175
Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro Asp
180 185 190
Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile Gly
195 200 205
His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp Glu
210 215 220
Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly Leu
225 230 235 240
Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys Leu
245 250 255
Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu
260 265 270
Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn Gln
275 280 285
Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys
290 295 300
Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Pro
305 310 315 320
Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met
325 330 335
Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe Leu
340 345 350
Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr
355 360 365
Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 60
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 没有His标签的A2-20
<400> 60
Val Thr Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn
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20 25 30
Asp Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala
35 40 45
Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
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130 135 140
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala
145 150 155 160
Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe
165 170 175
Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys
180 185 190
Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala
195 200 205
Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys
210 215 220
Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
225 230 235 240
Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys
245 250 255
Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys
260 265 270
Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
275 280 285
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Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu
305 310 315 320
Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
325 330 335
Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
340 345 350
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 61
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有His标签的A2-20
<400> 61
Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Glu Asn
1 5 10 15
Val Thr Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn
20 25 30
Asn Tyr Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn
35 40 45
Asp Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala
50 55 60
Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp
65 70 75 80
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85 90 95
Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn
100 105 110
Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
115 120 125
Gly Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu
130 135 140
Glu Lys Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys
145 150 155 160
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala
165 170 175
Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe
180 185 190
Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys
195 200 205
Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys
225 230 235 240
Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
245 250 255
Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys
260 265 270
Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys
275 280 285
Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
290 295 300
Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
305 310 315 320
Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu
325 330 335
Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
340 345 350
Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
355 360 365
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 62
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 没有His标签的ii-ell-40
<400> 62
Val Ala Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn
1 5 10 15
Asn Tyr Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn
20 25 30
Asp Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala
35 40 45
Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp
50 55 60
Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu
65 70 75 80
Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn
85 90 95
Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
100 105 110
Gly Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu
115 120 125
Glu Lys Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys
130 135 140
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala
145 150 155 160
Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe
165 170 175
Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys
180 185 190
Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala
195 200 205
Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys
210 215 220
Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
225 230 235 240
Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys
245 250 255
Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys
260 265 270
Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
275 280 285
Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
290 295 300
Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu
305 310 315 320
Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
325 330 335
Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
340 345 350
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 63
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有His标签的ii-ell-40
<400> 63
Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Glu Asn
1 5 10 15
Val Ala Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn
20 25 30
Asn Tyr Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn
35 40 45
Asp Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala
50 55 60
Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp
65 70 75 80
Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu
85 90 95
Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn
100 105 110
Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
115 120 125
Gly Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu
130 135 140
Glu Lys Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys
145 150 155 160
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala
165 170 175
Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe
180 185 190
Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys
195 200 205
Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys
225 230 235 240
Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
245 250 255
Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys
260 265 270
Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys
275 280 285
Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
290 295 300
Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
305 310 315 320
Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu
325 330 335
Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
340 345 350
Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
355 360 365
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 64
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 没有His标签的9-40
<400> 64
Val Ala Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn
1 5 10 15
Asn Tyr Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn
20 25 30
Asp Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala
35 40 45
Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn
85 90 95
Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
100 105 110
Gly Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu
115 120 125
Glu Lys Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys
130 135 140
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala
145 150 155 160
Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe
165 170 175
Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys
180 185 190
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195 200 205
Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys
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Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
225 230 235 240
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260 265 270
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275 280 285
Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
290 295 300
Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu
305 310 315 320
Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
325 330 335
Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
340 345 350
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 65
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有His标签的9-40
<400> 65
Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Glu Asn
1 5 10 15
Val Ala Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn
20 25 30
Asn Tyr Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn
35 40 45
Asp Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala
50 55 60
Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp
65 70 75 80
Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu
85 90 95
Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn
100 105 110
Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
115 120 125
Gly Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu
130 135 140
Glu Lys Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys
145 150 155 160
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala
165 170 175
Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe
180 185 190
Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys
195 200 205
Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys
225 230 235 240
Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
245 250 255
Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys
260 265 270
Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys
275 280 285
Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
290 295 300
Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
305 310 315 320
Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu
325 330 335
Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
340 345 350
Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
355 360 365
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
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<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (45-751)(loop2 his标签)
<400> 66
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Glu Asn Asp Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg
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Arg Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val
85 90 95
Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
100 105 110
Gly Val Gly Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg
115 120 125
Thr Leu Glu Glu Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met
130 135 140
Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp
165 170 175
Ala Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu
180 185 190
Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly
195 200 205
Ser Ala Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp
210 215 220
Glu Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Leu
225 230 235 240
Glu Lys Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe
245 250 255
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Gln Arg Val Asp Ser
260 265 270
Ser Lys His His His His His His Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val
275 280 285
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
290 295 300
Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
305 310 315 320
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
325 330 335
Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
340 345 350
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360 365
<210> 67
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> (46-737)(loop2 his标签)
<400> 67
Met Ala His His Gly Ser Glu Lys Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln
1 5 10 15
Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu
20 25 30
Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg
35 40 45
Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro
50 55 60
Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys
65 70 75 80
Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu
85 90 95
Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe
100 105 110
Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg
115 120 125
Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Glu Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg
130 135 140
Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val
145 150 155 160
Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys
165 170 175
Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly
180 185 190
Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile
195 200 205
Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val
210 215 220
Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val
225 230 235 240
Glu Ser Thr Leu Glu Lys Phe Lys Arg Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr
245 250 255
Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Gln
260 265 270
Arg Val Asp Ser Ser Lys His His His His His His Glu Thr Trp Lys
275 280 285
Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe
290 295 300
Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg
305 310 315 320
Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu
325 330 335
Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu
340 345 350
Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn
355 360 365
Ala
<210> 68
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 没有N末端His标签的TdT-M96
<400> 68
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Glu
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asn Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 69
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有N末端His标签的TdT-M96
<400> 69
Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Glu Lys
1 5 10 15
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
20 25 30
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
35 40 45
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
50 55 60
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
65 70 75 80
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
85 90 95
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
100 105 110
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
115 120 125
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Glu
130 135 140
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
145 150 155 160
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
165 170 175
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
180 185 190
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
195 200 205
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
225 230 235 240
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asn Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
245 250 255
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
260 265 270
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
275 280 285
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
290 295 300
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
325 330 335
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
355 360 365
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 70
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 没有N末端His标签的TdT-M103
<400> 70
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Val Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Arg Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 71
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有N末端His标签的TdT-M103
<400> 71
Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Glu Lys
1 5 10 15
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
20 25 30
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Val Glu Asn Asp Glu
35 40 45
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
50 55 60
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
65 70 75 80
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
85 90 95
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
100 105 110
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
115 120 125
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
130 135 140
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
145 150 155 160
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
165 170 175
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
180 185 190
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
195 200 205
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
225 230 235 240
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Arg Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
245 250 255
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
260 265 270
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
275 280 285
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
290 295 300
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
325 330 335
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
355 360 365
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375

Claims (21)

1.用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的设备，所述设备包括：
(a)多个反应室，每个反应室具有连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；
(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；
(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述反应室中，所述反应溶液包含3’-O-保护的核苷三磷酸、去保护溶液和无模板聚合酶；
(d)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列；和
(e)在操作上与所述用户界面、所述反应室、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统将每个多核苷酸的预定序列分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下，将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中以预定速率去除去保护溶液。
2.如权利要求1所述的设备，其还包括用于测量每个所述反应室中的液位的一个或多个液位传感器，并且其中所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中以预定速率去除去保护溶液，以及(iv)用所述一个或多个液位传感器测量每个所述反应室中的液位，并且每当鉴定出液位在预定边界之外的反应室时，在随后的试剂输送步骤中绕过鉴定的反应室。
3.如权利要求1或2所述的设备，其中所述多个反应室在定位在所述设备中的第一位置的平面合成板中均匀间隔，并且其中所述设备还包括(i)定位在所述设备中的第二位置的多核苷酸分离板，其中所述多核苷酸分离板包括平面阵列中间隔的多个室以与所述合成板的多个反应室的出口对齐，所述多核苷酸分离板的每个室具有入口、出口和用于分离多核苷酸的分离材料，和(ii)在操作上与所述控制系统、所述合成板和所述多核苷酸分离板关联的板移动器，使得在来自所述控制系统的指令下，所述板移动器移动所述合成板和所述多核苷酸分离板，使得在所述第一或第二位置处，所述多核苷酸分离板在操作上安装在废物歧管上，并且所述合成板在操作上安装在所述多核苷酸分离板上，使得每当在所述合成板的反应室之间建立正压差时，在每个反应室中的废物歧管分离试剂通过所述分离板的室流到所述废物歧管。
4.如权利要求1或2所述的设备，其中所述多个反应室在定位在所述设备中的第一位置的平面合成板中均匀间隔，并且其中所述设备还包括(i)定位在所述设备中的第二位置的多核苷酸分离板，其中所述多核苷酸分离板包括平面阵列中间隔的多个室以与所述合成板的多个反应室的出口对齐，所述多核苷酸分离板的每个室具有入口、出口和用于分离多核苷酸的分离材料，和(ii)在操作上与所述控制系统、所述合成板和所述多核苷酸分离板关联的移液器，使得在来自所述控制系统的指令下，所述移液器将每个反应室的内容物移动到所述多核苷酸分离板的单独室。
5.如权利要求1-4中任一项所述的设备，其中所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中以预定速率去除去保护溶液，(iv)将洗涤溶液输送至所述反应室，以及(v)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差以从所述反应室中以预定速率去除洗涤溶液。
6.用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的设备，所述设备包括：
(a)多个反应室，每个反应室具有设置在其中的连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；
(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；
(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述反应室中，所述反应溶液包含3’-O-保护的核苷三磷酸、去保护溶液、无模板聚合酶和蛋白酶溶液；
(d)一个或多个液位传感器，其用于测量各个反应室中液位的变化率；
(e)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列；和
(f)在操作上与所述用户界面、所述反应室、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统将每个多核苷酸的预定序列分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下，将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生预定的压差以从所述反应室中去除去保护溶液，(iv)将洗涤溶液输送至所述反应室中，(v)在所述反应室与所述废物歧管之间产生预定的压差以从所述反应室中去除洗涤溶液，以及(vi)用所述一个或多个液位传感器测量一部分所述反应室的每一个中的液位的变化率，并且每当检测到液体去除速率低于预定速率的反应室时，启动校正动作；其中在反应室中在步骤(i)中接触的3’-保护的核苷三磷酸的种类由分配至所述反应室的预定序列确定。
7.如权利要求6所述的设备，其中所述控制系统在所述去保护溶液的去除期间或在所述洗涤溶液的去除期间指导(iv)所述液位的变化率的测量。
8.如权利要求6或7所述的设备，其中所述校正动作包括将所述蛋白酶溶液输送至液体去除速率低于所述预定速率的所述反应室的其它步骤。
9.如权利要求6或7所述的设备，其中所述校正动作包括在随后的试剂输送步骤中绕过液体去除速率低于所述预定速率的所述反应室的其它步骤。
10.如权利要求6-9中任一项所述的设备，其中所述多个反应室的范围为24至100，并且所述一个或多个液位传感器的范围为2至32个液位传感器。
11.如权利要求6-9中任一项所述的设备，其中所述多个反应室的范围为200至1600，并且所述一个或多个液位传感器的范围为32至50个液位传感器。
12.如权利要求6-11中任一项所述的设备，其中所述控制系统指导以下的重复步骤：(i)在偶联条件下，将3’-O-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶输送至所述引发剂或去保护的延长片段，其中所述偶联条件包括预定的偶联孵育时间和孵育温度，以允许引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段通过所述3’-O-保护的核苷三磷酸延长以形成3’-O-保护的延长片段，(ii)将所述去保护溶液输送至所述反应室，使得所述3’-O-保护的延长片段去保护，(iii)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差以从所述反应室中以预定速率去除去保护溶液，(iv)将洗涤溶液输送至所述反应室中，以及(v)在所述反应室与所述废物歧管之间产生压差以从所述反应室中以预定速率去除洗涤溶液。
13.如权利要求6-12中任一项所述的设备，其中所述多个反应室在定位在所述设备中的第一位置的平面反应板中均匀间隔，并且其中所述设备还包括(i)定位在所述设备中的第二位置的多核苷酸分离板，其中所述分离板包括平面阵列中间隔的多个室以与所述反应板的多个反应室的出口对齐，所述分离板的每个室具有入口、出口和用于分离多核苷酸的分离材料，和(ii)在操作上与所述控制系统、所述反应板和所述分离板关联的板移动器，使得在来自所述控制系统的指令下，所述板移动器移动所述反应板和所述分离板，使得在所述第一或第二位置处，所述分离板在操作上安装在废物歧管上，并且所述反应板在操作上安装在所述分离板上，使得每当在所述反应板的反应室之间建立正压差时，在每个反应室中的废物歧管分离试剂通过所述分离板的室流到所述废物歧管。
14.用于在自动合成仪上实施多个多核苷酸的酶促合成的套件，所述套件包括具有多个反应孔的合成板，其中每个反应孔含有预定量的合成支持物材料，所述合成支持物材料具有在粘性湿润剂溶液或可溶解凝胶中连接的引发剂。
15.如权利要求14所述的套件，其中所述合成板被封闭在气密包装材料中。
16.如权利要求15所述的套件，其中所述合成板被真空包装在包含塑料或箔的包装材料中。
17.如权利要求14-16中任一项所述的套件，其中所述合成板包括96孔或384孔。
18.如权利要求14-17中任一项所述的套件，其中所述粘性湿润剂溶液具有相当于范围为40-60％(v/v)的甘油:水溶液的粘度。
19.如权利要求18所述的套件、其中所述粘性湿润剂溶液包括甘油、醇糖、乙基己基甘油、泛醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、己二醇、丁二醇、乳酸钠、透明质酸或聚右旋糖。
20.如权利要求14-19中任一项所述的套件，其还包括含有包含3’-O-保护的dATP的溶液的容器、含有包含3’-O-保护的dCTP的溶液的容器、含有包含3’-O-保护的dGTP的溶液的容器、含有包含3’-O-保护的dTTP的溶液的容器、含有包含无模板聚合酶的溶液的容器和含有去保护溶液的容器。
21.如权利要求20所述的套件，其中所述无模板聚合酶是TdT变体，所述3’-O-保护的-dATP是3’-O-氨基-dATP，所述3’-O-保护的-dCTP是3’-O-氨基-dCTP，所述3’-O-保护的-dGTP是3’-O-氨基-dGTP，以及所述3’-O-保护的-dTTP是3’-O-氨基-dTTP。
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