JP2023531620A - 酵素的ポリヌクレオチド合成のためのシステム、装置及びキット - Google Patents
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Abstract
本発明は、テンプレートフリーポリメラーゼを使用して反応チャンバーのアレイ内で複数のポリヌクレオチドを自動合成するためのシステム、装置及びキットを対象とする。幾つかの実施態様では、酵素凝集による合成プロセスと流体移動の乱れをモニターし制御するために適応要素及びプロセスが提供される。【選択図】なし
Description
ポリヌクレオチド合成に対する酵素的手法への関心が、合成生物学、CRISPR-Cas9の応用、ハイスループットシークエンシングなどの多くの領域における合成ポリヌクレオチドに対する需要が増加しているためだけでなく、ポリヌクレオチド合成に対する化学的手法の限界、例えば不活性雰囲気及び湿気のない環境下で多段階合成反応を実施することの難しさ、生成物の長さの限界、有機溶媒の使用と必要とされる廃棄などのため、最近増加している。例えばJensen等,Biochemistry,57:1821-1832(2018);Sindalar等,Nucleic Acids Research,23(6):982-987(1995);Lashkari等,Proc.Natl.Acad.Sci.,92:7912-7915(1995);Hargreaves等,Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids,34:691-707(2015)。酵素的合成は、酵素の特異性と効率のためだけでなく、取り扱いを簡素化し、危険な試薬の必要性を排除するその穏やかな水性反応条件の使用のため、魅力的である。
他方、酵素の使用は、限定されないが、表面への酵素の付着、酵素活性を維持するための厳密な温度及びpH制御の必要性、不活性及び/又は細孔若しくはノズルの詰まりをもたらす酵素の凝集、合成担体若しくはその近くでの酵素活性の変動、バッチ間での酵素比活性の差、試薬の移動及び分離を阻害する気泡若しくはバブルの形成などを含む、装置において多段階合成反応を自動化するための他の一連の問題を提起する。
上記に鑑みると、自動合成装置において酵素及び水性反応混合物及び試薬を使用する際に生じる問題に対処する方法及び装置が利用可能であれば、テンプレートフリーポリメラーゼを使用するポリヌクレオチドのパラレル合成が進められるであろう。
本発明は、別個の反応チャンバー又はサイトで複数のポリヌクレオチドを並行して酵素的に合成するためのシステム、装置及びキットに関する。幾つかの実施態様では、本発明のシステム、装置及びキットは、ポリ-2’-デオキシリボヌクレオチド(又はDNA)であるポリヌクレオチドの自動合成を実施し;他の実施態様では、本発明のシステム、装置及びキットは、ポリリボヌクレオチド(又はRNA)であるポリヌクレオチドの自動合成を実施する。
一態様では、本発明は、次の構成要素:(a)イニシエーターが結合した合成担体を各反応チャンバーが有する複数の反応チャンバーであって、各イニシエーターが遊離3’-ヒドロキシルを有し、各反応チャンバーが入口と出口と、合成担体を保持し、反応チャンバーを出る反応溶液がフィルターを通過するように出口に作用可能に関連付けられたフィルターとを有する、反応チャンバー;(b)反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に正の圧力差が確立されるときはいつでも、反応溶液が反応チャンバーから除去され、廃棄物マニホールドに入るように、反応チャンバーの出口と作用可能に関連付けられた廃棄物マニホールド;(c)反応溶液を反応チャンバーに送達するための流体送達システムであって、反応溶液が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェート、脱保護溶液;及びテンプレートフリーポリメラーゼを含む流体送達システム;(d)合成されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を受け入れるためのユーザーインターフェース;及び(e)ユーザーインターフェース、反応チャンバー、流体送達システム、及び廃棄物マニホールドに作用可能に関連付けられた制御システムであって、合成のために反応チャンバーに各ポリヌクレオチドの予め決まった配列を割り当て、各反応チャンバーについて、(i)カップリング条件下でイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液を反応チャンバーに送達するステップ、及び(iii)予め決まった率で反応チャンバーから脱保護溶液を除去する圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップの繰り返しを指示する制御システムを含む、テンプレートフリーポリメラーゼを用いて、各々が予め決まった配列を有する複数のポリヌクレオチドを合成するためのシステム及び装置を含む。
幾つかの実施態様では、上記システム及び装置は、反応チャンバーの各々における液体レベルを測定するための一又は複数の液体レベルセンサーを更に含み、前記制御システムは、(i)カップリング条件下でイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液を反応チャンバーに送達するステップ、(iii)予め決まった率で反応チャンバーから脱保護溶液を除去する圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップ、及び(iv)前記反応チャンバーの各々における液体レベルを一又は複数の液体レベルセンサーで測定し、反応チャンバーの液体レベルが予め決まった限界外にあると特定されるときはいつでも、特定された反応チャンバーをその後の試薬送達ステップでバイパスするステップの繰り返しを指示する。
幾つかの実施態様では、各々が予め決まった配列を有する複数のポリヌクレオチドを酵素的に合成するためのシステム及び装置は、次の構成要素:(a)イニシエーターが結合した合成担体を各反応チャンバーが有する複数の反応チャンバーであって、各イニシエーターが遊離3’-ヒドロキシルを有し、各反応チャンバーが入口と出口と、合成担体を保持し、反応チャンバーを出る反応溶液がフィルターを通過するように出口に作用可能に関連付けられたフィルターとを有する、反応チャンバー;(b)反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に正の圧力差が確立されるときはいつでも、反応溶液が反応チャンバーから除去され、廃棄物マニホールドに入るように反応チャンバーの出口と作用可能に関連付けられた廃棄物マニホールド;(c)反応溶液を反応チャンバーに送達するための流体送達システムであって、反応溶液が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェート、脱保護溶液、テンプレートフリーポリメラーゼ及びプロテアーゼ溶液を含む流体送達システム;(d)個々の反応チャンバー内の液体レベルの変化率を測定するための一又は複数の液体レベルセンサー;(e)合成されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を受け入れるためのユーザーインターフェース;及び(f)ユーザーインターフェース、反応チャンバーのアレイ、流体送達システム及び廃棄物マニホールドに作用可能に関連付けられた制御システムであり、合成のために反応チャンバーに各ポリヌクレオチドの予め決まった配列を割り当て、且つ各反応チャンバーについて、(i)カップリング条件下でイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液を反応チャンバーに送達するステップ、(iii)反応チャンバーから脱保護溶液を除去する、予め決まった圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップ、(iv)洗浄溶液を反応チャンバーに送達するステップ、(v)反応チャンバーから洗浄溶液を除去する、予め決まった圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップ、及び(vi)反応チャンバーの一部の各々における液体レベルの変化率を一又は複数の液体レベルセンサーで測定し、反応チャンバーの液体除去率が予め決まった率を下回るときはいつでも修正動作が作動されるステップの繰り返しを指示する制御システムであって;反応チャンバー内でステップ(i)において接触される3’-保護ヌクレオシドトリホスフェートの種類が、反応チャンバーに割り当てられた予め決まった配列によって決定される制御システムを含む。幾つかの実施態様では、修正動作は、液体除去率が前記予め決まった率を下回る反応チャンバーにプロテアーゼ溶液を送達する更なるステップを含む。幾つかの実施態様では、修正動作は、液体除去率が予め決まった率を下回る反応チャンバーへ後続の試薬送達ステップにおいてバイパスする更なるステップを含む。幾つかの実施態様では、修正動作は、反応チャンバーを空にするために使用される真空の強度を増加させることを含む。
本発明のこれらの上に特徴付けられた態様並びに他の態様は、その幾つかが図に示され、続く特許請求の範囲において特徴付けられる、多くの例証された実施形態び応用形態において実証される。しかし、上記の概要は、本発明の各々の例証された実施態様又はあらゆる実施形態を記載することは意図していない。
本発明の一般原理は、図面に示され、詳細に記載されているものなど、特に実施例によってここにより詳細に開示される。しかしながら、記載された特定の実施態様に本発明を限定する意図はないことを理解されたい。本発明では、幾つかの実施態様についてその詳細が示されている、様々な修正及び代替形態が適している。その意図は、本発明の原理及び範囲内にある全ての修正、均等物、及び代替物を網羅することである。特定の機能を実施する材料及びコンポーネントを選択するためのガイダンスは、限定されないが、Moore等,Building Scientific Apparatus,第3版(Perseus Books,Cambridge,MA);Hermanson,Bioconjugate Techniques,第3版(Academic Press,2013);及び類似文献を含む、科学機器に関する入手可能な論文及び参考文献に見出されうる。
一態様では、本発明は、テンプレートフリーポリメラーゼを使用して、アドレス可能な反応チャンバーのアレイ内で予め決まった配列の複数のポリヌクレオチドを並行して酵素合成するためのシステム及び装置を対象とする。すなわち、本発明のシステム及び装置は、各ポリヌクレオチドについて図1に示される合成スキームを使用して、予め決まった配列の複数のポリヌクレオチドの合成を自動的に実施する。ポリヌクレオチド配列に関して「予め決まった」という用語は、例えばランダム配列タグ又はバーコードの合成における、予め決まった位置へのランダム配列の配置を含むことが理解される。幾つかの実施態様では、本発明のシステムは、その実施が特定の方法ステップの実施を含む本発明の装置を含む。幾つかの実施態様では、本発明のシステム及び装置は、その合成担体からの合成ポリヌクレオチドの切断又は切り離しと、切断又は切り離しされたポリヌクレオチド生成物の単離を更に実施しうる。幾つかの実施態様では、本発明のシステム及び装置は、(i)各反応ウェルが、入口又は開口部を通して反応物質、洗浄溶液、合成担体を受け入れ、そのような反応物質、洗浄溶液及び合成担体を予め決まったインキュベーション時間の間、保持し、そのような反応物及び洗浄溶液を、合成担体を保持するフィルターに作用可能に関連付けられた出口を通して除去することができる、複数の反応ウェルであって、規則的、例えば直線的な平面アレイで通常、提供される複数の反応チャンバー、(ii)反応チャンバー内の流体を反応チャンバー出口を通って廃棄物マニホールドに流す正の圧力差が反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に確立されるときはいつでも、反応チャンバーから除去された反応物と洗浄溶液を受け入れるための反応チャンバーの出口と作用可能に関連付けられた廃棄物マニホールド、(iii)制御システムの制御下で試薬を貯蔵し反応チャンバーに送達するための流体送達システム、(iv)例えば、ユーザーによる直接入力、又は別のデバイス、例えばパーソナルコンピューター、携帯電話などからの送信を介して、ポリヌクレオチド配列を受け入れ、プロセスオプション、推奨事項、及び警告をユーザーに表示するためのユーザーインターフェース、(v)反応チャンバー内でポリヌクレオチド合成を行うため、加えてプロセスデータを収集して保存し、エラーを管理し、且つプロセスデータ解析に基づき、適応プロセス、すなわち修正動作を実施するために、流体送達システム、廃棄物マニホールド、及び反応チャンバーの動作を制御するための制御システム、及び(vi)また制御システムの制御下で、合成サイクル中に反応ウェルからの流体除去をモニターし、流体の除去の失敗又は不適切な流体除去を検出するための液体レベルセンサーを含む。幾つかの実施態様では、本発明の装置は、予備的(すなわち、合成前)ポリメラーゼ活性アッセイを実施するための構成要素を更に含みうる。アッセイの結果に基づいて、制御システムはカップリング反応のインキュベーション時間と温度を調整して収量を最適化することができ、又は極端な場合には、試薬を変更すべきことをユーザーインターフェイスを介してユーザーに推奨することができる。幾つかの実施態様では、本発明の装置及びシステムは、ポリヌクレオチド生成物をそれらの合成担体から切断し、切断された生成物を単離するための構成要素を含みうる。これらの実施態様は、使用される切断機構と使用される単離方法に応じて大きく変わりうる。幾つかの実施態様では、切断後、ゲル濾過又はガラスなどのシリカ系材料への吸着を含む、一般的な精製技術によって単離が達成される。而して、そのような実施態様では、(複数の反応チャンバーを含む)合成プレートと互換性のある市販のDNA単離プレートを用い、一般的なプレートムーバー又は装置の他のロボットコンポーネントによって配置することができる。例示的な市販の単離プレートは、Invitek Molecular(ベルリン)、Enzymax(ケンタッキー州レキシントン)、Qiagen(サンディエゴ)、又は類似の業者から入手可能である。そのような市販の単離プレートは、典型的には、製造業者の推奨プロトコルに従って使用される。本発明で使用するための例示的なプレートムーバーは、ステーション間の輸送のためのトラック上の動きと連動した簡単な特注のプレート把持構成要素を含み得、或いはプレートムーバーは、Spinnakerマイクロプレートロボット(ThermoFisher)などの市販のロボットを含みうる。そのようなプレートムーバーは、合成プレート及び/又はDNA単離プレートを、切断及び単離が行われるようにそれらが互いに適切な関係になるように移動させる。幾つかの実施態様では、切断されたポリヌクレオチド生成物は、クロマトグラフィーによって、例えば、96ウェル合成プレートを使用する実施態様では、適切な充填材料と共に、RepligenのOPUS(登録商標)RoboColumn(登録商標)プレートなどを使用して、単離することができる。
本発明の装置によって合成される複数のポリヌクレオチドの大きさは、広く変わりうる。幾つかの実施態様では、複数は、2から10000、又は2から5000、又は2から2000、又は2から500、又は2から100の範囲でありうる。他の実施態様では、複数は、100から2000、又は100から500の範囲でありうる。幾つかの実施態様では、複数のポリヌクレオチドは、24ウェル、48ウェル、96ウェル、384ウェル、又は1536ウェルプレートなどの標準的な市販のマルチウェルプレートにおけるウェルの数に等しいか又はそれより少ない。幾つかの実施態様では、複数のポリヌクレオチドは、平面アレイ内における反応チャンバー又は反応ウェルの数と同じか又はそれより少ない。複数のポリヌクレオチドの長さは、同じであっても異なっていてもよく、幾つかの実施態様では、10から1000ヌクレオチドの間で変わりうる。他の実施態様では、本発明のシステム及び装置によって合成されるポリヌクレオチドの長さは、10から500ヌクレオチドの間、又は10から200ヌクレオチドの間、又は10から100ヌクレオチドの間で変わりうる。
複数の各反応チャンバーは、入口と出口と、液体試薬が出口を通して反応チャンバーから除去されるときはいつでも反応チャンバー内に合成担体材料を保持することができる、出口と作用可能に関連付けられたフィルターとを有する。幾つかの実施態様では、本発明で使用するための反応チャンバーのアレイは、例えばPall、Agilent、ThermoFisher又は類似の会社から入手できる市販の24ウェル、48ウェル、96ウェル、384ウェル、又は1536ウェルのフィルタープレートでありうる。幾つかの実施態様では、反応チャンバーの容積は、0.5μLから10mLの範囲、又は1.0μLから5mLの範囲、又は2.0μLから5mLの範囲、又は5μLから5mLの範囲、又は1.0μLから400μLの範囲でありうる。反応チャンバーの典型的な作業反応容積は、反応チャンバー容積の50%から75%の範囲である。幾つかの実施態様では、反応チャンバーは、試薬への曝露及び酵素合成プロセスの条件下で不活性で安定である材料を含む平面基体に形成される。例示的な材料には、限定されないが、ナイロン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)などが含まれる。図2Aは、直線状アレイに配置された反応チャンバー(この場合は、ウェル(202))のアレイ又はプレート(200)を示し、アレイ又はプレート内の各ウェルは、特に制御システムがアレイ内の任意の予め決まったウェル(S1、S2...Sn)に予め決まった試薬を正確に送達するようにプログラムできるという意味でアドレス可能である。他の実施態様では、反応チャンバーのアレイは、六角形状、同心状などの異なる配置を有していてもよい。幾つかの実施態様では、複数のポリヌクレオチドの各々の異なるポリヌクレオチドが、異なる反応チャンバー内で合成される。
各反応チャンバーは、合成中に単量体がカップリングされるイニシエーターを結合させた合成担体材料を含む。以下により完全に記載されるように、該システム及び装置で用いられる合成担体のタイプは、サイズと組成の両方において広く変わりうる。幾つかの実施態様では、合成担体は、反応チャンバーのフィルターを含みうる。幾つかの実施態様では、合成担体は、反応チャンバーから分離され、反応チャンバー内に配されうる。例えば、幾つかの実施態様では、合成担体は固体粒子又はビーズである。そのような固体粒子又はビーズは、合成が合成担体材料の表面上で起こる非多孔性固体粒子又はビーズ、又は合成が合成担体材料の表面と内部の両方で起こるゲル粒子又は樹脂などの多孔性固体粒子又はビーズの何れかを含みうる。幾つかの実施態様では、複数の反応チャンバーは、イニシエーターが結合した予め決まった量の合成担体を各々が含む、例えば一般的な96ウェル又は384ウェル型式のウェルのアレイを含む合成プレートの形態でありうる。以下により完全に記載されるように、幾つかの実施態様では、そのような合成プレートは、ウェルに堆積された予め決まった体積の粘性湿潤剤溶液中に配された合成担体を含みうる。粘性湿潤剤は、ウェル内の合成担体を乾燥から保護し、担体を固定化又は局在化して、ウェル内の動きを最小限に抑えるか又は排除する。幾つかの実施態様では、そのような合成担体は、真空包装形態、例えば、プラスチック、マイラー、金属箔又は他の保護材料に真空包装された形態でユーザーに提供される。そのような真空包装された合成プレートを製造するための器具には、Kitchenbossのような単純な器具又は類似の器具が含まれる。幾つかの実施態様では、保湿剤は、グリセロール、アルコール糖、エチルヘキシルグリセリン、パンテノール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ブチレングリコール、乳酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ポリデキストロースなどから選択される。幾つかの実施態様では、そのような湿潤剤は、40~60パーセント(v/v)グリセロール:水の範囲のグリセロール/水溶液と同等の粘度を有する。幾つかの実施態様では、保湿剤は、50パーセント(v/v)のグリセロール:水溶液である。ここで使用される場合、「湿潤剤」は、水分を引き込んで保持する任意の吸湿性物質である。幾つかの実施態様では、合成プレートは、二種以上の湿潤剤の混合物を、又は異なるウェル内に異なる湿潤剤を含みうる。幾つかの実施態様では、粘性湿潤剤とは別個に、又は粘性湿潤剤と一緒に、合成担体を、ジスルフィド安定化ヒドロゲルのような溶解性ヒドロゲルなどの溶解性ゲルに固定化又は局在化されうる。例えば、Chong等,Small,5(22):2601-2610(2009);Lu等,Burns & Trama,6:35(2018);Konieczynska等,Acc Chem Res,50(2):151-160)等々。
反応チャンバー又は反応チャンバーのアレイに関連したフィルターは、反応チャンバーの一又は複数の出口に接合され、又は液密的にマウントされたフィルター材料の平面シートでありうる。典型的には、フィルターは、酵素合成プロセスの試薬及び条件に対して不活性で、安定な材料で製作されている。例えば、そのような濾過膜は、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セルロース、ナイロン、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ガラス繊維、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリ塩化ビニル、アクリル共重合体、酸化アルミニウム、ポリエステルなどを含みうる。幾つかの実施態様では、フィルター材料は、例えば、インキュベーション中にフィルターを介して水性試薬が漏出するのを防止するために疎水性であるか、又は疎水性になるように処理されている。幾つかの実施態様では、フィルターはPTFE、PVDF又はポリプロピレンを含む。
反応チャンバーのフィルター材料の孔径、孔径分布、細孔密度、及び類似の特性は、それが合成担体材料を保持するが、反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間の圧力差の適用時にタンパク質と他の試薬の通過を可能にするように選択される。従って、幾つかの実施態様では、選択される孔径は、合成担体材料の性質に部分的に依存する。幾つかの実施態様では、合成担体が一般的な固体又はゲル粒子又はビーズ(例えば、>40μm径)である場合、0.1μmから10.0μmの範囲の平均径を持つ細孔を有するフィルターを用いることができ;又は他の実施態様では、0.1μmから1.0μmの範囲の平均径を持つ細孔を有するフィルターを用いることができる。幾つかの実施態様では、0.45μmの細孔又は1.2μmの細孔を有する市販の96ウェル及び384ウェルのフィルタープレートを使用することができる。幾つかの実施態様では、用いられるフィルターは、1cm2当たり1から106個の細孔の範囲の細孔密度を有する。例えば、ポリマー担体などの可溶性合成担体が用いられる幾つかの実施態様では、ナノ濾過を使用することができる。ナノ濾過は、例えば、1nmから50nmの範囲、又は1nmから10nmの範囲の平均孔径(又は直径)を有するフィルターを使用して達成することができる。
幾つかの実施態様では、複数の反応チャンバーの幾らかは、例えば、合成の開始前に、テンプレートフリーポリメラーゼの活性を測定することに特化されうる。この目的に使用される反応チャンバーの数は、(i)単一のテンプレートフリーポリメラーゼが用いられるか、二種以上のテンプレートフリーポリメラーゼが用いられるかどうか、(ii)繰り返しの測定が望ましいかどうか、(iii)テンプレートフリーポリメラーゼが反応チャンバーへ分離した試薬として送達されるか、又はテンプレートフリーポリメラーゼが3’-O-保護dNTPをまた含む混合物として保存され、送達されるかどうかを含む、幾つかの要因に依存する。幾つかの実施態様では、テンプレートフリーポリメラーゼ活性を測定するために使用される反応チャンバーの数は、1から12、又は1から8、又は1から4の範囲であり;他の実施態様では、複数の反応チャンバの一部が使用されて、テンプレートフリーポリメラーゼ活性が試験され;更に他の実施態様では、そのような一部は、複数の反応チャンバーの最大10パーセント;又は複数の反応チャンバーの最大5パーセント;又は複数の反応チャンバーの最大2パーセントでありうる。幾つかの実施態様では、テンプレートフリーポリメラーゼ活性を測定するために使用される反応チャンバーは、同じ複数の、又は合成プレートの他の反応チャンバーと同一である。違いは、制御システムが、活性アッセイを実施するために使用される反応チャンバーの数と位置又はアドレスを指定することである。
一実施態様では、本発明のシステム及び装置で使用されるテンプレートフリーポリメラーゼの活性アッセイは、光学的読み取り、例えば、蛍光強度と活性の間の線形関係のような、活性と単調な関係を有する蛍光強度を提供する。本発明で使用されうる活性の特定の光学読み取りアッセイは、Batule等,Artificial Cells,Nanomedicine,and Biotechnology,47(1):256-259(2019)によって開示されたものである。簡単に言えば、Batule等は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)によってイニシエーターに取り込まれるまでFe(III)によってクエンチされるBODIPY標識dATP単量体を開示している。dATPアナログの合成は、Lin等,Biosensors and Bioelectronics,77:242-248(2016)によって記載されている。取り込まれると、Fe(III)ベースのクエンチングが止まり、BODIPY部分が取り込み量に比例する強度で蛍光を発する。従って、アッセイを実施するには、試験されるテンプレートフリーポリメラーゼとBODIPY標識dATPを、イニシエーターを含む指定された反応チャンバーに送達することだけが必要とされる。テンプレートフリーポリメラーゼが3’-O-保護単量体との混合物で送達される本発明の実施態様では、4つ全てのテンプレートフリーポリメラーゼ混合物の活性を試験する場合、少なくとも4つの反応チャンバーを使用する必要がある。
本発明の装置及びシステムは、複数の反応チャンバーと作用可能に関連付けられた少なくとも一の廃棄物マニホールドと、反応チャンバー内の流体を反応チャンバーのフィルターを通して廃棄物マニホールド(及び続いて廃棄物容器)に流れさせる正の圧力差を全ての反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に同時に生じさせるための制御システムとを含む。正の圧力差は、(例えば、Skold等の米国特許第5273718号に記載されているように)反応チャンバーに圧力ヘッドを適用することによって、又は(例えば、Sindelar等,Nucleic Acids Research,23(6):982-987(1995)に記載されているように)廃棄物マニホールドチャンバーに真空を適用することによって生じさせることができる。本発明で使用される例示的な真空マニホールドには、MilliporeHTSTM真空マニホールド、BioTek ELx405TM真空濾過モジュールなどが含まれる。例示的な合成プレートには、96ウェル又は384ウェル型式のこれらのマニホールド用のフィルタープレートが含まれる。真空を用いる実施態様では、廃棄物マニホールドは、反応チャンバーに適用される真空の強度を制御システムによって制御できるようにする真空センサー及びレギュレーターを含む。幾つかの実施態様では、廃棄物マニホールドはまた複数の反応チャンバーの温度を調節するためのコンポーネントと、反応チャンバー内の反応混合物を撹拌するためのシェーカーとを含む。廃棄物マニホールドと複数の反応チャンバーとの間の作用可能な関連付けは、廃棄物マニホールドチャンバーと反応チャンバーとの間の圧力差を制御できるように、反応チャンバーを含む基体と廃棄物マニホールドとの間にシールを確立することを含む。そのような作用可能な関連付けは、制御システムによって生成され、試薬送達のために流体送達システム及び廃棄マニホールドに送信される命令のタイミングと、酵素ベースプロセスの合成ステップを実行するためのインキュベーション時間の決定及び試薬除去のタイミングをまた含む。幾つかの実施態様では、そのような作用可能な関連付けは、テンプレートフリーポリメラーゼの測定された活性に応じて、温度、反応のインキュベーション時間を変更することをまた含みうる。幾つかの実施態様では、廃棄物マニホールドは、真空センサー、真空レギュレーター、温度センサー、及びマニホールドにマウントされたプレートの温度を制御する温度調節装置を含みうる。そのようなセンサー及びレギュレーターは、制御システムと作用可能に関連付けられており、液体レベルセンサーが反応チャンバーからの不十分な流体除去を示したときはいつでも、制御システムによって使用されて修正動作を実行しうる。そのような修正動作は、合成プレートに適用される真空の強度を増加させること、真空が適用される持続時間を増加させること、又はその両方を含みうる。一般的な96ウェル及び384ウェルのフィルタープレートの場合、真空は100~600mmHgの範囲であり、真空は5~40秒の範囲の時間、適用されうる。一般的な96ウェル及び384ウェルのフィルタープレート用の真空マニホールドを操作するためのガイダンスは、Goodrichのテクニカルノート“Tips for optimizing microplate vacuum filtration results,”Rev.10/26/2011に見出される。
流体送達システムは、(i)合成反応、幾つかの実施態様では、切断反応と、生成物単離を実施するために必要とされる試薬を貯蔵するためのリザーバーと、(ii)ピペットベースの送達又は導管、管類、コネクター、バルブ、ポンプ、ノズルなどのシステムを含みうる、適切な時間にリザーバーから反応チャンバーに試薬を送達するためのコンポーネントとを含む。流体送達システムは、(様々な位置、例えば、リザーバー、バルブ、ノズルなどに)温度センサー、試薬をその安定性と有効性を最大にする温度に維持するための温度制御要素(例えば、ヒーター及び/又は冷蔵装置)、リザーバーの容量レベルセンサーなどをまた含みうる。そのようなセンサーは、制御システムに作用可能に関連付けられており、装置内のエラー又は異常状態を監視するために使用されうる。本発明の流体送達要件を実施する使用のために、多種多様な流体送達装置及びコンポーネントを構築し又は適合させることができる。この目的のための広範なガイダンスは、自動化学合成及び分析の文献、例えば、Miertus等編,Combinatorial Chemistry and Technologies:Methods and Applications,2版(CRC Press,2005);West等,米国特許第9103809号;Butendeich等,J.Laboratory Automation,18(3):245-250(2013);Fluent Automated Workstations(Tecan Group);Tisone等,米国特許第6063339号;Cathcart等,米国特許第5443791号;Ingenhoven等,米国特許第7529598号;Glauser等,米国特許第8580197号;Sindalar等,Nucleic Acids Research,23(6):982-987(1995);Cheng等,Nucleic Acids Research,30(18):e93(2002);Skold等,米国特許第5273718等から入手可能である。幾つかの実施態様では、本発明の流体送達システムは、一般的な流体送達ロボットを部分的に含みうる。他の実施態様では、本発明の装置は、インクジェット流体送達システムを部分的に含みうる。幾つかの実施態様では、流体送達システムは、使い捨てであり得、装置の互換性のある受入れステーションに簡便に取り付け又は設置されうる試薬カートリッジを含みうる。そのようなカートリッジは、各々が予め決まった最大値未満の長さを有する予め決まった数のポリヌクレオチドの各々の予め決まった量を合成するために必要な量の試薬を含みうる。幾つかの実施態様では、そのような予め決まった量は、1から1000ピコモル、又は1から200ピコモルの範囲である。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドのそのような予め決まった数は、1から96の範囲、又は1から384の範囲である。幾つかの実施態様では、そのような予め決まった長さは、25から600ヌクレオチドの範囲、又は50から200ヌクレオチドの範囲である。
ユーザーインターフェースは、ユーザーが情報を装置に通信し、装置の状況(例えば、試薬温度、反応チャンバー温度、バルブ/ポンプ温度など)、試薬レベル、合成状況、切断及び単離状況、定量的及び定性的収量情報などに関する情報を装置から受信するための手段を提供する。ユーザーインターフェースはまた、例えばオリゴヌクレオチドデザインサービス、装置診断サービスなどの製品及びサービスを注文する目的で、ユーザーがインターネット上のウェブサイトと通信するための手段を提供しうる。ユーザーによって装置に提供される一次情報は、合成される複数のポリヌクレオチドの配列を含む。他の情報には、合成規模、特定の配列に対する反応チャンバーのユーザー決定の割り当て、ユーザー決定の反応条件(反応時間及び温度など)などが含まれる。ユーザインターフェースは、グラフィカルユーザインターフェースを備えたコンピューター、携帯電話、専用のハードウェア及びソフトウェア、又はこれらの組み合わせなど、様々な通信デバイスを含みうる。ユーザインターフェースの全部又は一部を提供するコンピューターは、本発明の装置と統合されてもよいし、例えばケーブル、ブルートゥースなどの通信リンクのみによって装置に接続されて本発明の装置から物理的に分離されてもよい。ユーザーインターフェースソフトウェアは、例えば、制御システムの一部又は全部を構成するLabViewなどの一般的な実験室ソフトウェアを含むか、又はその一部でありうる。
幾つかの実施態様では、本発明の機器及びシステムは、図6A~6Eに開示されるようなグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)を含みうる。GUIの機能を生成するソフトウェアは、機器又はリモートWebサイトに存在しうる。一般に、そのようなGUIは、複数のデータ値を単一オブジェクトに表すことができるグリフ又はグラフィックオブジェクトを提供する。本機器及びシステムでは、アレイの各反応チャンバーが、少なくとも一つのグリフに関連付けられ、幾つかの実施態様では、単一グリフに関連付けられる。通常、GUIは、グリフのアレイビューを表示する少なくとも一つの画面を生成し、グリフは、互いに対する相対位置が反応チャンバーの物理的アレイに対応するアレイに配置される。幾つかの実施態様では、GUIの別の機能は、アレイ内の各グリフをクリックすると、追加データ及びユーザ選択と共にグリフの拡大ビューを提供するウィンドウを開くことができることである。
幾つかの実施態様では、グリフは、円又は複数のネスト化された円などの幾何学的形状の一部である線又は曲線に沿った(異なるヌクレオチドを表す)有色又はパターン化形状の配列としてコード化されたポリヌクレオチド配列情報を提供する。幾つかの実施態様では、配列表現は、円又は正多角形のネスト化された集合(正方形のネスト化された集合など)、又はらせんなどの連続曲線の何れかにアレンジされうる。そのような幾何学図形は、表示される配列情報がどのようなものであれ、各グリフについて同じ境界領域内に表示されるという意味でコンパクトである。幾つかの実施態様では、図6Aのグリフ(602)の6×4のアレイ(600)に例示されるように、複数のグリフが一定の総面積を有するアレイ形式で表示されうるように、そのような境界領域は配列長とは無関係である。グリフ自体は同一ではなく、異なるポリヌクレオチド配列によって作成される異なるパターンによって、アレイ形式であっても視覚的に区別することができる;しかしながら、図6Aのグリフの拡大図を含む、図6Bに示されるようなクリックアクセス可能なウィンドウを提供することによって、GUIにおいて特定の反応チャンバーについてより容易に識別可能な配列情報及び追加データにアクセスすることができる。ここで使用される場合、「クリックアクセス可能」とは、ユーザー制御カーソルをGUI画面上の位置、例えばグリフ上に置き、続いて別のコントロールの作動、例えばマウス又はキーボードで、GUIに、位置に関連した幾つかの予め決まった機能を実施させ、例えばウィンドウを作成させうる機能を意味する。図6Bでは、グリフ(603)のクリック後、拡大されたグリフ(604)及び追加情報を含むウィンドウ(605)が生成される。拡大されたグリフにおいて、配列情報は、各々がそれぞれA、C、G及びTヌクレオチドの配列を表す灰色、斑点、黒及び白の塗りつぶされたスペースの配列を含む、二つの同心円(外側の円606と第二の内側の円608)に含まれる。両方の円について配列の最初は、記号(620)又は同様の手段によって示されうる。第一の内側の円(610)は、(塗りつぶされた円(又は環帯)の割合として表される)合成されるポリヌクレオチドに関連した情報を表示する。そのような長さの情報には、限定されないが、最大長に関連するポリヌクレオチドの相対長、合成されたポリヌクレオチドの割合(合成サイクル数に比例)、開始からの時間(例えば、サイクル数×サイクル時間)、完了までの時間、又は類似の量が含まれうる。中央ディスク(612)は、反応チャンバーに関連した重要な情報及び/又は警告、例えば(数値として又は勾配若しくはグレースケール形式で提供されうる)収量、生成物の濃度、容量又は生成物などを表示しうる。異なる量と形式の表示間の切り替えを可能にするボタン(616及び618)がGUIに提供されうる。つまり、濃度などの定量的データは、グレースケール(若しくは勾配)形式又は数値形式の何れかで表示されうる。図6C及び6Dは、短い配列(6C、配列コードが第二の円の一部(630)のみを占める)と長い配列(6D、配列コードが内側の円全体(632)と外側の円の一部(634)を占める)に対するこのタイプのグリフの図を提供する。図6Eは、ポリヌクレオチド配列を表す記号(灰色、斑点、黒及び白の正方形)の正方形形式及び連続曲線(すなわち、らせん)を含むグリフを示す。加えて、グリフは、開始点を示す記号(例えば、図6Cのバー(631)及び三角形(633))を含みうる。
幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチド配列の一又は複数の部分がグリフで表される。例えば、グリフは、各々がコード化された配列情報を含む二つの同心円(例えば、図6Bのように)を含み得、ここで、例えば、内側の同心円がポリヌクレオチドの5’末端の最大24のヌクレオチドを表し、外側の同心円がポリヌクレオチドの3’末端の最大36のヌクレオチドを表す。
また更なる実施態様では、グリフは、図6Eに例示されるように、らせんに配列情報を含みうる。らせんは、アルキメデスらせんなど、経路がらせんに沿って取られるにつれて、原点からの距離が連続的に増加するように、曲率が連続的に変化する曲線を含みうる。或いは、図6Eに示されるような幾つかの実施態様では、らせんは、図6Eに示されるように、正方形(640)などの正多角形の周りに曲がって進むか巻き付く連続経路を画定する一連のセグメント(642)を含みうる。
上記に従って、各々が予め決まった配列を有する複数のポリヌクレオチドを合成するための装置は、次の構成要素を含みうる:(a)各反応チャンバーが合成担体を有する複数の反応チャンバーのアレイであって、各反応チャンバーが入口と出口と、合成担体を保持し、反応チャンバーを出る反応溶液がフィルターを通過するように出口に作用可能に関連付けられたフィルターを有する、反応チャンバーのアレイ;(b)反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に正の圧力差が確立されるときはいつでも、反応溶液が反応チャンバーから除去され、廃棄物マニホールドに入るように、反応チャンバーの出口と作用可能に関連付けられた廃棄物マニホールド;(c)反応溶液をアレイの反応チャンバーに送達するための流体送達システム;(d)合成されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を受け入れ、且つ各々がポリヌクレオチドの配列の全て又は一若しくは複数の部分を表す空間的にコンパクトなグリフのグラフィック表示を提供するためのユーザーインターフェイスであって、そのようなグリフが、反応チャンバーのアレイにおけるポリヌクレオチドに対する反応チャンバーの相対位置が、グリフのアレイにおけるポリヌクレオチドのグリフの相対位置と同じであるアレイに配置されたユーザーインターフェイス;及び(e)ユーザーインターフェース、反応チャンバーのアレイ、流体送達システム及び廃棄物マニホールドに作用可能に関連付けられた制御システムであって、合成のために反応チャンバーに各ポリヌクレオチドの予め決まった配列を割り当て、各反応チャンバーについて、(i)反応チャンバーの各々内の合成担体又は伸長断片にカップリング条件下でヌクレオチド単量体を送達し、ヌクレオチド単量体によって合成担体又は伸長断片の各々を伸長させて、その予め決まった配列に従って伸長断片を形成するステップ、及び(ii)カップリングしていないヌクレオチド単量体を反応チャンバーから除去する圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップの繰り返しを指示する制御システム。幾つかの実施態様では、そのようなグリフは、配列の全て又は一若しくは複数の部分を、画定又は有界領域内にらせんなどの連続曲線又は閉じた円若しくは多角形のネスト化集合を含む曲線又は記号列として表す。
幾つかの実施態様では、各々が予め決まった配列を有する複数のポリヌクレオチドを合成するための本発明の装置は、次の構成要素を含みうる:(a)イニシエーターが結合した合成担体を各反応チャンバーが有する複数の反応チャンバーのアレイであって、各イニシエーターが遊離3’-ヒドロキシルを有し、各反応チャンバーが入口と出口と、合成担体を保持し、反応チャンバーを出る反応溶液がフィルターを通過するように出口に作用可能に関連付けられたフィルターとを有する、複数の反応チャンバーのアレイ;(b)反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に正の圧力差が確立されるときはいつでも、反応溶液が反応チャンバーから除去され、廃棄物マニホールドに入るように反応チャンバーの出口と作用可能に関連付けられた廃棄物マニホールド;(c)反応溶液をアレイの反応チャンバーに送達するための流体送達システムであって、反応溶液が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェート、脱保護溶液;及びテンプレートフリーポリメラーゼを含む流体送達システム;(d)合成されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を受け入れ、且つ各々がポリヌクレオチドの配列の全て又は一若しくは複数の部分を表す空間的にコンパクトなグリフのグラフィック表示を提供するためのユーザーインターフェイスであって、そのようなグリフが、反応チャンバーのアレイにおけるポリヌクレオチドに対する反応チャンバーの相対位置が、グリフのアレイにおけるポリヌクレオチドのグリフの相対位置と同じであるアレイに配置されたユーザーインターフェイス;及び(e)ユーザーインターフェース、反応チャンバーのアレイ、流体送達システム及び廃棄物マニホールドに作用可能に関連付けられた制御システムであり、合成のために反応チャンバーに各ポリヌクレオチドの予め決まった配列を割り当て、且つ各反応チャンバーについて、(i)カップリング条件下でイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液を反応チャンバーに送達するステップ、及び(iii)予め決まった率で反応チャンバーから脱保護溶液を除去する圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップの繰り返しを指示する制御システム。上記のように、幾つかの実施態様では、そのようなグリフは、配列の全て又は一若しくは複数の部分を、画定又は有界領域内にらせんなどの連続曲線又は閉じた円若しくは多角形のネスト化集合を含む曲線又は記号列として表す。
幾つかの実施態様では、空間的にコンパクトなグリフは、その複数がアレイとして配置されうる、空間的に制限された、又は画定領域内の配列情報の表現を意味する。幾つかの実施態様では、画定領域は、円、正方形、又は六角形の何れかを含む。配列は、合成されるポリヌクレオチドにおける異なる種類のヌクレオチドの順序など、異なるオブジェクトの画定順序である。幾つかの実施態様では、異なる種類のヌクレオチド(A、C、G又はT)などの異なるオブジェクトは、異なる形状(例えば、円、曲線のセグメント、四角形、文字、星など)、異なる色、又は両方で表されうる。グリフ内のヌクレオチド配列は、限られた領域におけるそのような記号の順序付けによって表されうる。
制御システムは、(例えば、ユーザーインターフェース、液体レベルセンサー、温度センサー、試薬レベルセンサー等から)合成されるポリヌクレオチドの配列、装置の状況及び合成の状況に関する情報を受け入れ、ついで合成に関連した特定の機能を実施するために、信号を発生し、様々な装置(例えば、バルブ、ポンプ、ユーザーインターフェイス、廃棄物マニホールド、流体分配用のノズルを位置付けるモーターなど)を作動させるコントローラーに送信するためのコンピューター及びソフトウェアを含む。制御システムはまた、(i)センサーからのプロセス及び装置データを監視して、異常なデータパターン又はエラー(例えば、ウェルからの不十分な流体除去、ウェル内の反応混合物の不十分な容量など)が発生しているかどうかを判定し、(ii)データとエラー信号の解析に基づく修正動作を実行(例えば、ユーザーインターフェイスを介してユーザーに警告と推奨事項を送信)しうる。当業者は、制御システムのハードウェアとソフトウェアが、装置の特定の実施態様に大部分が依存することを認識するであろう。
反応チャンバー内の液体レベルを測定し及び/又は監視する液体レベルセンサーは、その主な原因が、フィルター細孔又は出口流路でのタンパク質付着及び蓄積である、反応チャンバーのフィルター又は出口における妨害物の間接的な測定を提供する。液体レベルセンサーによって収集されるデータは、制御システムに送信され、保存され、解析される。全ての合成試薬が入口から反応チャンバーに入り、その出口から出ると考えると、タンパク質付着又は蓄積による妨害物は、妨害されたチャンバーからの試薬のオーバーフローと、オーバーフローによる反応チャンバー間の二次汚染を生じさせる可能性がある。オーバーフローが発生しなくても、流体除去率が変化すると、反応条件を有害に変化させうる残留反応物又は洗浄溶液を一部の空の反応チャンバーに残存させる場合がある。例えば、不十分な流体除去のために、その後の反応において反応容積が増加する場合がある。また、不十分な流体除去のために前のカップリングサイクルからの微量の反応混合物が保持されている場合、誤って取り込まれる確率が増加しうる。幾つかの実施態様では、各反応チャンバーの液体レベルは、各カップリングサイクルの間又は後に測定される。幾つかの実施態様では、液体レベルセンサーは、反応チャンバーが排出された直後に液面を測定し;他の実施態様では、液体レベルセンサーは、試薬又は洗浄溶液が反応チャンバーに分配された直後に液体レベルを測定し;更に他の実施態様では、液体レベルセンサーは、反応チャンバーの流体除去率を計算することができるように、反応チャンバーからの流体の排出中に反応チャンバー内の複数の液体レベル測定を行う。後者の実施態様では、液体レベルセンサーのバンクを、試薬除去ステップ中に反応チャンバーの全部又は一部又はサブセットの上に配置することができる。例えば、複数の反応チャンバーが96ウェルの合成プレートを含むときはいつでも、液面センサーのバンクは、4つのセンサー、又は8つのセンサー、又は16のセンサーを含みうる。すなわち、幾つかの実施態様では、そのような率の測定は、あらゆる反応チャンバーの排出率が6サイクル毎に測定されるように各カップリングサイクル中に反応チャンバーの一部(全てではない)について行われうる。この概念は、6カップリングサイクル毎に96ウェルの合成プレート(250)の16の反応チャンバー(サイクルiの陰影ウェル(252)及びサイクルi+1の陰影ウェル(254))のグループで連続測定を行う16のセンサーのバンクについて、図2B及び2Cに示される。他の実施態様では、液体レベルセンサーは、各カップリングサイクルにおいて、反応チャンバーの予め決まったパーセンテージにおける液体レベル又は流体除去率を測定しうる。例えば、そのような予め決まったパーセンテージは、2~50パーセントの範囲、又は2~25パーセントの範囲、又は2~10パーセントの範囲でありうる。幾つかの実施態様では、液体レベルセンサーは、試薬送達ノズル及び/又はピペットと同じガントリーヘッドに収容されうる(試薬がプレート間又は同じプレートのウェル間で移送される実施態様において)。幾つかの実施態様では、液体レベルセンサーのバンクは、米国特許第9103809号に記載されているデュアルガントリー装置と同様に、別個のガントリーヘッドに収容されうる。
液体レベルセンサーの選択は、装置の物理的制約(例えば、ウェルの間隔及びサイズ)とセンサーの応答速度によって部分的に制約を受ける。幾つかの実施態様では、複数のセンサーを使用して、複数の反応チャンバーで測定を同時に行う。そのような複数のセンサーは、反応チャンバーの平面アレイ上を単一ユニットとして移動するバンクに配置することができ、センサーは、例えば、超音波レベルセンサーの1×4バンクを伴う図5Hに示されるように、センサーがその下の反応チャンバーと整列されうるように、バンクに離間される。幾つかの実施態様では、本発明で使用されるレベルセンサーは非接触センサーである。幾つかの実施態様では、そのような非接触センサーは、光学ベース又は音響ベースの何れかである。後者のうち、超音波液体レベルセンサーは、一つには小さい反応チャンバーサイズに対応するように小型化でき、また例えば10ミリ秒という迅速な測定時間を有するため、特に興味深い。画像解析を使用する例示的な光学ベースの液体レベル測定技術は、Thurow等,J.Automated Methods and Management in Chemistry,2011(article ID 805153)に開示されている。96ウェルプレート用の超音波液体レベルセンサーの例は、Baumer(Southington,CT)モデル09T9114/D1である。
幾つかの実施態様では、本発明は、多孔性微粒子樹脂と最小の回転半径を有し、反応チャンバー壁及びフィルターなどの表面への接着性が低下するように改変されたTdTバリアントを使用して、各々が予め決まった配列を有する複数のポリヌクレオチドを酵素的に合成するためのシステムを含む。幾つかの実施態様では、そのようなシステムは、(a)イニシエーターが結合した多孔性樹脂粒子を各反応チャンバーが有する複数の反応チャンバーであって、各イニシエーターが遊離3’-ヒドロキシルを有し、各反応チャンバーが入口と出口と、多孔性樹脂粒子を保持し、反応チャンバーを出る反応溶液がフィルターを通過するように出口に作用可能に関連付けられたフィルターとを有する、反応チャンバー;(b)反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に正の圧力差が確立されるときはいつでも、反応溶液が反応チャンバーから除去され、廃棄物マニホールドに入るように、反応チャンバーの出口と作用可能に関連付けられた廃棄物マニホールド;(c)反応溶液をアレイの反応チャンバーに送達するための流体送達システムであって、反応溶液が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェート、脱保護溶液;及び最小の回転半径を有するように改変されたTdTバリアントを含む流体送達システム;(d)合成されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を受け入れるためのユーザーインターフェース;及び(e)ユーザーインターフェース、反応チャンバーのアレイ、流体送達システム及び廃棄物マニホールドに作用可能に関連付けられた制御システムであって、合成のために反応チャンバーに各ポリヌクレオチドの予め決まった配列を割り当て、各反応チャンバーについて、(i)カップリング条件下でイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとTdTバリアントを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液を反応チャンバーに送達するステップ、及び(iii)予め決まった率で反応チャンバーから脱保護溶液を除去する圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップの繰り返しを指示する制御システムを含む。幾つかの実施態様では、本発明のシステムは、反応チャンバーの各々における液体レベルを測定するための一又は複数の液体レベルセンサーを更に含み、前記制御システムは、(i)カップリング条件下でイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとTdTバリアントを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液を反応チャンバーに送達するステップ、(iii)予め決まった率で反応チャンバーから脱保護溶液を除去する圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップ;及び(iv)前記反応チャンバーの各々における液体レベルを一又は複数の液体レベルセンサーで測定し、その液体レベルが予め決まった境界外にあると反応チャンバーが特定されるときはいつでも、その後の試薬送達ステップにおいて特定された反応チャンバーをバイパスするステップの繰り返しを指示する。幾つかの実施態様では、多孔性樹脂粒子を通るより効率的な輸送のために最小回転半径を有するTdTバリアントが選択される。幾つかの実施態様では、そのようなTdTバリアントは、変異Q4E/S/D/N及び表2の変異を受ける配列番号16~50と少なくとも90パーセント同一のアミノ酸配列を有するか又は配列番号51~71と少なくとも90パーセント同一のアミノ酸配列を有するTdTバリアントの群から選択される。
本発明の一実施態様の基本的構成要素の作用を、フィルタープレートウェル内の固体担体上でのポリヌクレオチドの酵素合成、固体担体からのポリヌクレオチド生成物の切断、及び切断反応コンポーネントからのポリヌクレオチド生成物の単離を実施する図3Aの実施態様において例示する。複数の反応チャンバー又はウェル(301)を備えた合成プレート(300)が、廃棄マニホールド(302)と共に分解図(309)に示される。反応チャンバー(301)の入口は、合成プレート(300)の上部のウェル開口部である。出口(図では隠れている)とフィルター(同じく図では隠れている)は、合成プレート(300)の底部にある。作用下の合成プレート(300)は、真空(306)がライン(307)を介して廃棄マニホールド(302)のチャンバー(304)に適用されるときはいつでも、流体(試薬、洗浄溶液など)が、反応チャンバー(301)からフィルター材料及び出口を通って廃棄物マニホールドチャンバー(304)内に引き込まれ、ついで廃棄物貯蔵所(308)に引き込まれるように、廃棄物マニホールド(302)に(例えばクランプにより)液密的にマウントされる。複数の反応チャンバー(301)を含む合成プレート(300)は、例えばPall Corp.(Port Washington,NY)のような商業的製造業者から入手できる、24ウェル、48ウェル、96ウェル、384ウェル、1536ウェル、又は類似型式の慣例のフィルタープレートでありうる。そのようなフィルタープレートに典型的な反応容量は、本発明で用いることができ、例えば96ウェルプレートの場合は10~50μL、384ウェルプレートの場合は3~10μL、1536ウェルプレートの場合は0.5~3.0μLである。流体送達システム(340)(破線の長方形で囲まれている)は、制御システム(350)の制御(351)下でポンプ及びバルブのシステム(330)を介して合成プレート(300)の反応チャンバー(301)に、そしてまた制御システム(350)の制御(349)下で流体送達及びセンサーガントリー(312)に配置された送達ノズル(図示せず)に試薬(331~339)を送達する。ガントリー(312)内の液体送達ノズルは、ガントリー(312)が合成プレート(300)上を移動できるようにするフレキシブルライン(329)を介してバルブ及びポンプシステム(330)から試薬を受け入れる。他の実施態様では、ガントリー(312)は、例えば、追加の廃棄物マニホールドに関連した追加の反応プレートで反応を実施するために、装置内の異なる位置にある異なるステーションに移動する能力を有しうる。加えて、幾つかの実施態様では、マニホールド(302)及び合成プレート(301)は、ガントリー(312)に対して移動可能であってもよい。ガントリー(312)は、(図3Aに太い矢印で示されているように)合成プレート(300)の表面に対してx、y、及びz方向に移動可能であってもよく、又は合成プレート(300)はまたx及びy方向に移動可能であってもよく、或いは両部材がx及びy方向に互いに対して移動可能であってもよい。
幾つかの実施態様では、液体レベルセンサー(図示せず)は、流体送達及びセンサーガントリー(312)内に配置される。幾つかの実施態様では、液体レベルセンサーは、ガントリー(312)内のノズルが(カップリング試薬(331~334)、脱保護試薬(335)、洗浄溶液(337~338)、切断試薬(338)又は単離試薬(339)でありうる)予め決まった量の流体を反応チャンバー(301)に送達した直後に、反応チャンバー(301)内の液体レベルを単に確認する。以下により完全に記載されるように、切断されたポリヌクレオチド生成物の単離は、様々な技術によって達成されうる。そのような技術の各々では、ここでは「単離試薬」と呼ばれる異なる試薬が実行のために必要とされうる。例えば、幾つかの技術では、単離試薬であるイソプロパノールで達成することができるポリヌクレオチド生成物の沈殿が必要とされる。別の単離試薬は、シリカ吸着剤から吸着されたDNA沈殿物を溶出させるために使用されうる、水又はトリスEDTA(TE)バッファーでありうる。幾つかの実施態様では、液体レベル測定は、反応チャンバー(301)の全てへの試薬送達の完了後に行うことができ、或いは検出は、流体送達が行われているのと同時に、しかし異なる反応チャンバーで行うことができる。例えば、幾つかの実施態様では、ガントリー(312)内の液体レベルセンサーの数及び位置並びに流体送達ノズルの数及び位置により、それらを同じ合成プレートの反応チャンバーの異なる群上に同時に配置することが可能になる。本発明のシステム及び装置の幾つかの実施態様では、液体レベルセンサーが、真空が適用されて流体が除去されている間に、反応チャンバの一部において流体除去率を測定する、別のステップを合成プロセスにおいて実行することができる。そのような実施態様では、一サイクル内で、流体除去率を計算できるように、排出が進められている各反応チャンバー内で流体レベルの複数の測定がなされる。率が予め決まったレベルを下回った場合、制御システム(350)は、排出率が予め決まったレベルを下回った反応チャンバーにフラグを立て、それらへの流体送達を中止するなどの修正動作を作動するか、或いは以下に記載される他の是正動作を作動することができる。
制御システム(350)の制御下で、上記構成要素は、複数のポリヌクレオチドの各々について、合成ステップの予め決まった数のサイクルを実施する。制御システム(350)は、(i)流体送達システム(340)を作動させて、カップリング条件下で反応チャンバー(301)内のイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼ(ポリヌクレオチドの配列に応じて331、332、333又は334の何れか)を送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)流体送達システム(340)を作動させて、3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液(335)を反応チャンバー(301)に送達するステップ、及び(iii)廃棄物マニホールド(302)を作動させて、(例えば、圧力差の大きさによって決定された)予め決まった率で反応チャンバー(301)から脱保護溶液(335)を除去する圧力差を反応チャンバー(301)と廃棄物マニホールド(302)の間に生じさせるステップの繰り返しを実行する。幾つかの実施態様では、圧力差は、廃棄物マニホールド(302)を介して真空を適用して反応チャンバーから流体を「引き抜く」ことによって、又は反応チャンバーの入口に正の圧力を適用して反応チャンバーから流体を「押し出す」ことによって、或いはその両方によって、得ることができる。一般的な96ウェル合成プレートを用いる実施態様では、典型的には、ウェルから流体を排出するために10~30秒間、真空が適用される。96ウェルプレートを用いるような幾つかの実施態様では、流体除去の予め決まった率は、1から100μL/秒の範囲、又は1から50μL/秒の範囲、又は0.5から30μL/秒の範囲でありうる。
ポリヌクレオチドが合成プレート(300)で合成された後、図3Aのシステム及び装置は、ポリヌクレオチド生成物をそれらの合成担体から切断し、切断されたポリヌクレオチド生成物を切断反応混合物から単離するステップを実施する。図3B~3Dは、これらのステップがこの実施態様についてどのように達成されるかを示している。図3Bは、合成中で切断及び単離ステップの前の合成プレート(300)の位置を示す。すなわち、合成プレート(300)は、真空が適用されるときはいつでも、反応チャンバー(301)内の流体が廃棄物マニホールド(302)を介して除去されるように廃棄物マニホールド(302)上に液密的にマウントされる。この実施態様では、切断は反応チャンバー(301)で起こり、単離はDNA単離プレート(320)で起こる。DNA単離プレートは、単離チャンバー(又はウェル)(321)が合成プレート(300)の反応チャンバー(301)と空間的に整列するように選択され又は設計される。合成後、装置は、合成プレート(300)とDNA単離プレート(320)の両方が廃棄物マニホールド(302)上に液密的にマウントされるように、合成プレート(300)の下にDNA単離プレート(320)を配置するためにロボット装置を用いる。以下に記載されるように、切断及び単離ステップは、その各々が、当業者によって容易に提供される僅かに異なる装置コンポーネントを必要としうる多種多様な方法で実行されうる。幾つかの実施態様では、切断は合成プレート(300)で実行することができ、プレート(300)の各チャンバーの反応混合物は、単離プレートの異なる位置にピペットで移すことができ、DNA単離は異なる位置又はステーションで実行することができる。装置内の異なるステーションの異なるプレートでのそのような単離は、(例えば)用いられる特定のDNA単離プロトコルに応じて、より良い収量又は他の利点を提供しうる。幾つかの実施態様では、DNA単離プレート(320)は、切断されたポリヌクレオチドをイソプロパノールで沈殿させ、ガラスなどのシリカ化合物に吸着させる、Boom等の米国特許第5234809号によって開発された単離技術に基づきうる。そのような実施態様では、切断後、イソプロパノールが反応チャンバー(101)に送達され、インキュベートされ、ついで穏やかな真空が適用されて、各反応チャンバーの反応混合物がDNA単離プレート(320)内のそのすぐ下の単離チャンバーに移される。単離チャンバーのシリカが、沈殿したDNAを捕捉し、洗浄後、捕捉されたDNAはシリカから、例えば装置とは別に溶出させうる。
図3Cに戻ると、制御システム(350)の制御(357)下のトラック(356)上のプレートムーバー(354)は、ステーションA(310)の廃棄物マニホールド上の合成プレート(300)を把持し、それをステーションB(360)のDNA単離プレート(320)の上部に配置(360)し、その後、ステーションB(360)から合成プレート(300)と単離プレート(320)の両方を把持し、図3Dに示されるように、両方のプレートを、ステーションA(310)の廃液物マニホールド(302)上に戻して配置(362)し、切断及び単離ステップが実施される。プレートムーバー(354)は、例えば、Hudson Robotics(NJ)、Hamilton Microlab、TPA Motion、Beckman Coulterなどの幾つかの異なる製造業者から入手できる、プレート把持機能とプレート移送機能を備える一般的な実験室ロボットでありうる。プレートムーバー(354)は、汎用ロボットアーム、或いは図に示されるように、動きが制限された専用プレートムーバーでありうる。ついで、ガントリー(312)は、切断試薬を合成プレート(300)の反応チャンバー(301)に送達し、インキュベーション後、イソプロパノールを反応チャンバー(301)に送達して、切断されたポリヌクレオチド生成物を沈殿させる。インキュベーション後、廃棄物マニホールド(302)を通して穏やかな真空を適用して、イソプロパノール含有生成物を反応チャンバー(301)から単離プレート(320)の整列した単離チャンバー内に引き込む。合成試薬に対して上記したように、切断試薬及び/又は単離試薬は、真空を適用することによって、又は正の圧力を適用することによって、単離プレートを通って移動されうる。
幾つかの実施態様では、システム及び装置は、(i)反応収率を測定し、(ii)例えば生成物濃度を、例えば選択的希釈によって調整することによって、収量を測定した後に生成物濃度を正規化し、(iii)反応チャンバーフィルターの障害又は目詰まりを測定し、そのような測定結果に基づいて是正動作を作動させ、及び(iv)テンプレートフリーポリメラーゼ活性を測定し、そのような測定結果に基づいて、インキュベーション時間とカップリング反応の温度の調整を含む是正動作を作動させる更なるステップを実施する。
(iii)(フィルター障害の監視)に関連した幾つかの実施態様では、(a)特定の反応チャンバーが、異常な液体レベルの測定がなされた後に任意の将来の試薬送達のためにバイパスされうること、(b)予め決まったサイクル数の間、永久に又は一時的に、反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間の真空強度又は圧力差が増加されうること、(c)妨害するタンパク質凝集物を除去するために、反応チャンバー及び/又は他の流体流路が、プロテイナーゼKなどのタンパク質分解酵素溶液で処理されうること、又は(d)是正動作の組み合わせがなされうることを含み、多くの異なる是正動作を制御システム(350)によって実行することができる。(c)に関して、制御システム(350)は、合成サイクルの実施中に液体レベルセンサーデータを監視し、液体レベルセンサーデータが不十分な流体除去(例えば、除去率、排出又は流体添加後の最終レベルなどによって測定される)を示す場合、(修正動作として)一又は複数のプロテアーゼ処理ステップを挿入しうる。挿入されるプロテアーゼ処理ステップは、プロテアーゼ溶液(370)を反応チャンバー(301)に分配すること、反応チャンバーを所定の期間、例えば(プロテアーゼ、濃度、及び他の条件に応じて)30分、又は1時間、又は2時間、インキュベートすること、プロテアーゼ溶液を除去すること、反応チャンバーを洗浄することを含む。プロテアーゼ処理ステップの後、合成サイクルが再開される。制御システム(350)は、何れかの反応チャンバーにおいて異常な液体レベル測定がなされるときはいつでもプロテアーゼ処理ステップを挿入するようにプログラムされ得、又は修正動作の組み合わせを実行しうる。例えば、第一の修正動作は、一又は複数のプロテアーゼ処理ステップを挿入することであり、第二の修正動作は、異常な状態が持続する場合、異常な液体レベル測定の反応チャンバーをバイパスすることでありうる。例示的なプロテアーゼ処理ステップは、0.01から1.0mg/mLの範囲の濃度でプロテイナーゼKの溶液を送達することを含みうる。
(i)及び(iv)(濃度測定及び活性アッセイ)に関連した幾つかの実施態様では、カップリング反応インキュベーション時間が、測定されたポリメラーゼ活性が予め決まったレベルを下回るときはいつでも、予め決まった最大値まで自動的に増加されうる。図3E~3Hは、ポリメラーゼ活性を測定するために更なる試薬が提供され、合成及び単離後にポリヌクレオチド収量が測定される実施態様を示す。図3Eは、活性アッセイ試薬を含む試薬リザーバー(371)、マルチウェルプレートを保持し操作するための位置を提供するステーションC(374)及びD(373)、並びに260nmでの吸収によりDNA濃度を光学的に測定するための分光光度計(375)を含む追加のコンポーネントを示す。合成の完了後、合成プレート(300)はステーションAからステーションB(図3Eに示されている)に移動される。DNA単離プレート(320)と測定プレート(376)は、ステーションD(373)及びステーションC(374)にそれぞれ開始位置を有しうる。測定プレート(376)は、そのウェルが単離プレート(320)のウェルと整列し、流体、特に溶出したDNAを単離プレート(320)から受け入れ、そのような受け入れたDNAの濃度の光学ベースの測定を可能にするように設計された一般的なプレートでありうる。例示的な測定プレートは、例えば、Greiner Bio-One(Frickenhausen,DE)から市販されている。ステーションAの単離プレート(320)でポリヌクレオチド生成物が切断されて単離された後、合成プレート(300)がステーションA(310)からステーションB(360)に移動され、単離プレート(320)がステーションA(310)からステーションD(373)に移動され、その後、測定プレート(376)がステーションC(374)からステーションA(図3Fに示される)に移動(377)され、その後、単離プレート(320)が測定プレート(373)の上部に配置される(図3Gに示される)。単離されたDNAが単離プレート(320)の単離ウェルから溶出された後、それはステーションC(374)に移動され(378)、測定プレート(376)はステーションD(373)に移動され、そこで各ウェルの濃度が測定される分光光度計(375)内に続いて挿入される(380)。DNA濃度又は蛍光発光を測定するための例示的な分光光度計又は蛍光光度計(375)は、Epochマイクロプレート分光光度計(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,VT);Tecan infinite 200(Mannedorf,CH);又は類似機器である。そのような機器は典型的には96ウェル及び384ウェルプレート用に設計されている。幾つかの実施態様では、測定プレート(376)をステーションA(310)に戻し、そこで液体レベルを測定して、測定濃度からDNA量を決定することができる。
上述のように、幾つかの実施態様では、本発明のシステム及び装置は、複数のポリヌクレオチドを合成する前に、テンプレートフリーポリメラーゼのヌクレオチドカップリング活性を測定する。幾つかの実施態様では、そのようなアッセイは、図3E~3Hの実施態様を使用して、制御システム(350)の任意のルーチンの制御下、標準的な合成プレート(すなわち、各反応チャンバーに合成担体及びイニシエーターを含む)の反応チャンバーのサブセットにおいて行われうる。ポリヌクレオチド合成の前に、合成プレート(300)を、ガントリー(312)が活性アッセイ試薬(371)を一又は複数の予め決まった反応チャンバー(「アッセイウェル」)に送達することができるようにステーションA(310)の廃棄物マニホールド(302)上に配置させる。ポリメラーゼが単量体と混合して送達される実施態様では、少なくとも4つの反応チャンバーが活性測定に充てられるように、混合物当たり少なくとも一つの反応チャンバーが使用される。活性が測定された後、測定に使用される反応チャンバーはポリヌクレオチド合成には使用されない。BODIPY-ATP/Fe(III)ベースのアッセイを用いる実施態様では、BODIPY化合物及びバッファーを含む単一試薬がアッセイウェルの各々に送達され、その後、ポリメラーゼ含有dATP試薬(331)、dCTP試薬(332)、dGTP試薬(333)及びdTTP試薬(334)が送達される。予め決まったインキュベーションの後、合成プレートを、制御システム(350)に伝えられる蛍光測定のために分光光度計/蛍光光度計に移動される。測定された活性レベルが予め決まった範囲内にある場合、制御システム(350)が合成プレートをステーションA(310)に戻し、非アッセイウェル反応チャンバーで合成を開始する。一又は複数のポリメラーゼ活性が予め決まったレベルを下回る場合、制御システム(350)は、合成中のカップリング収量を最大にするために、カップリング反応時間の期間を予め決まった最大期間まで延長することができる。或いは、一又は複数の活性が予め決まったレベルを下回る場合、制御システム(350)は、ユーザーインターフェース(352)を介してユーザーに警告を発することができる。
本発明の他の実施態様では、二つ以上の異なるポリヌクレオチドが同じ反応チャンバー内で合成されうるか、分岐ポリヌクレオチドが合成されうるか、又はRNA-DNAキメラポリヌクレオチドが合成されうるように、イニシエーター及び単量体にオルソゴナル3’-O-保護基が提供されうる。そのようなパラレル合成の一実施態様は図4Aに示される。異なるオリゴヌクレオチドに対応する二つの異なるイニシエーター(471及び472)が、合成されるオリゴヌクレオチドの所望の比率をもたらす予め決まった比率で固体担体(473)に結合される。幾つかの実施態様では、イニシエーターの最も3’側のヌクレオチドは、切断可能なヌクレオチドでありうる。異なる3’-O-ブロッキング基は、「x」(474)及び「y」(476)として示される。二つのオリゴヌクレオチドが、(図4Aに示されるように)一度に一つずつ合成されうるか、或いは一つおきの伸長ステップで伸長されるオリゴヌクレオチドを交互にすることによって同時に合成されうる。図4Aに示されるように、「y」ブロッキング基を用いるオリゴヌクレオチドは、その全体が伸長され(478)、依然としてその3’-ヒドロキシルがブロックされている第一の伸長生成物(470)が生成され、その後(475)「x」ブロッキング基を用いるオリゴヌクレオチドが伸長されて、第二の伸長生成物(484)が生成される。両方の合成が完了した後、切断可能なヌクレオチド「Z」(485)を切断することにより、二つのブロッキング基を除去し、オリゴヌクレオチドを固体担体(473)から切り離すことができる。幾つかの実施態様では、同じ反応容器内で二つ以上のオリゴヌクレオチドを合成するための方法を、次のステップによって実行することができる:(a)一又は複数の担体にイニシエーターの二つ以上の集団を提供するステップであって、各集団のイニシエーターが、イニシエーターの一つおきの集団の3’-O-ブロッキング基のデブロッキング条件にオルソゴナルデブロッキング条件によって除去可能な集団特異的3’-O-ブロッキング基を有する切断可能なヌクレオチド又は切断可能な結合によって終端するステップ;(b)イニシエーター又は伸長断片の集団の集団特異的ブロッキング基をデブロックして、遊離3’-ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長断片を形成するステップ;(c)伸長条件下で、イニシエーター又は伸長断片が、3’-O-ブロックヌクレオシドトリホスフェートの取り込みによって伸長されて3’-O-ブロック伸長断片を形成するように遊離3’-ヒドロキシルを有するイニシエーター又その伸長断片の集団を3’-O-ブロックヌクレオシドトリホスフェートとテンプレート非依存性DNAポリメラーゼと接触させるステップ;及び(d)複数のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する伸長断片が形成されるまで、イニシエーターの各集団についてステップ(b)及び(c)を繰り返すステップ。ポリヌクレオチド生成物は、以下に記載されるようにイニシエーターから切断されうる。幾つかの実施態様では、上記の方法は、(d)伸長断片をデブロッキングするステップ;及び(e)切断可能なヌクレオチド又は切断可能な結合を切断して、伸長断片及び/又は二つ以上のオリゴヌクレオチドを遊離させるステップを更に含む。
同じ反応チャンバー内で一つ又は二つのポリヌクレオチドを合成するための本発明のシステム及び装置の実施態様を図4Bに示す。容易に分かるように、この実施態様と図3A~3Dのものとの間の重要な相違点は、オルソゴナル保護化学のそれぞれについて二組の合成試薬が存在することである。そのようなオルソゴナル保護化学の幾つかの対を以下に記載する。図4Bの実施態様のコンポーネントは、図3A~3Dの実施態様のものと同様に機能する。すなわち、(一つの代わりに)二つの異なるイニシエーターを有する合成担体を含む反応チャンバー(401)を有する合成プレート(400)が廃棄物マニホールド(402)にマウントされる。制御システム(450)の命令下で流体送達システム(440)は、二つの異なるポリヌクレオチドが完成するまで、上記のサイクルに従って、合成試薬(411~415及び416~420)をバルブ及びポンプブロック(430)及び流体送達及びセンサーガントリー(422)を介して送達する。RNA-DNAキメラポリヌクレオチドの合成では、合成試薬(416~420)は、RNA単量体であり得、RNAとDNA又はRNAとRNAのカップリングに特異的なテンプレートフリーポリメラーゼと組み合わせることができる。一部の試薬、例えば洗浄溶液、切断試薬及び単離試薬(436~439)は共有されうる。合成完了時に、DNA単離プレート(432)とプレートムーバー(454)は、図3A~3Dの実施態様について記載されたように機能する。
本発明のシステム及び装置とそのコンポーネントの更なる実施態様が、図5A~5Gに記載される。図5Aは、本発明の装置の一実施態様(500)におけるコンポーネントの配置を示す。この実施態様では、プロセシングは次のように進行する:ステーションAでの合成後、ポリヌクレオチド生成物が結合した合成担体は、ピペット(例えば、96ウェル合成プレートでは96ピペットバンク)によって分離ステーションCに移され、そこで切断反応が起こり、その後、切断反応混合物は同じピペットバンクを使用してステーションAに戻され、ステーションAにおいて合成プレートと交換したDNA単離プレートに沈着される。その間に、測定プレートがステーションBにおいて真空マニホールドにマウントされている。切断されたポリヌクレオチド生成物の捕捉後、DNA単離プレートはステーションBにおいて測定プレートの上部に移動されてマウントされ、そこで捕捉されたポリヌクレオチド生成物が測定プレート中に溶出される。次に、測定プレートが分光光度計に移動されて挿入され、そこで濃度が測定され、その後、測定プレートがステーションAに戻され、そこで、濃度が必要に応じて正規化される。
他の実施態様では、ステーションCは、例えば、選択されたポリヌクレオチドの最終生成物濃度を増加させるために、ステーションAの合成プレートの予め決まった反応ウェルからの合成担体をプールするために使用されうる。ステーションCはまた、分割混合合成戦略を使用してポリヌクレオチド生成物上にランダムオリゴヌクレオチドタグを合成するために、合成プレートのポリヌクレオチド生成物をプールするために使用されうる。
図5Aにおいて、イニシエーターを有する合成担体を各々が含む複数の反応チャンバーを含む合成プレート(502)が、廃棄物マニホールド(504)の上部にマウントされたステーションA(503)に位置されている。ステーションAに隣接するのは、真空マニホールド(506)を含むステーションB(505)であり、これは、この実施態様では、単離プレートのウェルから単離又は捕捉ポリヌクレオチド生成物を切り離し、真空マニホールド(506)上でその下にマウントされた測定プレートに移すために使用される。例えばユーザーインターフェースのタッチスクリーン(520)を介してポリヌクレオチド配列を入力した後、全ての合成サイクルがステーションA(503)の合成プレート(502)で実施され、ガントリーヘッド(508)に収容された流体送達ノズル(図示せず)がカップリング試薬、脱保護試薬及び洗浄溶液を反応チャンバーに送達し、その後、同じくガントリーヘッド(508)に収容された液体レベルセンサーが各ウェルの液体レベルを測定する。試薬送達ノズル及び液体レベルセンサーに加えて、ガントリーヘッド(508)には、ポリヌクレオチド生成物を含む合成担体をステーションC(510)に移送し、ついで切断混合物をステーションC(510)からステーションA(503)に戻すための96ピペットバンクもまた収容される。ガントリーヘッド(508)は、ガントリー(509)にマウントされ、白い矢印(511)で示されるように、ガントリー(509)上で前後に移動することができる。ガントリー(509)は、次に、ガントリーヘッド(508)がステーションA(503)、B(505)及びC(510)にアクセスできるように、トラック(515a)及び(515b、図5Bに示される)上を白い矢印(512)によって示されるように前後に移動することができる。
流体の移動及び送達は、制御システムの制御下で、フレキシブルライン(PTFE(テフロン)などの材料製)によってガントリーヘッド(508)に接続されたリザーバー、バルブ、及びポンプのシステムを通してなされる。試薬保管キャビネット(516)は、カップリング試薬、洗浄試薬、切断試薬、溶出試薬、及び装置で実行される合成方法のあらゆる実施態様で使用される他の試薬を収容する。他の図に示されているように、試薬リザーバーからの流体は、制御システムによって制御されるバルブ(図示せず)及びポンプのバンク(518)を通って送られ、反応チャンバーに分配するために流体送達ノズル(図示せず)に送達される。そのようなバルブバンクは、試薬が反応チャンバー内の所望の反応条件のための予め決まった温度にあることを担保する温度制御要素を含みうる。上記のように、一実施態様では、ガントリーヘッド(508)内のピペットバンクは、ポリヌクレオチド生成物が結合した洗浄済み合成担体をステーションC(510)の切断プレート(522)に移送し、その後、切断試薬がガントリーヘッド(508)のノズルによって切断プレート(522)の反応チャンバーに分配される。インキュベーション後、単離技術がBoomの沈殿/吸着法(上で引用)に基づいている場合は常に、切断されたポリヌクレオチド生成物を反応混合物中に沈殿させるイソプロパノールをついで加える。切断反応が実行されている間、プレートムーバー(524)がトラック(526)に沿って移動し、DNA単離プレートがステーションA(503)に配置され、測定プレートがステーションB(505)の真空マニホールド(506)の上部に配置されるようにプレートをステーションA(503)及びD(528)に再配置する。切断プレート(522)のウェルからの切断反応混合物は、ガントリーヘッド(508)のピペットバンクによって、ステーションA(503)の廃棄物マニホールド(504)に今マウントされたDNA単離プレートのウェルに移される。そこで、切断反応混合物は、DNA単離プレートのシリカ吸着材料を通して引き抜かれ、ポリヌクレオチド生成物沈殿物がシリカ材料上に吸着される。ついで、プレートムーバー(524)がDNA単離プレートをステーションB(505)に移動させ、それを測定プレートの上部に置く。ついで、ガントリー(508)が溶出溶液(例えば、水又はTE)をDNA単離プレートのウェルに送達し、吸着されたポリヌクレオチド生成物が測定プレートのウェルに溶出される。溶出後、プレートムーバー(524)が、測定プレートがステーションD(528)に移送され、そこで分光光度計(533)に挿入されて各ポリヌクレオチド生成物の濃度を測定するように、ステーションA(503)、B(505)及びD(528)にプレートを再配置する。そのような測定の後、測定プレートは分光光度計(533)からステーションA(503)に移され、そこで追加の流体(例えば、溶出バッファー)が必要に応じてウェルに加えられ、全てのウェルにわたって濃度が正規化されるか、又は異なるポリヌクレオチド生成物に対してユーザーが特定した濃度値を満たすように濃度が調整される。
装置(500)の上面図が図5Bに示される。ステーションA(503)、B(505)及びC(510)が、ガントリーヘッド(508)とレール(515a)及び(515b)との関連で示される。コンポーネント(532)は、流体送達システムのラインをフラッシングするために流体分配ノズルを配置しうるリンスステーションである。試薬ボトル又はリザーバー(530)が試薬キャビネット(516)内に示される。試薬リザーバー(530)とガントリー(508)との間に取り付けられた8基のポンプ(518)のバンクが示される。この実施態様の試薬リザーバーの割り当てを図5Cに示す。
図5D~5Gは、ガントリーヘッド(508)に関連付けられた流体送達システムのコンポーネントの詳細を示している。図5Dは、側面図(541)と上面図(543)の両方で、分配マニホールド(536)と、32個のノズル(548)を含む分配ノズルバンク(538)との8基のポンプとの関連を示す。この実施態様では、液体レベルセンサーバンク(540)が、ガントリーヘッド(508)に収容された単一ユニット(542)として分配ノズルバンク(538)に強固に取り付けられる。分配マニホールド(536)の出力ライン(549)は、図5A及び5Bの8基のポンプ(518)に対応する8群にグループ分けされる。図5Eは、出口(552)と1対1で対応する32個のバルブ(550)のバンクを示す分配マニホールド(536)の斜視図である。分配マニホールド(536)及びノズル(548)は、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)又は類似の材料のような強固で機械的に安定で化学的に不活性な材料から製造される。図5Fは、ポンプ1~8が、合成ステップとその後の切断、単離、及び正規化ステップにわたって、どのように様々な試薬に割り当てられるかを示している。図5Gは、分配マニホールド(536)、液体レベルセンサーバンク及びノズルバンク(542)並びにピペットバンク(556)の位置を示しているガントリーヘッド(508)の断面図である。
[テンプレートフリー酵素合成法]
本発明のシステム、装置及びキットは、予め決まった配列を有する複数のポリヌクレオチドのテンプレートフリー酵素合成の様々な方法の実行を可能にする。ポリヌクレオチドのテンプレートフリー酵素合成法の異なる実施態様に対応させるために装置のコンポーネントを自明の方法で適合させることは、当業者の技量の範囲内である。一般に、テンプレートフリー(又は同等に、「テンプレート非依存」)酵素ポリヌクレオチド合成法は、図1に示されているように、予め決まったヌクレオチドが各サイクルにおいてイニシエーター又は成長鎖にカップリングされるステップの繰り返しサイクルを含む。テンプレートフリー酵素合成の一般的な構成要素は、次の参考文献に記載されている:Ybert等,国際特許公開第2015/159023号;Ybert等,国際特許公開第2017/216472号;Hyman,米国特許第5436143号;Hiatt等,米国特許第5763594号;Jensen等,Biochemistry,57:1821-1832(2018);Mathews等,Organic & Biomolecular Chemistry,DOI:0.1039/c6ob01371f(2016);Schmitz等,Organic Lett.,1(11):1729-1731(1999)。
本発明のシステム、装置及びキットは、予め決まった配列を有する複数のポリヌクレオチドのテンプレートフリー酵素合成の様々な方法の実行を可能にする。ポリヌクレオチドのテンプレートフリー酵素合成法の異なる実施態様に対応させるために装置のコンポーネントを自明の方法で適合させることは、当業者の技量の範囲内である。一般に、テンプレートフリー(又は同等に、「テンプレート非依存」)酵素ポリヌクレオチド合成法は、図1に示されているように、予め決まったヌクレオチドが各サイクルにおいてイニシエーター又は成長鎖にカップリングされるステップの繰り返しサイクルを含む。テンプレートフリー酵素合成の一般的な構成要素は、次の参考文献に記載されている:Ybert等,国際特許公開第2015/159023号;Ybert等,国際特許公開第2017/216472号;Hyman,米国特許第5436143号;Hiatt等,米国特許第5763594号;Jensen等,Biochemistry,57:1821-1832(2018);Mathews等,Organic & Biomolecular Chemistry,DOI:0.1039/c6ob01371f(2016);Schmitz等,Organic Lett.,1(11):1729-1731(1999)。
遊離の3’-ヒドロキシル基(130)を有するイニシエーターポリヌクレオチド(100)は、例えば合成担体(120)に結合して提供される。以下により完全に記載されるように、合成担体は、可溶性担体又は固体担体、例えば平面状固体表面又は磁気ビーズ、アガロースビーズなどのビーズでありうる。イニシエーターポリヌクレオチド(100)(又はその後のサイクルにおける伸長イニシエーターポリヌクレオチド)に、イニシエーターポリヌクレオチド(100)(又は伸長イニシエーターポリヌクレオチド)の3’末端への3’-O-保護-dNTPの酵素的取り込みに効果的な条件(140)下で、3’-O-保護-dNTPとテンプレートフリーポリメラーゼ、例えば末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)又はそのバリアント(例えば、Ybert等,国際公開第2017/216472号;Chamipon等,国際公開第2019/135007号)が加えられる。この反応は、その3’-ヒドロキシルが保護された伸長イニシエーターポリヌクレオチドを生成する(160)。伸長配列が完了していない場合、別の付加サイクルが実行される(180)。伸長イニシエーターポリヌクレオチドが競合配列を含む場合、3’-O-保護基を除去又は脱保護することができ、元のイニシエーターポリヌクレオチドから所望の配列を切断することができる(182)。そのような切断は、様々な一本鎖切断技術の何れかを使用して、例えば、元のイニシエーターポリヌクレオチド内の予め決まった位置に切断可能なヌクレオチドを挿入することによって、行うことができる。例示的な切断可能なヌクレオチドは、ウラシルDNAグリコシラーゼによって切断されるウラシルヌクレオチドでありうる。伸長イニシエーターポリヌクレオチドが完全な配列を含まない場合、3’-O-保護基が除去されて遊離3’-ヒドロキシルを露出させ(130)、伸長イニシエーターポリヌクレオチドはヌクレオチド付加及び脱保護の別のサイクルに供される。
ここで使用される場合、「イニシエーター」(又は「イニシエーティング断片」、「イニシエーター核酸」、「イニシエーターオリゴヌクレオチド」などのような等価な用語)は、TdTなどのテンプレートフリーポリメラーゼによって更に伸長させることができる、遊離3’-ヒドロキシルをその末端に持つ短いオリゴヌクレオチド配列を指す。一実施態様では、イニシエーティング断片はDNAイニシエーティング断片である。別の実施態様では、イニシエーティング断片はRNAイニシエーティング断片である。幾つかの実施態様では、イニシエーティング断片は、3から100のヌクレオチド、特に、3から20のヌクレオチドを有する。幾つかの実施態様では、イニシエーティング断片は一本鎖である。別の実施態様では、イニシエーティング断片は二本鎖でありうる。幾つかの実施態様では、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、その5’末端によって合成担体に結合され得;他の実施態様では、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、例えば共有結合を介して合成担体に直接結合している相補的オリゴヌクレオチドと二重鎖を形成することによって、合成担体に間接的に結合されうる。幾つかの実施態様では、合成担体は、中実の平面状固体の分離した領域でありうるか、又はビーズでありうる固体担体である。
幾つかの実施態様では、イニシエーターは、TdTが3’-O-保護dNTPを結合しうる遊離ヒドロキシルを有する非核酸化合物を含みうる。例えば、Baigaの米国特許出願公開第2019/0078065号及び米国特許出願公開第2019/0078126号。
合成が完了した後、所望のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが、切断によってイニシエーター及び合成担体から切り離されうる。
この目的のために、多種多様な切断可能な結合又は切断可能なヌクレオチドを使用することができる。幾つかの実施態様では、所望のポリヌクレオチドを切断すると、切断された鎖に天然の遊離5’-ヒドロキシルが残る;しかしながら、別の実施態様では、切断ステップは、例えばホスファターゼ処理により、次のステップで除去されうる部分、例えば5’-ホスフェートを残しうる。切断ステップは、化学的、熱的、酵素的、又は光化学的方法によって実施されうる。幾つかの実施態様では、切断可能なヌクレオチドは、特定のグリコシラーゼ(例えば、それぞれエンドヌクレアーゼVIII、及び8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼが続くウラシルデオキシグリコシラーゼ)によって認識されるデオキシウリジン又は8-オキソ-デオキシグアノシンなどのヌクレオチドアナログでありうる。幾つかの実施態様では、切断は、イニシエーターに最後から二番目の3’ヌクレオチドとしてデオキシイノシンを提供することによって達成され得、これは、イニシエーターの3’末端でエンドヌクレアーゼVによって切断されて、切り離されたポリヌクレオチド上に5’-ホスフェートを残しうる。幾つかの実施態様では、イニシエーターは、合成後、所望のポリヌクレオチドがKOH又は類似の塩基での処理によってイニシエーターから切断されうるように末端ウリジンを含んでいてもよい。一本鎖ポリヌクレオチドを切断するための更なる方法は、出典明示により援用される次の文献に開示されている:米国特許第5739386号、第5700642号及び第5830655号;及び米国特許出願公開第2003/0186226号及び第2004/0106728号;及びUrdea及びHornの米国特許第5367066号。
図1に戻ると、幾つかの実施態様では、各合成ステップにおいて、3’-O-保護dNTPの存在下で、TdTなどのテンプレートフリーポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドの順序付けられた配列がイニシエーター核酸にカップリングされる。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドを合成する方法は、(a)遊離3’-ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供するステップ;(b)3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートの存在下でテンプレートフリーポリメラーゼとイニシエーター又は遊離3’-ヒドロキシルを有する伸展中間体を伸展条件下で反応させて、3’-O-保護伸展中間体を生成するステップ;(c)伸展中間体を脱保護して、遊離3’-ヒドロキシルを有する伸展中間体を生成するステップ;及び(d)ポリヌクレオチドが合成されるまでステップ(b)及び(c)を繰り返すステップを含む(しばしば「伸展中間体」又は「伸長断片」又は「成長鎖」という用語は、互換的に使用される)。幾つかの実施態様では、イニシエーターは、固体担体に、例えばその5’末端で結合したオリゴヌクレオチドとして提供される。上記の方法はまた洗浄ステップを、反応又は伸長ステップの後、並びに脱保護ステップの後に、含みうる。例えば、反応ステップは、予め決まったインキュベーション期間又は反応時間の後、例えば洗浄することによって、取り込まれなかったヌクレオシドトリホスフェートを除去するサブステップを含みうる。幾つかの実施態様では、そのような予め決まったインキュベーション期間又は反応時間は、30秒から30分、又は1分から30分、又は1分から15分、又は1分から10分の範囲でありうる。
幾つかの実施態様では、図1の合成サイクルが完了した後、完成したポリヌクレオチドを固体担体から切断し、適用のためにそれらを精製するために、更なるステップを実施することができる。そのような更なるステップは、アレイの反応チャンバー内で実施されうるか、或いは固体担体にまだ結合しているポリヌクレオチドが、そのような更なるステップを実施するための他の反応容器に移送されうる。加えて、一部の切断方法では、使用可能な生成物に変換するためにまだ改変を必要とする放出生成物が得られる場合がある。例えば、「エンドヌクレアーゼV-イノシン」切断(後述)では、一部の用途では除去されなければならない5’-ホスフェートが残る。従って、ホスファターゼ処理の更なるステップが必要とされうる。
幾つかの実施態様では、合成サイクルは次のように表されうる:
上に示されるように、幾つかの実施態様では、カップリング反応溶液は反応チャンバー内に残り、ステップ(ii)でデブロッキング溶液が単にそれに加えられる。幾つかの実施態様では、カップリングステップの後で脱保護ステップの前に、洗浄ステップを実施してもよい。
上に示されるように、幾つかの実施態様では、カップリング反応溶液は反応チャンバー内に残り、ステップ(ii)でデブロッキング溶液が単にそれに加えられる。幾つかの実施態様では、カップリングステップの後で脱保護ステップの前に、洗浄ステップを実施してもよい。
特定の実施態様では、合成プロセス中の各サイクルにおいて又は定期的に、更なるステップが実施されうる。例えば、上述のように、時折、例えば、テンプレートフリーポリメラーゼが、反応チャンバー壁、フィルター表面、又は細孔などの表面に付着して、液体移動を阻害する閉塞が引き起こされることにより、酵素の蓄積が生じた場合、プロテアーゼ処理のステップが用いられうる。反応時間又は持続時間、t1、t2及びt3は、例えば、異なるテンプレートフリーポリメラーゼ、反応温度、反応バッファー、単量体、脱保護溶液などが用いられる特定の実施態様に依存して、広く変わりうる。
合成担体上のポリヌクレオチドの予め決まった配列が逆相補サブ配列を含む場合、逆相補領域間における水素結合の形成によって、二次分子内又は分子間構造が生成されうる。幾つかの実施態様では、環外アミンの塩基保護部分は、保護された窒素の水素が水素結合に関与できず、それによってそのような二次構造の形成が妨げられるように選択される。すなわち、塩基保護部分は、例えばヌクレオシドAとTの間、及びGとCの間など、通常の塩基対形成において形成されるような水素結合の形成を妨げるように用いることができる。合成の終わりに、塩基保護部分は除去することができ、ポリヌクレオチド生成物は、例えば、そのイニシエーターから切断することによって、固体担体から切断することができる。
3’-O-ブロックdNTP単量体に塩基保護基を提供することに加えて、伸長反応は、熱安定性テンプレートフリーポリメラーゼを使用してより高い温度で実施されうる。例えば、40℃を超えて活性を有する熱的に安定なテンプレートフリーポリメラーゼを用いることができ;又は幾つかの実施態様では、40~85℃の範囲で活性を有する熱的に安定なテンプレートフリーポリメラーゼを用いることができ;又は幾つかの実施態様では、40~65℃の範囲で活性を有する熱的に安定なテンプレートフリーポリメラーゼを用いることができる。
幾つかの実施態様では、伸長条件は、水素結合又は塩基スタッキングを阻害する溶媒を伸長反応混合物に添加することを含みうる。そのような溶媒には、ジメチルスルホキシド(DMSO)、メタノールなどの低誘電率の水混和性溶媒が含まれる。同様に、幾つかの実施態様では、伸長条件は、限定されないが、n-ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、2-プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、尿素などを含むカオトロピック剤の提供を含みうる。幾つかの実施態様では、伸長条件は、二次構造抑制量のDMSOの存在を含む。幾つかの実施態様では、伸長条件は、二次構造の形成を阻害するDNA結合タンパク質の提供を含み得、そのようなタンパク質には、限定されないが、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、DNAグリコラーゼなどが含まれる。
塩基保護dNTPが用いられる場合、図1の上記方法は、塩基保護部分を除去するステップ(e)を更に含み得、これは、アシル又はアミジン保護基の場合、(例えば)濃アンモニアでの処理を含みうる。
上記の方法はまたキャッピングステップ並びに洗浄ステップを、反応又は伸長ステップの後、並びに脱保護ステップの後に含みうる。上述のように、幾つかの実施態様では、非伸長遊離3’-ヒドロキシルを、キャップされた鎖の更なる伸長を妨げる化合物と反応させる、キャッピングステップが含まれうる。幾つかの実施態様では、そのような化合物は、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートでありうる。他の実施態様では、遊離3’-ヒドロキシルを有する非伸長鎖は、それらを3’-エキソヌクレアーゼ活性、例えばExo Iで処理することによって分解されうる。例えば、Hymanの米国特許第5436143号を参照のこと。同様に、幾つかの実施態様では、デブロックに失敗した鎖を処理して、鎖を除去するか、更なる伸長に対して不活性にすることができる。
幾つかの実施態様では、伸長ステップ(伸展ステップ又はカップリングステップと呼ばれることもある)の反応条件は、2.0μMの精製TdT;125~600μMの3’-O-ブロックdNTP(例えば、3’-O-NH2-ブロックdNTP);約10から約500mMのカコジル酸カリウムバッファー(6.5と7.5の間のpH)及び約0.01から約10mMの二価カチオン(例えば、CoCl2又はMnCl2)を含み得、ここで、伸長反応は、室温から45℃の範囲内の温度で3分間、50μLの反応容量で実施されうる。3’-O-ブロックdNTPが3’-O-NH2-ブロックdNTPである実施態様では、デブロッキングステップの反応条件は、700mMのNaNO2;1Mの酢酸ナトリウム(酢酸で4.8~6.5の範囲のpHに調整)を含み得、ここで、デブロッキング反応は、室温から45℃の範囲内の温度で30秒から数分間、50μLの容量で実施されうる。洗浄は、カップリング反応の成分(例えば、酵素、単量体、二価カチオン)を含まないカコジル酸バッファーで実施されうる。
幾つかの実施態様では、RNA合成は、上記と同様のステップによるが、例えば、Heinisch等の国際特許公開第2021/018919号に記載されているような、RNA合成のために特に選択されたテンプレートフリーポリメラーゼ及び単量体を用いて達成されうる。例えば、本発明のシステム、装置及びキットは、a)遊離3’-ヒドロキシルを有する3’末端ヌクレオチドを有するイニシエーターを提供するステップ;及びb)ポリリボヌクレオチドが形成されるまで、(i)イニシエーター又は伸長断片が、3’-O-ブロックヌクレオシドトリホスフェートの取り込みによって伸長されて、3’-O-ブロック伸長断片を形成するように、遊離3’-ヒドロキシルを有するイニシエーター又は伸長断片を、3’-O-ブロックヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼと伸長条件下で接触させ、且つ(ii)伸長断片をデブロックして、遊離3’-ヒドロキシルを有する伸長断片を形成するサイクルを繰り返すステップを含み、ここで、テンプレートフリーポリメラーゼがポリ(A)ポリメラーゼ(PAP)又はポリ(U)ポリメラーゼである、予め決まった配列を有するポリリボヌクレオチドを合成する方法を実行しうる。更なる実施態様では、イニシエーターは、5’末端によって担体に結合され得、担体は固体担体であり得、上記の方法は、イニシエーターからポリヌクレオチドを切断するステップを含みうる。幾つかの実施態様では、PAP又はPUPを使用する伸長又は伸展ステップの反応条件は、次のものを含みうる:反応条件1(プライマー+AM-rATPに対して):250uMのAM-rATP、0.1uMのATTO488-(rA)5、1uMのPAP、1×ATPバッファー(20mMのTris-HCl、0.6mMのMnCl2、0.02mMのEDTA、0.1%のBSA、10%のグリセロール、100mMのイミダゾール,pH7~8)、37C、30分。反応条件2(プライマー+AM-rGTPに対して):250uMのrGTP、0.1uMのATTO488-(rA)5、1uMのPAP、1×GTPバッファー(0.6mMのMnCl2、0.1%のBSA、10mMのイミダゾール,pH6)、37C、30分。上記において、「AM-rNTP」は、3’-アジドメチル-O-リボヌクレオシドトリホスフェートを指す。本発明において用いられる3’?O-ブロックrNTPの多くは、商業供給業者(例えば、Jena Bioscience、MyChemLabsなど)から購入するか、公開された技術、例えば、米国特許第7057026号;国際特許公開第2004/005667号、国際公開第91/06678号;Canard等,Gene(上で引用);Metzker等,Nucleic Acids Research,22:4259-4267(1994);Meng等,J.Org.Chem.,14:3248-3252(3006);米国特許出願公開第2005/037991号;Zavgorodny等,Tetrahedron Letters,32(51):7593-7596(1991)を使用して合成されうる。更なる特定の実施態様では、3’-ブロックヌクレオチドトリホスフェートは、3’-O-プロパルギル、3’-O-アジドメチル、3’-O-NH2又は3’-O-アリル基の何れかによってブロックされる。更に他の実施態様では、本発明の3’-O-ブロッキング基には、3’-O-メチル、3’-O-(2-ニトロベンジル)、3’-O-アリル、3’-O-アミン、3’-O-アジドメチル、3’-O-tert-ブトキシエトキシ、3’-O-(2-シアノエチル)、及び3’-O-プロパルギルが含まれる。
[合成担体]
本発明のシステム及び装置によって実行される方法では、多種多様な合成担体を使用することができる。合成担体は、望ましくない反応物が洗浄ステップなどで除去されるときに、結合した前駆体を保持する手段を提供することによって、所望のポリヌクレオチド生成物の中間体又は前駆体について複数の反応、特にカップリング反応サイクルを実施することを可能にする。合成担体の重要な特徴は、担体と結合した前駆体又は生成物とが、流体除去ステップ中に反応チャンバーのフィルターによって保持されることである。合成担体の他の有用な特徴には、結合した生成物前駆体へのテンプレートフリーポリメラーゼの到達性、反応物又は前駆体と(例えば吸着による物理的に、又は化学的に)相互作用しない組成物、イニシエーターが容易に結合できるようにする組成物、用いられる試薬における良好な溶解性などが含まれる。合成担体には、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)担体、デンドリマー担体などを含むポリマー担体などの可溶性担体;ポリスチレン粒子、Dynabeadsなどの非膨潤性固体担体;アガロースを含む樹脂又はゲルなどの膨潤性固体担体が含まれる。合成担体体は、フィルター膜などの反応チャンバーの一部を形成することもできる。可溶性担体を選択するためのガイダンスは、参考文献Bonora等,Nucleic Acids Research,212(5):1213-1217(1993);Dickerson等,Chem.Rev.102:3325-3344(2002);Fishman等,J.Org.Chem.,68:9843-9846(2003);Gavert等,Chem.Rev.97:489-509(1997);Shchepinov等,Nucleic Acids Research,25(22):4447-4454(1997):及び類似の参考文献に見出される。固体担体を選択するためのガイダンスは、Brown等,Synlett 1998(8):817-827;Maeta等,米国特許第9045573号;Beaucage及びIyer,Tetrahedron,48(12):2223-2311(1992)等々に見出される。オリゴヌクレオチドを固体担体に結合させるためのガイダンスは、Arndt-Jovin等,Eur.J.Biochem.,54:411-418(1975);Ghosh等,Nucleic Acids Research,15(13):5353-5372(1987);Integrated DNA Technologies,“Strategies for attaching oligonucleotides to solid supports,”2014(v6);Gokmen等,Progress in Polymer Science 37:365-405(2012);及び類似文献に見出される。
本発明のシステム及び装置によって実行される方法では、多種多様な合成担体を使用することができる。合成担体は、望ましくない反応物が洗浄ステップなどで除去されるときに、結合した前駆体を保持する手段を提供することによって、所望のポリヌクレオチド生成物の中間体又は前駆体について複数の反応、特にカップリング反応サイクルを実施することを可能にする。合成担体の重要な特徴は、担体と結合した前駆体又は生成物とが、流体除去ステップ中に反応チャンバーのフィルターによって保持されることである。合成担体の他の有用な特徴には、結合した生成物前駆体へのテンプレートフリーポリメラーゼの到達性、反応物又は前駆体と(例えば吸着による物理的に、又は化学的に)相互作用しない組成物、イニシエーターが容易に結合できるようにする組成物、用いられる試薬における良好な溶解性などが含まれる。合成担体には、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)担体、デンドリマー担体などを含むポリマー担体などの可溶性担体;ポリスチレン粒子、Dynabeadsなどの非膨潤性固体担体;アガロースを含む樹脂又はゲルなどの膨潤性固体担体が含まれる。合成担体体は、フィルター膜などの反応チャンバーの一部を形成することもできる。可溶性担体を選択するためのガイダンスは、参考文献Bonora等,Nucleic Acids Research,212(5):1213-1217(1993);Dickerson等,Chem.Rev.102:3325-3344(2002);Fishman等,J.Org.Chem.,68:9843-9846(2003);Gavert等,Chem.Rev.97:489-509(1997);Shchepinov等,Nucleic Acids Research,25(22):4447-4454(1997):及び類似の参考文献に見出される。固体担体を選択するためのガイダンスは、Brown等,Synlett 1998(8):817-827;Maeta等,米国特許第9045573号;Beaucage及びIyer,Tetrahedron,48(12):2223-2311(1992)等々に見出される。オリゴヌクレオチドを固体担体に結合させるためのガイダンスは、Arndt-Jovin等,Eur.J.Biochem.,54:411-418(1975);Ghosh等,Nucleic Acids Research,15(13):5353-5372(1987);Integrated DNA Technologies,“Strategies for attaching oligonucleotides to solid supports,”2014(v6);Gokmen等,Progress in Polymer Science 37:365-405(2012);及び類似文献に見出される。
幾つかの実施態様では、固相担体は、典型的には、樹脂又はゲルの形態の小さな多孔性ビーズ又は粒子から構成される。数多くの材料が、ポリヌクレオチドの合成のための固相担体として適している。上述のように、そのような担体は、その細孔内外への良好な物質移動を提供し、化学的に不活性であり、試薬及び溶媒による影響を最小限に抑え、イニシエーターとポリヌクレオチド生成物の両方のポリヌクレオチドの誘導体化、結合及び除去を可能にする必要がある。ここで使用される場合、「粒子」という用語は、限定されるものではないが、「マイクロ粒子」又は「ナノ粒子」又は「ビーズ」又は「マイクロビーズ」又は「ミクロスフェア」を含む。本発明において有用な粒子又はビーズには、例えば、直径10から300ミクロン、又は直径20から300ミクロン、又は直径30から300ミクロンのビーズ、又は直径300ミクロンより大きいビーズが含まれる。粒子は、ガラス、プラスチック、ポリスチレン、樹脂、ゲル、アガロース、セファロース、及び/又は他の適切な材料で作製されうる。特に興味深いのは、アガロースビーズなどの多孔性樹脂粒子又はビーズである。例示的なアガロース粒子には、SepharoseTMビーズが含まれる。幾つかの実施態様では、40~165μmの範囲の直径を有する臭化シアン活性化4%架橋アガロースビーズを、本発明によって実行される方法で使用することができる。他の実施態様では、200~300μmの範囲の直径を有する臭化シアン活性化6%架橋アガロースビーズを、本発明によって実行される方法で使用することができる。後者の二つの実施態様では、5’-アミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドイニシエーターを、本発明で使用するためにSepharoseTMビーズにカップリングさせることができる。アガロースビーズの他の望ましいリンカーには、チオール及びエポキシリンカーが含まれる。
粒子は、分子、細胞、他の粒子又は他の材料に共有結合するために官能化されうる。結合されうる例示的な分子には、合成反応の中間化合物(又は最終化合物)が含まれる。当業者によって理解されるように、粒子の官能化は、実施される合成反応に依存する。チオール、アミン、カルボキシルなどの化学反応基を有する所定のポリマーなどの固体担体表面の官能化は、一般に当該技術分野で知られている。合成反応中に続いてビルディングブロックを付加するためのこれら界面化学の幾つかの例には、限定されないが、脂肪族及び芳香族アミンを含むアミノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネート及びホスフェートが含まれる。これらの官能基は、限定されないが、アミノ官能化担体、スルフヒドリルリンカーなどの使用を含む、既知の化学を一般に使用して、任意の数の異なるビルディングブロック部分を粒子に付加するために使用することができる。当該技術分野ではSPDP、マレイミド、o-ハロアセチル、及びピリジルジスルフィドなどの知られている多くのスルフヒドリル反応性リンカーがある。同様に、ビルディングブロック上及び表面上のアミノ基は、リンカーを使用して結合されうる;例えば、ホモ二官能性リンカー及びヘテロ二官能性リンカーを含む、多数の安定な二官能基が当該技術分野で周知である(例えば、Hemanson(上記で引用)を参照)。追加の実施態様では、カルボキシル基(表面から又はビルディングブロックからの何れか)は、周知のリンカーを使用して誘導体化することができる。例えば、カルボジイミドは、アミンなどの良好な求核試薬による攻撃のためにカルボキシル基を活性化する(Torchilin等,Critical Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems,7(4):275-308(1991)を参照)。
幾つかの実施態様では、多孔性樹脂担体は、少なくとも10nm、又は少なくとも20nm、又は少なくとも50nmの平均孔径を有する。他の実施態様では、多孔性樹脂担体は、10nmから500nmの範囲、又は50nmから500nmの範囲の平均孔径を有する。
図3A~3H及び5A~5Gに記載されたもののような幾つかの実施態様では、合成担体として96ウェル合成プレート及びアガロースビーズを使用すると、切断された20~60量体のポリヌクレオチド生成物のウェル当たりの収量は、イニシエーター負荷の50~70パーセントの範囲でありうる。従って、合成担体が100ピコモルのイニシエーターを含む場合、切断された生成物は50~70ピコモルの範囲である。
[3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェート]
特定の適用に応じて、デブロッキング及び/又は切断のステップは、様々な化学的又は物理的条件、例えば、光、熱、pH、特定の化学結合を切断することができる酵素などの特異的試薬の存在を含みうる。3’-O-ブロッキング基と対応するデブロッキング条件の選択におけるガイダンスは、出典明示により援用される次の参考文献に見出されうる:Bennerの米国特許第7544794号及び第8212020号;米国特許第5808045号;米国特許第8808988号;国際特許公開第91/06678号;及び以下に引用した参考文献。幾つかの実施態様では、切断剤(しばしば、デブロッキング試薬又はデブロッキング剤とも呼ばれる)は、化学的切断剤、例えば、ジチオトレイトール(DTT)などである。別の実施態様では、切断剤は、3’-ホスフェートブロッキング基を切断しうる酵素切断剤、例えば、ホスファターゼなどでありうる。デブロッキング剤の選択が、使用される3’-ヌクレオチドブロッキング基のタイプ、一又は複数のブロッキング基が使用されるかどうか、イニシエーターが生細胞若しくは生物又は固体担体などに結合されるかどうか(これは穏やかな処理を必要とする)に依存することが当業者には理解される。例えば、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)などのホスフィンを使用して3’O-アジドメチル基を切断することができ、パラジウム錯体を使用して3’O-アリル基を切断することができ、或いは、亜硝酸ナトリウムを使用して3’O-アミノ基を切断することができる。特定の実施態様では、切断反応は、TCEP、パラジウム錯体又は亜硝酸ナトリウムを含む。
特定の適用に応じて、デブロッキング及び/又は切断のステップは、様々な化学的又は物理的条件、例えば、光、熱、pH、特定の化学結合を切断することができる酵素などの特異的試薬の存在を含みうる。3’-O-ブロッキング基と対応するデブロッキング条件の選択におけるガイダンスは、出典明示により援用される次の参考文献に見出されうる:Bennerの米国特許第7544794号及び第8212020号;米国特許第5808045号;米国特許第8808988号;国際特許公開第91/06678号;及び以下に引用した参考文献。幾つかの実施態様では、切断剤(しばしば、デブロッキング試薬又はデブロッキング剤とも呼ばれる)は、化学的切断剤、例えば、ジチオトレイトール(DTT)などである。別の実施態様では、切断剤は、3’-ホスフェートブロッキング基を切断しうる酵素切断剤、例えば、ホスファターゼなどでありうる。デブロッキング剤の選択が、使用される3’-ヌクレオチドブロッキング基のタイプ、一又は複数のブロッキング基が使用されるかどうか、イニシエーターが生細胞若しくは生物又は固体担体などに結合されるかどうか(これは穏やかな処理を必要とする)に依存することが当業者には理解される。例えば、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)などのホスフィンを使用して3’O-アジドメチル基を切断することができ、パラジウム錯体を使用して3’O-アリル基を切断することができ、或いは、亜硝酸ナトリウムを使用して3’O-アミノ基を切断することができる。特定の実施態様では、切断反応は、TCEP、パラジウム錯体又は亜硝酸ナトリウムを含む。
上述の通り、幾つかの実施態様では、オルソゴナルなデブロッキング条件を使用して除去されうる二以上のブロッキング基を用いることが望ましい。次の例示的なブロッキング基の対を、並行合成実施態様で使用できる。他のブロッキング基の対又は二を超えて含む基が、本発明のこれらの実施態様での使用に対して利用可能でありうることが理解される。
幾つかの実施態様では、特異的な酵素的に除去可能なブロッキング基は、その除去に特異的な酵素を必要とする。例えば、エステル又はアシル系のブロッキング基は、アセチルエステラーゼなどのエステラーゼ又は類似の酵素を用いて除去され得、ホスフェートブロッキング基は、T4ポリヌクレオチドキナーゼなどの3’ホスファターゼを用いて除去されうる。例として、3’-O-ホスフェートは、100mMのTris-HCl(pH6.5)、10mMのMgC12、5mMの2-メルカプトエタノール、及び1単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼの溶液での処理によって除去されうる。反応は、37℃の温度において1分間進行する。
3’-O-エステル保護dNTP又は3’-O-ホスフェート保護dNTPの合成及び酵素的脱保護の更なる例は次の文献に記載されている:Canard等,Proc.Natl.Acad.Sci.,92:10859-10863(1995);Canard等,Gene,148:1-6(1994);Cameron等,Biochemistry,16(23):5120-5126(1977);Rasolonjatovo等,Nucleosides & Nucleotides,18(4&5):1021-1022(1999);Ferrero等,Monatshefte fur Chemie,131:585-616(2000);Taunton-Rigby等,J.Org.Chem.,38(5):977-985(1973);Uemura等,Tetrahedron Lett.,30(29):3819-3820(1989);Becker等,J.Biol.Chem.,242(5):936-950(1967);Tsien,国際特許公開第1991/006678号。
幾つかの実施態様では、改変ヌクレオチドは、プリン又はピリミジン塩基と、3’炭素原子が構造:
-O-Z
の基に結合しているように、除去可能な3’-OHブロッキング基が共有結合的に結合したリボース又はデオキシリボース糖部分とを含む改変ヌクレオチド又はヌクレオシド分子を含み、ここで、-Zは、-C(R’)2-O-R’’、-C(R’)2-N(R’’)2、-C(R’)2-N(H)R’’、-C(R’)2-S-R’’、及び-C(R’)2-Fのうちの何れかであり、各R’’は、除去可能な保護基であるか又はその一部であり;各R’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ若しくはアミド基、又は連結基を介して結合した検出可能な標識であり;但し、幾つかの実施態様では、そのような置換基は、10個までの炭素原子及び/又は5個までの酸素若しくは窒素ヘテロ原子を有し;或いは、(R’)2は、式=C(R’’’)2の基を表し、ここで、各R’’’は、同一でも異なっていてもよく、水素原子及びハロゲン原子並びにアルキル基を含む群から選択され、但し、幾つかの実施態様では、各R’’’のアルキルは、1から3の炭素原子を有し;且つ分子が反応して、各R’’がHと交換されるか、或いはZが-(R’)2-Fである場合、FがOH、SH、又はNH2、好ましくはOHと交換される中間体を生成してもよく、該中間体は水性条件下で解離して遊離3’-OHを有する分子が得られ;但し、Zが-C(R’)2-S-R’’である場合、両方のR’基はHではない。所定の実施態様では、改変ヌクレオチド又はヌクレオシドのR’は、アルキル又は置換アルキルであり、但し、そのようなアルキル又は置換アルキルは、1から10個の炭素原子と0から4個の酸素又は窒素ヘテロ原子を有する。所定の実施態様では、改変ヌクレオチド又はヌクレオシドの-Zは、式-C(R’)2-N3である。所定の実施態様では、Zはアジドメチル基である。
-O-Z
の基に結合しているように、除去可能な3’-OHブロッキング基が共有結合的に結合したリボース又はデオキシリボース糖部分とを含む改変ヌクレオチド又はヌクレオシド分子を含み、ここで、-Zは、-C(R’)2-O-R’’、-C(R’)2-N(R’’)2、-C(R’)2-N(H)R’’、-C(R’)2-S-R’’、及び-C(R’)2-Fのうちの何れかであり、各R’’は、除去可能な保護基であるか又はその一部であり;各R’は、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ若しくはアミド基、又は連結基を介して結合した検出可能な標識であり;但し、幾つかの実施態様では、そのような置換基は、10個までの炭素原子及び/又は5個までの酸素若しくは窒素ヘテロ原子を有し;或いは、(R’)2は、式=C(R’’’)2の基を表し、ここで、各R’’’は、同一でも異なっていてもよく、水素原子及びハロゲン原子並びにアルキル基を含む群から選択され、但し、幾つかの実施態様では、各R’’’のアルキルは、1から3の炭素原子を有し;且つ分子が反応して、各R’’がHと交換されるか、或いはZが-(R’)2-Fである場合、FがOH、SH、又はNH2、好ましくはOHと交換される中間体を生成してもよく、該中間体は水性条件下で解離して遊離3’-OHを有する分子が得られ;但し、Zが-C(R’)2-S-R’’である場合、両方のR’基はHではない。所定の実施態様では、改変ヌクレオチド又はヌクレオシドのR’は、アルキル又は置換アルキルであり、但し、そのようなアルキル又は置換アルキルは、1から10個の炭素原子と0から4個の酸素又は窒素ヘテロ原子を有する。所定の実施態様では、改変ヌクレオチド又はヌクレオシドの-Zは、式-C(R’)2-N3である。所定の実施態様では、Zはアジドメチル基である。
幾つかの実施態様では、Zは、200以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Zは、100以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Zは、50以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない切断可能な有機部分である。幾つかの実施態様では、Zは、200以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Zは、100以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Zは、50以下の分子量を有するヘテロ原子を持つか持たない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施態様では、Zは、200以下の分子量を有する酵素的に切断可能なエステル基である。他の実施態様では、Zは、3’-ホスファターゼによって除去可能なホスフェート基である。幾つかの実施態様では、次の3’-ホスファターゼの一又は複数を、製造者の推奨プロトコルを用いて使用してもよい:T4ポリヌクレオチドキナーゼ、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、組換えエビアルカリホスファターゼ(例えば、New England Biolabs,Beverly,MAから入手可能)。
更なる実施態様では、3’-ブロックヌクレオチドトリホスフェートは、3’-O-アジドメチル、3’-O-NH2又は3’-O-アリル基の何れかによってブロックされる。
更に他の実施態様では、本発明の3’-O-ブロッキング基には、3’-O-メチル、3’-O-(2-ニトロベンジル)、3’-O-アリル、3’-O-アミン、3’-O-アジドメチル、3’-O-tert-ブトキシエトキシ、3’-O-(2-シアノエチル)、及び3’-O-プロパルギルが含まれる。
幾つかの実施態様では、3’-O-保護基は、電気化学的に不安定な基である。すなわち、保護基の脱保護又は切断は、切断を生じる保護基近傍の電気化学的条件を変えることによって達成される。電気化学的条件のそのような変化は、電圧差又は光などの物理的量を変化させ又は印加して補助種を活性化し、これが次にpHの増減のような保護基の部位で電気化学的条件の変化を引き起こすことによって、もたらされうる。幾つかの実施態様では、電気化学的に不安定な基には、例えば、pHが予め決まった値に変化するときは常に切断されるpH感受性保護基が含まれる。他の実施態様では、電気化学的に不安定な基には、例えば、保護基の部位で電圧差を増加又は減少させることによって、還元又は酸化条件が変化するときは常に直接切断される保護基が含まれる。
塩基保護のない3’-O-ブロックdNTPは、販売者から購入されうるか、又は公開された技術、例えば、米国特許第7057026号;Guo等,Proc.Natl.Acad.Sci.,105(27):9145-9150(2008);Benner,米国特許第7544794号及び第8212020号;国際特許公開第2004/005667号、国際特許公開第91/06678号;Canard等,Gene(上で引用);Metzker等,Nucleic Acids Research,22:4259-4267(1994);Meng等,J.Org.Chem.,14:3248-3252(2006);米国特許出願公開第2005/037991号を使用して合成されうる。塩基保護を伴う3’-O-ブロックdNTPは、以下に記載されるように合成されうる。
[テンプレートフリーポリメラーゼ]
本発明のシステム及び装置によって実行される合成法において使用するために、様々な異なるテンプレートフリーポリメラーゼが利用可能である。テンプレートフリーポリメラーゼには、限定されないが、例えば、次の参考文献:Ybert等,国際特許公開WO2017/216472;Champion等,米国特許第10435676号;Champion等,国際特許公開WO2020/099451;Yang等,J.Biol.Chem.,269(16):11859-11868(1994);Motea等,Biochim.Biophys.Acta,1804(5):1151-1166(2010)に記載されている、polXファミリーポリメラーゼ(DNAポリメラーゼβ、λ及びμを含む)、ポリ(A)ポリメラーゼ(PAP)、ポリ(U)ポリメラーゼ(PUP)、DNAポリメラーゼθ等が含まれる。特に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)とそのバリアントは、テンプレートフリーDNA合成において有用である。幾つかの実施態様では、テンプレートフリーポリメラーゼは、カップリング反応効率、製造可能性、貯蔵寿命、最小回転半径、並びに自己凝集及び表面への付着の欠如などの特性に基づいて選択される。幾つかの実施態様では、テンプレートフリーポリメラーゼは、例えばM96(配列番号:68又は69)及びM103(配列番号:70又は71)など、カップリング効率、最小回転半径、並びに自己凝集及び表面への付着の欠如について特に選択された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)バリアントである。
本発明のシステム及び装置によって実行される合成法において使用するために、様々な異なるテンプレートフリーポリメラーゼが利用可能である。テンプレートフリーポリメラーゼには、限定されないが、例えば、次の参考文献:Ybert等,国際特許公開WO2017/216472;Champion等,米国特許第10435676号;Champion等,国際特許公開WO2020/099451;Yang等,J.Biol.Chem.,269(16):11859-11868(1994);Motea等,Biochim.Biophys.Acta,1804(5):1151-1166(2010)に記載されている、polXファミリーポリメラーゼ(DNAポリメラーゼβ、λ及びμを含む)、ポリ(A)ポリメラーゼ(PAP)、ポリ(U)ポリメラーゼ(PUP)、DNAポリメラーゼθ等が含まれる。特に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)とそのバリアントは、テンプレートフリーDNA合成において有用である。幾つかの実施態様では、テンプレートフリーポリメラーゼは、カップリング反応効率、製造可能性、貯蔵寿命、最小回転半径、並びに自己凝集及び表面への付着の欠如などの特性に基づいて選択される。幾つかの実施態様では、テンプレートフリーポリメラーゼは、例えばM96(配列番号:68又は69)及びM103(配列番号:70又は71)など、カップリング効率、最小回転半径、並びに自己凝集及び表面への付着の欠如について特に選択された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)バリアントである。
幾つかの実施態様では、酵素合成法は、3’-O-修飾ヌクレオシドトリホスフェートに関して増加した取り込み活性を示すTdTバリアントを用いる。例えば、そのようなTdTバリアントは、出典明示によりここに援用されるChampion等の米国特許第10435676号に記載された技術を使用して産生されうる。幾つかの実施態様では、配列番号:2と少なくとも60パーセント同一、若しくは少なくとも80パーセント同一のアミノ酸配列、207位の第一アルギニンに置換、及び325位の第二のアルギニンに置換を有し、或いはその機能的に同等の残基を有するTdTバリアントが用いられる。幾つかの実施態様では、配列番号:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60パーセント同一のアミノ酸配列を、配列番号:2、3、4、6、7、9、12及び13に対しては207位、配列番号:5に対しては206位、配列番号:8及び10に対しては208位、配列番号:11に対しては205位、配列番号:14に対しては216位、及び配列番号:15に対しては210位にアルギニン(「第一のアルギニン」)の置換を持ち;且つ配列番号:2、9及び13に関しては325位、配列番号:3及び4に関しては324位、配列番号:320に関しては320位、配列番号:6及び8に関しては331位、配列番号:11に関しては323位、配列番号:12及び15に関しては328位、及び配列番号:14に関しては338位にアルギニン(「第二のアルギニン」)の置換を持ち;或いはその機能的に同等の残基を有するTdTバリアントが用いられ;ここで、TdTバリアントは、(i)テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、且つ(ii)3’-O-修飾ヌクレオチドを核酸断片の遊離3’-ヒドロキシル上に取り込むことができる。幾つかの実施態様では、上記同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも80パーセントの同一性であり;幾つかの実施態様では、上記同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも90パーセントの同一性であり;幾つかの実施態様では、上記同一性パーセント値は、示された配列番号と少なくとも95パーセントの同一性であり;幾つかの実施態様では、上記同一性パーセント値は、少なくとも97パーセントの同一性であり;幾つかの実施態様では、上記同一性パーセント値は、少なくとも98パーセントの同一性であり;幾つかの実施態様では、上記同一性パーセント値は、少なくとも99パーセントの同一性である。ここで使用される場合、参照配列をバリアント配列と比較するために使用される同一性パーセント値は、バリアント配列の置換を含む明示的に特定されたアミノ酸位置を含まない;すなわち、同一性パーセントの関係は、参照タンパク質の配列と、バリアント内の置換を含む明示的に特定された位置の外側のバリアントタンパク質の配列との間である。従って、例えば、参照配列とバリアント配列がそれぞれ100個のアミノ酸を含み、バリアント配列が25位及び81位に変異を有する場合、相同性パーセントは配列1~24、26~80及び82~100に関するものであろう。
(ii)に関して、そのような3’-O-修飾ヌクレオチドは、3’-O-NH2-ヌクレオシドトリホスフェート、3’-O-アジドメチル-ヌクレオシドトリホスフェート、3’-O-アリル-ヌクレオシドトリホスフェート、3’O-(2-ニトロベンジル)-ヌクレオシドトリホスフェート、又は3’-O-プロパルギル-ヌクレオシドトリホスフェートを含みうる。
幾つかの実施態様では、上記TdTバリアントは、表1に示されるように、第一及び第二のアルギニンに置換を有する。
幾つかの実施態様では、本発明の方法で使用するための更なるTdTバリアントは、表1に示されるように、メチオニン、システイン又はグルタミン酸の置換の一又は複数を含む。
本発明のシステムの幾つかの実施態様は、切断型配列のN末端に安定化変異を有するN末端切断型末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)バリアントの使用を含む。すなわち、幾つかの実施態様では、本発明のシステムは、TdTバリアントが野生型TdT又は前のTdTバリアントよりも容易に多孔性固体担体及び樹脂の内部空間にアクセスできるようにする最小化されたサイズ及び回転半径を有するコンパクトなTdTバリアントを用いる。幾つかの実施態様では、N末端切断型TdTバリアントの安定化変異は、Q152位(ここで、アミノ酸位置番号は全長マウスTdT(配列番号:1)に対するものである)、又は他のTdTアミノ酸配列では機能的に同等の位置にある。幾つかの実施態様では、本発明で使用されるTdTバリアントは、精製を容易にし、その回転半径を最小化する末端又は内部親和性タグを含む。幾つかの実施態様では、本発明の装置で使用されるそのような安定化切断型TdTは、配列番号:16~30、32、35、37、39、41、43、45、46、49又は50のアミノ酸配列と少なくとも90パーセント同一であり、表2の更なる変異を受けるアミノ酸配列を有する。
更なる実施態様では、本発明の装置で使用するためのTdTバリアントは、配列番号:31、33、34、36、38、40、42、44、47、48、又は51~71のアミノ酸配列を有するTdTバリアントの群から選択される。幾つかの実施態様では、そのようなTdTバリアントは、配列番号:56、57、68、69、70又は71のアミノ酸配列を有する。
更なる実施態様では、本発明の装置で使用するためのTdTバリアントは、配列番号:31、33、34、36、38、40、42、44、47、48、又は51~71のアミノ酸配列を有するTdTバリアントの群から選択される。幾つかの実施態様では、そのようなTdTバリアントは、配列番号:56、57、68、69、70又は71のアミノ酸配列を有する。
上に記載された本発明のキメラTdTバリアントは、示された置換の存在を条件として、特定された配列番号とある配列同一性パーセントを有するアミノ酸配列をそれぞれ含む。幾つかの実施態様では、このように記載される本発明のTdTバリアントと特定された配列番号との間の配列差の数及びタイプは、置換、欠失及び/又は挿入によるものであり得、置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸は、任意のアミノ酸を含みうる。幾つかの実施態様では、そのような欠失、置換及び/又は挿入は、天然に存在するアミノ酸のみを含む。幾つかの実施態様では、置換は、Grantham,Science,185:862-864(1974)に記載されているように、保存的又は同義のアミノ酸変化のみを含む。つまり、アミノ酸の置換は、その同義アミノ酸セットのメンバー間でのみ起こりうる。幾つかの実施態様では、用いられうる同義アミノ酸のセットは、表3Aに示される。
幾つかの実施態様では、用いられうる同義アミノ酸のセットは、表3Bに示される。
幾つかの実施態様では、用いられうる同義アミノ酸のセットは、表3Bに示される。
[自動合成機で複数のポリヌクレオチドの酵素合成を実施するためのキット]
一態様では、本発明のキットは、本発明のシステム及び装置の特定の実施態様での使用に適合した消耗品を含む。幾つかの実施態様では、本発明のキットは、各々が一般的な96ウェル又は384ウェルのフィルタープレートの形態で結合したイニシエーターを有する合成担体を有する複数の反応チャンバーの平面アレイを含み、各ウェルには粘性湿潤剤溶液中の予め決まった量の合成担体が堆積される。幾つかの実施態様では、そのような合成担体は、プラスチック、ホイル又は他の気密性の非透過性包装材料に更に真空パックされる。幾つかの実施態様では、湿潤剤溶液の粘度は、40~60パーセント(v/v)のグリセロール:水溶液と同等である。幾つかの実施態様では、保湿剤溶液は、グリセロール、アルコール糖、エチルヘキシルグリセリン、パンテノール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ブチレングリコール、乳酸ナトリウム、ヒアルロン酸、及びポリデキストロースからなる群から選択される保湿剤を含む。幾つかの実施態様では、複数の反応チャンバーのそのような平面アレイを含むキットは、該装置によって実行される方法で使用されるTdTと3’-O-保護dNTPの各々の混合物を含む、合成試薬のTdT活性を測定するための活性アッセイ試薬を更に含む。幾つかの実施態様では、活性アッセイ試薬は、Fe(III)によってクエンチされるBODIPY標識dATP単量体を含む。
一態様では、本発明のキットは、本発明のシステム及び装置の特定の実施態様での使用に適合した消耗品を含む。幾つかの実施態様では、本発明のキットは、各々が一般的な96ウェル又は384ウェルのフィルタープレートの形態で結合したイニシエーターを有する合成担体を有する複数の反応チャンバーの平面アレイを含み、各ウェルには粘性湿潤剤溶液中の予め決まった量の合成担体が堆積される。幾つかの実施態様では、そのような合成担体は、プラスチック、ホイル又は他の気密性の非透過性包装材料に更に真空パックされる。幾つかの実施態様では、湿潤剤溶液の粘度は、40~60パーセント(v/v)のグリセロール:水溶液と同等である。幾つかの実施態様では、保湿剤溶液は、グリセロール、アルコール糖、エチルヘキシルグリセリン、パンテノール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ブチレングリコール、乳酸ナトリウム、ヒアルロン酸、及びポリデキストロースからなる群から選択される保湿剤を含む。幾つかの実施態様では、複数の反応チャンバーのそのような平面アレイを含むキットは、該装置によって実行される方法で使用されるTdTと3’-O-保護dNTPの各々の混合物を含む、合成試薬のTdT活性を測定するための活性アッセイ試薬を更に含む。幾つかの実施態様では、活性アッセイ試薬は、Fe(III)によってクエンチされるBODIPY標識dATP単量体を含む。
別の態様では、本発明のキットは、複数の異なるコンパートメント又はリザーバー内に、予め決まった数のカップリング反応サイクルを実行してそれぞれ最大収量で最大長の予め決まった複数のポリヌクレオチドを生成するための合成試薬を含んでいる試薬カートリッジを含む。幾つかの実施態様では、そのような試薬カートリッジは、液体レベルセンサーが一又は複数の反応チャンバー内の異常な液体レベル又は液体レベルの変化率を検出するときはいつでもプロテアーゼ処理ステップを実行するためのプロテアーゼ溶液を更に含みうる。幾つかの実施態様では、そのような試薬カートリッジは、それぞれ一つがTdTと3’-O-保護dATP、TdTと3’-O-保護dCTP、TdTと3’-O-保護dGTP、並びにTdTと3’-O-保護dTTPを含むカップリング試薬を含む、少なくとも4つのリザーバーを含む。幾つかの実施態様では、各リザーバーは、それぞれ100ピコモル以下の収量で少なくとも96のポリヌクレオチドを合成するのに十分なカップリング試薬を含み、ここで、各ポリヌクレオチドは最大200ヌクレオチドの長さを有し、ポリヌクレオチド全てのヌクレオチド組成物において各ヌクレオチドが20~30パーセントの範囲にある。幾つかの実施態様では、そのような試薬カートリッジは、それぞれ一つがTdTと3’-O-保護dATP、TdTと3’-O-保護dCTP、TdTと3’-O-保護dGTP、並びにTdT、3’-O-保護-dTTPを含むカップリング試薬を含み、一つが脱保護試薬を含む、少なくとも5つのリザーバーを含む。幾つかの実施態様では、そのようなカップリング試薬は、TdTと3’-O-アミノ-dATP、TdTと3’-O-アミノ-dCTP、TdTと3’-O-アミノ-dGTP、並びにTdTと3’-O-アミノ-dTTPを含む。他の実施態様では、そのようなカップリング試薬は、TdTと3’-O-アジドメチル-dATP、TdTと3’-O-アジドメチル-dCTP、TdTと3’-O-アジドメチル-dGTP、並びにTdTと3’-O-アジドメチル-dTTPを含む。
幾つかの実施態様では、そのような試薬カートリッジは、それぞれ一つが、TdTと3’-O-保護-dATP、TdTと3’-O-保護-dCTP、TdTと3’-O-保護-dGTP、並びにTdT、3’-O-保護-dTTPを含むカップリング試薬を含み、一つが脱保護試薬を含み、一つがプロテアーゼ溶液を含む、少なくとも6つのリザーバーを含む。幾つかの実施態様では、そのようなカップリング試薬は、TdTと3’-O-アミノ-dATP、TdTと3’-O-アミノ-dCTP、TdTと3’-O-アミノ-dGTP、TdTと3’-O-アミノ-dTTP、アミノ脱保護試薬、及びプロテアーゼ溶液を含む。他の実施態様では、そのようなカップリング試薬は、TdTと3’-O-アジドメチル-dATP、TdTと3’-O-アジドメチル-dCTP、TdTと3’-O-アジドメチル-dGTP、TdTと3’-O-アジドメチル-dTTP、アジドメチル脱保護試薬、及びプロテアーゼ溶液を含む。前述の実施態様の幾つかでは、プロテアーゼ溶液は、プロテイナーゼKを含む。
[定義]
ここで特に定義しない限り、ここで使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び記号は、当該分野の標準的な論文及びテキスト、例えば、Kornberg及びBaker,DNA Replication,2版(W.H.Freeman,New York,1992);Lehninger,Biochemistry,2版(Worth Publishers,New York,1975);Strachan及びRead,Human Molecular Genetics,2版(Wiley-Liss,New York,1999)のものに従う。
ここで特に定義しない限り、ここで使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び記号は、当該分野の標準的な論文及びテキスト、例えば、Kornberg及びBaker,DNA Replication,2版(W.H.Freeman,New York,1992);Lehninger,Biochemistry,2版(Worth Publishers,New York,1975);Strachan及びRead,Human Molecular Genetics,2版(Wiley-Liss,New York,1999)のものに従う。
二以上の異なるTdTにおけるアミノ酸位置に関して「機能的に同等」とは、(i)それぞれの位置のアミノ酸がTdTの活性において同じ機能的役割を果たし、且つ(ii)アミノ酸がそれぞれのTdTのアミノ酸配列における相同のアミノ酸位置に存在することを意味する。配列アラインメント及び/又は分子モデリングに基づいて、二以上の異なるTdTのアミノ酸配列に位置的に同等又は相同なアミノ酸残基を同定することが可能である。幾つかの実施態様では、機能的に同等のアミノ酸位置は、進化的に関連する種の、例えば属、科などが関連するTdTのアミノ酸配列間で保存されている非効率モチーフに属する。そのような保存された非効率モチーフの例は、Motea等,Biochim.Biophys.Acta.1804(5):1151-1166(2010);Delarue等,EMBO J.,21:427-439(2002);及び類似の文献に記載されている。
「キット」は、本発明のシステム又は装置によって実行される方法を実施するための材料又は試薬を送達するための、パッケージなどの任意の送達系を指す。幾つかの実施態様では、消耗品材料又は試薬は、ここで「キット」と呼ばれるパッケージで本発明のシステム又は装置のユーザーに送達される。本発明のシステム及び装置の文脈において、そのような送達システムは、合成担体などの容易に損傷し又は汚染されるコンポーネントを有しうる合成プレートのような材料の保管、輸送、又は送達を可能にする通常の包装方法及び材料を含む。例えば、キットは、合成プレート及び/又は担体材料を含む一又は複数の筺体(例えば、箱)を含みうる。そのような内容物は、意図されたレシピエントに一緒に又は別個に送達されうる。例えば、第一の容器は、保護プラスチック材料で真空包装された各ウェルに合成担体を備えた合成プレートを含み得、第二又は更なる容器は、3’-O-可逆的ブロックdNTPとテンプレートフリーポリメラーゼとバッファーを含む。
互換的に使用される「バリアント」又は「バリアント」は、ここに記載の天然又は参照TdTポリペプチドに由来し、一又は複数の位置に修飾又は改変、すなわち、置換、挿入、及び/又は欠失を含むポリペプチドを指す。バリアントは、当該分野で周知の様々な技術によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードするDNA配列を改変するための技術の例には、限定されないが、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、配列シャッフリング及び合成オリゴヌクレオチド構築が含まれる。変異誘発活性は、タンパク質又は本発明の場合はポリメラーゼの配列における一又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換からなる。次の用語法を使用して置換を命名する:L238Aは、参照又は野生型配列の238位のアミノ酸残基(ロイシン、L)がアラニン(A)に変えられていることを示す。A132V/I/Mは、親配列の132位のアミノ酸残基(アラニン、A)が次のアミノ酸のうちの一つによって置換されていることを示す:バリン(V)、イソロイシン(I)、又はメチオニン(M)。置換は、保存的置換又は非保存的置換でありうる。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン及びヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミン、アスパラギン及びスレオニン)、疎水性アミノ酸(メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン及びバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン)、及び小アミノ酸(グリシン、アラニン及びセリン)のグループ内にある。
「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、それぞれ、ヌクレオチド単量体の線状ポリマー又はそのアナログを意味する。ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを構成する単量体は、ワトソン・クリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、又はフーグスティーン若しくは逆フーグスティーン型の塩基対形成などの規則的な単量体対単量体の相互作用パターンによって天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。そのような単量体及びそのヌクレオシド間結合は、天然に存在しうるか、そのアナログ、例えば、天然に存在するアナログ又は天然には存在しないアナログでありうる。天然には存在しないアナログには、PNA、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、フルオロフォアなどの標識の結合を可能にする連結基を含む塩基、又はハプテンなどが含まれうる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの使用が酵素的プロセシング、例えばポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションなどを必要とする場合は常に、当業者は、前記例では、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが任意の又は幾つかの位置にヌクレオシド間結合、糖部分、又は塩基の所定のアナログを含まないと理解するであろう。ポリヌクレオチドは、典型的には、それらが通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合、数個の単量体単位、例えば、5~40個から、数千の単量体単位までのサイズ範囲である。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが文字(大文字又は小文字)の配列、例えば「ATGCCTG」などによって表される場合は常に、別段の指示がない限り又は文脈から明白でない限り、ヌクレオチドが左から右に5’から3’の順序であり、且つ「A」がデオキシアデノシンを示し、「C」がデオキシシチジンを示し、「G」がデオキシグアノシンを示し、「T」がチミジンを示し、「I」がデオキシイノシンを示し、「U」がウリジンを示すと理解される。他に断りのない限り、用語法及び原子番号付けの慣習は、Kornberg及びBaker,DNA Replication,2版(W.H.Freeman,1992)又は類似の文献に開示されたものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された4つの天然ヌクレオシド(例えば、DNAについては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はRNAについてはそれらのリボース対応物)を含む;しかしながら、それらは、例えば、改変された塩基、糖、又はヌクレオシド間結合を含む非天然ヌクレオチドアナログをまた含みうる。酵素が活性のために特異的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質要件、例えば、一本鎖DNA、RNA/DNA二重鎖などを有する場合、特に、Sambrook等,Molecular Cloning,2版(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)などの専門書及び類似の文献からのガイダンスを用いての、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質に適切な組成の選択は、十分に当業者の知識の範囲内にあることが当業者には明らかである。同様に、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、一本鎖形態又は二本鎖形態(すなわち、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとそのそれぞれの相補鎖の二重鎖)の何れかを指しうる。用語使用法の文脈から、どの形態が意図されるのか又は両方の形態が意図されるのかは当業者には明らかであろう。
「配列同一性」は、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列などの二つの配列の間の一致(例えば、同一のアミノ酸残基)の数(又は通常、百分率で表される分率)を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小にしながら重複と同一性を最大にするように整列させたときの配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、二つの配列の長さに応じて、多くの数学的なグローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムのうちの何れかを使用して決定されうる。類似の長さの配列は、全長にわたって配列を最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム(例えば、Needleman-Wunschアルゴリズム;Needleman及びWunsch,1970)を使用して整列させることが好ましい一方、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム(例えば、Smith-Watermanアルゴリズム(Smith及びWaterman,1981)又はAltschulアルゴリズム(Altschul等,1997;Altschul等,2005))を使用して整列させることが好ましい。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該分野の技量の範囲内にある様々な方法で、例えば、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/又はttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/などのインターネットウェブサイトで利用可能な公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するために適切なパラメーターを決定することができる。ここでの目的のために、アミノ酸配列同一性%値は、Needleman-Wunschアルゴリズムを使用して二つの配列の最適なグローバルアラインメントを作り出すペアワイズ配列アラインメントプログラムEMBOSS Needleを使用して生成された値を指し、ここで全ての検索パラメーターはデフォルト値に設定され、すなわち、スコアリング行列=BLOSUM62、ギャップオープン=10、ギャップ伸長=0.5、エンドギャップペナルティ=偽、エンドギャップオープン=10、及びエンドギャップ伸長=0.5である。
「置換」は、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置き換えられることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、あるアミノ酸残基の、天然に存在する標準的な20種のアミノ酸残基、稀に天然に存在するアミノ酸残基(例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、6-N-メチルリジン、N-エチルグリシン、N-メチルグリシン、N-エチルアスパラギン、アロ-イソロイシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン)、及びしばしば合成的に作製される天然に存在しないアミノ酸残基(例えば、シクロヘキシル-アラニン)から選択される別のものによる置き換えを指す。好ましくは、「置換」という用語は、あるアミノ酸残基の、天然に存在する標準的な20種のアミノ酸残基から選択される別のものによる置き換えを指す。符号「+」は、置換の組み合わせを示す。アミノ酸は、ここでは、次の命名法に従ってその1文字又は3文字コードによって表される:A:アラニン(Ala);C:システイン(Cys);D:アスパラギン酸(Asp);E:グルタミン酸(Glu);F:フェニルアラニン(Phe);G:グリシン(Gly);H:ヒスチジン(His);I:イソロイシン(Ile);K:リジン(Lys);L:ロイシン(Leu);M:メチオニン(Met);N:アスパラギン(Asn);P:プロリン(Pro);Q:グルタミン(Gln);R:アルギニン(Arg);S:セリン(Ser);T:スレオニン(Thr);V:バリン(Val);W:トリプトファン(Trp)及びY:チロシン(Tyr)。本明細書では、次の用語法を使用して置換を命名する:L238Aは、親配列の238位のアミノ酸残基(ロイシン、L)がアラニン(A)に変えられていることを示す。A132V/I/Mは、親配列の132位のアミノ酸残基(アラニン、A)が次のアミノ酸のうちの一つによって置換されていることを示す:バリン(V)、イソロイシン(I)、又はメチオニン(M)。置換は、保存的置換又は非保存的置換でありうる。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン及びヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミン、アスパラギン及びスレオニン)、疎水性アミノ酸(メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン及びバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン)、及び小アミノ酸(グリシン、アラニン及びセリン)のグループ内にある。
Claims (21)
- テンプレートフリーポリメラーゼを用いて、各々が予め決まった配列を有する複数のポリヌクレオチドを合成するための装置において、
(a)イニシエーターが結合した合成担体を各反応チャンバーが有する複数の反応チャンバーであって、各イニシエーターが遊離3’-ヒドロキシルを有し、各反応チャンバーが入口と出口と、合成担体を保持し、反応チャンバーを出る反応溶液がフィルターを通過するように、出口に作用可能に関連付けられたフィルターとを有する、反応チャンバー;
(b)反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に正の圧力差が確立されるときはいつでも、反応溶液が反応チャンバーから除去され、廃棄物マニホールドに入るように、反応チャンバーの出口と作用可能に関連付けられた廃棄物マニホールド;
(c)反応溶液を反応チャンバーに送達するための流体送達システムであって、反応溶液が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェート、脱保護溶液;及びテンプレートフリーポリメラーゼを含む流体送達システム;
(d)合成されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を受け入れるためのユーザーインターフェース;及び
(e)ユーザーインターフェース、反応チャンバー、流体送達システム、及び廃棄物マニホールドに作用可能に関連付けられた制御システムであって、合成のために反応チャンバーに各ポリヌクレオチドの予め決まった配列を割り当て、且つ各反応チャンバーについて、(i)カップリング条件下でイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液を反応チャンバーに送達するステップ、及び(iii)予め決まった率で反応チャンバーから脱保護溶液を除去する圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップの繰り返しを指示する制御システム
を含む、装置。 - 反応チャンバーの各々における液体レベルを測定するための一又は複数の液体レベルセンサーを更に含み、前記制御システムが、(i)カップリング条件下でイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液を反応チャンバーに送達するステップ、(iii)予め決まった率で反応チャンバーから脱保護溶液を除去する圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップ、及び(iv)前記反応チャンバーの各々における液体レベルを一又は複数の液体レベルセンサーで測定し、反応チャンバーの液体レベルが予め決まった限界外にあると特定されるときはいつでも、特定された反応チャンバーをその後の試薬送達ステップでバイパスするステップの繰り返しを指示する、請求項1に記載の装置。
- 前記複数の反応チャンバーが該装置の第一の位置に位置させられた平面合成プレート内に均一に離間され、(i)該装置内の第二の位置に位置させられたポリヌクレオチド単離プレートであり、合成プレートの前記複数の反応チャンバーの前記出口と整列するように離間された平面アレイに複数のチャンバーを含むポリヌクレオチド単離プレートであって、その各チャンバーが、入口、出口及びポリヌクレオチドを単離するための分離材料を有する、ポリヌクレオチド単離プレートと、(ii)前記制御システム、合成プレート及びポリヌクレオチド単離プレートに作用可能に関連付けられたプレートムーバーであって、前記制御システムからの指示に応じて、第一又は第二の位置で、ポリヌクレオチド単離プレートが廃棄物マニホールドに作用可能にマウントされ、合成プレートが、合成プレートの前記反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に正の圧力差が確立されるときはいつでも各反応チャンバー内の単離試薬が単離プレートのチャンバーを通って前記廃棄物マニホールドに流れるようにポリヌクレオチド単離プレートに作用可能にマウントされるように、合成プレートとポリヌクレオチド単離プレートを移動させるプレートムーバーを更に含む、請求項1又は2に記載の装置。
- 前記複数の反応チャンバーが該装置の第一の位置に位置させられた平面合成プレート内に均一に離間され、(i)該装置の第二の位置に位置させられたポリヌクレオチド単離プレートであり、合成プレートの前記複数の反応チャンバーと整列するように離間された平面アレイに複数のチャンバーを含むポリヌクレオチド単離プレートであって、その各チャンバーが、入口、出口及びポリヌクレオチドを単離するための分離材料を有する、ポリヌクレオチド単離プレートと、(ii)前記制御システム、合成プレート及びポリヌクレオチド単離プレートに作用可能に関連付けられたピペッターであって、前記制御システムからの指示に応じて、各反応チャンバーの内容物をポリヌクレオチド単離プレートの別個のチャンバーに移動させるピペッターを更に含む、請求項1又は2に記載の装置。
- 前記制御システムが、(i)カップリング条件下で前記イニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)前記3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように前記脱保護溶液を前記反応チャンバーに送達するステップ、(iii)予め決まった率で前記反応チャンバーから脱保護溶液を除去する圧力差を前記反応チャンバーと前記廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップ、(iv)前記反応チャンバーに洗浄溶液を送達するステップ、及び(v)前記反応チャンバーと前記廃棄物マニホールドとの間に圧力差を生じさせて予め決まった率で前記反応チャンバーから洗浄溶液を除去するステップの繰り返しを指示する、請求項1から4の何れか一項に記載の装置。
- テンプレートフリーポリメラーゼを用いて、各々が予め決まった配列を有する複数のポリヌクレオチドを合成するための装置において、
(a)イニシエーターが結合した合成担体が各反応チャンバーに配された複数の反応チャンバーであって、各イニシエーターが遊離3’-ヒドロキシルを有し、各反応チャンバーが入口と出口と、合成担体を保持し、反応チャンバーを出る反応溶液がフィルターを通過するように出口に作用可能に関連付けられたフィルターとを有する、反応チャンバー;
(b)反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に正の圧力差が確立されるときはいつでも、反応溶液が反応チャンバーから除去され、廃棄物マニホールドに入るように反応チャンバーの出口と作用可能に関連付けられた廃棄物マニホールド;
(c)反応溶液を反応チャンバーに送達するための流体送達システムであって、反応溶液が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェート、脱保護溶液、テンプレートフリーポリメラーゼ及びプロテアーゼ溶液を含む流体送達システム;
(d)個々の反応チャンバー内の液体レベルの変化率を測定するための一又は複数の液体レベルセンサー;
(e)合成されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を受け入れるためのユーザーインターフェース;及び
(f)ユーザーインターフェース、反応チャンバー、流体送達システム及び廃棄物マニホールドに作用可能に関連付けられた制御システムであり、合成のために反応チャンバーに各ポリヌクレオチドの予め決まった配列を割り当て、且つ各反応チャンバーについて、(i)カップリング条件下でイニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように脱保護溶液を反応チャンバーに送達するステップ、(iii)反応チャンバーから脱保護溶液を除去する、予め決まった圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップ、(iv)洗浄溶液を反応チャンバーに送達するステップ、(v)反応チャンバーから洗浄溶液を除去する、予め決まった圧力差を反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップ、及び(vi)反応チャンバーの一部の各々における液体レベルの変化率を一又は複数の液体レベルセンサーで測定し、反応チャンバーの液体除去率が予め決まった率を下回るときはいつでも修正動作が作動されるステップの繰り返しを指示する制御システムであって;反応チャンバー内でステップ(i)において接触される3’-保護ヌクレオシドトリホスフェートの種類が、反応チャンバーに割り当てられた予め決まった配列によって決定される制御システム
を含む、装置。 - 前記制御システムが、前記脱保護溶液の除去中又は前記洗浄溶液の除去中の前記(iv)の前記液体レベルの変化率の測定を指示する、請求項6に記載の装置。
- 前記修正動作が、液体除去率が前記予め決まった率を下回る前記反応チャンバーに前記プロテアーゼ溶液を送達する更なるステップを含む、請求項6又は7に記載の装置。
- 前記修正動作が、液体除去率が前記予め決まった率を下回る前記反応チャンバーへ後続の試薬送達ステップにおいてバイパスする更なるステップを含む、請求項6又は7に記載の装置。
- 前記複数の前記反応チャンバーが24から100の範囲にあり、前記一又は複数の液体レベルセンサーが2から32の液体レベルセンサーの範囲にある、請求項6から9の何れか一項に記載の装置。
- 前記複数の前記反応チャンバーが200から1600の範囲にあり、前記一又は複数の液体レベルセンサーが32から50の液体レベルセンサーの範囲にある、請求項6から9の何れか一項に記載の装置。
- 前記制御システムが、(i)カップリング条件下で前記イニシエーター又は脱保護された伸長断片に3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートとテンプレートフリーポリメラーゼを送達するステップであって、カップリング条件が、イニシエーターオリゴヌクレオチド又は脱保護された伸長断片が前記3’-O-保護ヌクレオシドトリホスフェートによって伸長されて3’-O-保護伸長断片を形成できるようにする、予め決まったカップリングインキュベーション時間とインキュベーション温度を含むステップ、(ii)前記3’-O-保護伸長断片が脱保護されるように前記脱保護溶液を前記反応チャンバーに送達するステップ、(iii)予め決まった率で前記反応チャンバーから脱保護溶液を除去する圧力差を前記反応チャンバーと前記廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップ、(iv)洗浄溶液を前記反応チャンバーに送達するステップ、及び(v)予め決まった率で前記反応チャンバーから洗浄溶液を除去する圧力差を前記反応チャンバーと前記廃棄物マニホールドとの間に生じさせるステップの繰り返しを指示する、請求項6から11の何れか一項に記載の装置。
- 前記複数の反応チャンバーが該装置の第一の位置に位置させられた平面合成プレート内に均一に離間され、該装置が、(i)該装置内の第二の位置に位置させられたポリヌクレオチド単離プレートであり、反応プレートの前記複数の反応チャンバーの前記出口と整列するように離間された平面アレイに複数のチャンバーを含む単離プレートであって、その各チャンバーが、入口、出口及びポリヌクレオチドを単離するための分離材料を有する、ポリヌクレオチド単離プレートと、(ii)前記制御システム、反応プレート及び単離プレートに作用可能に関連付けられたプレートムーバーであって、前記制御システムからの指示に応じて、第一又は第二の位置で、単離プレートが廃棄物マニホールドに作用可能にマウントされ、反応プレートが、反応プレートの前記反応チャンバーと廃棄物マニホールドとの間に正の圧力差が確立されるときはいつでも各反応チャンバー内の単離試薬が単離プレートのチャンバーを通って前記廃棄物マニホールドに流れるように単離プレートに作用可能にマウントされるように、反応プレートと単離プレートを移動させるプレートムーバーとを更に含む、請求項6から12の何れか一項に記載の装置。
- 自動合成機で複数のポリヌクレオチドの酵素合成を実施するためのキットであって、複数の反応ウェルを有する合成プレートを含み、各反応ウェルが、粘性湿潤剤溶液中又は溶解可能なゲル中に、結合したイニシエーターを有する予め決まった量の合成担体材料を含む、キット。
- 前記合成プレートが気密包装材料に封入されている、請求項14に記載のキット。
- 前記合成プレートが、プラスチック又はホイルを含む包装材料に真空パックされている、請求項15に記載のキット。
- 前記合成プレートが96ウェル又は384ウェルを含む、請求項14から16の何れか一項に記載のキット。
- 前記粘性湿潤剤溶液が、40~60%(v/v)の範囲のグリセロール:水溶液と同等の粘度を有する、請求項14から17の何れか一項に記載のキット。
- 前記粘性保湿剤溶液が、グリセロール、アルコール糖、エチルヘキシルグリセリン、パンテノール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ブチレングリコール、乳酸ナトリウム、ヒアルロン酸、又はポリデキストロースを含む、請求項18に記載のキット。
- 3’-O-保護dATPを含む溶液を含む容器、3’-O-保護dCTPを含む溶液を含む容器、3’-O-保護dGTPを含む溶液を含む容器、3’-O-保護dTTPを含む溶液を含む容器、テンプレートフリーポリメラーゼを含む溶液を含む容器、及び脱保護溶液を含む容器を更に含む、請求項14から19の何れか一項に記載のキット。
- 前記テンプレートフリーポリメラーゼがTdTバリアントであり、前記3’-O-保護dATPが3’-O-アミノ-dATPであり、前記3’-O-保護dCTPが3’-O-アミノ-dCTPであり、前記3’-O-保護dGTPが3’-O-アミノ-dGTPであり、前記3’-O-保護dTTPが3’-O-アミノ-dTTPである、請求項20に記載のキット。
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