CN115803092A - 用于治疗癌症的缺乏SIRPα的巨噬细胞 - Google Patents

用于治疗癌症的缺乏SIRPα的巨噬细胞 Download PDF

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Abstract

如本文所公开，SIRPα通过许多不同的癌症类型以及癌症对疗法的抗性而构成免疫逃避的一部分，并且降低SIRPα水平有助于抗原获取、加工和呈递，减少TME免疫抑制，且由此促进肿瘤特异性T细胞活化以消除肿瘤并产生由记忆性T细胞、循环抗体和浆细胞组成的适应性免疫反应，所有这些都能对原始癌症中的新抗原具有特异性。因此，公开了适用于治疗癌症的活化的SIRPα低巨噬细胞。

Description

用于治疗癌症的缺乏SIRPα的巨噬细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月24日提交的美国临时申请第63/015,013号的权益，所述临时申请以全文引用的方式并入本文中。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号Al 106839和CA241271在政府支持下进行的。政府在本发明中享有某些权利。
背景技术
在世界范围内，即使在各种治疗努力下，癌症仍然对人体健康有着重大威胁。考虑到免疫逃避是癌症的标志，已开发出新的免疫疗法，如免疫检查点阻断(ICB)、嵌合抗原受体(CAR)-T、癌症疫苗接种和免疫调节的辐射疗法(RT)来对抗癌症；然而，由于反应率低并且这些治疗有效治疗的癌症类型有限，故这些努力尚未完全满足临床需要。因此，迫切需要额外的方法和治疗性创新来改进对避开免疫消除并对当前疗法具有抗性的癌症的治疗。
发明内容
如本文所公开，SIRPα通过许多不同的癌症类型以及癌症对RT、ICB和其它免疫调节疗法的抗性而构成免疫逃避的一部分。减少SIRPα表达或减少SIRPα介导的调节可以加强抗原获取、加工和呈递，减少肿瘤微环境(TME)免疫抑制，并由此促进肿瘤特异性T细胞活化以消除肿瘤并产生由T细胞、循环抗体和浆细胞组成的适应性免疫反应，所有这些都可以对原始癌症中的新抗原具有特异性。
因此，本文公开了活化的SIRPα低巨噬细胞，其用于治疗癌症。在一些实施例中，这些活化的SIRPα低巨噬细胞通过涉及以下的方法来制备：从受试者获得包含外周血单个核细胞(PBMC)的生物样品；从PBMC中分离单核细胞；在体外分化单核细胞以产生巨噬细胞；使巨噬细胞与SIRPα抑制剂接触；及使巨噬细胞与巨噬细胞活化剂接触，由此产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα细胞表面表达显著降低(SIRPα低)并且对癌细胞的吞噬作用、促炎性反应和免疫原性抗原呈递的能力增加的巨噬细胞群体，其活化肿瘤特异性T细胞，由此产生包含活化的SIRPα低巨噬细胞的用于治疗癌症的药剂。
在一些实施例中，SIRPα抑制剂和巨噬细胞活化剂为依次施用。这可以按任一次序进行并且可以相隔数分钟、数小时或数天，例如相隔1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、16小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。在其它实施例中，SIRPα抑制剂和巨噬细胞活化剂为同时或并行施用。
在一些实施例中，SIRPα抑制剂和巨噬细胞活化剂存在于同一组合物中。因此，在一些实施例中，方法涉及从生物样品中的外周血单个核细胞(PBMC)中分离单核细胞；在体外分化单核细胞以产生巨噬细胞；以及使巨噬细胞与SIRPα表达抑制剂和巨噬细胞活化剂接触，以产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα细胞表面表达降低并且吞噬作用、促发炎和抗原呈递的活性增加的活化的巨噬细胞群体(活化的SIRPα低巨噬细胞)。
在一些实施例中，所公开的组合物和方法与任何专职性抗原呈递细胞一起使用。专职性抗原呈递细胞(APC)是专门将抗原呈递到T细胞的免疫细胞。专职性APC的主要类型是树突状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞，但还可包括内皮细胞，且在一些实施例中是粒细胞。
因此，还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，其涉及向该受试者施用治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞。在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中(瘤内施用)，之后进行肿瘤定向原位放射疗法(图13A)。在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，之前进行肿瘤定向原位放射疗法(图13B)。在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，无任何肿瘤定向原位放射疗法(图13C)。
在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，之后进行肿瘤定向原位放射疗法和静脉内(IV)施用ICB疗法(图13D)。在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，之前进行肿瘤定向原位放射疗法，并且之后静脉内施用ICB(图13E)。在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，之后静脉内施用ICB，无任何肿瘤定向原位放射疗法(图13F)。
在一些实施例中，静脉内施用治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞，之后进行肿瘤定向原位放射疗法(图13G)。在一些实施例中，静脉内施用治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞，之后进行肿瘤定向原位放射疗法和静脉内施用ICB(图13H)。
在一些实施例中，静脉内施用治疗有效量的尚未在体外培养物中活化的SIRPα低巨噬细胞，之后进行肿瘤定向原位放射疗法(图13I)。在一些实施例中，静脉内施用治疗有效量的尚未在体外培养物中活化的SIRPα低巨噬细胞，之后进行肿瘤定向原位放射疗法和静脉内施用ICB(图13J)。
本文还公开了用于治疗癌症的体外扩增的肿瘤特异性外周血T(PBT)细胞，其由如下方法产生，该方法涉及从受试者获得包含外周血单个核细胞(PBMC)的生物样品；从PBMC中分离单核细胞；从血液或PBMC中分离外周血T细胞；在体外分化单核细胞以产生巨噬细胞；使巨噬细胞与SIRPα表达抑制剂接触；使巨噬细胞与活化剂接触，由此产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα细胞表面表达显著降低(SIRPα低)并且对癌细胞的吞噬作用、促炎性反应和免疫原性抗原呈递的能力增加的巨噬细胞群体；从受试者获得包含肿瘤活检或手术肿瘤切除的生物样品；将活化的SIRPα低巨噬细胞与来自肿瘤的细胞在体外共培养，以允许肿瘤抗原的吞噬作用(肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞)；将肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞与分离的PBT细胞在体外共培养以扩增肿瘤特异性T细胞的数目；由此产生包含体外扩增的肿瘤特异性PBT细胞的用于治疗癌症的药剂。
因此，还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，其涉及向该受试者施用治疗有效量的体外扩增的肿瘤特异性PBT细胞。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者(图13K)。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，接着是肿瘤定向原位放射疗法(图13L)。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，接着是静脉内施用ICB(图13N)。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，接着是肿瘤定向原位放射疗法和静脉内施用ICB(图13M)。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之前进行肿瘤定向原位放射疗法。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之前进行肿瘤定向原位放射疗法，并且之后静脉内施用ICB。
本文还公开了来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞，其由如下方法产生，该方法涉及从受试者获得包含外周血单个核细胞(PBMC)的生物样品；从PBMC中分离单核细胞；在体外分化单核细胞以产生巨噬细胞；使巨噬细胞与SIRPα表达抑制剂接触；使巨噬细胞与活化剂接触，由此产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα细胞表面表达显著降低(SIRPα低)并且对癌细胞的吞噬作用、促炎性反应和免疫原性抗原呈递的能力增加的巨噬细胞群体；从受试者收集包含肿瘤活检或手术肿瘤切除的生物样品；从肿瘤活检中分离肿瘤浸润T淋巴球(TIL)细胞；将活化的SIRPα低巨噬细胞与来自肿瘤样品的肿瘤细胞在体外共培养，以允许吞噬作用并获得肿瘤抗原(肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞)；将肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞与分离的TIL细胞在体外共培养以扩增肿瘤特异性T细胞的数目；由此产生包含来自TIL的体外扩增肿瘤特异性T细胞的用于治疗癌症的药剂。
本文还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，其涉及向该受试者施用治疗有效量的来自TIL的体外扩增肿瘤特异性T细胞。在一些实施例中，来自TIL的体外扩增肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者(图13O)。在一些实施例中，来自TIL的体外扩增肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，接着是肿瘤定向原位放射疗法(图13P)。在一些实施例中，来自TIL的体外扩增肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，接着是静脉内施用ICB(图13R)。在一些实施例中，来自TIL的体外扩增肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，接着是肿瘤定向原位放射疗法和静脉内施用ICB(图13Q)。在一些实施例中，来自TIL的体外扩增肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之前进行肿瘤定向原位放射疗法。在一些实施例中，来自TIL的体外扩增肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之前进行肿瘤定向原位放射疗法，并且之后静脉内施用ICB。
在一些实施例中，“SIRPα抑制剂”遏制SIRPα的表达，抑制SIRPα的活性，减少细胞表面上SIRPα的丰度，破坏SIRPα与CD47之间的相互作用，活化吞噬作用，促进抗原加工和呈递到T细胞，促进T细胞的活化或其组合。
在一些实施例中，巨噬细胞活化剂增加巨噬细胞的吞噬作用，增加巨噬细胞的抗原加工和呈递活性和功能，增加巨噬细胞的免疫刺激能力，改善巨噬细胞的T细胞刺激功能，促进巨噬细胞的促炎(所谓M1)表型，或使巨噬细胞能够改变TME以促进针对癌细胞的免疫反应。
本文还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，其涉及向该受试者施用治疗有效量的SHP-1抑制剂，与RT、ICB、溶瘤病毒或其任何组合进行组合。
在附图和以下描述中阐述本发明的一个或多个实施例的细节。从描述和附图中以及从权利要求书中将显而易见本发明的其它特征、目标和优点。
附图说明
图1是示出控制对自我/肿瘤细胞的吞噬作用的活化和抑制机制的示意图，特别提及SIRPα-CD47信号传导轴所起的作用。
图2A和2B展示在野生型和SIRPα-/-小鼠中肿瘤内抗PD-L1对皮下MC38肿瘤的作用。当肿瘤刚形成(≤50mm3，第8天/第11天)(图2A)或长得更大(>200mm3，第12天/第15天)时给与两种剂量的抗PD-L1 Ab(50μg，BioXcell，克隆10F.9G2)，后者给与±IFNγ和CpG(分别为100ng和20μg)(图2B)。
图3展示肿瘤内抗PD-1/L1对皮下PDA肿瘤Panc02和KPC的作用。经由肿瘤内将两种剂量的抗PD-L1 Ab(每种50μg)给与至大约100mm3的Panc02和KPC肿瘤。
图4展示αPD-L1与肿瘤放射组合的作用。给与150-400mm3的皮下MC38、Pan02和KPC肿瘤8Gy X射线放射，接着αPD-L1 Ab(50μg，肿瘤内)，SIRPα-/-小鼠一次，或野生型小鼠2次(相隔3天)。
图5A至5C展示通过使用αPD-L1+IFNγ/CpG(2次)或αPD-L1+8Gy放射处理根除MC38肿瘤之后的SIRPα-/-小鼠发展持久的免疫性，这阻止了肿瘤再次移植，即使MC38细胞增加(图5A)。血清(图5B)或脾T细胞(图5C)从肿瘤根除的SIRPα-/-小鼠转移到野生型接受者赋予抗MC38肿瘤性。血清样品阳性染色MC38细胞表面。
图6A至6D展示通过使用αPD-L1±IFNγ/CpG或8Gy放射处理，SIRPα-/-小鼠显示TME中增强的抗肿瘤CD8 Tc(所有数据均为处理后5天)。图6B展示p15E特异性和GranzB表达以及Tem的检测。图6C展示通过从肿瘤中分离的Tc与MC38共同温育过夜进行的离体细胞毒性分析。图6D展示总Tc、GranzB+和P15E+亚群的统计数据。
图7A至7D展示SIRPα-/-小鼠在用αPD-L1+IFNγ/CpG或8Gy RT/IR(放射处理/辐照)处理之后显示TME中之CD4+Foxp3+Treg减少。图7C展示野生型小鼠中在αPD-L1+8Gy RT之后肿瘤中显著的Ly6C+单核细胞/MDSC浸润，但SIRPα-/-小鼠中缺乏。图7D展示αPD-L1+8Gy RT处理之前和之后的肿瘤相关白细胞。数据在处理后3天收集。
图8A至8C展示将用IFNγ/CpG离体活化的
Figure BDA0004010117540000061
(BMDM，0.5×106)与αPD-L1 Ab(2次)一起经肿瘤内注射到MC38肿瘤中，成功诱导肿瘤消除。图8B展示在肿瘤内
Figure BDA0004010117540000062
或各种量的
Figure BDA0004010117540000063
之后TME中的肿瘤特异性Tc增加。图8C展示野生型小鼠中
Figure BDA0004010117540000064
(2次)经肿瘤内注射到MC38肿瘤。
图9A和9B展示CD47触发的SIRPα信号传导抑制
Figure BDA0004010117540000065
抗原呈递机制和促炎性细胞因子产生。在CD47(mCD47.ex)存在或不存在下用IFNγ/CpG刺激WT和Sirpα-/-BMDM 12小时，接着用FACS和ELISA检测细胞表面蛋白表达和分泌到培养基中的细胞因子。
图10是证明SIRPα-/-的两步抑制的示意图：1)肿瘤CD47-吞噬细胞SIRPα经由SHP-1遏制抗原呈递机制；2)APC SIRPα→T上的CD47抑制T细胞活化。
图11展示所公开的巨噬细胞疗法治疗显著降低人PBMC来源的
Figure BDA0004010117540000071
中的SIRPα(图11A)；治疗的SIRPα低
Figure BDA0004010117540000072
的吞噬作用-活化诱导自我RBC(图11B)和人肠癌细胞HT29、T84和Caco2以及THP1白血病细胞(图11C)的吸收。
图12是展示所公开的巨噬细胞疗法治疗的一实施例的示意图。
图13A至13R是描绘所公开的方法的各种实施例的步骤的示意图。如图13A至13R中所用，术语“试剂A”意谓SIRPα抑制剂并且术语“试剂B”意谓巨噬细胞活化剂。
图14A至14F展示在Sirpα-/-小鼠中局部RT消除MC38和PDA肿瘤，但野生型小鼠中没有。图14A展示RT方案。将MC38、Pan02或KPC细胞(5×105，皮下)移植到野生型或Sirpα-/-小鼠中的右侧胁腹(flanks)中，并当肿瘤达到>150mm3时，给与各种剂量的X射线辐照(IR)。图14B至14D展示肿瘤体积和存活的变化。当肿瘤为150-400mm3>500mm3时，分别给与单分次(图14B和14C)或三分次(图14D)IR，用两分次处理的一些Sirpα-/-小鼠(紫线，图14D)除外。蓝线指示用2x 8Gy(图4C)或8Gy-4Gy-4Gy(图14D)处理并在每个分次之后用抗PD-L1 Ab(50μg，肿瘤内)处理的野生型小鼠。数据代表不同肿瘤的至少三个独立实验(n＝3-12/组)。存活数据是IR后长达1.5年的记录。图14E含有在单个8Gy IR之前和之后野生型和Sirpα-/-小鼠中MC38和表达荧光素酶的KPC肿瘤的代表性影像。图14D展示在IR之后指示时间评估的血清细胞因子(n＝5/组)。
图15A至15G展示Sirpα-/-小鼠表现出RT诱导的远位作用和持久的抗肿瘤免疫性。图15A和15B展示具有MC38(图15A)或KPC(图15B)肿瘤的小鼠中的远位作用。对原发性肿瘤(>150mm3)进行辐照(8Gy)，并在8-10天后，给与远位肿瘤游移的小鼠子集抗PD-L1 Ab(αPD-L1；100μg，腹膜内2次，相隔3天)。记录肿瘤体积和存活。代表性图像(图15B)展示在RT±αPD-L1之前和之后在两侧胁腹、背侧区或腹膜腔中移植表达荧光素酶的KPC肿瘤的野生型和Sirpα-/-小鼠。数据代表五个独立实验(n＝3-8/组)。图15C至15D展示持久的抗肿瘤免疫性。在根除MC38或PDA肿瘤(RT之后3周)之后，用三轮递增剂量的相同肿瘤的接种物攻击Sirpα-/-小鼠(图15C)。记录肿瘤体积和存活(图15D)。数据代表四个独立实验(n＝3-8/组)。在最后一个接种物之后十天，通过相应肿瘤细胞的细胞表面免疫染色检测其血清的抗肿瘤IgG(图15E)并评估补体依赖性细胞毒性(CDC)和巨噬细胞的吞噬作用(图15F)；展示来自MC38抗性(含有抗MC38 IgG)或肿瘤未处理(tumor
Figure BDA0004010117540000082
)的Sirpα-/-小鼠的血清。在MC38移植之前，将来自相同MC38抗性或肿瘤未处理的Sirpα-/-小鼠的脾T细胞转移到野生型接受者；记录肿瘤生长。图15G展示数据代表三个独立实验(n＝3/组)并呈现为一式三份测试的平均值±SD。
图16A至16I展示Sirpα-/-巨噬细胞在IR之后赋予完全反应，但CD47-阻断没有。图16A和16B展示在Sirpα-/-小鼠中肿瘤内巨噬细胞的耗尽减弱RT功效。在肿瘤8Gy IR之前2天和紧接在IR之后向Sirpα-/-小鼠中的MC38或PDA肿瘤(>200mm3)施用CI2MDA-脂质体或抗CSF受体抗体(αCSF1R)以耗尽巨噬细胞。数据代表两个独立实验(n＝3-4/组)。图16C至16F展示将RT与过继性Sirpα-/-BMDM输注组合在野生型小鼠中赋予肿瘤消除。将野生型小鼠中的MC38肿瘤用以下处理一次(1x)或两次(2x，3天时间间隔)：肿瘤内(i.t.)注射Sirpα-/-BMDM(1×104/mm3肿瘤块)、抗鼠CD47阻断抗体(αCD47、miap301，100μg)、可溶性鼠SIRPα胞外结构域(mSIRPα、ex，100μg)、抗MC38血清(100μl，未稀释)或αCD47+抗MC38血清，没有(图16H)或有另一8Gy IR，在3小时后给与。3天后重复相同处理。记录肿瘤体积和动物存活。数据代表两个独立实验(n＝3-5/组)。
图17A至17I展示辐照-活化Sirpα-/-巨噬细胞驱动促炎性TME。图17A至17D展示通过流式细胞术分析在单次8Gy IR之前和之后野生型和Sirpα-/-小鼠中的MC38肿瘤的CD45+肿瘤浸润白细胞群体和CD45-非白细胞。通过t-SNE目测(图17B)并计算每毫克肿瘤块(图17D)在IR之前和之后肿瘤内F4/80高巨噬细胞
Figure BDA0004010117540000081
的频率。数据代表至少六个独立实验(图17A-17B)或从三个实验汇集(图17C-17D，n-12-16/组)。图17E展示在IR之前和IR之后的不同时间点分析肿瘤内输注(i.t.，1×104/mm3)到野生型接受者中的GFP阳性Sirpα-/-BMDM(GFP-Sirpα-/-M)。数据从两个独立实验汇集并呈现为平均值±S.D.(n＝3/组)。图17F-17G展示在IR(8Gy)之前(-IR)和IR之后12小时针对抗原呈递和炎性表型分析野生型和Sirpα-/-小鼠(图17F)中或GFP-Sirpα-/-BMDM输注的野生型接受者(图17G)中的MC38-肿瘤内F4/80高巨噬细胞。细胞表面染色：MHC I/II、CD80/86和PX40L；细胞内染色：IL-12、IFNα和IL-10。数据代表三个独立实验(n＝3-4/组)。图17A和17I展示在IR之前和IR之后12小时通过Nanostring(nCounter小鼠免疫学组)进行的块状肿瘤的mRNA剖析。热图(图17H)和散点图(图171)描绘抗原呈递、促炎性和抗炎性相关基因的差异表达(n＝3只小鼠/组)。
图18A至18H展示在RT之后Sirpα-/-巨噬细胞驱动稳固的肿瘤特异性Tc扩增。图18A展示在单分次8Gy IR之前和之后MC38、Pan02或KPC肿瘤中CD45+肿瘤浸润白细胞当中的CD8+Tc和CD4+Th的TME分析。图18B展示在IR之后3天MC38肿瘤中的CD8+Tc的IHC和IF染色。图18C展示MC38 TME中颗粒酶B高(GranzB)和p15E+Tc的频率。还确定p15E+Tc中CD44+CD62L-效应记忆性T细胞(TEM)的频率。图18D是在IR之前和之后肿瘤内GranzB高和p15E+Tc的总结。图18A至18D中的数据代表至少六个独立实验(n＝4-6/组)。图18E展示MC38根除的Sirpα-/-小鼠的外周血和脾脏中P15E+Tc和p15E+CD44+CD62L-TEM的频率。数据代表三个独立实验(n＝5/组)。图18F展示具有MC38肿瘤的野生型小鼠经由i.t.(总共2×106，肿瘤尺寸约200mm3)和静脉内途径(1×107/小鼠)经肿瘤内输注Sirpα-/-BMDM，接着IR(8Gy)两轮(3天时间间隔)。在第二轮之后3天，确定p15+和GranzB+Tc的频率。数据代表三个独立实验(n＝2-4/组)。图18G展示将来自辐照肿瘤的Tc分离(IR之后3天)并与MC38细胞一起以所指示的各种效应:目标比率共培养6小时或24小时。通过碘化丙锭(PI)染色判定MC38细胞的死亡。数据表示为平均值±SD并代表三个独立实验(n＝3/组)。图18H展示在IR之前Sirpα-/-小鼠的MC38肿瘤中的CD8 Tc(αCD8)或CD4 Th(αCD4)的耗尽。数据代表两个独立实验(n＝4/组)。
图19A至19L展示在RT之后Sirpα-/-巨噬细胞减少肿瘤免疫抑制。切除IR之前和IR之后3天的MC38肿瘤并分析肿瘤内免疫群体的细胞数目(图19A)和百分比(图19B)。注意：野生型小鼠的数据没有Sirpα-/-巨噬细胞输注。数据从四个独立实验汇集并呈现为平均值±S.D.(n＝12/组)。图19C至19D展示肿瘤内CD4 T细胞当中的Foxp3+Treg和产生IFNγ的Th1。数据代表三个独立实验(n＝10-12/组)。图19E展示NK细胞中的GranzB表达，平均荧光强度(MFI)呈现为平均值±S.D.。数据代表两个独立实验(n＝5/组)。图19F至19J展示在IR之后野生型和Sirpα-/-小鼠中的单核细胞和PMN的有差异的肿瘤内浸润。门控策略(图19F、图19I)确定CD11b+骨髓细胞当中单核细胞(Ly6C+)和PMN(Ly6G+)以及其数目(图19G)。分析在肿瘤内骨髓细胞存在下T细胞增殖的抑制(图19H)。分析在DCFDA和1μM PMA存在下PMN的ROS产生(图19J)。数据代表三个独立实验且呈现为平均值±S.D.(n＝3-5/组)。图19K至19L展示PMN浸润促进肿瘤消退。在IR之后3天Sirpα-/-小鼠的15个MC38肿瘤中的肿瘤内PMN和其它白细胞(K)，和肿瘤内PMN和肿瘤消退百分比(L)的回归分析。数据代表三个独立实验且呈现为三个重复分析的平均值±S.D.(n＝15/组)。
图20A至20J展示吞噬性Sirpα-/-巨噬细胞充当APC并活化肿瘤特异性Tc。图20A展示紧接在IR(8Gy)之后切除MC38肿瘤(约300mm3)，剁碎，并且接着离体培养；在培养之前，紧接在切除之后，一些野生型MC38肿瘤经肿瘤内注射Sirpα-/-BMDM(1×106/mm3)。在4天之后，针对CD45+群体中的Tc和Th分析单细胞悬浮液。数据代表两个独立实验(n＝3-5/组)。图20B-20G展示通过肿瘤吞噬的Sirpα-/-BMDM从TIL的肿瘤特异性Tc的体外扩增。图20B展示实验方案。图20C展示Tc(红色，CD8染色)与加载肿瘤抗原的Sirpα-/-BMDM(灰色)形成结合物的影像。TIL-Sirpα-/-BMDM共培养2天之后Tc的活化通过以下显而易见：细胞尺寸扩大(SSC和FSC增加)和GranzB表达(图20D)，并且CSFE稀释指出稳固的Tc(但不是Th)增殖增加(图20E)且概述为频率(图20F)和数目(图20G)增加。数据代表至少五个独立实验，每个实验利用从三个肿瘤和一式三份共培养物汇集的TIL。图20H展示通过M38或KPC加载的Sirpα-/-BMDM扩增的Tc的细胞毒性，通过分别与MC38或KPC细胞以所指示的效应:目标比率共培养24小时来评估。使用约70％是通过αCD3/CD28扩增的Tc的TIL作为比较。数据代表三个独立实验并呈现为平均值±S.D.(n＝3/组)。图20I和20J展示Tc-MC38和Tc-KPC在体内的有效性。负载MC38(图20I)或KPC(图20J)肿瘤的野生型小鼠用Tc-MC38或Tc-KPC(静脉内5×106)、±全身放射(WBI；5Gy)和重组人类IL-2(腹膜内25,000IU，每天2次，持续5天)处理，或用通过αCD3/CD28活化的相同数目的TIL处理。与αCD3/CD28-TIL相比，MC38-Tc表现出活化/迁移形态。数据代表五个独立实验(n＝3-4只小鼠/组)。
图21A至21C为用于控制癌细胞的巨噬细胞吞噬作用的方案。图21A和21B展示在CD47-SIRPα轴非必需的情况下肿瘤相关巨噬细胞主要由TEM中的免疫抑制细胞因子/因子抑制；由此单独的CD47阻断(图21B)不诱导吞噬作用。图21C展示SIRPANT的专用试剂Phago-ActTM同时下调SIRPα表达和活化巨噬细胞的吞噬作用，产生能够强力吞噬肿瘤细胞并进行抗原呈递以活化肿瘤特异性T细胞的细胞毒性和持久的适应性免疫的SIRPANT-M。
图22A至22D展示肿瘤上调SIRPα表达。图22A-22B展示当肿瘤生长得更大时肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)、肿瘤浸润树突状细胞(DC)和骨髓源性抑制细胞(MDSC)显示SIRPα表达增加，如通过流式细胞术检测。MC38：鼠结直肠癌；KPC：鼠胰腺导管腺癌；EL4：鼠T细胞淋巴瘤。图22C展示MC38肿瘤切片的IF染色。注意：随着肿瘤生长，CD47(也是PD-L1，图22A)在肿瘤细胞上展现增加，表明在大的肿瘤中CD47-SIRPα调节更强并且免疫抑制增强许多。图22D展示用各种癌细胞条件培养基处理人PBMC源性巨噬细胞(人类M)增加SIRPα表达。HT29、Caco2和T84：人结直肠癌细胞；MDA231、MDA-435、BT549和T47D：人乳腺癌细胞等。
图23A至23D展示高SIRPα表达(SIRPα高)赋予巨噬细胞强烈免疫抑制表型和肿瘤对疗法的抗性。图23A展示针对由IFNγ/LPS±肿瘤培养基(TME)的存在和/或CD47连接(CD47.ex)诱导的促炎性和抗炎性细胞因子的产生，比较肿瘤调节的SIRPα高-M和SIRPα-/--M。图23B展示SIRPα高-M增加由IL-4诱导的精氨酸酶-1表达并减少由IFNγ/LPS诱导的iNOS，而SIRPα-/--M显示相反的表达。图23C展示针对SIRPα高肿瘤和SIRPα-/-肿瘤对放射线疗法(RT)的反应的转录分析：SIRPα高肿瘤很差地诱导抗原呈递或促炎性反应，但免疫抑制增强，这体现在由TGFB和吸引MDSC进行伤口愈合和T细胞抑制的趋化介素增加；SIRPα-/-肿瘤展现与其免疫景观相反的反应，表现出强烈炎性反应和免疫原性抗原呈递，其活化T细胞杀伤肿瘤的活性。MC38：结直肠癌；KPC和Pan02：胰腺导管腺癌。图23D展示针对抗原呈递机制在细胞表面上的表达，肿瘤调节的SIRPα高-M与Phago-ActTM产生的SIRPα低/SIRPANT-M的比较。
图24A至24D展示SIRPα调节机制。图24A展示肿瘤免疫抑制信号上调SIRPα，其细胞质ITIM由Btk磷酸化，引起SHP-2的募集和TME免疫抑制的加强。图24B展示在疗法下，SIRPα经由SFK介导的ITIM磷酸化募集/活化SHP-1，其抑制多通路促炎信号，赋予治疗抗性。图24C展示分别在促炎性或抗炎性刺激下，巨噬细胞中的磷酸化SIRPαITIM分开介导与SHP-1或SHP-2的结合。图24D展示SIRPα调节不依赖于CD47细胞外连接，但可通过其增强。
图25A和25B展示缺乏SIRPα的巨噬细胞的活化以吞噬癌细胞。图25A展示IL-17、LPS和IL-6(各10ng/ml)活化SIRPα-/--M，使之吞噬共培养的B16黑色素瘤细胞。该图还展示SIRPα-/--M在不存在活化的情况下不具有吞噬作用，且WT-M在存在或不存在活化的情况下无吞噬作用。B)用包含IL-6(10ng/ml)、CpG和聚I:C(各100ng/ml)的混合物处理的SIRPα-/--M表现出LLC肺癌细胞、MC38结直肠腺癌、EL4淋巴瘤和Pan02胰腺癌细胞的侵袭性吞噬作用。
图26A展示经IL-17A处理的SIRPα-/-小鼠消除B16黑色素瘤。图26B展示根除黑色素瘤的SIRPα-/-小鼠在抗B16 Ab下发展抗癌免疫性并能够抵抗再移植。WB：用对照血清或来自根除黑色素瘤的SIRPα-/-小鼠的抗B16血清检测B16膜蛋白。图26C展示接受抗B16血清的野生型小鼠展示对黑素瘤植入的抗性。
图27A和27B展示SIRPα-/-小鼠中通过RT的肿瘤消除。将MC38、Pan02或KPC皮下移植到野生型或SIRPα-/-小鼠中。在肿瘤良好形成之后(≥200mm3)，给与一分次的X射线RT(4-15Gy)，随后记录肿瘤体积变化和动物存活。灰色线：野生型小鼠施加2次8Gy RT+抗PD-L1(100μg，腹膜内)，相隔3天。图27C展示在SIRPα-/-小鼠中SIRPα-/--M的肿瘤内耗尽消除RT功效。图27D展示骨髓源性SIRPα-/--M过继转移到野生型小鼠中的肿瘤中通过RT使肿瘤消退。
图28A至28D展示SIRPα-/-小鼠中IR引起的肿瘤消除与表达高GranzB的抗肿瘤Tc的扩增(图28A)和一部分分化成TEM(CD44+CD62L-)的肿瘤抗原(p15E)特异性(图28B)有关。SIRPα-/-肿瘤在IR之后还减弱Foxp3 Treg(图28C)并减少Ly6C+MDSC浸润但增加NK(图28D)。
图29A至29C展示通过细胞因子、TLR激动剂、类固醇和肿瘤条件培养基上调和下调巨噬细胞中的SIRPα表达。图29A和29B展示鼠骨髓源性巨噬细胞并且图29C展示人PBMC源性巨噬细胞。图29D是通过Phago-ActTM离体产生SIRPα低活化巨噬细胞SIRPANT-M的方案。图29E展示人SIRPANT-M抵抗肿瘤条件的表型变化(再表达SIRPα)并维持长久性。图29F展示人SIRPANT-M直接吞噬人癌细胞。
图30A至30D展示鼠SIRPANT-M直接吞噬同基因型癌细胞。图30A展示实验方案。图30B展示吞噬EL4淋巴瘤和MC38结直肠腺癌细胞的SIRPANT-M的样品显微术结果。图30C展示示出MC38细胞的SIRPANT-M吞噬作用的样品流式细胞术。通过CD11b+门控BMDM或SIRPANT-M。图30D展示4小时内同基因型癌细胞的吞噬。****p<0.0001。
图31A展示在测试对各种人癌细胞的吞噬作用之前2天，用TNFα和IL-17、或INFy、或Phag-Act(SIRPANT-M)处理人PBMC源性巨噬细胞(SIRPα*-M)。仅SIRPANT-M表现出积极吞噬作用。图31B展示SIRPANT-M吞噬时程。图31C展示在4小时内对NCI-60人癌症组的SIRPANT-M吞噬作用。图31D展示示出SIRPANT-M对HT29、T84、Caco2和THP-1的吞噬作用的显微图像。图31E展示SIRPANT-M介导吞噬作用，与癌细胞上的CD47表达不相关。
图32A和32B展示人SIRPANT-M对经过X射线放射处理的人癌细胞展现出增强的吞噬作用。将人PBMC源性SIRPANT-M(图32A)或SIRPα+-M(图32B)与各种未辐照(-IR)或进行辐照(8Gy)的人癌细胞一起温育4小时，接着评估吞噬作用。样品荧光显微术图像展示SIRPANT-M侵袭性吞噬辐照OVCAR3卵巢癌细胞和UACC-62黑色素瘤细胞(CFSE)，但SIRPα+-M(CD11b染色)不这样。
图33A至33E展示鼠SIRPANT-M增强对经过放射处理的癌细胞的吞噬作用。图33A是BMDM(SIRPα+)和SIRPANT-M对未辐照(-IR)和进行辐照(8Gy)的同基因型肿瘤细胞的吞噬作用的比较。B)示出SIRPANT-M侵袭性吞噬辐照的MC-38细胞但BMDM不这样的显微术和流式细胞术。图33C展示示出SIRPANT-M对在变化剂量下进行辐照的EL4的吞噬增强的时程分析。图33D至33E展示非消融性放射不诱导细胞凋亡(PI/YO-PRO-1)或细胞表面CD47的变化，但增加钙网蛋白(CRT)。
图34A至34C展示SIRPANT-M活化表型和抗原呈递能力。将新鲜获得的鼠BMDM(SIRPα+-M)进一步用Phago-ActTM处理48小时以诱导SIRPANT-M。图34A展示在Phago-ActTM处理之前和之后SIRPα+-M和SIRPANT-M上的SIRPα表达。B)SIRPANT-M对比SIRPα+-M作为抗原呈递细胞(APC)的能力通过其对MHC-I、MHC-II和共刺激分子CD80和CD86的表达来评估。图34C展示SIRPANT-M对比SIRPα+-M的炎性特征，通过其促炎性和抗炎性细胞因子的产生来评估。图34D展示通过Nanostring MRNA剖析对SIRPANT-M中与SIRPα+-M相比参与抗原呈递和促炎性反应的基因的转录分析。
图35A至35C展示与供体匹配的SIRPα+-M相比，七种人PBMC源性SIRPANT-M的mRNA转录定位。图35A是参与抗原呈递和促炎性和抗炎性反应的基因的热图转录分析。图35B展示SIRPANT-M中由Phago-ActTM诱导的基因表达程序。显示表明有差异地调节的基因(总共2029个，上调1093个，下调936个)，根据已知或预测的功能、文献和序列相似性分类。图35C是展示与SIRPα+-M相比SIRPANT-M中的基因表达差异的散点图。
图36A至36LK展示体外SIRPANT-M活化来自肿瘤内TIL的MC38和KPC特异性T细胞。图36A是示例方案。图36B-36D展示用肿瘤抗原饲养(图36C)的SIRPANT-M诱导CD8+T细胞从TIL扩增，但SIRPα+-M不诱导(图36B)。检测到最少CD4+T细胞扩增(图36D)。图36E至36G展示SIRPANT-M在吞噬肿瘤抗原之后介导与CD8 T细胞的接合(CD8染色)以进行抗原呈递(图36E)，这个过程诱导CD8T细胞扩大(第2天(D2)增加SSC和FSC)和增殖(图36G)。图36H至36I展示SIRPANT-M活化的针对MC38的CD8 T细胞显示与MC38特异性p15E和ADPGK抗原决定基的反应性增加并且高度表达颗粒酶B。图36J展示体外SIRPANT-M活化的CD8 T细胞针对癌症的细胞毒性。从MC38 TIL和KPC TIL(称为TMC38和TKPC)扩增的CD8 T细胞分别与健康的经培养的MC38和KPC细胞一起以1:1或1:3的T:癌细胞比率共温育(12小时)，接着与没有与T细胞共温育的MC38和KPC细胞(对照)相比分析癌细胞死亡(J)。图36K展示TMC38(箭头)杀伤MC38细胞的实时成像快照。
图37展示SIRPANT-M体外诱导B16-gp33抗原特异性CD8 T细胞活化。左侧：实验方案。右侧：仅B16gp33饲养的SIRPANT-M稳固地诱导抗原(gp33)特异性T细胞活化。
图38A至38F展示治疗早期(小肿瘤)和晚期(大肿瘤)结直肠癌MC38和胰腺导管腺癌KPC(均皮下)的SIRPANT-M肿瘤内单一疗法。剂量依赖性研究。图38A展示肿瘤内注射(肿瘤内)给药策略。图38B展示在肿瘤内注射之后追踪MC38肿瘤中的SIRPANT-M并且动力学展示SIRPANT-M在肿瘤中存在大约2天。图38C展示SIRPANT-M经肿瘤内处理尺寸变化(虚线)的MC38。数据展示用D1/2和D1剂量处理的每种尺寸MC38肿瘤的两个-三个队列中的一者，给药3次，每三天一次，MC38移植之后第10天、第12天、第14天和第16天开始。图38D展示用媒介物(PBS)对照或3x SIRPANT-M i.t.以D1/2和D1剂量处理的移植MC38的小鼠的总存活。数据概述每个处理组的两个-三个队列，n＝10-22。图38E展示SIRPANT-M经肿瘤内处理尺寸变化(虚线)的KPC。数据展示用D1剂量处理的每种KPC肿瘤尺寸的两个-三个队列中的一者，给药3次，每三天一次，KPC移植之后第14天、第16天和第18天开始。注意：通过皮下，MC38肿瘤一般比KPC肿瘤长得快；根据肿瘤尺寸计算处理剂量。图38F展示用媒介物(PBS)对照或3xSIRPANT-M i.t.以D1剂量处理的移植KPC的小鼠的总存活。数据概述每个处理组中的两个-三个队列，总共n＝15-20。
图39A至39C展示SIRPANT-M疗法是不定肿瘤类型的。图39A展示用SIRPANT-M以D2剂量(肿瘤内，3次，每三天一次)处理结直肠(MC38)、胰腺(Pan02)、肺(LLC)或淋巴瘤(EL4)肿瘤(尺寸150-400mm3)。展示每种类型的癌症的两个-三个队列中的一者。图39B展示用媒介物对照(PBS)或D2剂量的SIRPANT-M经肿瘤内处理的移植肿瘤的小鼠的总存活。数据概述处理施加在不同阶段(肿瘤尺寸)的每种类型的癌症的多个队列。图39C展示SIRPANT-M处理MMTV-PyMT小鼠中的自发性三阴性乳腺癌(n＝20)。D1剂量的SIRPANT-M经肿瘤内在第62天和第66天注射到第一个出现的肿瘤以及在第70天、第74天、第76天和第82天和第80天注射到后面出现的最大肿瘤中。每次仅处理一个肿瘤。总存活示为活的小鼠的数目，呈分数形式。展示中值总存活和卡普兰迈耶分析(Kaplan Meier analysis)。
图40A至40F展示SIRPANT-M i.t.与RT组合消除RT难治性MC38结直肠癌和KPC和Pan02胰腺癌。图40A展示患有不同尺寸的MC38、KPC和Pan02癌症的小鼠用两轮RT或RT+D2剂量的SIRPANT-M i.t.处理。相对较小肿瘤的处理方案是4Gy和4Gy(肿瘤≤200mm3，相隔3天)或8Gy和8Gy(肿瘤200-400mm3，相隔3天)，在每个RT分次之后没有或立即进行SIRPANT-Mi.t.。对于大肿瘤，第一次处理使用15Gy且接着第二次处理使用8Gy。一组荷瘤小鼠被设置为不进行处理的对照。图40B和40C展示MC38结直肠癌进展或消退(图40B)和移植癌症的小鼠在接受针对不同尺寸的肿瘤的处理之后的总存活(图40C)。图40D和40E展示KPC胰腺癌进展或消退(图40D)和小鼠在接受针对不同尺寸的肿瘤的处理之后的总存活(图40E)。图40F和40G展示Pan02胰腺癌进展或消退(图40F)和小鼠在接受针对不同尺寸的肿瘤的处理之后的总存活(图40G)。
图41A和41B展示与RT组合的治疗MC38结直肠癌和KPC和Pan02胰腺癌的剂量依赖性SIRPANT-M功效。图41A展示尺寸<250mm3(蓝线)或更大(>300mm3，红线)的良好建立的MC38、KPC和Pan02肿瘤用一分次的8Gy X射线辐照处理，接着立即(<30分钟)肿瘤内施用D1/2(空心圆)或D2剂量(实心矩形)的SIRPANT-M。三天后重复相同处理(总共2次)。记录肿瘤体积变化。图41B展示不进行处理、仅8Gy RT或8Gy RT+变化剂量的SIRPANT-M i.t.的小鼠的存活记录。数据包括给与D1/2、D1和D2剂量的SIRPANT-M i.t.的小鼠。
图42A至42C展示SIRPANT-M i.t与RT组合诱导强力远位作用并全身性消除KPC癌症病变。小鼠在多个位置移植KPC/Luc胰腺腺癌(图40A)。在肿瘤形成之后，第一轮用8Gy RT和D1剂量的SIRPANT-M i.t.处理一或两个最大可触摸的肿瘤(红圈，均>200mm3)，接着两轮用4Gy RT和D1剂量的SIRPANT-M i.t.处理。(以两轮之间间隔三天给与每一轮)。对照组(左侧)给与三轮8Gy RT，没有SIRPANT-M。在每次处理之前和之后进行全身发光成像以记录肿瘤生长或消退。总肿瘤体积(图42B)通过KPC/Luc细胞的体内发光强度来计算，并记录动物存活(图42C)。
图43A至43E展示SIRPANT-M+RT诱导强力远位作用，全身性清除MC38结直肠癌病变。小鼠在两侧胁腹中移植MC38肿瘤，右侧为原发性，其中给与SIRPANT-M i.t.+RT处理。图43A展示实验方案。图43B和43C展示当右侧原发性肿瘤接受处理时两侧胁腹上肿瘤体积的变化。图43D和43E分别展示具有与图43B和43C相关的小的和大的原发性和远位肿瘤的小鼠的存活记录。注意：给与图43C中最初具有大的远位肿瘤的小鼠单次剂量(20μg，腹膜内)抗PD-L1，以促进远位清除。
图44A和44B展示在RT之前或在之后施用SIRPANT-M i.t.的功效。图44A展示在一分次8Gy RT之前立即(<3小时)或24小时或48小时或在RT之后相同时长用SIRPANT-M i.t.(D1剂量)处理在C57BL6小鼠中建立的MC38结直肠癌和EL4淋巴瘤。记录对不同处理起反应的肿瘤体积变化并与无处理对照和仅RT处理的肿瘤相比。图44B展示用不同次序的SIRPANT-M i.t.和RT处理的小鼠的存活记录。
图45A至45D展示在与RT组合用于治疗肺癌(LLC)、淋巴瘤(EL4)和两种形式三阴性乳腺癌(4T1和PyMT)时的剂量依赖性SIRPANT-M功效。LLC肺癌和EL4淋巴瘤皮下移植到C57BL6小鼠中。4T1乳腺癌原位植入到Balb C小鼠乳腺中。雌性MMTV-PyMT小鼠在大约50日龄自发地出现乳腺癌。在形成可触摸的肿瘤之后，在一分次8Gy RT之后，立即用D1/2、D1和D2剂量的同基因型SIRPANT-M经肿瘤内处理肿瘤。3天后重复处理(总共2次)。对于PyMT小鼠，将SIRPANT-Mi.t.和8Gy RT处理施加到第一个可触摸的肿瘤，接着另外处理后面出现的其它肿瘤，然而每次只处理最大肿瘤。总共施加6次SIRPANT-Mi.t.与RT组合。
图46展示从PBMC产生人SIRPα低巨噬细胞的时间安排和顺序。
图47A和47B展示用TPI-1或TPI-1+RT处理KPC(图47A)和MC38(图47B)癌症。
具体实施方式
在更详细地描述本公开之前，应理解本公开不限于所描述的具体实施例，因而当然可变化。还应当理解，本文所使用的术语仅仅是出于描述具体实施例的目的，并且不旨在是限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限定。
在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值，到下限单位的十分之一，以及该陈述范围内的任何其它陈述值或中间值，都涵盖在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该较小范围内并且也涵盖于本公开内，从属于在该陈述范围内的任何特定地排除的限值。当该陈述范围包括限值中的一个或两个时，排除所包括的那些限值中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文所描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本公开的实践和测试中，但是现在描述优选的方法和材料。
本说明书中所引用的所有出版物和专利均以引用的方式并入本文中，就像每个单独的出版物或专利被具体且单独地指示为以引用的方式并入一样，并且以引用的方式并入本文中，以便结合所引用的出版物来公开和描述方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在提交日之前的公开内容，并且不应理解为承认本公开因先前的公开而无权先于这类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。
如对于所属领域技术人员将显而易见的是，在阅读本公开时，本文描述和示出的单独实施例中的每一个均具有离散的组成部分和特征，这些组成部分和特征可以在不偏离本公开的范围或精神的情况下易于与其它几个实施例中的任何实施例的特征分开或组合。任何叙述的方法都可以按照所叙述的事件的次序或以逻辑上可能的任何其它次序来执行。
除非另外指示，否则本公开的实施例将采用在所属领域的技术内的化学、生物学、医学等的技术。
本发明的方法的描述可包括常规步骤，例如从个体收集或获得生物样品，或向受试者递送或施用组合物，伴随本发明的加工步骤。在这类情况下，应理解，本发明的方法可排除收集或获得生物样品或向受试者施用或递送组合物的任何或所有步骤。
提出了以下实例以便向所属领域的普通技术人员提供如何执行本文中所公开和要求的方法和使用本文中所公开和要求的疗法的完整公开内容和说明。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑一些误差和偏差。除非另外指示，否则份数为重量份数，温度是以℃为单位，并且压力处于或接近大气压。标准温度和压力被定义为20℃和1个大气压。
在详细描述本公开的实施例之前，应理解，除非另外指示，否则本公开不限于具体的材料、试剂、反应材料、制造工艺等，因而可变化。还应该理解，本文所使用的术语仅出于描述具体的实施例的目的，并且不旨在是限制性的。在本公开中还可能以不同顺序执行步骤，这在逻辑上是可能的。
定义
必须指出，除非上下文另外明确规定，否则如说明书中和所附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数个提及物。
术语“受试者”是指作为施用或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”是指在临床医生(例如医师)治疗下的受试者。
术语“治疗有效”是指使用的组合物的量是足以改善疾病或病症的一种或多种病因或症状的量。这类改善仅需要减少或改变，并不需要消除。
术语“药学上可接受”是指在合理医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“载体”意指当与化合物或组合物组合时，有助于或促进化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或任何其它特征以达到其预期用途或目的的化合物、组合物、物质或结构。例如，可选择载体以使活性成分的任何降解降到最低并使受试者的任何不良副作用降到最低。
术语“治疗”是指对患者的医疗管理，旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理性病状或病症。该术语包括积极治疗，即特异性针对疾病、病理性病状或病症的改善的治疗，并且还包括病因治疗，即针对相关疾病、病理性病状或病症的病因的去除的治疗。另外，该术语包括姑息治疗，即，被设计用于减轻症状而不是治愈疾病、病理性病状或病症的治疗；预防治疗，即，针对最大程度地减少相关疾病、病理性病状或病症或部分或完全抑制其发展的治疗；以及支持性治疗，即，用于补充针对相关疾病、病理性病状或病症的改善的另一种特定疗法的治疗。
如本文所用的术语“药剂”或“化合物”是指向受试者施用以治疗或预防或控制疾病或病状的化学实体或生物产品或者化学实体或生物产品的组合。化学实体或生物产品优选地但不一定是低分子量化合物，但也可以是较大的化合物或任何有机或无机分子，包括经修饰和未修饰的核酸，如反义核酸；RNAi，如siRNA或shRNA；肽；肽模拟物；受体；配体；和抗体；适体；多肽；核酸类似物或其变体。举例来说，药剂可以是核酸、氨基酸或碳水化合物的低聚物，包括但不限于蛋白质、肽、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、RNAi剂(例如siRNA)、脂蛋白、适体以及其修饰和组合。药剂还可以是天然存在的细胞或经修饰的细胞。在一些实施例中，活性剂是核酸，例如miRNA或其衍生物或变体。
术语“抑制”是指活性、反应、病状、疾病或其它生物参数的降低。这可以包括但不限于活性、反应、病状或疾病的完全消除。这还可以包括例如与天然或对照水平相比，活性、反应、病状或疾病减少10％。因此，与天然或对照水平相比，减少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何减少量。
术语“放射”是指由在高速或高能电磁波下移动的高能亚原子粒子、离子或原子组成的电离辐射。本文中，术语“放射”在医学背景中使用并且与“电离辐射”、“辐照”、“放射疗法”和“放射线疗法”同义使用。术语“肿瘤定向放射”是指直接指向患者肿瘤的放射束的医疗用途。
组合物和方法
本文公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，其涉及向该受试者施用治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞。在一些实施例中，这些活化的SIRPα低巨噬细胞由如下方法产生，该方法涉及从受试者收集包含外周血单个核细胞(PBMC)的生物样品；从PBMC中分离单核细胞；在体外培养单核细胞以产生巨噬细胞；使巨噬细胞与SIRPα抑制剂接触以产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα细胞表面表达或活性降低的巨噬细胞群体(SIRPα低巨噬细胞)；以及使SIRPα低巨噬细胞与巨噬细胞活化剂接触以活化SIRPα低巨噬细胞。
在一些实施例中，SIRPα抑制剂和巨噬细胞活化剂为依次施用。这可以按任一次序进行并且可以相隔数分钟、数小时或数天，例如相隔1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、16小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。在其它实施例中，SIRPα抑制剂和巨噬细胞活化剂为同时或并行施用。
在一些实施例中，SIRPα抑制剂和巨噬细胞活化剂存在于同一组合物中。因此，在一些实施例中，方法涉及从生物样品中的外周血单个核细胞(PBMC)中分离单核细胞；在体外分化单核细胞以产生巨噬细胞；以及使巨噬细胞与SIRPα表达抑制剂和巨噬细胞活化剂接触，以产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα细胞表面表达降低并且吞噬作用、促发炎和抗原呈递的活性增加的活化的巨噬细胞群体(活化的SIRPα低巨噬细胞)。
在一些实施例中，SIRPα低巨噬细胞具有降低的SIRPα细胞表面表达或活性，与未处理的巨噬细胞相比降低约90％，包括与未处理的巨噬细胞相比，大约降低约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
图13A至13R中示出了所公开的方法的各种实施例。举例来说，在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，并在该施用之后进行肿瘤定向原位放射疗法(图13A)。在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，并在该施用之前进行肿瘤定向原位放射疗法(图13B)。在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，无任何肿瘤定向原位放射疗法(图13C)。
在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，并且在该施用之后进行肿瘤定向原位放射疗法和静脉内(IV)施用ICB(图13D)。在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，并且在该施用之前进行肿瘤定向原位放射疗法，之后进行静脉内施用ICB(图13E)。在一些实施例中，治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞直接施用于肿瘤中，并且在该施用之后静脉内施用ICB，不进行任何肿瘤定向原位放射疗法(图13F)。
在一些实施例中，静脉内施用治疗有效量的尚未在体外培养物中活化的SIRPα低巨噬细胞，并在该施用之后进行肿瘤定向原位放射疗法(图13G)。在一些实施例中，静脉内施用治疗有效量的尚未在体外培养物中活化的SIRPα低巨噬细胞，并在该施用之后进行肿瘤定向原位放射疗法和静脉内施用ICB(图13H)。
在一些实施例中，静脉内施用治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞，并在该施用之后进行肿瘤定向原位放射疗法(图13I)。在一些实施例中，静脉内施用治疗有效量的活化的SIRPα低巨噬细胞，并在该施用之后进行肿瘤定向原位放射疗法和静脉内施用ICB(图13J)。
如图13K至13R中所示，活化的SIRPα低巨噬细胞也可以与来自肿瘤活检的细胞共培养，以产生肿瘤特异性外周血T(PBT)细胞(图13K至13N)或肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)(图13O至13R)。
在一些实施例中，作为从受试者中收集包含PBMC的生物样品的替代方案，所述方法将涉及从受试者中收集包含血液的生物样品，或从受试者中收集包含外周血白细胞的生物样品，或从受试者中收集包含单采血液成分术产物的生物样品，或从受试者中收集包含骨髓的生物样品，或从受试者中收集包含切除的健康组织的生物样品。这类生物样品可以用于分离单核细胞，用于分离巨噬细胞，用于分离T细胞，或用于分离其它细胞。
用于从生物样品中分离单核细胞的方法在所属领域中是众所周知的。用于从生物样品中分离巨噬细胞的方法在所属领域中是众所周知的。在体外培养单核细胞以产生巨噬细胞的方法在所属领域中是众所周知的。
本文公开了抑制SIRPα的活性或破坏其与CD47的相互作用的药剂。抑制SIRPα的活性或破坏其与CD47的相互作用可增强表达SIRPα的细胞的吞噬活性并且增强T细胞介导的适应性免疫反应的产生。药剂(SIRPα抑制剂)可以是遏制SIRPα活性或破坏其与CD47的相互作用的化合物或抗体(例如抗SIRPα单克隆抗体)或其它蛋白质。举例来说，抗体或其它蛋白质可以特异性结合靶标，如SIRPα，或SIRPα介导的通路内的下游组分，而不活化结合的目标。药剂可以是例如通过分子技术工程化为与天然存在的CD47胞外结构域相同或不同的可溶性CD47胞外结构域或其片段。这类药剂可以结合但不活化SIRPα，由此破坏SIRPα与CD47的相互作用。药剂可以是例如通过分子技术工程化为与天然存在的SIRPα胞外结构域相同或不同的可溶性SIRPα胞外结构域或其片段。这类药剂可以结合但不活化CD47，由此破坏SIRPα与CD47的相互作用。药剂可以是引起细胞表面上存在的SIRPα的量降低的化合物或抗体或其它蛋白质。药剂可以是通过驱动表面表达的SIRPα的胞吞作用来引起细胞表面上存在的SIRPα的量降低的化合物或抗体或其它蛋白质。药剂可以是通过降低编码SIRPα的基因的表达水平来引起细胞表面上存在的SIRPα的量降低的化合物或抗体或其它蛋白质。药剂可以是细胞因子、生长因子或趋化因子。
SIRPα还可通过抑制SIRPα信号传导通路来抑制。数种酪氨酸激酶抑制剂(例如靶向Src家族酪氨酸激酶和/或Btk的那些酪氨酸激酶抑制剂)抑制SIRPα细胞质域磷酸化和SHP-1/2的募集。因此，这些药剂适用于本发明的方法。SIRPα还可以通过抑制SIRPα信号传导通路或其比SHP-1/2更下游的元件来抑制。
可以在所公开的方法中使用的SHP-1抑制剂的非限制性实例包括：TPI-1(0.1-5mg/kg，2-(2,5-二氯苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a1(0.1-5mg/kg，2-(2,5-二氯苯基)-2,4-苯醌)、TPI-1a2(0.1-5mg/kg，2-(3-氯苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a3(0.1-5mg/kg，2-苯基萘醌)、TPI-1a4(0.1-5mg/kg，2-(4-乙氧基苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a5(0.1-5mg/kg，2-(4-甲氧基苯基)-1,4-苯醌)、SSG(0.5-10mg/kg，葡萄糖酸锑钠)、PTP抑制剂I(0.5-10mg/kg，2-溴-1-(4-羟苯基)-乙酮)、PTP抑制剂II(0.5-10mg/kg，2-溴-1-(4-甲氧苯基)-乙酮)、PTP抑制剂III(0.5-10mg/kg，2-[4-(2-溴乙酰基)苯氧基]-乙酸)、PTP抑制剂IV(0.5-10mg/kg，N,N'-[1,4-亚苯基双[(1-甲基亚乙基)-4,1-亚苯基]]双[1,1,1-三氟-甲磺酰胺)、NSC 23922(0.5-10mg/kg，3-氨基胆甾烷)和NSC 87877(0.5-10mg/kg，8-羟基-7-[2-(6-磺酸基-2-萘基)二氮烯基]-5-喹啉磺酸)。
在一些实施例中，SIRPα抑制剂遏制SIRPα的表达，抑制SIRPα的活性，减少细胞表面上SIRPα的丰度，破坏SIRPα与CD47之间的相互作用，活化吞噬作用或其组合。用于敲低巨噬细胞中的SIRPα表达的方法包括在体外用细胞因子或细胞因子的混合物、用趋化因子或趋化因子的混合物、用生长因子或生长因子的混合物、用细胞因子、趋化因子和/或生长因子的混合物、用免疫刺激分子、用细胞信号传导蛋白质或其它细胞信号传导分子或用以上任意者的组合处理巨噬细胞。还可以通过刺激细胞表面受体或其它细胞受体来敲低巨噬细胞中的SIRPα表达。这类刺激可以通过使受体交联来进行。受体交联可以由抗体或抗体的混合物介导。还可以通过用小分子或药物处理来刺激细胞受体。
SIRPα抑制剂的实例包括：IFNγ、IL-6、IL-1家族细胞因子(例如IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra、IL-37、IL-38)、TNFα、IL-12、IFNα、IFNβ、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、Toll样受体(TLR)激动剂或含有病原体相关分子模式(PAMP)或损伤相关分子模式(DAMP)的其它分子(例如LPS、CpG、聚I:C、LTA、PGN、鞭毛蛋白、HMGB1等)、Pam3CSK4、酵母聚糖、细胞因子、趋化因子、生长因子和糖皮质激素，如甲基泼尼松龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)。SIRPα抑制也可以通过刺激细胞表面受体或其它细胞受体进行。这类刺激可以通过使受体交联来进行。受体交联可以由抗体或抗体的混合物介导。SIRPα抑制剂可以是所列任何药剂的组合。
在一些实施例中，SIRPα抑制剂为100ng/mL IFNγ、100ng/mL IL-6和1μg/mL CpG的混合物。在其它实施例中，SIRPα抑制剂是IFNγ、IL-6和CpG的混合物，其中IFNγ的浓度是1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500或1000ng/mL，IL-6的浓度是1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500或1000ng/mL，并且CpG的浓度是1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400或500nm/mL，或者1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/mL。
在一些实施例中，巨噬细胞活化剂增加巨噬细胞的吞噬作用，增加巨噬细胞的抗原加工和呈递活性和功能，增加巨噬细胞的免疫刺激能力，改善巨噬细胞的T细胞刺激功能，促进巨噬细胞的促炎(所谓M1)表型，或使巨噬细胞能够改变TME以促进针对癌细胞的免疫反应。
巨噬细胞活化剂的实例包括：IL-1家族细胞因子(例如IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra、IL-37、IL-38或将来可能鉴定的其它细胞因子)、IL-12、IFNα、IFNβ、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、Toll样受体(TLR)激动剂(例如LPS、CpG、聚I:C、LTA、PGN、鞭毛蛋白、Pam3CSK4、酵母聚糖、HMGB1等)或含有病原体相关分子模式(PAMP)或损坏相关分子模式(DAMP)的其他分子、细胞因子、趋化因子、生长因子或糖皮质激素，如甲基泼尼松龙和地塞米松。活化巨噬细胞也可以通过刺激细胞表面受体或其它细胞受体进行。这类刺激可以通过使受体交联来进行。受体交联可以由抗体或抗体的混合物介导。细胞受体还可以通过用小分子或药物(如PKC活化剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，和蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂，如过钒酸盐)处理来刺激，巨噬细胞也可以用PMA活化。因为PMA是一种PKC刺激剂，所以它是通过刺激PKC-Syk通路来活化巨噬细胞的药剂。还可使用这些活化剂的生物活性变化形式。巨噬细胞活化剂也可以是TLR的配位体(例如，脂多醣(LPS)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、脂磷壁酸(LTA)、鞭毛蛋白、GARDIQUIMODTM(目前由InvivoGen制造的咪唑并喹啉化合物；CAS编号1020412-43-4)、IMIQUIMODTM(1-异丁基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺；CAS编号99011-02-6)、肽聚糖(PDG)或CpG寡核苷酸)。因为巨噬细胞和一些癌细胞(例如，乳腺癌细胞)都表达TLR，所以TLR配体或活化TLR的药剂可以在用于活化巨噬细胞并随后治疗癌症的组合物和方法中用作SIRPα抑制剂或巨噬细胞活化剂。在一些实施例中，可能通过破坏SIRPα与CD47之间的相互作用来活化巨噬细胞的药剂可以是表面活性型蛋白(例如，表面活性型蛋白A、B或D)。巨噬细胞还可以通过电离辐射活化。
在一些实施例中，巨噬细胞活化剂为20nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)。在其它实施例中，巨噬细胞活化剂是浓度为0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、25、30、40、50、60、70、80、90、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500或1000nM的PMA。
在一些实施例中，巨噬细胞的治疗有效量为50×106个巨噬细胞、150×106个巨噬细胞或450×106个巨噬细胞。在一些实施例中，巨噬细胞的治疗有效量为1、5、10、20、30、40、60、70、80、90、100、125、175、200、250、300、350、400、500、600、750或1000×106个巨噬细胞。在一些实施例中，巨噬细胞的治疗有效量随肿瘤块的尺寸而变。在一些实施例中，巨噬细胞的治疗有效量随患者体重而变。在一些实施例中，巨噬细胞的治疗有效量随患者年龄而变。在一些实施例中，巨噬细胞的治疗有效量随肿瘤块的尺寸、患者体重和患者年龄的组合而变。
在一些实施例中，方法还涉及用有效量的肿瘤定向原位放射疗法治疗受试者。举例来说，肿瘤定向放射可以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或25戈瑞(Gray)的量施用。肿瘤定向放射可以单个剂量施用或可以多个剂量施用。如本文所公开，辐照在即将施用巨噬细胞前、紧接在施用巨噬细胞之后或与施用巨噬细胞同时进行。举例来说，辐照可在施用巨噬细胞之前或之后0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时施用。作为其它实例，辐照可在施用巨噬细胞之前或之后1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天施用。
在一些实施例中，放射疗法为通常用于癌症治疗的任何形式的能量或粒子辐射。在一些实施例中，放射疗法为电离辐射。在一些实施例中，放射是非电离辐射。非电离辐射包含可见光、热、雷达、微波和无线电波。电离辐射包括x射线，它比非电离辐射能量更大。粒子辐射包括α粒子、β粒子、γ射线和中子。
在一些实施例中，所述方法还涉及用免疫检查点抑制剂(也称为免疫检查点阻断)治疗受试者。用免疫检查点抑制剂治疗受试者也称为“免疫检查点抑制剂疗法”或“免疫检查点阻断疗法”。在任一种本发明的方法中，巨噬细胞和免疫检查点抑制剂可以通过相同或不同的施用途径同时施用，或可以通过相同或不同的施用途径依次施用。举例来说，免疫检查点抑制剂可以在施用巨噬细胞之前或之后0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时施用。作为其它实例，免疫检查点抑制剂可在施用巨噬细胞之前或之后1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天施用。
在通过相同的施用途径同时施用药剂的情况下，药剂可以含于单一制剂内。免疫检查点抑制剂的实例包括靶向以下的单克隆抗体：PD-1(例如
Figure BDA0004010117540000271
(帕博利珠单抗(pembrolizumab))、
Figure BDA0004010117540000272
(纳武单抗(nivolumab))或
Figure BDA0004010117540000273
(西米普利单抗(cemiplimab)-rwlc))、PD-L1(例如
Figure BDA0004010117540000274
(阿替利珠单抗(atezolizumab))、
Figure BDA0004010117540000275
(阿维鲁单抗(avelumab))或
Figure BDA0004010117540000276
(德瓦鲁单抗(durvalumab)))、CTLA-4(例如
Figure BDA0004010117540000277
(伊派利单抗(ipilimumab)))或将来可能鉴定或批准用于人类使用的其它免疫检查点蛋白。
在一些实施例中，所述方法还涉及用化学治疗剂治疗受试者。在一些实施例中，化学治疗剂为增加肿瘤损伤信号的治疗剂。已知癌症药物的非限制性实例包括阿贝西利(Abemaciclib)、阿比特龙乙酸酯(Abiraterone Acetate)、Abraxane(太平洋紫杉醇(Paclitaxel)白蛋白稳定化纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿卡替尼(Acalabrutinib)、AC-T、Actemra(托珠单抗(Tocilizumab))、Adcetris(维布妥昔单抗(Brentuximab Vedotin))、ADE、阿多-曲妥珠单抗恩他新(Ado-Trastuzumab Emtansine)、阿德力霉素(Adriamycin)(盐酸多柔比星(Doxorubicin Hydrochloride))、二马来酸阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、Afinitor(依维莫司(Everolimus))、Akynzeo(奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼(Netupitant and Palonosetron Hydrochloride))、Aldara(咪喹莫特(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、Alecensa(艾乐替尼(Alectinib))、艾乐替尼、阿仑妥珠单抗(Alemtuzumab)、Alimta(培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium))、Aliqopa(盐酸考帕昔布(Copanlisib Hydrochloride))、注射用Alkeran(盐酸美法仑(MelphalanHydrochloride))、Alkeran片剂(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼(PalonosetronHydrochloride))、艾培昔布(Alpelisib)、Alunbrig(布加替尼(Brigatinib))、Ameluz(氨基乙酰丙酸盐酸盐(Aminolevulinic Acid Hydrochloride))、阿米福汀(Amifostine)、胺基乙酰丙酸盐酸盐、阿那曲唑(Anastrozole)、阿帕鲁胺(Apalutamide)、阿瑞匹坦(Aprepitant)、Aranesp(α达贝泊汀(Darbepoetin Alfa))、Aredia(帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium))、Arimidex(阿那曲唑(Anastrozole))、Aromasin(依西美坦(Exemestane))、Arranon(奈拉滨(Nelarabine))、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗(Ofatumumab))、天冬酰胺酶菊欧文氏菌(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、Asparlas(聚乙二醇化天冬酰胺酶(Calaspargase Pegol)-mknl)、阿替利珠单抗、阿伐替尼(Avapritinib)、Avastin(贝伐珠单抗(Bevacizumab))、阿维鲁单抗、阿基仑赛(Axicabtagene Ciloleucel)、阿西替尼(Axitinib)、Ayvakit(阿伐替尼)、阿扎胞苷、Azedra(碘苄胍(Iobenguane)I 131)、Balversa(厄达替尼(Erdafitinib))、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、玛贝妥单抗(Belantamab Mafodotin)-blmf、Beleodaq(贝利司他(Belinostat))、贝利司他、盐酸苯达莫司汀(Bendamustine Hydrochloride)、Bendeka(盐酸苯达莫司汀)、BEP、Besponsa(奥英妥珠单抗(Inotuzumab Ozogamicin))、贝伐珠单抗、贝沙罗汀(Bexarotene)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、BiCNU(卡莫司汀(Carmustine))、贝美替尼(Binimetinib)、Blenrep(玛贝妥单抗-blmf)、硫酸博来霉素(Bleomycin Sulfate)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、Blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米(Bortezomib)、Bosulif(伯舒替尼(Bosutinib))、伯舒替尼、Braftovi(康奈非尼(Encorafenib))、维布妥昔单抗、布卡奥赛(Brexucabtagene Autoleucel)、Breyanzi(利基迈仑赛(Lisocabtagene Maraleucel))、布加替尼(Brigatinib)、Brukinsa(泽布替尼(Zanubrutinib))、BuMel、白消安(Busulfan)、Busulfex(白消安)、卡巴他赛(Cabazitaxel)、Cablivi(卡普赛珠单抗(Caplacizumab)-yhdp)、Cabometyx(卡博替尼-S-苹果酸盐(Cabozantinib-S-Malate))、卡博替尼-S-苹果酸盐、CAF、聚乙二醇化天冬酰胺酶-mknl、Calquence(阿卡替尼)、Campath(阿仑妥珠单抗)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨(Capecitabine)、卡普赛珠单抗-yhdp、盐酸卡玛替尼(Capmatinib Hydrochloride)、CAPOX、Carac(外用氟尿嘧啶)、卡铂(Carboplatin)、卡铂-紫杉醇、卡非佐米(Carfilzomib)、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀植入物、Casodex(比卡鲁胺(Bicalutamide))、CEM、西米普利单抗-rwlc、色瑞替尼(Ceritinib)、柔红霉素(Cerubidine)(盐酸道诺霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、Cervarix(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗(Cetuximab)、CEV、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、苯丁酸氮芥-泼尼松(PREDNISONE)、CHOP、顺铂(Cisplatin)、克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、富马酸考比替尼(Cobimetinib Fumarate)、Cometriq(卡博替尼-S-苹果酸盐)、盐酸考帕昔布、COPDAC、Copiktra(杜维昔布(Duvelisib))、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(放线菌素D(Dactinomycin))、Cotellic(富马酸考比替尼(CobimetinibFumarate))、克卓替尼(Crizotinib)、CVP、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、Cyramza(雷莫芦单抗(Ramucirumab))、阿糖胞苷(Cytarabine)、甲磺酸达拉非尼(Dabrafenib Mesylate)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、Dacogen(地西他滨(Decitabine))、达可替尼(Dacomitinib)、放线菌素D、Danyelza(那昔妥单抗(Naxitamab)-gqgk)、达雷木单抗(Daratumumab)、达雷木单抗和玻尿酸酶-fihj、α达贝泊汀、达洛鲁胺(Darolutamide)、Darzalex(达雷木单抗)、Darzalex Faspro(达雷木单抗和玻尿酸酶-fihj)、达沙替尼(Dasatinib)、盐酸道诺霉素、盐酸道诺霉素和阿糖胞苷脂质体、Daurismo(马来酸格拉吉布(Glasdegib Maleate))、地西他滨(Decitabine)、地西他滨和西达尿苷(Cedazuridine)、去纤维钠、Defitelio(去纤维钠)、地加瑞克(Degarelix)、地尼白介素(Denileukin Diftitox)、地诺单抗(Denosumab)、地塞米松、盐酸右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride)、迪努妥昔单抗(Dinutuximab)、多西他赛(Docetaxel)、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、德瓦鲁单抗、杜维昔布、Efudex(外用氟尿嘧啶)、Eligard(乙酸亮丙立德(LeuprolideAcetate))、Elitek(拉布立酶(Rasburicase))、Ellence(盐酸表柔比星(EpirubicinHydrochloride))、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、Eloxatin(奥沙利铂(Oxaliplatin))、艾曲波帕乙醇胺(Eltrombopag Olamine)、Elzonris(塔拉福司(Tagraxofusp)-erzs)、依帕伐单抗(Emapalumab-lzsg)、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(埃罗妥珠单抗(Elotuzumab))、甲磺酸恩西地平(Enasidenib Mesylate)、康奈非尼、维恩诺单抗(Enfortumab Vedotin)-ejfv、Enhertu(Fam-德喜曲妥珠单抗(Trastuzumab Deruxtecan)-nxki)、恩曲替尼(Entrectinib)、恩杂鲁胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride)、EPOCH、α依伯汀(Epoetin Alfa)、Epogen(α依伯汀)、Erbitux(西妥昔单抗)、厄达替尼(Erdafitinib)、甲磺酸艾日布林(Eribulin Mesylate)、Erivedge(维莫德吉(Vismodegib))、Erleada(阿帕鲁胺(Apalutamide))、盐酸埃罗替尼(ErlotinibHydrochloride)、Erwinaze(天冬酰胺酶菊欧文氏菌)、Ethyol(阿米福汀(Amifostine))、Etopophos(磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate))、依托泊苷、磷酸依托泊苷、依维莫司、Evista(盐酸雷诺昔酚(Raloxifene Hydrochloride))、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射剂)、5-FU(外用氟尿嘧啶)、Fam-德喜曲妥珠单抗-nxki、Fareston(托瑞米芬(Toremifene))、Farydak(乳酸帕比司他(Panobinostat Lactate))、Faslodex(氟维司群(Fulvestrant))、FEC、盐酸非德替尼(Fedratinib Hydrochloride)、Femara(来曲唑(Letrozole))、非格司亭(Filgrastim)、Firmagon(地加瑞克)、磷酸氟达拉滨(FludarabinePhosphate)、Fluoroplex(外用氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶注射剂、外用氟尿嘧啶、氟他胺(Flutamide)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐珠单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙(Pralatrexate))、福他替尼二钠(Fostamatinib Disodium)、Fulphila(乙二醇化非格司亭(Pegfilgrastim))、FU-LV、氟维司群(Fulvestrant)、Gamifant(依帕伐单抗-lzsg)、Gardasil(重组HPV四价疫苗)、Gardasil9(重组HPV九价疫苗)、Gavreto(普拉替尼(Pralsetinib))、Gazyva(阿托珠单抗(Obinutuzumab))、吉非替尼(Gefitinib)、盐酸吉西他滨(Gemcitabine Hydrochloride)、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、奥吉妥珠单抗(Gemtuzumab Ozogamicin)、Gemzar(吉西他滨盐酸盐)、Gilotrif(二马来酸阿法替尼)、富马酸吉列替尼(Gilteritinib Fumarate)、马来酸格拉吉布、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel Wafer(卡莫司汀植入物)、谷卡皮酶(Glucarpidase)、乙酸戈舍瑞林(Goserelin Acetate)、格拉司琼(Granisetron)、盐酸格拉司琼、Granix(非格司亭)、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔(Propranolol Hydrochloride))、Herceptin Hylecta(曲妥珠单抗和玻尿酸酶-oysk)、Herceptin(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hycamtin(盐酸拓扑替康(TopotecanHydrochloride))、Hydrea(羟基脲(Hydroxyurea))、羟基脲、Hyper-CVAD、Ibrance(帕泊昔布(Palbociclib))、替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、依鲁替尼(Ibrutinib)、ICE、Iclusig(盐酸普纳替尼(Ponatinib Hydrochloride))、伊达米星(Idamycin)PFS(盐酸艾达霉素(Idarubicin Hydrochloride))、盐酸艾达霉素、艾德昔布(Idelalisib)、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺(Ifosfamide))、异环磷酰胺、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(依鲁替尼(Ibrutinib))、Imfinzi(德瓦鲁单抗)、咪喹莫特、Imlygic(塔力拉赫(Talimogene Laherparepvec))、Infugem(盐酸吉西他滨)、Inlyta(阿西替尼)、奥英妥珠单抗、Inqovi(地西他滨和西达尿苷)、Inrebic(盐酸非德替尼)、重组干扰素α-2b、白细胞介素-2(阿地白介素)、Intron A(重组干扰素α-2b)、碘苄胍I 131、伊派利单抗、Iressa(Gefitinib)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、伊萨妥昔单抗(Isatuximab)-irfc、Istodax(罗米地辛(Romidepsin))、艾伏尼布(Ivosidenib)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、柠檬酸埃沙佐米(Ixazomib Citrate)、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸盐鲁索利替尼(Ruxolitinib Phosphate))、JEB、Jelmyto(丝裂霉素(Mitomycin))、Jevtana(卡巴他赛(Cabazitaxel))、Kadcyla(恩美曲妥珠单抗(Ado-Trastuzumab Emtansine))、Kepivance(帕利夫明(Palifermin))、Keytruda(帕博利珠单抗)、Kisqali(瑞博西尼(Ribociclib))、Koselugo(硫酸司美替尼(Selumetinib Sulfate))、Kymriah(替沙来塞(Tisagenlecleucel))、Kyprolis(卡非佐米(Carfilzomib))、乙酸兰瑞肽(LanreotideAcetate)、二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、硫酸拉罗替尼(LarotrectinibSulfate)、来那度胺(Lenalidomide)、甲磺酸乐伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、Lenvima(甲磺酸(Lenvatinib Mesylate))、来曲唑、甲酰四氢叶酸钙(Leucovorin Calcium)、Leukeran(苯丁酸氮芥)、乙酸亮丙立德、Levulan Kerastik(氨基乙酰丙酸盐酸盐)、Libtayo(西米普利单抗-rwlc)、利基迈仑赛、洛莫司汀(Lomustine)、Lonsurf(曲氟尿苷(Trifluridine)和盐酸替普拉斯(Tipiracil Hydrochloride))、Lorbrena(劳拉替尼(Lorlatinib))、劳拉替尼、Lumoxiti(帕克莫单抗(Moxetumomab Pasudotox)-tdfk)、Lupron Depot(乙酸亮丙立德)、卢比克替定(Lurbinectedin)、罗特西普(Luspatercept)-aamt、Lutathera(镥Lu 177-Dota盐)、镥(Lu 177-Dota盐)、Lynparza(奥拉帕尼(Olaparib))、Margenza(马戈妥昔单抗(Margetuximab)-cmkb)、马戈妥昔单抗-cmkb、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体(Vincristine Sulfate Liposome))、Matulane(盐酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride))、氮芥盐酸盐(Mechlorethamine Hydrochloride)、乙酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、Mekinist(曲美替尼二甲亚砜(Trametinib DimethylSulfoxide))、Mektovi(贝美替尼(Binimetinib))、美法仑、盐酸美法仑、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、Mesnex(美司钠(Mesna))、甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)、溴化甲基纳曲酮(Methylnaltrexone Bromide)、米哚妥林(Midostaurin)、丝裂霉素(Mitomycin)、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、莫格利珠单抗(Mogamulizumab)-kpkc、Monjuvi(塔法司它单抗(Tafasitamab)-cxix)、帕克莫单抗-tdfk、Mozobil(普乐沙福(Plerixafor))、MVAC、Mvasi(贝伐珠单抗)、Myleran(白消安)、Mylotarg(奥吉妥珠单抗)、纳米颗粒太平洋紫杉醇(太平洋紫杉醇白蛋白稳定纳米颗粒制剂)、那昔妥单抗-gqgk、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、奈拉滨、马来酸来那替尼、Nerlynx(马来酸来那替尼)、奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼、Neulasta(乙二醇化非格司亭)、Neupogen(非格司亭)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib Tosylate))、Nilandron(尼鲁米特(Nilutamide))、尼罗替尼(Nilotinib)、尼鲁米特、Ninlaro(柠檬酸埃沙佐米)、单水合甲苯磺酸尼拉帕尼(NiraparibTosylate Monohydrate)、纳武单抗、Nplate(罗米司亭(Romiplostim))、Nubeqa(达洛鲁胺(Darolutamide))、Nyvepria(乙二醇化非格司亭)、阿托珠单抗、Odomzo(索尼得吉(Sonidegib))、OEPA、奥法木单抗、OFF、奥拉帕尼、高三尖杉酯碱(OmacetaxineMepesuccinate)、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼(Ondansetron Hydrochloride)、Onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、Ontak(地尼白介素)、Onureg(阿扎胞苷)、Opdivo(纳武单抗)、OPPA、Orgovyx(瑞卢戈利(Relugolix))、甲磺酸奥希替尼(Osimertinib Mesylate)、奥沙利铂、太平洋紫杉醇、太平洋紫杉醇白蛋白稳定纳米颗粒制剂、PAD、Padcev(维恩诺单抗-ejfv)、帕泊昔布、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕尼单抗(Panitumumab)、乳酸帕比司他、盐酸帕唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride)、PCV、PEB、培门冬酶、乙二醇化非格司亭、聚乙二醇化干扰素α-2b、PEG-Intron(聚乙二醇化干扰素α-2b)、Pemazyre(佩米替尼(Pemigatinib))、帕博利珠单抗、培美曲塞二钠、佩米替尼、Perjeta(帕妥株单抗(Pertuzumab))、帕妥株单抗、帕妥株单抗、曲妥珠单抗和玻尿酸酶-zzxf、盐酸培西达替尼(Pexidartinib Hydrochloride)、Phesgo(帕妥株单抗、曲妥珠单抗和玻尿酸酶-zzxf)、Piqray(艾培昔布)、普乐沙福、维泊妥珠单抗(Polatuzumab Vedotin)-piiq、Polivy(维泊妥珠单抗-piiq)、泊马度胺(Pomalidomide)、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸普纳替尼(Ponatinib Hydrochloride)、Portrazza(耐昔妥珠单抗)、Poteligeo(莫格利珠单抗(Mogamulizumab)-kpkc)、普拉曲沙、普拉替尼、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、Procrit(α依伯汀)、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(地诺单抗)、Promacta(艾曲波帕乙醇胺)、盐酸普萘洛尔、Provenge(西普亮塞-T(Sipuleucel-T))、Purinethol(巯基嘌呤)、Purixan(巯基嘌呤)、Qinlock(瑞派替尼(Ripretinib))、二氯化镭223、盐酸雷诺昔酚、雷莫芦单抗、拉布立酶(Rasburicase)、雷武珠单抗(Ravulizumab)-cwvz、Reblozyl(罗特西普-aamt)、R-CHOP、R-CVP、重组人类乳头状瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人类乳头状瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人类乳头状瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞格非尼(Regorafenib)、Relistor(溴化甲基纳曲酮)、瑞卢戈利、R-EPOCH、Retacrit(α依伯汀)、Retevmo(塞尔帕替尼(Selpercatinib))、Revlimid(来那度胺(Lenalidomide))、瑞博西尼、R-ICE、瑞派替尼、Rituxan(利妥昔单抗)、Rituxan Hycela(利妥昔单抗和人玻尿酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人玻尿酸酶、盐酸罗拉吡坦(Rolapitant Hydrochloride)、罗米地辛、罗米司亭、Rozlytrek(恩曲替尼)、正定霉素(Rubidomycin)(盐酸道诺霉素)、Rubraca(樟脑磺酸卢卡帕尼(Rucaparib Camsylate))、樟脑磺酸卢卡帕尼、磷酸鲁索利替尼、Rydapt(米哚妥林)、戈沙妥组单抗(Sacituzumab Govitecan)-hziy、Sancuso(格拉司琼)、Sarclisa(伊萨妥昔单抗-irfc)、Sclerosol胸膜内气溶胶(Talc)、塞利尼索(Selinexor)、塞尔帕替尼(Selpercatinib)、硫酸司美替尼、司妥昔单抗(Siltuximab)、西普亮塞-T、Soltamox(柠檬酸他莫昔芬)、Somatuline Depot(乙酸兰瑞肽)、索尼得吉、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石)、Steritalc(滑石)、Stivarga(瑞格非尼(Regorafenib))、苹果酸舒尼替尼(Sunitinib Malate)、Sustol(格拉司琼)、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇化干扰素α-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(高三尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、Tabrecta(盐酸卡玛替尼)、TAC、塔法司它单抗-cxix、Tafinlar(甲磺酸达拉非尼)、塔拉福司-erzs、Tagrisso(甲磺酸奥希替尼)、甲苯磺酸拉唑帕尼、滑石、塔力拉赫、Talzenna(甲苯磺酸拉唑帕尼)、柠檬酸他莫昔芬、Tarceva(盐酸埃罗替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼罗替尼)、Tavalisse(福他替尼二钠)、Taxotere(多西他赛)、氢溴酸他泽司他、Tazverik(氢溴酸他泽司他)、Tecartus(布卡奥赛)、Tecentriq(阿替利珠单抗)、Temodar(替莫唑胺(Temozolomide))、替莫唑胺、坦罗莫司(Temsirolimus)、Tepadina(噻替派(Thiotepa))、沙力度胺(Thalidomide)、Thalomid(沙力度胺)、硫鸟嘌呤、噻替派、Tibsovo(艾伏尼布)、替沙来塞、托珠单抗、Tolak(外用氟尿嘧啶)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、Torisel(坦罗莫司)、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定(Trabectedin)、曲美替尼二甲亚砜、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗和玻尿酸酶-oysk、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、Trexall(甲氨蝶呤钠)、曲氟尿苷和盐酸替普拉斯、Trisenox(三氧化二砷)、Trodelvy(戈沙妥组单抗(Sacituzumab Govitecan)-hziy)、Truxima(利妥昔单抗)、Tucatinib、Tukysa(图卡替尼(Tucatinib))、Turalio(盐酸培西达替尼)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Ukoniq(甲苯磺酸厄布利塞(Umbralisib Tosylate))、Ultomiris(雷武珠单抗-cwvz)、甲苯磺酸厄布利塞、Undencyca(乙二醇化非格司亭)、Unituxin(迪努妥昔单抗(Dinutuximab))、三乙酸尿苷、VAC、伐柔比星(Valrubicin)、Valstar(伐柔比星)、凡德他尼(Vandetanib)、VAMP、Varubi(盐酸罗拉吡坦)、Vectibix(帕尼单抗)、VelP、Velcade(硼替佐米)、维罗非尼(Vemurafenib)、Venclexta(维奈托克(Venetoclax))、维奈托克、Verzenio(阿贝西利)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞宾、VIP、维莫德吉(Vismodegib)、Vistogard(三乙酸尿苷)、Vitrakvi(硫酸拉罗替尼)、Vizimpro(达可替尼)、Voraxaze(谷卡皮酶)、伏立诺他(Vorinostat)、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸道诺霉素和阿糖胞苷脂质体)、Xalkori(克卓替尼(Crizotinib))、Xatmep(甲氨蝶呤钠)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地诺单抗)、Xofigo(二氯化镭223Dichloride)、Xospata(富马酸吉列替尼(Gilteritinib Fumarate))、Xpovio(塞利尼索(Selinexor))、Xtandi(恩杂鲁胺)、Yervoy(伊派利单抗)、Yescarta(阿基仑赛)、Yondelis(曲贝替定)、Yonsa(阿比特龙乙酸酯)、Zaltrap(Ziv-阿柏西普(Aflibercept))、泽布替尼(Zanubrutinib)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(单水合甲苯磺酸尼拉帕尼)、Zelboraf(维罗非尼(Vemurafenib))、Zepzelca(卢比克替定)、Zevalin(替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan))、Ziextenzo(乙二醇化非格司亭)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、Zirabev(贝伐珠单抗)、Ziv-阿柏西普、Zofran(盐酸昂丹司琼)、Zoladex(乙酸戈舍瑞林)、唑来膦酸(Zoledronic Acid)、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来膦酸)、Zyclara(咪喹莫特)、Zydelig(艾德昔布)、Zykadia(色瑞替尼)和Zytiga(阿比特龙乙酸酯)。
在任一种本发明的方法中，巨噬细胞和化学治疗剂可以通过相同或不同的施用途径同时施用，或可以通过相同或不同的施用途径依次施用。举例来说，化学治疗剂可以在施用巨噬细胞之前或之后0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时施用。作为其它实例，化学治疗剂可在施用巨噬细胞之前或之后1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天施用。
在一些实施例中，所述方法还涉及用溶瘤病毒疗法治疗受试者。溶瘤病毒为优先感染和杀死癌细胞的病毒。因为感染的癌细胞被溶瘤作用破坏，所以其释放新的感染性病毒颗粒或病毒粒子以帮助破坏剩余的肿瘤。认为溶瘤病毒不仅会直接破坏肿瘤细胞，还刺激宿主的抗肿瘤免疫系统反应。腺病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、痘病毒和新城疫病毒尤其是处于癌症疗法的临床前和临床开发下的一些溶瘤病毒。在一些实施例中，肿瘤病毒为牛痘病毒(VACV)或水泡性口炎病毒(VSV)。
在任一种本发明的方法中，巨噬细胞和溶瘤病毒疗法可以通过相同或不同的施用途径同时施用，或可以通过相同或不同的施用途径依次施用。举例来说，溶瘤病毒疗法可以在施用巨噬细胞之前或之后0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时施用。作为其它实例，溶瘤病毒疗法可在施用巨噬细胞之前或之后1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天施用。
本文还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法涉及从受试者收集包含外周血单个核细胞(PBMC)的生物样品；从PBMC中分离单核细胞；从PBMC中分离外周血T(PBT)细胞；在体外培养单核细胞以产生巨噬细胞；使巨噬细胞与SIRPα抑制剂接触以产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα细胞表面表达或活性降低的巨噬细胞群体(SIRPα低巨噬细胞)；使SIRPα低巨噬细胞与巨噬细胞活化剂接触以活化SIRPα低巨噬细胞；从受试者收集包含肿瘤活检的生物样品；将活化的SIRPα低巨噬细胞与来自肿瘤活检的细胞在体外共培养(肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞)；将肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞与分离的PBT细胞在体外共培养以扩增肿瘤特异性T细胞的数目；以及向受试者施用治疗有效量的体外扩增的PBT细胞。
在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之后进行肿瘤定向原位放射疗法。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之后静脉内施用ICB。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之后进行肿瘤定向原位放射疗法和静脉内施用ICB。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之前进行肿瘤定向原位放射疗法。在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之前进行肿瘤定向原位放射疗法，并且之后静脉内施用ICB。
在一些实施例中，体外扩增的PBT细胞通过静脉内施用来施用于受试者。在其它实施例中，体外扩增的PBT细胞通过肿瘤内注射来施用于受试者。在其它实施例中，体外扩增的PBT细胞通过注射在肿瘤周围的组织中来施用于受试者。
本文还公开了一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法涉及从受试者收集包含外周血单个核细胞(PBMC)的生物样品；从PBMC中分离单核细胞；在体外培养单核细胞以产生巨噬细胞；使巨噬细胞与SIRPα抑制剂接触以产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα细胞表面表达或活性降低的巨噬细胞群体(SIRPα低巨噬细胞)；使SIRPα低巨噬细胞与巨噬细胞活化剂接触以活化SIRPα低巨噬细胞；从受试者收集包含肿瘤活检的生物样品；从肿瘤活检中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞；将活化的SIRPα低巨噬细胞与来自肿瘤活检的肿瘤细胞在体外共培养(肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞)；将肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞与分离的TIL细胞在体外共培养以扩增肿瘤特异性T细胞的数目；以及向受试者施用治疗有效量的来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞。
在一些实施例中，来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者。在一些实施例中，来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之后进行肿瘤定向原位放射疗法。在一些实施例中，来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之后静脉内施用ICB。在一些实施例中，来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之后进行肿瘤定向原位放射疗法和静脉内施用ICB。在一些实施例中，来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之前进行肿瘤定向原位放射疗法。在一些实施例中，来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者，之前进行肿瘤定向原位放射疗法，并且之后静脉内施用ICB。
在一些实施例中，TIL细胞为肿瘤浸润T淋巴细胞。在一些实施例中，来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞通过静脉内施用来施用于受试者。在其它实施例中，来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞通过肿瘤内注射来施用于受试者。在其它实施例中，来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞通过注射在肿瘤周围的组织中来施用于受试者。
可以通过本文所述的方法治疗各种类型的癌症和其转移。例如，癌症可为肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、卡斯尔曼病(Castlemandisease)、宫颈癌、结肠/直肠(结直肠)癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道基质瘤(gist)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病(Hodgkin disease)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、喉癌和下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良综合征、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、未霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体肿瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、威尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)、黑色素瘤、腺瘤、实体组织癌瘤、低氧肿瘤、泌尿生殖器癌症、头颈癌、神经系统癌症、良性病变或其任何组合。
在一些实施例中，癌症是辐照疗法、化学疗法或免疫疗法(例如检查点阻断)中的一者或多者难治的。在一些实施例中，癌症为结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、转移性三阴性乳腺癌、肺癌或脑癌。
活化巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用的药剂可以是小分子、氨基酸、肽、核酸(例如，RNA或DNA)、蛋白质(例如，抗体)或其一者或多者的组合。药剂可以是天然存在的，来源于天然存在的药剂或合成的。在一些实施例中，药剂活化受试者中的PKC-Syk通路。举例来说，药剂可以是细胞因子(例如，IL-17、IL-1β、IFNγ、IL-6或其生物活性变体)。药剂还可以是脂多糖(LPS)或其生物活性变体。在一些实施例中，药剂可以是IL-1、TNFα、PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)或其生物活性变体。在某些实施例中，所公开的方法可以包括鉴定活化巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用的药剂的步骤。
在药剂为核酸的情况下，其可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，或者可以是含有一个或多个并且至多所有人工核酸类似物的DNA或RNA序列。包含DNA序列的药剂可以包括多个核碱基，包括胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶，以及其它天然或合成核碱基或其组合。核碱基还可包括C、G、A或T的衍生物或合成核碱基。在某些实施例中，DNA序列可以呈一种或多种构象，包括A-DNA、B-DNA和Z-DNA。DNA序列也可以是线性或支化的。在某些实施例中，DNA序列可以是单链、双链或多链的。
在一些实施例中，RNA可以是信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移信使RNA(tmRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、CRISPR RNA、反义RNA、前mRNA或小核RNA(snRNA)。RNA还可以包括多个核碱基，包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶、其它天然核碱基或其组合。在某些实施例中，核碱基可包括A、C、G、U的衍生物或合成核碱基。RNA也可以是线性或支化的。在某些实施例中，RNA可以是单链、双链或多链的。
在一些实施例中，人工核酸类似物可包括主链类似物(例如，抗水解RNA类似物、RNA世界前体(例如，TNA、GNA、PNA))或碱基类似物(例如，核碱基结构类似物、荧光团、荧光碱基类似物、天然非经典碱基、碱基对、金属碱基对)。
在一些实施例中，蛋白质可以是抗体，包括但不限于IgG类别的抗体、单克隆抗体、抗体片段、单链抗体或单链可变片段。抗体可以是天然存在的或非天然存在的。
在一些实施例中，CD47、SIRPα或它们之间的相互作用可抑制一种或多种受体或使其失活。因此，通过抑制SIRPα的表达或活性或遏制CD47与SIRPα之间的相互作用，药剂可以活化一种或多种受体。在某些实施例中，一种或多种受体还可以通过巨噬细胞活化剂活化。因此，通过抑制SIRPα的表达或活性或遏制CD47与SIRPα之间的相互作用，药剂可增强一种或多种受体的活性。
所公开的巨噬细胞和/或免疫检查点抑制剂(“药剂”)可以口服或肠胃外施用。在肠胃外施用的情况下，药剂可以静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、胸膜内、支气管内、经阴道、局部、经由耳、眼或鼻、舌下、鞘内、经直肠施用或施用于脑脊髓液中。
在各种实施例中，组合物可以呈丸剂、胶囊、颗粒、片剂、制粒(pallet)、悬浮液、注射剂、输注、栓剂、持续递送系统、糖浆、酊剂、软膏、乳膏、滴眼剂、滴耳剂、冲洗液、灌洗液、缓慢吸收储槽、敷料、口含片或任何药学上可接受的应用的形式或呈营养补充剂的形式配制。
如本文所公开的药剂可以用常规载体和赋形剂配制，所述载体和赋形剂可以根据通常做法来选择。片剂通常可含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性调配物可以呈无菌形式制备，并且当打算通过除口服施用以外的方式递送时，通常可以是等张的。制剂可含有赋形剂(例如，以下中阐述的赋形剂：《药物赋形剂手册(the Handbook ofPharmaceutical Excipients)》,第5版；Rowe,Sheskey,和Owen编；American PharmacistsAssociation；Pharmaceutical Press:Washington,DC,2006)。赋形剂可包括抗坏血酸或其它抗氧化剂、螯合剂(如EDTA)、碳水化合物(如糊精)、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸等。
当用于口服使用时，可以制备片剂、糖锭、口含片、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。打算用于口服使用的组合物可根据所属领域中已知用于制造药物组合物的任何方法制备，并且这类组合物可含有一种或多种包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂在内的试剂，以便提供适口的制剂。
当用于注射时，药物组合物可以呈无菌可注射制剂形式(例如，无菌可注射水性或油性悬浮液)。悬浮液可以根据所属领域中已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液(例如，在1,3-丁二醇中的溶液或制备为冻干粉剂)。可以采用的可接受的媒剂和溶剂是水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油可常规地用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油(例如，合成单酸甘油酯或二酸甘油酯)。脂肪酸(例如，油酸)可也可以用来制备可注射剂。
制剂可以呈单位剂量或多剂量容器(例如，密封安瓿和小瓶)呈现，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在即将使用时添加用于注射的无菌液体载体(例如，水)。可以由先前所描述的种类的无菌粉剂、颗粒和片剂制备即用型注射溶液和悬浮液。优选的单位剂量制剂可以是含有活性成分的日剂量或单位日亚剂量(如上文所叙述)或其适当分数的单位剂量制剂。
必要时，本发明所公开的主题的化合物可以与一种或多种惰性或非活性成分一起施加。如本文所公开的第一药剂和/或第二药剂可以通过适于要治疗的病状的任何途径施用。合适的途径可包括口服、经直肠、经鼻、局部(包括经颊和舌下)、经阴道和肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等。
在一些实施例中，所公开的SIRPα抑制剂、巨噬细胞活化剂和放射还可以与其它活性成分组合使用。基于要治疗的病状、成分的交叉反应性和组合的药理特性选择这类组合。药剂也可以与一种或多种其它活性成分组合成一体式剂型以向患者同时或依次施用。组合疗法可以作为同时或依次方案施用。当依次施用时，组合可以两次或更多次施用形式施用。
一般来说，在交替疗法期间，可依次(即，连续)施用每种活性成分的有效剂量，而在组合疗法中，可一起施用两种或更多种活性成分的有效剂量。组合疗法可以提供“协同作用”或“协同效应”(即，一起使用的活性成分所实现的作用大于由单独使用化合物产生的作用的总和)。在某些实施例中，当活性成分：(1)以组合制剂共同配制并且同时施用或递送；(2)作为单独制剂交替或平行递送；或(3)通过一些其它方案递送时，可获得协同效应。在交替疗法中，当依次施用或递送化合物(例如在单独的片剂、丸剂或胶囊中或通过在单独的注射器中不同注射)时，也可以获得协同效应。
本公开的方面
方面1.一种用于产生活化的SIRPα低巨噬细胞的方法，其包含
(a)从生物样品中的外周血单个核细胞(PBMC)中分离单核细胞；
(b)在体外分化所述单核细胞以产生巨噬细胞；以及
(c)使所述巨噬细胞与SIRPα抑制剂接触；以及
(d)使所述巨噬细胞与巨噬细胞活化剂接触，
由此产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα的细胞表面表达显著降低(SIRPα低)的巨噬细胞群体，
其中所述SIRPα低巨噬细胞具有活化的对癌细胞的吞噬作用、增加的促炎性反应和增加的免疫原性抗原呈递。
方面2.方面1的方法，其中所述SIRPα抑制剂遏制SIRPα的表达，降低细胞表面上SIRPα的丰度，抑制SIRPα的活性，破坏SIRPα与CD47之间的相互作用，或其组合。
方面3.方面1或2的方法，其中所述SIRPα抑制剂包含细胞因子、TLR配体、糖皮质激素或其组合。
方面4.方面3的方法，其中所述SIRPα抑制剂选自由以下组成的群组：IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18、LPS、CpG、聚I:C、LTA、PGN、鞭毛蛋白、Pam3CSK4、酵母聚糖和HMGB1。
方面5.方面1至4中任一项的方法，其中所述巨噬细胞活化剂包含细胞因子、佛波醇酯、TLR配体或其组合。
方面6.方面5的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的群组：IFNα、IFNβ、IL-6、IL-1、IL-17、IL-18、TNFα和IL-12。
方面7.方面5或6的方法，其中所述佛波醇酯包含佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)。
方面8.方面5至7中任一项的方法，其中所述TLR配体选自由以下组成的群组：LPS、CpG、聚I:C、LTA、PGN、鞭毛蛋白、Pam3CSK4、酵母聚糖和HMGB1。
方面9.方面8至11中任一项的方法，其中所述糖皮质激素包含甲基泼尼松龙或地塞米松。
方面10.方面1至10中任一项的方法，其中所述SIRPα抑制剂和所述巨噬细胞活化剂为依次施用。
方面11.方面1至10中任一项的方法，其中所述SIRPα抑制剂和所述巨噬细胞活化剂为同时或并行施用。
方面12.方面1至10中任一项的方法，其中所述SIRPα抑制剂和所述巨噬细胞活化剂存在于同一组合物中。
方面13.方面12的方法，其中所述组合物包含重组人干扰素-γ(IFNγ)、重组人干扰素-αA2(IFNα)、CpG寡脱氧核苷酸和聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。
方面14.方面1至13中任一项的方法，其中所述SIRPα抑制剂包含SHP-1抑制剂。
方面15.方面14的方法，其中所述SHP-1抑制剂选自由以下组成的群组：TPI-1(2-(2,5-二氯苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a1(2-(2,5-二氯苯基)-2,4-苯醌)、TPI-1a2(2-(3-氯苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a3(2-苯基萘醌)、TPI-1a4(2-(4-乙氧基苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a5(2-(4-甲氧基苯基)-1,4-苯醌)、SSG(葡萄糖酸锑钠)、PTP抑制剂I(2-溴-1-(4-羟苯基)-乙酮)、PTP抑制剂II(2-溴-1-(4-甲氧基苯基)-乙酮)、PTP抑制剂III(2-[4-(2-溴乙酰基)苯氧基]-乙酸)、PTP抑制剂IV(N,N'-[1,4-亚苯基双[(1-甲基亚乙基)-4,1-亚苯基]]双[1,1,1-三氟-甲磺酰胺)、NSC 23922(3-氨基胆甾烷)和NSC 87877(8-羟基-7-[2-(6-磺酸基-2-萘基)二氮烯基]-5-喹啉磺酸)。
方面16.方面1至13中任一项的方法，其还包含使所述巨噬细胞与SHP-1抑制剂接触。
方面17.方面16的方法，其中所述SHP-1抑制剂是不可逆SHP-1抑制剂。
方面18.一种组合物，其包含通过方面1至12中任一项的方法产生的活化的SIRPα低巨噬细胞。
方面19.一种用于产生体外扩增的肿瘤特异性外周血T(PBT)细胞的方法，其包含：
(a)从生物样品中分离外周血T(PBT)细胞；
(b)在体外将通过根据权利要求1所述的方法产生的活化的SIRPα低巨噬细胞与来自肿瘤活检的细胞共培养，以产生肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞；
(c)在体外将所述肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞与分离的PBT细胞共培养以扩增肿瘤特异性T细胞的数目，由此产生体外扩增的肿瘤特异性PBT细胞。
方面20.一种组合物，其包含通过方面19的方法产生的体外扩增的肿瘤特异性PBT细胞。
方面21.一种用于产生体外扩增的肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)的方法，其包含：
(a)从肿瘤活检中分离肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)细胞；
(b)在体外将通过根据权利要求1所述的方法产生的活化的SIRPα低巨噬细胞与来自所述肿瘤活检的肿瘤细胞共培养，以产生肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞；
(c)在体外将所述肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞与分离的TIL细胞共培养以扩增肿瘤特异性T细胞的数目，由此从TIL产生体外扩增的肿瘤特异性T细胞。
方面22.一种组合物，其包含通过方面21的方法产生的来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞。
方面23.一种用于治疗受试者的肿瘤的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的方面18所述的活化的巨噬细胞、方面20的体外扩增的肿瘤特异性PBT细胞、方面22所述的来自TIL细胞的体外肿瘤特异性T细胞或其任何组合。
方面24.23 18的方法，其还包含用肿瘤定向辐照治疗所述受试者。
方面25.方面23或24的方法，其还包含向所述受试者施用治疗有效量的免疫检查点抑制剂。
方面26.方面25的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包含抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA4抗体或其组合。
方面27.方面23至26中任一项的方法，其中所述受试者是PD-1阻断难治的。
方面28.方面23至27中任一项的方法，其还包含用溶瘤病毒治疗所述受试者。
方面29.方面23的方法，其中所述溶瘤病毒是水泡性口炎病毒。
方面30.一种组合物，其包含重组人干扰素-γ(IFNγ)、重组人干扰素-αA2(IFNα)、CpG寡脱氧核苷酸和聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。
方面31.方面30的组合物，其中所述IFNγ以40-200ng/ml的浓度存在。
方面32.方面30或31的组合物，其中所述IFNα以40-200ng/ml的浓度存在。
方面33.方面25至27中任一项的组合物，其中所述CpG寡脱氧核苷酸以1-5μg/ml的浓度存在。
方面34.方面30至33中任一项的组合物，其中所述聚I:C以1-5μg/ml的浓度存在。
方面35.一种组合物，其包含活化的SIRPα低巨噬细胞，所述活化的SIRPα低巨噬细胞通过包含使来自受试者的巨噬细胞与有效量的方面30至34中任一项的组合物接触的方法产生。
方面36.方面35的方法，其中所述巨噬细胞是骨髓源性巨噬细胞或单核细胞源性巨噬细胞。
方面37.一种用于治疗受试者的肿瘤的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的含有SH-结构域的酪氨酸磷酸酶-1(SHP-1)抑制剂和治疗有效量的放射疗法、免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒或其组合。
方面38.权利要求37的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包含抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA4抗体或其组合。
方面39.权利要求37的方法，其中所述SHP-1抑制剂选自由以下组成的群组：TPI-1(2-(2,5-二氯苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a1(2-(2,5-二氯苯基)-2,4-苯醌)、TPI-1a2(2-(3-氯苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a3(2-苯基萘醌)、TPI-1a4(2-(4-乙氧基苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a5(2-(4-甲氧基苯基)-1,4-苯醌)、SSG(葡萄糖酸锑钠)、PTP抑制剂I(2-溴-1-(4-羟苯基)-乙酮)、PTP抑制剂II(2-溴-1-(4-甲氧基苯基)-乙酮)、PTP抑制剂III(2-[4-(2-溴乙酰基)苯氧基]-乙酸)、PTP抑制剂IV(N,N'-[1,4-亚苯基双[(1-甲基亚乙基)-4,1-亚苯基]]双[1,1,1-三氟-甲磺酰胺)、NSC23922(3-氨基胆甾烷)和NSC 87877(8-羟基-7-[2-(6-磺酸基-2-萘基)二氮烯基]-5-喹啉磺酸)。
已经描述了本发明的许多实施例。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其它实施例在以下权利要求书的范围内。
实例
实例1：
免疫检查点阻断(ICB)因其在数种类型的癌症中的优越功效而备受称赞(Wei,S.C.等人,《癌症发现(Cancer Discov.)》,2018.8(9):1069-1086)。不幸的是，许多癌症患者未能对ICB作出反应或变得ICB难以治愈，这已经归因于肿瘤和肿瘤微环境(TME)协调机制颠覆了T细胞免疫性(Jenkins,R.W.等人,《英国癌症杂志(British Journal OfCancer)》,2018.118:9)。具体地说，结直肠癌(CRC)和胰腺癌，尤其是胰腺导管腺癌(PDA)因表现出对ICB有限的差的反应(对于CRC，<11％，对于PDA，<4％)而众所周知(Brahmer,J.R.等人,《新英格兰医学杂志(N Engl J Med.)》,2012.366(26):2455-2465)。尽管CRC和PDA与高突变负荷相关并且因此应该是免疫原性的，但CRC和PDA都显示缺乏细胞毒性CD8 T细胞(Tc)，和TREG和骨髓源性抑制细胞(MDSC)高度密集的强免疫抑制TME，由此破坏了ICB的功效(Kabacaoglu,D.等人,《免疫学前沿(Frontiers in Immunology)》,2018.9(1878)；Emambux,S.等人,《生物疗法专家评论(Expert Opin Biol Ther)》,2018.18(5):561-573)。因此，迫切需要提高在耐ICB癌症(例如CRC和PDA)中的ICB功效的治疗创新。
抗PD-L1抗体(αPD-L1 Ab)在缺乏SIRPα的小鼠(Sirpα-/-)中的施用引起深远的抗肿瘤免疫性，实现了CRC和PDA的完全原位消除，具有稳健性，这是在野生型小鼠中观察不到并且很少在其它地方报告的。SIRPα是一种含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的信号传导受体，其典型功能是经由与自身标志物CD47的相互作用来抑制专职性吞噬细胞(例如巨噬细胞
Figure BDA0004010117540000471
树突状细胞(DC))吞噬自身细胞/肿瘤细胞(图1)(Veillette,A.等人,《免疫学趋势(Trends Immunol)》,2018.39(3):173-184)。尽管许多癌症通过增加CD47表达而利用这一机制(Willingham,S.B.等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》,2012.109(17):6662-7)，但仅CD47-SIRPα轴或SIRPα信号传导的耗尽不会引起吞噬作用-这种活性只有在同时通过活化机制，如通过TLR激动剂或促炎性细胞因子介导的活化机制(图1中所描绘)刺激吞噬细胞时才会发生(Bian,Z.等人,《美国国家科学院院刊》,2016.113(37):E5434-43)。实际上，Sirpα-/-小鼠在不存在针对同基因型的非免疫原性MC38(CRC)和Panc02和KPC(PDA)的ICB的情况下展示最小的免疫控制。所有这些肿瘤均耐受并且类似于野生型小鼠中，在皮下(s.c.)移植之后生长以形成可触摸的原发性肿瘤(图2和3)。然而，肿瘤移植的Sirpα-/-小鼠表现出比野生型小鼠高的基础数目的肿瘤浸润T细胞。鉴于发现吞噬细胞，尤其是
Figure BDA0004010117540000472
在这些肿瘤中是丰富的(Cassetta,L.等人,《自然综述：药物发现(NatureReviews Drug Discovery)》,2018.17:887)，存在以下问题：假定不存在SIRPα下，ICB是否将活化Sirpα-/-小鼠中的肿瘤相关的吞噬细胞以消除其肿瘤，ICB将进一步活化Tc以诱导细胞毒性细胞损伤、DAMP释放和局部增加促炎性细胞因子(例如IFN-γ、TNFα和IL-17)。
给与MC38肿瘤(皮下)的两剂αPD-L1(每剂50μg，BioXcell克隆10F.9G2)在Sirpα-/-小鼠中诱导稳固的抗肿瘤免疫反应(图2)，引起尺寸≤50mm3的肿瘤直接消除，或当肿瘤相对较大(>200mm3)时强力抑制生长。尽管增加αPD-L1的剂量数以消除Sirpα-/-小鼠中的较大肿瘤将可能产生类似的结果，但出于两个原因，IFN-γ加CpG连同αPD-L1一起使用：1)认为添加促炎性细胞因子/TLR激动剂将确保肿瘤相关的Sirpα-/-吞噬细胞的稳固活化；和2)聚焦于肿瘤内吞噬细胞和其活性的活化将证实Sirpα-/-吞噬细胞对肿瘤消除的影响程度，而不是耗竭T细胞的进一步复兴。实际上，将IFN-γ和CpG与αPD-L1组合增强免疫原性，并且引起Sirpα-/-小鼠中较大MC38肿瘤的完全消除(图2B)。在野生型小鼠中的相同αPD-L1处理仅在肿瘤较小时产生部分作用，或在肿瘤长大时，即使与CpG组合，也几乎没有有益的作用。(注意：为了节省试剂，经由肿瘤内(i.t.)注射给与αPD-L1 Ab来进行这些初步研究，而非腹膜内(i.p.))。
还针对Sirpα-/-小鼠中移植(皮下)的PDA肿瘤Panc02和KPC测试αPD-L1处理，并且再次观察到完全反应(图3)。在这些实验中，当给与两剂中的第一剂αPD-L1±IFNγ/CpG时，肿瘤为约100mm3，而第二剂3天后给与。在Sirpα-/-小鼠中，单独的αPD-L1强烈遏制Panc02和KPC肿瘤生长，并且在一些情况下足够完全缓解，而组合IFNγ/CpG则一致地完全消除这些肿瘤。然而，相同的处理在野生型小鼠中显示微不足道的作用，其中肿瘤继续生长且不久达到人道终点。因为临床试验已经评估肿瘤放射与检查点阻断的组合(Gong,J.等人,《癌症免疫疗法杂志(J Immunother Cancer)》,2018 6(1):46)，所以测试这种用于增强αPD-L1功效的方法。明显地，用8Gy(RT)的单个X射线分次处理Sirpα-/-小鼠，紧接着施用αPD-L1，引起尺寸甚至>250mm3的MC38、Panc02和KPC肿瘤的完全消除(图4)。形成鲜明对比的是，用两轮放射+αPD-L1处理的野生型小鼠仅实现肿瘤进展的轻微控制。这些肿瘤模型，尤其MC38肿瘤，在临床前免疫疗法和放射疗法中进行了广泛研究(Deng,L.等人,《临床研究杂志(J ClinInvest)》,2014.124(2):687-695；Vatner,R.E.等人,《放射肿瘤学研讨会(Semin RadiatOncol.)》,2015.25(1):18-27；Ahn,G.-O.等人,《美国国家科学院院刊》,2010.107(18):8363-8368)，部分归因于其具有非常低的免疫原性，由此有助于鉴定可能适用于临床环境中的那些难以治疗的癌症的干预。除了仅针对尺寸相对较小的肿瘤展示的功效(Goding,S.R.等人,《免疫学杂志(J Immunol.)》,2018.200(9):3304-3311；Smilowitz,H.M.等人,《癌症免疫与免疫疗法(Cancer Immunol Immunother.)》,2016.65(2):127-139；Filatenkov,A.等人,《临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》,2015.21(16):3727-3739；Twyman-Saint Victor,C.等人,《自然(Nature)》,2015.520(7547):373-7；Azad,A.等人,《欧洲分子生物学学会分子医学(EMBO Mol Med.)》,2017.9(2):167-180)，很少看到或在文献中发现Sirpα-/-小鼠中甚至大的MC38和PDA肿瘤的急剧肿瘤消退和缓解的这个幅度。
一项研究(Deng,L.等人,《临床研究杂志》,2014.124(2):687-695)用20Gy放射和四剂αPD-L1组合治疗约50mm3的小MC38肿瘤，诱导持久的肿瘤消退；然而，在治疗停止后的10天出现复发。而用12Gy放射和四剂αPD-L1治疗约100mm3的Panc02和KPC肿瘤的另一研究仅实现肿瘤生长延迟(Azad,A.等人,《欧洲分子生物学学会分子医学》,2017.9(2):167-180)。值得注意的是，用单独αPD-L1(小肿瘤，50mm3)或αPD-L1+IFNγ/CpG或8Gy放射(较大肿瘤，100-250mm3)处理的所有Sirpα-/-小鼠均存活(100％)并且保持无肿瘤，并证实已针对其癌症获得强力持久的适应性免疫。观察到两种直接作用：首先，这些小鼠对肿瘤再移植的多次尝试具有抗性(图5A)；其次，将血清或脾T细胞从肿瘤抗性Sirpα-/-小鼠过继转移到野生型小鼠可赋予野生型接受者肿瘤抗性(图5B、5C)。来自供体小鼠的血清样品的评估揭露了直接标记MC38细胞的IgG的存在(图5B)。
鉴于Tc对于PD-L1阻断介导抗癌作用是关键的(Wei,S.C.等人,《癌症发现(CancerDiscov.)》,2018.8(9):1069-1086)，在向野生型和Sirpα-/-小鼠施用αPD-L1之前和之后分析MC38肿瘤中的Tc浸润。如图6A中所示，在αPD-L1施用之后，与野生型小鼠相比，Sirpα-/-小鼠能够扩增肿瘤中大得多的数量的Tc；甚至在处理之前，Sirpα-/-肿瘤也显示较高的Tc基础水平(图6A)。这些事实因此解释了为何单独的αPD-L1在Sirpα-/-小鼠中产生的功效比其在野生型小鼠中的功效更好。用αPD-L1连同IFNγ/CpG或8Gy RT处理Sirpα-/-小鼠，进一步将肿瘤浸润Tc增加到大得多的数目，甚至达到总浸润白细胞(CD45+)的>50％。相比之下，野生型肿瘤中的Tc在两剂αPD L1±IFNγ/CpG或8Gy RT之后仅适度增加。
不仅Tc在Sirpα-/-肿瘤中大量快速增殖和浸润，而且其还表现出高水平的颗粒酶B(GranzB)表达，这表明了其稳固活化和有效细胞毒性，以及对肿瘤细胞的显著特异性(图6B)，后者通过与p15E-MHCI四聚物的反应性来评估。MuLV p15E是在MC38肿瘤细胞中特异性表达而在宿主动物中不存在的表位(Kershaw,M.H.等人,《癌症研究(Cancer Research)》,2001.61(21):7920-7924；Bronte,V.等人,《免疫学杂志》,2003.171(12):6396-6405；Kim,E.-K.等人,《癌症研究》,2014.74(22):6705-6716)；因此其代表了适用于评估Tc肿瘤特异性的一种肿瘤特异性抗原。在αPD-L1处理的Sirpα-/-肿瘤中30-40％ Tc为p15E反应性的，并且一旦组合IFNγ/CpG或RT，该数值进一步增加到>70％，这是惊人的。在这些p15E反应性Tc中，发现相当大的部分是CD44+CD62L-，这表明分化成效应记忆细胞(TEM)。还在αPD-L1-处理的Sirpα-/-小鼠的外周血中发现p15E反应性Tc和TEM。相反，在已经较小的总Tc群体中αPD-L1处理的野生型小鼠产生的p15E反应性Tc/TEM的数目显著较少，其大部分也是GranzB低的，表示较差的Tc活化和细胞毒性。离体细胞毒性分析(图6C)证实了这一事实，表明从经处理的Sirpα-/-肿瘤中分离的Tc对MC38具有强杀伤能力，而来自野生型肿瘤的那些Tc则表现出弱的活性。总的来说，这些发现暗示SIRPα表达不利地影响抗肿瘤Tc的量和质量两者，尤其是对αPD-L1的反应。
MC38 TME的另外的表征揭露了在αPD-L1处理，尤其与IFNγ/CpG或RT组合之后Sirpα-/-与野生型小鼠之间的其它差异。这些包括：1)与野生型小鼠相比，CD4 FoxP3+TREG在Sirpα-/-TME中以大得多的规模减少；2)在αPD-L1+RT处理之后，野生型小鼠中存在许多Ly6C高单核细胞/MDSC浸润肿瘤，但这在Sirpα-/-小鼠中没有发生。如图7A中所示，用αPD-L1+IFNγ/CpG或8Gy RT处理的Sirpα-/-肿瘤显示出FoxP3+TREG惊人的减少，从占总CD4 T辅助细胞(Th)群体>50％到占很少部分(<10％)。TREG的这一急剧降低表明经辐照的Sirpα-/-肿瘤已改变其免疫原性并且可能去除了许多免疫抑制障碍。然而，野生型小鼠仅适度减少TREG。
发现野生型小鼠中在用αPD-L1+RT处理肿瘤之后大量的Ly6C+单核细胞浸润肿瘤(图7C)，这表明了在放射/Tc介导的损伤之后野生型肿瘤产生强烈的伤口愈合信号传导，其募集单核细胞，充当MDSC(Bian,Z.等人,《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.)》,2018.48(3):532-542)，遏制Tc细胞毒性同时促进肿瘤生长(Gabrilovich,D.I.等人,《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res.)》,2017.5(1):3-8)。有趣的是，在Sirpα-/-小鼠中，在相同处理之后，这一重要的肿瘤支持机制明显不存在。再次，野生型与Sirpα-/-小鼠之间的这些差异是惊人的且将进一步研究。
考虑到Sirpα在骨髓吞噬细胞中表达，因此，这些数据表明肿瘤内Sirpα-/-吞噬细胞在赋予αPD-L1敏感性和对肿瘤免疫景观重新编程中起重要作用。SIRPα的缺乏使ITIMs-SHP1/2介导的抑制通路衰竭(Weiskopf,K.,《欧洲癌症杂志(Eur J Cancer)》,2017.76:100-109)，这是一种操控，有可能促进吞噬细胞以及整个TME朝向促发炎和抗原呈递。相比之下，由周围肿瘤细胞上增加的CD47触发的SIRPα信号传导强烈遏制这种活化。为了探究如果转移到野生型肿瘤中，Sirpα-/-吞噬细胞是否将产生类似的免疫原性变化并增强αPD-L1功效，将
Figure BDA0004010117540000517
(来源于骨髓，BMDM，5×105或2×106)用IFNγ/CpG离体处理(6到12小时)，以活化其吞噬能力并增强抗原呈递(Kranzer,K.等人,《免疫学(Immunology)》,2000.99(2):170-8)，且接着肿瘤内注射(输注)到野生型小鼠中的大的αPD-L1难治性MC38肿瘤(≥200mm3)中。在2小时之后，给出一剂αPD-L1。如图8A中所示，Sirpα-/-
Figure BDA0004010117540000518
输注显著逆转野生型小鼠对αPD-L1的抗性，并且在两剂该组合下，完全消除MC38肿瘤。再次，该有效抗癌作用与肿瘤特异性Tc扩增相关(图8B)。这些结果支持以下假定：Sirpα-/-吞噬细胞构成对ICB的敏化的一部分，并且还揭露了使用Sirpα-/-吞噬细胞作为逆转ICB难治性病状的治疗模态的前景，尤其是目前无法治愈的低免疫原性的癌症中存在的那些。
有趣的是，单独的活化的
Figure BDA0004010117540000511
(2-5×106)转移到野生型肿瘤中也诱导显著Tc扩增和肿瘤消退(图8C)，这表明这些
Figure BDA0004010117540000512
在对癌细胞/抗原的吞噬作用(预测功能)之后进行免疫原性抗原呈递。为了测试
Figure BDA0004010117540000513
是否具有增强的抗原呈递能力以及SIRPα信号传导是否会不利地调节其，检查IFNγ/CpG刺激后MHC-I和MHC-II和共刺激分子CD80和CD86的
Figure BDA0004010117540000514
表达。如图9中所示，虽然IFNγ/CpG在
Figure BDA0004010117540000515
上均诱导MHC-I/II和CD80/CD86表达，但WT
Figure BDA0004010117540000516
上的CD47(mCD47.ex)对SIRPα的连接强烈抑制它们表达。此外，CD47-SIRPα相互作用还显著抑制WT
Figure BDA0004010117540000521
产生免疫原性抗原呈递必需的炎性细胞因子，如IL-12、TNFα和IL-6，而SIRPα的耗尽增加了它们的释放。
这些研究产生的结果引人注目，揭露了由Sirpα-/-吞噬细胞介导的新的抗癌机制。发现指出吞噬细胞/APC在诱导抗癌免疫性中的重要作用，SIRPα充当关键“制动”/屏障，其决定对肿瘤细胞的固有吞噬作用、吞噬性APC抗原呈递、Tc活化和TME免疫抑制。明显地，耗尽SIRPα释放了吞噬细胞/APC活化Tc的完整能力，甚至重塑TME以促进免疫原性，共同使ICB能够消除癌症。实际上，输注的
Figure BDA0004010117540000522
Figure BDA0004010117540000523
与αPD-L1一起消除野生型小鼠中的不良免疫原性的MC38肿瘤的有效性是极为不寻常的。
实例2：
结果
病灶RT实现Sirpα-/-小鼠中针对不良免疫原性肿瘤的治愈性反应
在野生型和Sirpα-/-小鼠中，皮下移植的MC38或PDA(Pan02或KPC)类似地生长。一旦肿瘤良好地建立(>150mm3)，则给与单个或多个分次的X射线放射以治疗肿瘤。如所示(图14A-14D)，这些RT方案，甚至是高剂量低分次RT与PD-1阻断(2×[8Gy+αPD-L1]；图14C)也无法控制野生型小鼠中的肿瘤负荷，其中肿瘤快速进展超出人道终点。这些结果与他人的研究一致，表明这些低免疫原性肿瘤高度耐受可用疗法。然而，X射线放射的单个分次(1×4、8或20Gy)赋予Sirpα-/-小鼠的完全反应，诱导MC38、Pan02或KPC肿瘤的所有迹线的消除，不仅是小肿瘤(<200mm3)，相当大的肿瘤(>300mm3)也如此。在大多数情况下，在辐照(IR)之后Sirpα-/-小鼠中肿瘤生长立即停止，接着持久消退并在几天(5-12天)内完全清除。即使对于MC38肿瘤>600mm3，多分次方案(8Gy-4Gy或8Gy-4Gy-4Gy；3天时间间隔)实现Sirpα-/-小鼠中完全消除，而利用αPD-L1的相同策略仅略微有利于野生型小鼠(图14E)。
所有用4Gy或8Gy处理的移植肿瘤的Sirpα-/-小鼠均存活(100％)，没有明显不良作用，并且在研究其余时间保持无肿瘤(>1.5y)(图14)。接受20Gy的Sirpα-/-小鼠尽管显示肿瘤快速消退，但出现类似于全身性炎症反应综合征(SIRS)的严重不良反应，大量释放促炎性细胞因子且引起33％死亡率，不过存活(67％)的小鼠恢复且保持无肿瘤(>1.5y)。不仅用20Gy处理的那些小鼠，所有辐照的Sirpα-/-小鼠在其血清中均显示升高水平的TNFα、IL-6、IL-12和IL-2(14F)，而RT之后的野生型小鼠未展示类似的细胞因子增加。这些差异再次指示Sirpα-/-小鼠对RT的卓越反应性，产生显著增强的促炎性抗肿瘤反应。
经辐照的Sirpα-/-小鼠中的远位作用和持久免疫性
进一步的研究揭露了根除肿瘤的Sirpα-/-小鼠获得稳固持久的抗肿瘤细胞和体液免疫性。观察到两种直接作用：首先，经RT处理的Sirpα-/-小鼠证实有效的远位肿瘤遏制；其次，根除肿瘤的Sirpα-/-小鼠抵抗复发(图15D-15F)。
在极少数情况下，RT驱动足够稳固的内源性免疫反应以控制辐照区域外部的肿瘤负荷，即，远位作用。为了评估原发性病变的辐照是否可以诱导对未辐照肿瘤的控制，小鼠在两侧胁腹(一些也在背侧区中)移植MC38或PDA，并且当原发性肿瘤(右侧胁腹)达到>150mm3时，给出一个分次的8Gy。如(图15A-15C)所示，在Sirpα-/-小鼠中，RT处理不仅消除原发性肿瘤，而且还极大地阻碍其它区域中未辐照肿瘤的生长或诱导其消退。在子集实验中，将远位KPC肿瘤原位移植到上腹膜/肝脏区域，也显示与RT引起的原发性肿瘤消除一起消退(图15D)。尽管在Sirpα-/-小鼠中远位反应是明显的，但远位肿瘤的消退通常比辐照肿瘤的消退慢或不完全。鉴于远位反应很大程度上取决于细胞毒性CD8 T细胞(Tc)介导的破坏肿瘤的作用，施用抗PD-L1以增强Tc功能，且该方案显著加快远位肿瘤消除，在几天内实现完全清除(图15B-15D)。相比之下，所有实验中的野生型小鼠均没有表现出远位反应(图5)。
在肿瘤消除之后，Sirpα-/-小鼠中的有效抗肿瘤免疫记忆明显。尽管用三轮接种物递增的MC38或Pan02再移植进行攻击，但每种尝试均未能在先前消除同一肿瘤的Sirpα-/-小鼠中建立肿瘤(图15E-15F)。来自这些抗肿瘤小鼠的血清样品揭露了直接标记肿瘤细胞(图15G)并通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和Fc介导的吞噬作用介导肿瘤细胞杀伤(图15H)的抗肿瘤免疫球蛋白(多克隆IgG)。脾T细胞从相同的抗肿瘤Sirpα-/-小鼠过继转移到野生型小鼠也赋予后者以免疫保护，在尝试移植之后预防接受者中形成肿瘤(图15I)。
肿瘤内Sirpα-/-巨噬细胞决定对局部辐照的完全反应
为了确定肿瘤内Sirpα-/-巨噬细胞是否支撑RT在Sirpα-/-小鼠中的功效，在这些小鼠中通过CI2MDA-脂质体或针对CSF受体的抗体(aCSF1R)耗尽肿瘤内巨噬细胞，并且发现任一种策略均消除RT的功效(图16A-16B)。此外，在野生型小鼠中，将骨髓源性Sirpα-/-巨噬细胞(Sirpα-/-BMDM)输注到MC38或PDA肿瘤中并测试RT反应(图16C)。对于这些实验，将Sirpα-/-BMDM直接注射到肿瘤(肿瘤内多点方式)中或静脉内(i.v.)施用，后一种方法是基于以下事实：单独Sirpα缺乏不驱动巨噬细胞吞噬自身细胞。两种方法在野生型小鼠中均实现肿瘤内Sirpα-/-巨噬细胞输注，而两种施用途径都没有引起不良反应，如贫血。具体地说，静脉内施用(200μl PBS中1-2×107)后的药物动力学分析发现，大部分Sirpα-/-BMDM在12小时内溢出，大约20％-30％浸润肿瘤组织，这是一种显示与肿瘤表达的单核细胞/巨噬细胞化学引诱物CCL2相关的现象。
肿瘤内Sirpα-/-巨噬细胞输注在接受野生型小鼠中依赖于剂量且从根本上增强RT的功效(图16D-16F)。两轮8Gy辐照+Sirpα-/-BMDM施用(输注的Sirpα-/-BMDM的数目与内源性肿瘤内野生型(Sirpα+)巨噬细胞(约1×104/mm3肿瘤块，图16E，插图)相当)引起MC38、Pan02和KPC肿瘤(均>200mm3)的快速消退和完全消除，使得处理的野生型小鼠100％存活(图16D-16F)。这些实验还显示，在IR之前1-3小时或IR之后立即施用的Sirpα-/-BMDM具有类似的抗肿瘤功效。这些结果一起证实了Sirpα-/-巨噬细胞决定对RT的肿瘤反应。Sirpα-/-巨噬细胞的肿瘤内输注在另外的RT难治性野生型小鼠中实现类似的消除肿瘤的功效的事实让人相信，未来的RT治疗方案与工程化的缺乏SIRPα的巨噬细胞组合可提高功效和远位作用。
CD47阻断未再现RT中的Sirpα缺乏
CD47阻断可能无法再现RT之后由Sirpα-/-巨噬细胞赋予的引人注目的抗肿瘤功效，尽管两种模态都破坏CD47-SIRPα轴。两种CD47阻断试剂，即拮抗CD47抗体(αCD47；miap301)和可溶性鼠SIRPα胞外结构域(mSIRPα.ex)与兔Fc融合蛋白，与RT组合用于处理野生型小鼠中的MC38和PDA肿瘤(均>200mm3)。为了评估它们的影响，根据Sirpα-/-BMDM输注的给药时程，在IR之前或之后立即施用这些试剂。如(图16G-16I)所示，即使是在高剂量下αCD47和mSIRPα.ex均未能像Sirpα-/-BMDM一样有效，因为IR与这些CD47阻断剂组合仅略微延迟肿瘤进展。IR和αCD47还进一步与针对MC38或PDA肿瘤的高滴度抗血清组合，该抗血清是从肿瘤消除的Sirpα-/-小鼠在三轮再移植攻击之后获得的(图2)。尽管基本上延迟肿瘤进展，但作用主要归因于与RT组合的抗血清(图16I)，该三重组合方案同样不能诱导完全反应。还应注意，单独的CD47阻断试剂和抗肿瘤血清或其组合在缺乏IR的情况下均无法抑制肿瘤生长。这些结果表明，仅阻断CD47结合并不完全使Sirpα信号传导停止，即使其只具有部分活性，也能显著妨碍RT诱导的抗肿瘤反应。
辐照活化的Sirpα-/-巨噬细胞重塑肿瘤微环境
在8Gy处理之后在有和没有Sirpα-/-巨噬细胞下对肿瘤微环境(TME)的分析揭露根本免疫景观的变化与对IR的不同反应相关。如所示(图17A-17C)，与不具有Sirpα-/-巨噬细胞的肿瘤(野生型小鼠)相比，在IR之后，在Sirpα-/-小鼠中或在输注Sirpα-/-巨噬细胞的荷瘤野生型接受者中包含Sirpα-/-巨噬细胞的MC38和PDA肿瘤被更大数目的白细胞(CD45+)迅速浸润。到IR后第6天，Sirpα-/-TME中的浸润白细胞(其中大部分是淋巴细胞)数量通常超过肿瘤细胞，肿瘤细胞随着肿瘤体积迅速收缩而减少。有趣的是，尽管在IR之前Sirpα-/-小鼠中的总肿瘤白细胞>35％为Sirpα-/-巨噬细胞，但该群体在IR之后在可检测的肿瘤消退之前迅速减弱(图17B和17D)。类似地，在IR后的一天中，在野生型接受者中肿瘤内输注的Sirpα-/-巨噬细胞不可检测(图17E)，而同一肿瘤中的内源性野生型(Sirpα+)巨噬细胞的数目未减少。然而，当改为输注Sirpα+巨噬细胞时，或如果撤销IR，则肿瘤内巨噬细胞群体未降低。在IR之后24小时窗口期间的进一步时程分析揭露了到IR后12小时，肿瘤内Sirpα-/-巨噬细胞群体均保持不变，但之后迅速减少(图17D)。鉴于Sirpα-/-巨噬细胞在RT诱导的肿瘤消除中的必不可少的作用(图3)，这些发现出人意料，并且还表明除活化的Sirpα-/-巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用外的机制是持久肿瘤消退的基础。
尽管Sirpα-/-巨噬细胞消失，但其对IR诱导的肿瘤损伤的初始反应驱动一系列事件，这些事件以TME的免疫原性再极化和最终肿瘤消除结束。如(图17F-17G)所示，在IR之后不久(<12小时)，Sirpα-/-小鼠和荷瘤野生型接受者中的肿瘤内Sirpα-/-巨噬细胞都显现出稳固的促炎特征和免疫原性抗原呈递机制，具有增加的细胞表面MHC-I、MHC-II、CD80、CD86和OX40L以及IL-12和IFNα的表达。通过Nanostring转录分析对块状MC38、Pan02和KPC肿瘤的炎性特征进行剖析(图17H-17I)，揭露了在IR之后TME类似的显著改变，其中促炎性细胞因子(IFNα/β/γ、IL-1α/β、IL-12、IL-18和IL-33)、免疫原性抗原呈递共刺激分子(CD80、CD86、OX40L、IcosL、GITRL和CD40)、T细胞和嗜中性粒细胞趋化因子(CXCL1/2、CXCL8等)和肿瘤抗性不可或缺的其它值得注意的分子(CX3CR1、CCR7、IRF3、IRF7等)的转录广泛增加。同时，如TGFβ1/2/3的免疫抑制细胞因子基本上下调，表示辐照的Sirpα-/-TME表型朝向促炎和远离创伤愈合转移。相比之下，无Sirpα-/-巨噬细胞输注下的野生型小鼠中的辐照肿瘤仅显示弱的促炎性转录，但TGFβ的诱导突出，且其相关Sirpα+巨噬细胞显现出免疫原性抗原呈递能力有限但IL-10的表达增加，一起暗示递增免疫抑制性的TME。这些研究还揭露了Sirpα-/-或野生型小鼠中的未辐照MC38、Pan02和KPC肿瘤的转录谱之间的微小差异(图17H)。
SIRPα缺乏稳固地诱导肿瘤特异性细胞毒性CD8 T细胞
在包含Sirpα-/-巨噬细胞的肿瘤环境与不含Sirpα-/-巨噬细胞的肿瘤环境之间的诸多显著差异中，肿瘤浸润CD8 T细胞(Tc)群体在前者中显著更大。如(图18A)所示，Sirpα-/-小鼠中MC38或PDA肿瘤的辐照引起肿瘤内Tc的迅速扩增，在IR后内24小时内Tc占总肿瘤浸润白细胞的几乎40％，并且在第3天-第6天进一步增加到50％-70％。Sirpα-/-TME中的这些大量Tc分布在整个肿瘤核心中并且沿着侵袭性边缘(图18B)，并且展现高细胞毒性和肿瘤特异性，分别由它们的高颗粒酶B(GranzB)表达和与MuLV p15E-H2Kb四聚体的反应性指示(图18C和18D)。MuLV p15E是在MC38、Pan02和KPC肿瘤细胞中表达的抗原，但宿主动物中缺乏。Sirpα-/-TME中大约30％-50％的扩增的Tc是肿瘤特异性的，其中，相当大一部分是CD44+CD62L-，表明分化成效应记忆性T细胞(TEM)。肿瘤特异性(p15E+)Tc和TEM在Sirpα-/-小鼠中持续存在，并且在肿瘤根除之后的两周在外周血和脾中容易检测到(图18E)。在MC38肿瘤受到辐照的Sirpα-/-小鼠中还检测到增加的针对另一MC38特异性肿瘤抗原ADPGK的Tc。值得注意的是，野生型接受者中输注Sirpα-/-巨噬细胞的肿瘤的辐照类似地诱导了GranzB高p15E+Tc的稳固扩增(图18E)。形成鲜明对比的是，没有Sirpα-/-巨噬细胞的野生型小鼠在IR之后仅产生少量肿瘤内Tc群体，该群体基本上缺乏肿瘤特异性(p15E+)并且大部分是非细胞毒性的(GranzB低)。离体细胞毒性分析证实，从受到辐照的包含Sirpα-/-巨噬细胞的肿瘤中分离的Tc具有高度细胞毒性并且能够在低效应:目标细胞比率下迅速消除(<3小时)癌细胞(图18G)，而来自野生型小鼠的无IR或未输注Sirpα-/-巨噬细胞的肿瘤的Tc对肿瘤细胞无作用。显然，肿瘤特异性Tc的大量扩增对于IR诱导的持久肿瘤消退是至关重要的；肿瘤内Tc(αCD8)而不是Th细胞(αCD4)的耗尽减弱SIRPα-/-小鼠中RT的功效(图18H)。
活化的SIRPα-/-巨噬细胞阻止代偿性免疫抑制
进一步的分析揭露了其它突出的免疫特征，协同充实了包含Sirpα-/-巨噬细胞的经辐照的TME中的破坏肿瘤的活性。这些包括：1)CD4 FoxP3+TREG的减少和IFNγ+Th1的扩增；2)NK细胞显著增加；
3)促炎性PMN(多形核白细胞、嗜中性粒细胞)的显著浸润和Ly6C高单核细胞/MDSC的显著缺乏。图19A-19B)
尽管维持类似的肿瘤内CD4 T细胞(Th)总群体(图19B)，但Sirpα-/-小鼠中的肿瘤在IR之后表现出FoxP3+TREG的显著减少，从占总Th>50％到很少数量(<10％)；同时，IFNγ+Th1群体扩增(图19C-19D)。WT小鼠中没能出现这种Th表型变换(TREG→Th1)，这表明TME内发生了有利于肿瘤消除的免疫原性转变。此外，Sirpα-/-小鼠中的这些抗肿瘤TME显示NK细胞增加4倍，还具有高的GranzB表达(图19E)。
与显示IR引发的肿瘤损伤驱动特征在于募集单核细胞(其充当MDSC，遏制Tc免疫性并促进肿瘤恢复和生长)的强烈伤口愈合反应的报告一致，在野生型小鼠中所有辐照的MC38和PDA肿瘤在没有输注Sirpα-/-巨噬细胞下被强烈抑制Tc增殖的Ly6C高单核细胞高度浸润(图19F-19H)。明显地，Sirpα-/-小鼠中显然缺乏这一代偿性促肿瘤机制，而在IR之后减少肿瘤浸润单核细胞/MDSC。确切地说，这些Sirpα-/-小鼠显示特征性促炎性反应，伴有促炎性细胞因子的释放(参见Nanostring剖析和图14)和PMN(Ly6G高)的肿瘤浸润增加，这产生高水平的活性氧物种(ROS)，但对Tc增殖无抑制(图19H-19J)。Sirpα-/-小鼠中大约20％的辐照肿瘤被PMN广泛浸润，这种现象与快得多的肿瘤消退相关(图19K-19L)。趋化因子剖析证实了这些结果，显示Sirpα-/-小鼠的肿瘤在IR之后分泌高水平的吸引嗜中性粒细胞的CXCL8，而来自野生型小鼠的肿瘤高度产生吸引单核细胞的CCL2(参见图17G)。离体趋化性分析进一步证实了在IR之后分别针对Sirpα-/-和野生型肿瘤的不同嗜中性粒细胞和单核细胞趋化性。
吞噬性SIRPα-/-巨噬细胞原位活化肿瘤特异性Tc
在IR之后肿瘤内Sirpα-/-巨噬细胞上免疫原性抗原呈递机制(包括MHC I/II和共刺激分子)的高表达(图17)表明了这些巨噬细胞在肿瘤细胞的吞噬作用之后充当抗原呈递细胞(APC)，其通过呈递肿瘤抗原活化肿瘤特异性Tc。鉴于包含Sirpα-/-巨噬细胞的辐照肿瘤中Tc扩增的规模和动力学，假定该抗原呈递事件主要原位发生并引起组织驻留的肿瘤特异性记忆性T细胞(即，TEM和TRM)的回忆反应。
进行两个实验来测试这种假设。首先，离体培养无肿瘤引流淋巴结(TDLN)的肿瘤外植体，其是从Sirpα-/-小鼠紧接在IR(<30分钟)之后获得的(图20A)。尽管不存在TDLN，但这些经培养的肿瘤外植体表现出与体内类似的Tc扩增。将Sirpα-/-巨噬细胞输注到来自野生型小鼠的肿瘤外植体中也诱导肿瘤内Tc扩增。其次，建立体外巨噬细胞-TIL(肿瘤浸润T细胞)共培养物以确定Sirpα-/-巨噬细胞呈递肿瘤抗原和活化肿瘤特异性Tc的能力。在这些实验中(图20B中所描绘)，首先将Sirpα-/-BMDM与辐照的MC38或PDA肿瘤解离物(包含肿瘤细胞和ICD的碎片)一起温育，以用于肿瘤抗原的吞噬作用。在温育过夜(16-18小时)以用于抗原加工之后，那时Sirpα-/-BMDM显示促炎性特征和增加的免疫原性抗原呈递机制，接着将肿瘤抗原加载的Sirpα-/-BMDM与从相同类型的未辐照的肿瘤中分离的TIL共培养。如(图20C)所示，在共培养1小时内看到Sirpα-/-BMDM与Tc之间清晰的接合，其方式让人联想到APC抗原呈递。这些接合的Tc占总施加Tc的不到5％，表明大多数其它细胞可能是“旁观者”，保持远离或不粘附。在共培养1-3天之后，从细胞扩大(即，爆发)、稳固的Tc增殖和GranzB的表达中显而易见Tc的活化(图20D-20E)。有趣的是，Sirpα-/-APC在TIL群体内仅诱导Tc的增殖，但不诱导Th的增殖，这种现象反映了辐照的TME中在Sirpα-/-巨噬细胞下Tc的扩增。在IL-2存在下培养8-10天之后，从Sirpα-/-BMDM/APC-TIL共培养物中收获大量Tc，这些Tc是在超过10个增殖循环之后产生的(图20F-20G)。
肿瘤细胞杀伤分析证实了这些体外扩增的Tc的肿瘤特异性和有效细胞毒性，其在低效应:目标比率(1-3:1)下快速诱导MC38或PDA细胞死亡(图20H)。有趣的是，尽管其具有卓越的细胞毒性，但这些Tc中仅一部分(<5％)为p15E+，表明Tc群体是多克隆的并且大多数通过其它肿瘤相关抗原识别肿瘤细胞。进一步评估Tc在体内消除所建立的肿瘤的能力。在这些实验中，向负载相同肿瘤的野生型小鼠静脉内施用(5×106，2x，3天时间间隔)针对MC38或KPC的体外扩增的Tc(分别称为Tc-MC38和Tc-KPC)。在Tc输注之前，用全身辐照(WBI；5Gy)预调节小鼠子集，接着静脉内注射Tc以及IL-2(腹膜内，每天50,000IU，连续5天)。如(图20I-20J)所示，经过WBI调节的小鼠中的两轮Tc输注加IL-2引起大于400mm3的MC38和KPC肿瘤的完全清除和100％存活。没有WBI和IL-2的类似Tc输注实现显著延迟肿瘤进展的部分反应。为了比较，通过CD3和CD28的抗体结合扩增的Tc/TIL(非肿瘤特异性方法)的输注对于已建立的肿瘤或在体外与肿瘤细胞一起培养时基本上无效(图20H-20I)。
讨论
尽管野生型TME本身不能在IR之后稳固地活化Tc，但Sirpα-/-巨噬细胞的输注引起对IR的强力反应，引起荷瘤野生型接受者中的GranzB高p15E+Tc的迅速扩增(图18F)。
实例2：
概述
SIRPANT技术包含一种创新的方法，它将自体SIRPα低活化巨噬细胞(SIRPANT-M)工程化以驱动强大的抗癌先天性免疫和适应性免疫，从而消除癌症。从外周血单采获得的患者单核细胞(外周血单个核细胞[PBMC])用SIRPANT的专用试剂Phago-ActTM离体操控，以产生具有显著减少的信号调节蛋白α(SIRPα)表达(即，SIRPα低)和强化吞噬作用、促发炎和免疫原性抗原呈递的固有能力的巨噬细胞。在施用于肿瘤块中之后，SIRPANT-M发挥强力的抗癌活性，包括摄取肿瘤细胞，将肿瘤微环境(TME)重新编程到促炎性，由此减少免疫抑制，以及以免疫原性方式呈递肿瘤相关的新抗原以活化T细胞。因此，大量的肿瘤特异性多克隆细胞毒性T细胞被活化，用于消除肿瘤和远端癌转移，这种反应还产生预防癌症复发的持久细胞和体液免疫性。
随着它的发展，已经在淋巴瘤和各种实体瘤(包括结直肠腺癌、胰腺导管腺癌、黑色素瘤、肺癌和转移性乳腺癌)的鼠癌症模型中彻底地审查作为癌症治疗方法的SIRPANT-M。在这些所测试的癌症中，一些为晚期并且具有大肿瘤与多个远端病变(癌转移)，其抗拒免疫检查点抑制剂(ICI)、放射线疗法(RT)、CD47阻断、肿瘤疫苗和抗肿瘤抗体的组合疗法。然而，在所有情况下用SIRPANT-M处理这些肿瘤展现高有效性，引起肿瘤病变全身消除和高达100％的存活率。经处理的动物还表现出有效预防癌症复发的持久免疫记忆的标志。
除了在鼠癌症模型中完成的体内原理论证和功效研究以外，还使用人SIRPANT-M进行离体人类研究以评估其针对国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)-60人肿瘤细胞系组的吞噬作用和来自从病患样本获得的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的杀灭肿瘤的T细胞的活化。结果证实人SIRPANT-M能够通过吞噬作用和肿瘤特异性细胞毒性T细胞的有效诱导快速消除癌细胞。
SIRPANT的目标是将这些研究发现转化到临床测试中，作为治疗癌症的一种有效细胞免疫疗法。基于广泛的临床前研究来选择这种细胞疗法方法，这些研究证明SIRPANT-M的作用，尤其是治疗实体瘤的作用，是使用ICI、RT、化学疗法、CD47阻断试剂或其它治疗无法再现或甚至接近的。
研究总结
已经在淋巴瘤和各种实体瘤的鼠癌症模型中完成了体内原理论证和功效研究，所述实体瘤包括同基因型结直肠腺癌(MC38细胞系)、胰腺导管腺癌(KPC和Pan02细胞系)、路易斯肺癌(Lewis lung cancer，LLC)、黑色素瘤(B16细胞系)、乳腺癌4T1细胞系(原位移植)和转移性乳腺癌(小鼠乳腺肿瘤病毒-多瘤中部肿瘤抗原[MMTV-PyMT])。在所有情况下，SIRPANT-M处理，尤其当与局部肿瘤放射(TR)组合时，引起持久完全反应与远位作用，消除晚期原发性肿瘤与远端病变。所有经处理的小鼠在处理后均存活，没有明显的副作用，并实现了与圈养在相同设施中的健康小鼠相当的长期处理后存活率(>90％，>1年)。来自这些研究的数据总结在表1中。
已经离体进行人类研究以评估Phago-ActTM产生的人SIRPANT-M：a)针对人肿瘤细胞系和其它人癌细胞的整个NCI-60组的吞噬作用；b)产生炎性细胞因子，由此驱动促炎性反应的能力；以及c)免疫原性抗原呈递机制的表达和活化来自从患者样本获得的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的杀伤肿瘤的T细胞的能力。结果显示SIRPANT-M积极地吞噬健康和辐照癌细胞两者，针对调节PBMC源性巨噬细胞无法吞噬的细胞。这些研究还证实了人SIRPANT-M能够驱动强烈的促炎性反应和免疫原性抗原呈递，活化杀伤肿瘤的细胞毒性T细胞。由不同性别和人种/种族的6名健康志愿者制备的SIRPANT-M的进一步转录剖析证实有偏差的促炎性表达和加强的免疫原性抗原呈递机制。
综上所述，临床前体外和体内研究一起指出SIRPANT-M作为使先天性免疫和适应性免疫两者能够消除癌症的不定癌症类型免疫疗法的潜在高功效。
行动背景和机制
巨噬细胞是肿瘤微环境(TME)中最丰富的白细胞并且在免疫系统消除或耐受癌细胞的能力中起关键作用。调节巨噬细胞活性的一个关键机制由SIRPα介导的信号传导控制，其一方面经由SHP-1的活化执行以抑制：i)癌细胞的吞噬作用；ii)toll样受体(TLR)激动剂、干扰素(IFN)和其它促炎性细胞因子和癌症疗法诱导因子的促炎性活化；以及ⅲ)用于抗原呈递以诱导抗癌适应性免疫的免疫原性机制的表达。相反地，经由螯合细胞因子受体抑制SHP-2的SIRPα促进免疫抑制IL-4/13、IL-10和TGFβ诱导的信号转导，从而加强TME内的免疫抑制和对癌症的耐受性。这些机制的细节描述于以下章节中。
巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用的调节
CD47是自身细胞普遍存在的标志物和SIRPα的细胞配体。当癌细胞的CD47在细胞外结合巨噬细胞上的SIRPα时，癌细胞通过触发强烈的SIRPα介导的抑制而逃避吞噬消除。然而，尽管一些癌症表现出高CD47表达，但广泛代表不同癌症类型的更多的情况(>50％)较差地表达或不表达CD47(人类病理图谱：CD47)；但即使TME包含大量的巨噬细胞，这些癌症仍避免体内的免疫消除。实际上，仅耗尽CD47或同源SIRPα信号传导不会引起吞噬作用；实际上，需要另外的吞噬作用活化机制作用于巨噬细胞来引发其吞噬活性。这些研究最初在基因缺乏CD47(Cd47-/-)或SIRPα(Sirpα-/-)的小鼠中进行，这两种小鼠通常是健康的但当暴露于病毒感染或在发炎条件下时显现出侵袭性噬血现象诱发的贫血。类似地，使用Sirpα-/-巨噬细胞的离体研究发现，尽管缺乏SIRPα介导的抑制，但这些巨噬细胞仍静止，除非通过某些促炎性细胞因子或TLR激动剂处理，然后使其吞噬自身细胞和癌细胞。依此，发现包括IL-1家族(例如，IL-1β和IL-18)、IL-6、IL-17、TNFα和I型IFN(IFNα和IFNβ)，但没有IFNγ，以及所有TLR激动剂(LPS、CpG、LTA、聚I:C、鞭毛蛋白等)的炎性细胞因子活化巨噬细胞的吞噬作用，而免疫抑制细胞因子IL-10和TGFβ以及类固醇糖皮质激素通过抑制巨噬细胞的吞噬作用活化来抵制这些促炎因子。尽管详细的根本机制仍然不明确，但该过程可能涉及特定吞噬受体，其需要促炎性细胞因子/TLR诱导的信号传导来进行由内而外的活化，之后其在不存在CD47R-SIRPα抑制的情况下介导“通用”巨噬细胞吞噬作用到自身细胞/癌细胞(图21C)。这些研究共同表明巨噬细胞的吞噬作用由多层活化和抑制机制控制：最前线控制，其决定巨噬细胞保持静止还是活化用于吞噬作用；和后续控制，其经由CD47-SIRPα轴进行控制，决定吞噬目标。这些知识部分地解释了肿瘤相关巨噬细胞(TAM)为何一般不吞噬，即使是在CD47-低/阴性癌细胞周围。同时，这还让人理解了对单独的CD47(例如抗CD47抗体)的阻断为何不足以治疗癌症(图11B)。实际上，该治疗策略需要与活化吞噬作用的模态组合，该模态例如癌症特异性抗体(例如，用于B细胞淋巴瘤的利妥昔单抗)，其经由Fc受体活化吞噬作用，或化学疗法试剂(例如，用于骨髓发育不良综合症[MDS]或急性骨髓性白血病[AML]的氮杂胞苷)，其增加钙网蛋白的细胞表达，钙网蛋白又结合巨噬细胞表达的LRP1，从而触发吞噬作用。
实例3：SIRPα在TME免疫抑制中起作用
研究小鼠中的不同实体瘤，发现SIRPα通过加强TAM的免疫抑制表型来控制TME免疫原性。TAM、树突状细胞(DC)和骨髓源性抑制细胞(MDSC)上的SIRPα的表达随着肿瘤生长而逐渐增加(图22)，这一作用归因于SIRPα的动态性质和癌细胞和TME产生上调SIRPα表达的因子，例如IL-10、IL-4、TGFβ、IL-17等(参见图29)。巨噬细胞上的SIRPα表达深深影响其对促炎性和抗炎性刺激的反应并且因此决定其后续效应功能。将具有高水平SIRPα(SIRPα高-M)的巨噬细胞与无SIRPα的巨噬细胞(肿瘤内Sirpα-/--M和SIRPα低-M，后者又称为SIRPant-M)进行比较，显示SIRPα高-M优先采用高免疫抑制表型，该表型的特征是IL-10、TGFβ和精氨酸酶-1的表达升高，普遍抵抗促炎性活化和抗原呈递机制的表达减弱(图23)。甚至当暴露于强促炎性刺激(如特征性M1-表型处理LPS加IFNγ)时，SIRPα高-M仅诱导促炎性分子的弱表达，但高度表达IL-10，其量等于或超过其促炎性细胞因子产生的总和。这些显著结果表明，TME中的高SIRPα表达固有地自增强，其中免疫抑制TME上调SIRPα，然后进一步驱动TAM以加强肿瘤免疫抑制。此外，SIRPα强烈抑制促炎信号的能力暗示其在TAM抗性中的作用是响应于治疗性治疗而经历促炎性表型变换。实际上，高SIRPα表达促进免疫抑制(IL-10)并且驱动TAM活化朝向癌症疗法下的伤口愈合反应，以促进肿瘤恢复和进展。支持这一观点，发现LPS/IFNγ处理的SIRPα高-M具有增加的化学引诱物CCL2(其募集单核细胞/MDSC以驱动伤口愈合)的产生，但最少的CXCL1/2(其吸引促进肿瘤组织损伤的促炎性嗜中性粒细胞)分泌。
与SIRPα高-M形成对比，Phago-ActTM处理的SIRPα低巨噬细胞(又称为SIRPANT-M)对相同刺激起反应，展现相反的、主要促炎的极化和不良免疫抑制表型。类似于LPS/IFNγ处理的Sirpα-/--M，SIRPANT-M产生较高水平的IL-12、IL-1β、IL-6、TNFα和CXCL1/2，但不产生CCL2，并且展现包括MHC-I、MHC-II和共刺激分子CD80、CD86、OX40L、CD40等的抗原呈递机制的较高表达。(图23)。
SIRPα控制巨噬细胞极化信号转导
机理研究(图24)揭露了SIRPα经由其细胞质ITIM调节巨噬细胞的免疫表型和功能，SIRPα的ITIM在巨噬细胞受到刺激后经历酪氨酸磷酸化并且为SHP-1或SHP-2(调节下游信号传导事件的主要细胞酪氨酸磷酸酶)提供不同的对接位点。SIRPαITIM的磷酸化需要细胞因子、TLR激动剂或其它刺激诱导的酪氨酸激酶活性。在肿瘤内稳态下，TAM一直暴露于免疫抑制细胞因子(例如，IL-4/13、IL-10)，这些免疫抑制细胞因子活化布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，Btk)，Btk以引起SHP2而非SHP1的排他性对接的方式使SIRPαITIM发生磷酸化。免疫抑制细胞因子活化Btk以驱动SIRPα-SHP-2结合的这一连串事件阻止SHP-2抑制IL-4/13R或IL-10R，由此增强巨噬细胞中的免疫抑制信号转导(图24A)。作为该通路的另一结果，SIRPα表达在TAM中进一步增加，因此主要控制其表型。
在由癌症疗法、免疫调节治疗、细胞因子、TLR激动剂或其它刺激引起的促炎性条件下，诱导Src家族酪氨酸激酶(SFK)并且使SIRPαITIM磷酸化(图24B)。不同于Btk，SFK以引起SHP-1对接和活化的模式使ITIM磷酸化。通过使多个蛋白质脱磷酸，SHP-1减少IFNα/β/γ介导的JAK-STAT和PI3k-Akt通路，所述通路诱导抗原呈递机制和共刺激分子的表达(Kalbasi 2020)。同样地，SHP-1抑制促炎性细胞因子/TLR介导的MAPK和NFkB通路，所述通路活化吞噬作用、驱动促发炎和/或增大其它促炎信号，包括下调SIRPα表达的那些信号(参见图29)。在已建立的肿瘤中，SIRPα-SHP-1介导的促发炎的抑制以及SIRPα-SHP-2介导的免疫抑制的增强在癌症疗法期间基本上保持完整，因此极大地减弱了或几乎完全消除了大多数治疗模态的功效。举例来说，处理诱发的细胞损伤(DAMP)通过TAM中的TLR发信号，其高SIRPα表达(SIRPα高)使反应偏移到强烈的伤口愈合，放大IL-10、TGFβ和CCL2的产生，后者吸引MDSC抑制T细胞介导的抗癌免疫性。图24描绘了由SHP-2或SHP-1介导的二分SIRPα调节，其促进免疫抑制巨噬细胞表型(经由SHP-2)或抑制促炎性巨噬细胞活化和抗原呈递(经由SHP-1)。SIRPα调节不需要CD47连接(图24D)；然而，CD47连接确实诱导SIRPα的细胞质域发生结构变化，这促进激酶对SIRPαITIM的磷酸化，从而增强SHP-1/2对接和后续下游调节的强度。
基于对这些机制的理解预测，SIRPANT的策略是经由离体方法制造治疗性SIRPα低巨噬细胞SIRPANT-M，由此避免了会抑制Phago-ActTM的作用的免疫抑制TME和其中强劲的SIRPα介导的调节(参见图29)。先前的研究显示，尽管Phago-ActTM能够下调SIRPα和活化吞噬作用，但将Phago-ActTM或其它促炎性试剂注射到已建立的肿瘤中没有反应并且最低限度地减少TAM上的SIRPα表达或控制肿瘤。甚至多次注射Phago-ActTM与肿瘤定向放射组合也未能降低肿瘤负荷，仅适度地抑制肿瘤生长。这些结果在挑战难以治疗的癌症，如MC38结直肠癌和胰腺导管腺癌KPC和Pan02时尤其典型，所述癌症均包含高度免疫抑制TME且因此对例如肿瘤放射(RT)、抗PD-1/L1检查点阻断和其组合等疗法具有抗性。
耗尽SIRPα将TME重新编程并能够消除癌细胞
尽管单独SIRPα耗尽不会使巨噬细胞吞噬癌细胞，但将SIRPα耗尽与细胞因子/TLR激动剂介导的活化组合可使巨噬细胞变成强力的消除癌症的吞噬细胞(图25)。使用Sirpα-/-小鼠的研究发现这些小鼠尽管没有显现出阻止肿瘤形成的自然免疫，但常常表现出对免疫调节治疗性治疗的完全反应(CR)和全身性清除甚至晚期癌症与远端病变(癌转移)。已经在Sirpα-/-小鼠中测试了多种同基因型癌症，这些癌症包括黑色素瘤(B16)、淋巴瘤(EL4)、路易斯肺癌(LLC)、结直肠癌(MC38)、胰腺导管腺癌(Pan02、KPC)和DSS-AOM诱导的自发性结直肠癌。在所有情况下，用简单细胞因子+TLR激动剂方案(图26)或一分次的非消融性X射线RT(4-15Gy)处理Sirpα-/-小鼠中已建立的肿瘤可诱导显著的抗癌反应，引起大肿瘤以及未处理的远端病变(远位作用)迅速消退和最终消除(图27和28)。此外，这种强烈的抗癌反应赋予持久的抗癌免疫性，预防复发。值得注意的是，这些实体瘤，尤其是MC38、KPC、Pan02和LLC，是临床前研究中非常难以治疗的癌症，已显示建立的肿瘤>200mm3对包括免疫检查点抑制剂、RT和其它组合的另外有效的疗法具有抗性。在我们的实验中，施用高剂量的RT与抗PD-1组合未能控制野生型小鼠中的这些肿瘤。实际上，尚未在文献中看到或在其它地方发现免疫调节治疗针对Sirpα-/-小鼠中的这些肿瘤的有效程度。
在这些研究期间，发现肿瘤内Sirpα-/--M在肿瘤消除中起关键作用，因为这种群体的耗尽消除了所处理的Sirpα-/-小鼠中的治愈反应(图27C)。同时，Sirpα-/--M过继转移到野生型小鼠中的肿瘤中显著逆转其对疗法的抗性并且赋予肿瘤消退(图27D)。尽管肿瘤内Sirpα-/--M可预测抗癌反应，但发现引起肿瘤消除的治疗功效不仅仅归因于Sirpα-/--M对癌细胞的吞噬作用的增强，还归因于活化的Sirpα-/--M的结果，所述活化的Sirpα-/--M在吞噬作用之后获取癌症抗原，然后进行免疫原性抗原呈递，活化大量的破坏肿瘤的T细胞。TME中细胞毒性T细胞(CD8+)的扩增在肿瘤处理之后迅速发生(之后24小时)，并且与TME在CD8T细胞浸润方面从“极冷”转变到“极热”一致(图28A)。这些CD8 T细胞高度表达指示癌症特异性(p15E)、强力破坏肿瘤能力(颗粒酶B)和免疫记忆标志(CD44+CD62L-、TEM)的分子，这些属性有助于T细胞介导的远位抑制和癌病变的清除(图28B)。机理研究证实Sirpα-/--M经由原位呼叫肿瘤特异性记忆性T细胞(即，TEM/TRM)诱导T细胞活化，这一反应比淋巴器官中DC介导的初始T细胞的活化快且稳固得多。另外，活化的Sirpα-/--M的稳固促炎性特征驱动抗癌反应，吸引抗肿瘤的嗜中性粒细胞和细胞毒性NK细胞，同时减少免疫抑制Treg和MDSC，一起形成促进癌症消除的破坏肿瘤的组织小生境(图28C-28D)。相比之下，不具有Sirpα-/--M的肿瘤通过将TME转向伤口愈合来响应RT，并通过增加TGFβ和MDSC浸润来加强免疫抑制。在RT之前或之后包含或不包含Sirpα-/--M的各种肿瘤(例如，MC38、KPC和Pan02)的转录组剖析证实Sirpα-/--M引发显著的抗肿瘤反应并重塑免疫景观以促进肿瘤消除。
使巨噬细胞中的SIRPα下调的非遗传方法的发现
SIRPANT的策略采用吞噬作用活化的SIRPα低巨噬细胞SIRPANT-M作为针对癌症的中心治疗武器，其显示类似于活化的Sirpα-/--M的特征。SIRPANT-M的开发是基于发现IFNγ，尽管不能活化吞噬作用，但显著减少来自小鼠和人的巨噬细胞中的SIRPα蛋白表达(图29A-29C)。对其它因子的筛选进一步发现细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IFNα和IFNβ以及迄今测试的所有TLR激动剂(LPS、CpG、LTA、鞭毛蛋白、聚I:C、PGN等)下调SIRPα，同时活化吞噬作用。不同于它们快速活化吞噬作用(1-6小时)的能力，这些因子大约需要2天才能下调SIRPα(>90％)，其机制涉及细胞因子和TLR介导的信号转导，导致三种微小RNA(mir-17/20a/106a)的诱导，继而抑制SIRPαmRNA翻译。相反，我们发现免疫抑制细胞因子IL-10、TGFβ、IL-4和IL-13以及促炎性细胞因子IL-17和TNFα上调SIRPα表达，尽管后面两者也活化吞噬作用。另外，我们还发现地塞米松(DEX)和甲基泼尼松龙(MP)下调SIRPα表达；然而，这些糖皮质激素强力抑制巨噬细胞的吞噬作用。这些研究SIRPα表达的动力学和巨噬细胞的吞噬作用活化的全面研究告知了对产生治疗上适用的SIRPANT-M的试剂的选择。已在各种实验条件下详尽地探索、重新测试和优化无数次迭代，从中，细胞因子和TLR激动剂混合物变成专用试剂Phago-ActTM的核心。在单个处理步骤中，Phago-ActTM强力下调SIRPα(SIRPα低)，活化巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用并赋予巨噬细胞加强的促炎性表型和免疫原性抗原呈递能力。
Phago-ActTM
专用试剂Phago-ActTM含有四种组分，重组人类干扰素-γ(IFNγ)、重组人类干扰素-αA2(IFNα)、CpG寡脱氧核苷酸和聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)，用于离体处理人和小鼠来源的巨噬细胞。在Phago-ActTM中，IFNγ可以40ng/ml至200ng/ml的范围存在，IFNα可以40ng/ml至200ng/ml的范围存在，CpG寡脱氧核苷酸可以1μg/ml至5μg/ml的范围存在，并且聚I:C可以1μg/ml至5μg/ml的范围存在。在Phago-ActTM的一特定实施例中，IFNγ以100ng/ml的浓度存在，IFNα以100ng/ml的浓度存在，CpG寡脱氧核苷酸以2μg/ml的浓度存在，并且聚I:C以2μg/ml的浓度存在。
这些试剂的组合是SIRPANT技术的关键知识产权，并且在质量控制下专门制备以确保有效性和一致性。为了制备治疗有效的自体SIRPANT-M(SIRPα低活化巨噬细胞)，用Phago-ActTM处理由具有M-CSF的癌症患者制备的PBMC源性SIRPα+-M 48小时(2天)(图29D描绘工作流程)以显著降低SIRPα表达，产生表型和功能上类似于当SIRPα经基因敲除时所看到的SIRPα低巨噬细胞群体。不仅下调SIRPα，Phago-ActTM的配方还立即赋予巨噬细胞强力吞噬能力、高促炎性表型和增加的免疫原性抗原呈递机制的表达。离体表型分析显示，在Phago-ActTM处理完成之后SIRPANT-M维持表型稳定性和活力至少三天(图29E)，这一时间段允许治疗患者的临床操作。对SIRPANT-M吞噬作用的分析证实了其侵吞噬一系列癌细胞的能力(图29F；在下一个章节药理学图30-31中的额外数据)。采用类似的实验设置将人SIRPANT-M的吞噬作用评估扩增到人癌细胞的整个NCI-60组(图31)。正如预期，SIRPANT-M表明对所有测试的健康癌细胞具有吞噬作用，并且该吞噬能力并不取决于CD47的癌细胞表达(R2＝0.0191)。SIRPANT-M对X射线放射处理的未细胞凋亡的癌细胞的吞噬作用的另外测试显示吞噬作用进一步增强，因为辐照的癌细胞表达促进吞噬作用的DAMP。相比之下，由相同供体制备的没有Phago-ActTM处理的巨噬细胞(SIRPα+-M)无法吞噬健康或辐照的癌细胞。相同的方法还可以用于从小鼠产生SIRPANT-M，并且不同遗传背景的鼠骨髓源性SIRPANT-M对其同基因型癌细胞展现吞噬作用，例如C57BL6/J SIRPANT-M→B16、MC38、KPC等，BALB/cSIRPANT-M→4T1，以及FVB/NJ SIRPANT-M→从MMTV-PyMT小鼠的可触摸的肿瘤分离的乳腺癌细胞(参见图30-31)。
SIRPANT-M作为针对癌症的有效免疫疗法
Phago-ActTM产生的SIRPANT-M在功能上类似于活化的Sirpα-/--M，并具有能够活化针对癌症的先天性和适应性免疫两者的能力。已经在体外在许多巨噬细胞表型和功能分析中广泛地审查SIRPANT-M，这些分析评估吞噬作用、促炎性和抗炎性反应和抗原呈递以活化抗原特异性T细胞(图34-37)。这些体外研究还补充了对不同遗传背景(C57BL6/J、BALB/C、FVB/NJ)、具有和不具有适应性免疫(WT、Rag-1-/-、裸)以及鼠和人来源癌症的各种鼠癌症模型中的SIRPANT-M的全面体内评估(图38-45)。所有这些研究均表明SIRPANT-M通过驱动肿瘤新抗原特异性、多克隆和持久T细胞和体液免疫性而有望作为癌症患者的高效免疫疗法。这一疗法不是概括现在实践中或开发中的任何其它疗法，对于现在实践中或开发中的任何其它疗法也不多余，而是很好地定位以与免疫检查点阻断、RT、肿瘤疫苗和其它免疫调节方案协同作用。SIRPANT-M不同于CD47阻断，并且不需要癌症特异性抗体或引发吞噬作用的其它方法，由此广泛地适合于许多癌症。实际上，临床前研究支持SIRPANT-M是适用于大多数(如果不是所有类型的)癌症的一种独特的不定肿瘤类型疗法，且不需预先鉴定癌症特异性标志物。另外，除短暂地加强与肿瘤消除相关的发炎反应以外，在经SIRPANT-M处理的小鼠中尚未发现或仅发现最小的副作用，其中肿瘤消除的动物一般实现长期存活(处理之后>1年)，没有复发。
实例4：SIRPANT-M药理学
SIRPANT-M是用Phago-ActTM处理产生的自体SIRPα低活化巨噬细胞。SIRPANT-M的治疗功效依赖于三个因素：i)SIRPANT-M吞噬癌细胞的能力；ii)SIRPANT-M驱动肿瘤微环境中的稳固促炎性反应的能力；以及ⅲ)SIRPANT-M呈递肿瘤抗原并活化发挥肿瘤破坏活性的肿瘤特异性T细胞的能力。下文呈现的体外研究集中于评估这些SIRPANT-M特征。
对癌细胞的吞噬作用
根据图29D中所概述的标准操作程序产生鼠和人SIRPANT-M，然后分别测试对小鼠或人类来源的癌细胞的吞噬作用。
方法：通过在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF；10ng/ml)存在下培养(RPMI 1640、10％胎牛血清[FBS]、37℃、5％ CO2)骨髓细胞连续5天，将来自不同遗传背景(C57BL6/J、BALB/C或FVB/NJ)的小鼠的总骨髓细胞在体外分化为巨噬细胞(BMDM)。此后，分化的巨噬细胞用Phago-ActTM(鼠型式)处理两天以产生SIRPANT-M(图31A)。通过将SIRPANT-M或对照BMDM与健康的同基因型癌细胞(CFSE标记)以1:2(BMDM:癌细胞)比率共培养4小时(37℃)，接着通过荧光显微术和/或流式细胞术评估和定量吞噬作用来进行吞噬作用分析(图31B和31C)。癌细胞的遗传背景如下：C57BL6/J-B16F10、MC38、KPC、Pan02、LLC和EL4；BALB/C-4T1；从荷瘤MMTV-PyMT小鼠分离的FVB/NJ-PyMT乳腺癌细胞。针对基因匹配的同基因型癌细胞测试SIRPANT-M和对照BMDM。对于荧光显微术，通过以下计算吞噬作用：(视场中吞噬至少一个癌细胞的BMDM数目/100个BMDM)×100。对于流式细胞术，吞噬作用通过CFSE+BMDM的频率来定量。使用学生t检验确定统计显著性。
方法：用Phago-ActTM处理人PBMC源性巨噬细胞(SIRPα+-M)两天以产生SIRPANT-M。通过用其它因子(例如TNFα/IL-17或IFNγ)处理SIRPα+-M产生另外的对照。通过将粘附的SIRPANT-M、对照SIRPα+-M或其它处理的SIRPα+-M与健康人癌细胞(从NCI-60细胞系储存库获得)共温育变化时间段(37℃)，接着通过荧光显微术和/或流式细胞术评估和定量吞噬作用来进行吞噬作用分析。人癌细胞用CFSE标记并且通过流式细胞术检测其CD47表达以确定其CD47表达是否影响吞噬作用的程度。统计显著性通过单向ANOVA和弗邓恩事后检验(Dunn's test post-hoc)来确定。通过线性回归分析测定CD47表达与吞噬作用之间的相关性评估并且展示皮尔逊系数(Pearson coefficient)。
结论：鼠骨髓源性SIRPANT-M和人PBMC源性SIRPANT-M均表现出擅长体外直接吞噬癌细胞。此外，SIRPANT-M吞噬癌细胞的能力与癌细胞上的CD47表达无关。这些研究证实Phago-ActTM处理去除了CD47-SIRPα介导的抑制并且提供活化，使SIRPANT-M能够稳固地吞噬癌细胞。
方法：将健康的鼠或人癌细胞用非消融性X射线放射(4Gy、8Gy或15Gy)处理，随后与鼠或人SIRPANT-M或对照SIRPα+-M/BMDM在37℃下共同温育各种时间段。此后，通过荧光显微术和/或流式细胞术定量吞噬作用。统计显著性通过学生t检验或单向ANOVA和图基事后检验(Tukey's post-hoc)来确定。
结论：癌细胞的辐照显著增强其对SIRPANT-M的吞噬作用的敏感性。数据表明，非消融性放射尽管维持癌细胞活力和CD47表达，但诱导癌细胞上的损伤相关分子(例如钙网蛋白)，这加强了SIRPANT-M的吞噬作用。相比之下，SIRPα+-M部分没有表现出对辐照的癌细胞的吞噬作用显著改良，这部分归因于CD47-SIRPα抑制的存在。然而，抗CD47 Ab对CD47的阻断或癌细胞上缺乏CD47仅部分改良辐照的癌细胞的SIRPα+-M吞噬作用，尽管辐照的癌细胞被SIRPANT-M吞噬的程度不匹配。
炎性表型和抗原呈递机制
方法：将新鲜制备的鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM、SIRPα+-M)用Phago-ActTM进一步处理48小时以诱导SIRPANT-M。收集人PBMC源性SIRPANT-M(+Phago-ActTM)和对照SIRPα+-M(-Phago-ActTM)的细胞培养基并通过ELISA分析促炎性和抗炎性细胞因子。进行流式细胞术以分析包括MHC-I和MHC-II的抗原呈递机制和共刺激分子CD80和CD86的细胞表面表达。制备总RNA用于通过Nanostring进行mRNA转录分析。
结论：与SIRPα+-M相比，SIRPANT-M表现出加强的促炎性表型，所述加强的促炎性表型的特征在于促炎性细胞因子的表达增加、免疫抑制IL-10的产生减少以及包括MHC-I/II和共刺激分子的免疫原性抗原呈递机制的表达增加。
方法：从人PBMC源性SIRPANT-M和供体匹配的SIRPα+-M的七个样品(#1-7)中分离总RNA。供体为健康志愿者并且包括4名男性和3名女性，其中存在2名白人、2名黑人、2名亚洲人和1名混血儿。使这些RNA样品经历全面测序，分析超过10,000个基因的表达。
结论：与供体匹配的SIRPα+-M相比，SIRPANT-M表现出升高的与免疫原性抗原呈递机制有关的遗传学表达，包括MHC-I、MHC-II、CIITA和共刺激分子(CD80/86/40/70、OX40L、4-1BBL、ICAM-1等)，但非经典的免疫耐受性相关的HLA-G的表达减少。SIRPANT-M还增加促炎性细胞因子和趋化因子(IL-1/6/12/18/23/27、IFNα/β/γ、TNFα、CXCL1/2/9/10/11等)的表达，同时减少抗炎性IL-10、TGFα/β、TGFβR和CCL2/18的表达。
SIRPANT-M介导抗原呈递并活化肿瘤抗原特异性T细胞
方法：图36A中展示实验方案。将鼠骨髓源性SIRPANT-M或对照BMDM/SIRPα+-M与经过放射处理的MC38或KPC肿瘤细胞一起温育过夜(约18小时，37℃)，以获得吞噬癌细胞和加工肿瘤抗原的巨噬细胞。在肿瘤组织的胶原蛋白酶消化之后，从切除的MC38或KPC肿瘤获得肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，培养解离的细胞并收集非粘附性细胞群体，其中大部分是T淋巴细胞。然后，以5:1的TIL:巨噬细胞比率(24孔板中每孔1×106TIL和2×105SIRPANT-M或SIRPα+-M)将富集TIL添加到含有肿瘤抗原加载的巨噬细胞的孔中。然后将SIRPANT-M-TIL共培养物维持(37℃、5％ CO2)在含有10％ FBS、2mM L-谷氨酰胺和50μMβ-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中8-10天，在第2天添加50IU/ml重组IL-2。每三天补充含有IL-2的培养基并且将细胞密度维持在1×106个细胞/毫升以下。为了检查T细胞活化和扩增，在共培养之后24小时(第2天)进行荧光显微术和流式细胞术以评估TIL-巨噬细胞接合和T细胞扩大(图36E-36F)。通过CFSE稀释使用流式细胞术在各个时间点评估T细胞增殖(图36G)。(TIL在共培养之前用CFSE预标记，图36E-36G)。在与SIRPα+-M/BMDM(图36B)和已吞噬和加工抗原的SIRPANT-M(+抗原)一起温育之后或当抑制癌细胞(-抗原)时(图36C)，还测定CD8 T细胞和CD4 T细胞的量。进行另外流式细胞术分析以测定表达颗粒酶B并且对肿瘤特异性MHC四聚体p15E和ADPGK具有反应性的CD8 T细胞的频率和数量(图36H-36I)，这两个方面均指示T细胞对癌症的特异性。在含有肿瘤抗原加载的SIRPANT-M和TIL的共培养物中，总T细胞数通常从初始1×106个细胞增加20倍到约2×107个T细胞，其中共培养8-10天后>95％是CD8 T细胞。取决于肿瘤类型，将扩增的T细胞称为TMC38或TKPC，并且通过过继T细胞疗法测试体外和体内针对相应MC38或KPC癌细胞的肿瘤破坏毒性(图36J-36K)。
结论：这些研究证明：i)吞噬肿瘤的SIRPANT-M是优良的抗原呈递细胞(APC)，其介导免疫原性抗原呈递并稳固活化来自TIL的肿瘤特异性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)；ii)SIRPANT-M通过原位呼叫TIL内的肿瘤特异性记忆性T细胞(亦即，TEM/TRM)来活化CD8 T细胞；ⅲ)SIRPANT-M介导的抗原呈递优先活化肿瘤特异性CD8+细胞毒性T细胞，但不活化CD4+T辅助细胞(Th)；iv)SIRPANT-M活化的CD8T细胞高度表达颗粒酶B并表现出多克隆癌症特异性；v)在相对较低的效应:目标比率下SIRPANT-M活化的CD8 T细胞对癌症具有高度细胞毒性并迅速消除癌细胞。这些结论与小鼠肿瘤模型中的体内实验一致。
方法：除了诱导B16黑色素瘤特异性的初始CD8 T细胞以外，如图36A中详述的遵循类似的实验方案。将SIRPANT-M或对照BMDM/SIRPα+-M与亲本B16F10黑色素瘤细胞或表达gp33的B16F10黑色素瘤细胞一起共温育，所述黑色素瘤细胞进行多个冻融循环以诱导免疫原性细胞死亡并提供B16抗原。接着将加载B16抗原的SIRPANT-M或对照BMDM/SIRPα+-M与来自P14转基因小鼠的初始脾CD8+T细胞一起共温育，所述CD8+T细胞表达对H-2Db限制的gp33抗原决定基具有特异性的TCR。
结论：这些实验证实，SIRPANT-M在肿瘤抗原的吞噬作用之后变成优良APC，进行抗原呈递以活化抗原特异性的初始CD8+T细胞。
实例5：体内药理学研究
已经在不同遗传背景的小鼠中的各种临床前癌症模型中广泛测试了SIRPANT-M在体内驱动抗癌反应的能力(C57BL6、BalbC、FVB/NJ)。这些癌症包括淋巴瘤、结直肠腺癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺导管腺癌、转移性乳腺癌、致癌物和炎症诱发的结肠癌等。在这些测试的癌症中，一些为晚期，具有大的肿瘤与远端病变(癌转移)。在所有情况下，SIRPANT-M一施用于肿瘤块后就发挥强力抗癌活性，这证明了对癌细胞的直接吞噬作用和驱动促炎性反应以及以免疫原性方式下游呈递肿瘤相关新抗原以活化破坏肿瘤的T细胞。因此，扩增大量肿瘤特异性多克隆细胞毒性T细胞以对抗肿瘤和远端病变(癌转移)，实现(i)实体瘤的快速和全身性消除，和(ii)诱导T细胞和抗体持久抗癌免疫性，防止癌症复发。
以下章节展示小鼠中进行的临床前癌症治疗研究。
SIRPANT-M单一疗法
处理：SIRPANT-M肿瘤内注射(i.t.)
剂量：D1/2＝0.5×104/mm3肿瘤块
D1＝1×104/mm3肿瘤块
D2＝2×104/mm3肿瘤块
癌症类型：i.结直肠腺癌MC38-C57BL6同基因型移植；ii.胰腺导管腺癌(PDA)KPC-C57BL6同基因型移植；iii.胰腺导管腺癌(PDA)Pan02--C57BL6同基因型移植；iv.肺癌LLC-C57BL6同基因型移植；v.淋巴瘤EL4-C57BL6同基因型移植；以及vi.MMTV-PyMT三阴性转移性乳腺癌-FVB/NJ自发性。
实验程序：
肿瘤模型：对于同基因型移植模型，将悬浮于50μl PBS中的健康的经培养的EL4、MC38、LLC、KPC、Pan02癌细胞(5×105)皮下移植到WT C57BL6小鼠(6-8周，雄性或雌性)中。一般在10-18天之后形成可触摸的肿瘤，生长速率取决于癌症类型。使用卡尺测量肿瘤长度和宽度，随后用下式计算肿瘤体积(V)：体积＝(长度×宽度2)/2。从The JacksonLaboratory(002374FVB/N-Tg(MMTV-PyVT)634Mul/J)获得MMTV-PyMT小鼠。雌性PyVT转基因载体在约2月龄时自然地发展可触摸的乳腺肿瘤(平均潜伏期53天)。
SIRPANT-M制备：从WT C57BL6小鼠或雄性MMTV-PyVT小鼠获得股骨。骨髓源性巨噬细胞(BMDM)由M-CSF产生，接着用Phago-ActTM处理(37℃、48小时)，以产生SIRPANT-M。在使用之前，SIRPANT-M从培养皿中胰蛋白酶化，并在洗涤之后，将这些细胞以1×108/ml再悬浮于PBS中且在0.5-3小时内使用(在使用之前保持在冰上)。流式细胞术分析证实SIRPANT-M为SIRPα低，且具有增加的MHC-I、MHC-II、CD80和CD86的表达。仅基因匹配的SIRPANT-M用于处理不同背景的小鼠中的肿瘤，使得由C57BL6小鼠制备的SIRPANT-M用于处理C57BL6小鼠中的EL4、MC38、LLC、KPC和Pan02肿瘤，由FVB/NJ小鼠制备的SIRPANT-M用于处理相同背景的小鼠中的PyMT乳腺癌。
肿瘤处理：根据肿瘤尺寸计算SIRPANT-M的剂量。按照多点注射方式，例如用Exel-Comfort Point胰岛素注射器针头(29G1/2)从肿瘤的不同方向或角度进行2-4次注射(一种改进肿瘤组织中的SIRPANT-M扩散的程序)，将PBS中的SIRPANT-M经肿瘤内注射到肿瘤中。每三天重复处理并总共给与2-3次处理。
SIRPANT-M单一疗法的研究结论：
肿瘤内SIRPANT-M剂量依赖性地强烈抑制肿瘤生长或诱导肿瘤消退。
SIRPANT-M单一疗法基本上增加动物存活，并且对于小肿瘤，赋予完全反应与长期存活。
SIRPANT-M的抗肿瘤作用不定肿瘤类型的，表明对所有测试的肿瘤的强力抑制。
SIRPANT-M和放射线疗法(RT)组合
治疗模态：1-SIRPANT-M肿瘤内注射(i.t.)
2-集中在肿瘤上的非消融性X射线放射(RT)
SIRPANT-M剂量：D1/2＝0.5×104/mm3肿瘤块
D1＝1×104/mm3肿瘤块
D2＝2×104/mm3肿瘤块
RT剂量：X射线4Gy
X射线8Gy
X射线15Gy
癌症类型：i.结直肠腺癌MC38-C57BL6同基因型移植；ii.胰腺导管腺癌(PDA)KPC-C57BL6同基因型移植；iii.胰腺导管腺癌(PDA)Pan02-C57BL6同基因型移植；iv.肺癌LLC-C57BL6同基因型移植；v.淋巴瘤EL4-C57BL6同基因型移植；vi.三阴性乳腺癌(TNBC)4T1-Balb C原位移植；以及vii.MMTV-PyMT三阴性乳腺癌(TNBC)-FVB/NJ自发性。
实验程序：
肿瘤模型：使用与上一个章节(单一疗法)相同的程序在WT C57BL6小鼠中建立EL4、MC38、LLC、KPC和Pan02肿瘤的同基因型移植模型。为了建立远端病变，一个位置(例如，右侧胁腹)植入5×105个肿瘤细胞用于形成原发性肿瘤并且其它位置(例如，左侧胁腹、右侧和/或左侧腋窝和腹膜腔)植入0.5-2×105个肿瘤细胞以形成较小的“远端”病变进行移植。在一些实验中，两个原发性肿瘤连同多个远端病变一起移植。在Balb C小鼠中建立4T1原位乳腺癌。对于这种模型，将悬浮于50μl PBS中的3×104个4T1细胞注射到6-8周龄雌性Balb C小鼠的乳腺脂肪垫中，并且在移植之后两周中一般形成可触摸的肿瘤。在上一个章节中描述了MMTV-PyMT三阴性转移性乳腺癌的建立。
SIRPANT-M制备：采取相同程序(图29D)从C57BL6、MMTV-PyVT或Balb C小鼠制备骨髓源性SIRPANT-M。仅基因匹配的SIRPANT-M用于处理相同背景的小鼠中的肿瘤以确保同基因型，使得由C57BL6小鼠制备的SIRPANT-M用于处理C57BL6小鼠中的EL4、MC38、LLC、KPC和Pan02肿瘤，由Balb C小鼠制备的SIRPANT-M用于处理Balb C小鼠中移植的4T1乳腺癌等。
肿瘤处理：
i)SIRPANT-M i.t.-按照多点注射方式，例如用Exel-Comfort Point胰岛素注射器针头(29G1/2)从肿瘤的不同方向或角度进行2-4次注射，将悬浮于PBS中的根据肿瘤尺寸计算的新鲜制备的SIRPANT-M注射到肿瘤块中。
ii)肿瘤RT：将用氯胺酮(ketamine)(17.5mg/ml，Henry Schein)和甲苯噻嗪(xylazine)(2.5mg/ml，Henry Schein)进行麻醉的荷瘤小鼠放置于定制的具有主要固定器的夹具中，以便仅暴露原发性肿瘤，接着在RS-2000生物X射线辐照器(Rad SourceTechnology)中以1.2Gy/min(160kV、25mA)的剂量率达到4Gy、8Gy、10Gy或15Gy进行辐照。
iii)组合：在一分次放射给与相同肿瘤之前或之后肿瘤内施用SIRPANT-M。在肿瘤病灶RT之前0.5小时至48小时或RT之后相同时间段测试肿瘤内SIRPANT-M。
研究-1：测试肿瘤内SIRPANT-M与变化剂量(4Gy、8Gy或15Gy)的RT组合，以治疗不同阶段(变化的肿瘤尺寸)的RT难治性结直肠腺癌MC38和胰腺导管腺癌KPC和Pan02。图40中展示部分数据。
研究-2：测试8Gy RT与变化剂量的SIRPANT-M组合，以治疗RT难治性结直肠腺癌MC38和胰腺癌KPC和Pan02。图41展示研究的部分数据。
研究-3：测试远位作用。鉴于SIRPANT-M主要通过其免疫原性抗原呈递和肿瘤特异性T细胞的活化来介导抗癌功效，因此预期强烈的远位肿瘤破坏活性。此研究测试SIRPANT-M诱导远端作用，引起远位癌病变(模拟癌转移)的抑制和/或清除的能力。
研究-3-1：测试SIRPANT-M和RT组合的全身性消除KPC胰腺癌与远端病变的远位作用。将KPC/Luc胰腺腺癌肿瘤同时移植在多个位置中，其中一个或两个移植形成原发性肿瘤。在肿瘤形成之后，在8Gy(第1次)-4Gy-4Gy RT方案之后，用SIRPANT-M i.t.加RT处理原发性肿瘤两次或三次循环(相隔3天)，每次利用D2剂量下的立即SIRPANT-M i.t.。未处理其它癌病变。拍摄全身图像以监测原发性和全身性KPC肿瘤的进展、消退或清除。图42中展示部分数据。
研究-3-2：测试SIRPANT-M和RT组合的消除MC38结直肠癌与远端病变的远位作用。在本研究中，MC38腺癌移植在胁腹的两侧中。在肿瘤形成之后，用SIRPANT-M i.t.加RT处理右侧肿瘤(原发性)两次循环(第一次循环是8Gy，第2次循环是4Gy，相隔3天)，同时保持左侧肿瘤未处理。如果在两次处理循环之后原发性肿瘤保持体积≥100mm3，那么将给与原发性肿瘤一次额外的SIRPANT-M和4Gy RT处理(第3次循环)。在整个处理中测量两侧胁腹的肿瘤体积以监测远位作用和全身性MC38肿瘤消除。图43中展示部分数据。
研究-4：施用两种模式SIRPANT-M i.t.和RT的测试时间安排和顺序。进行研究以比较在肿瘤RT之前和之后给出的SIRPANT-M i.t.的功效。这些研究得出结论，应该在短时间间隔(3小时)内施用两种治疗模态，并且在肿瘤RT之前或之后给出的SIRPANT-M i.t.实现类似的功效。两种模态之间更长的时间间隔会导致处理有效性降低。图44展示利用两种模态的不同次序治疗MC38结直肠癌和EL4淋巴瘤的数据。
研究-5：测试SIRPANT-M和RT组合治疗其它RT难治性癌症。这些研究测试SIRPANT-M i.t.与8Gy RT组合，治疗另外的癌症，包括LLC肺癌(s.c.)、EL4淋巴瘤(s.c.)、4T1原位移植的三阴性乳腺癌和MMTV-PyMT小鼠中PyMT自发出现的三阴性乳腺癌。将SIRPANT与RT组合的功效与仅具有相同剂量RT的治疗进行比较。图45中展示部分数据。
总结：
体外和体内研究证实，Phago-ActTM产生的SIRPANT-M是强大的抗癌免疫引发剂并且利用SIRPANT-M(SIRPα低活化巨噬细胞)的策略有效消除癌症和癌转移。下表概述了使用通过肿瘤内注射(i.t.)施用的D2剂量的SIRPANT-M的体内测试。
Figure BDA0004010117540000781
实例6：
鉴于SIRPANT-M实现癌症消除的机制取决于活化肿瘤特异性T细胞的肿瘤破坏活性，因此SIRPANT-M+RT与增加T细胞活性的检查点抑制剂组合将加强消除肿瘤和清除远端病变(癌转移)的能力。在本实例中，测试这些可能性，且所产生的数据用于确定IND方案内的临床治疗方案和模态。两条线实验测试SIRPANT-M+RT±抗PD1/L1或抗CTLA4，以治疗皮下肿瘤模型(IIB-1和IIB-2)中的胰腺腺癌KPC或结直肠癌MC38。为了密切模拟治疗在人类中形成的癌症，另外两条线实验测试SIRPANT-M+RT±抗PD1/L1或抗CTLA4针对炎症(DSS-结肠炎)或致癌物(AOM)诱发的结直肠赘瘤/癌症(IIB-3和IIB-4)。与预处理免疫反应且不在其天然位置中形成肿瘤的同基因型移植(如皮下模型)相比，DSS-AOM诱发的结直肠癌在炎症位置处出现，与加强的结肠炎相关且由引起致癌基因和肿瘤抑制基因中的突变的致癌物的存在诱发。因此，本癌症模型紧密类似于癌症如何‘自发’在人中形成。这类癌症的实例包括在肺、结肠、卵巢、乳腺、前列腺等中形成的那些癌症。针对这一自发癌症测试SIRPANT-M治疗支持其在更广泛癌症患者中的应用。
除优化癌症治疗策略之外，设计和测试人类SIRPα低巨噬细胞的CMC生产所需的质量控制(QC)分析。当前从外周血单核细胞(PBMC)制造人类SIRPα低巨噬细胞遵循图46中的图，包括用M-CSF处理5天以分化巨噬细胞和用专用药剂“Phago-ActTM”处理48小时以下调SIRPα，以产生SIRPα低巨噬细胞。设计两种QC分析，QC1和QC2。QC1在48小时Phago-ActTM处理之后进行以证实巨噬细胞已经实现所期望表型和功能性。在SIRPα低巨噬细胞施用于患者之前进行QC2，确保无菌、细胞存活和其它临床疗法相关参数。表2和表3中展示QC1/2的设计并测试这些分析。
Figure BDA0004010117540000791
Figure BDA0004010117540000801
Figure BDA0004010117540000802
实例7：抑制SIRPα下游的SHP-1作为针对癌症的潜在疗法SIRPα通过活化含有SH-结构域的酪氨酸磷酸酶SHP-1，然后所述酪氨酸磷酸酶介导广泛的蛋白质脱磷酸并且终止多个细胞因子和TLR介导的活化通路来介导巨噬细胞中的抑制性调节。除了下调SIRPα之外，还测试SHP-1抑制作为一种耗尽SIRPα-SHP-1介导的抑制的替代方法。
SHP-1抑制剂TPI-1(Kundu等人,《免疫学杂志》2010184:6529-6536)购自CaymanChemical(还可获自Selleck Chemicals)。TPI-1用作单一药剂，或与RT组合以治疗皮下确立的结直肠癌(CRC)MC38和胰腺导管腺癌(PDA)KPC。
测试SHP-1抑制剂TPI-1在体内治疗CRC和PDA肿瘤
一旦MC38或KPC肿瘤达到大约200mm3，将于50μl PBS中的20μg TPI-1经肿瘤内注射到肿瘤中(根据1mg/kg体重计算剂量)。2天后重复处理。对于组合处理，给肿瘤内注射TPI的小鼠30分钟以允许TPI在肿瘤组织内扩散，接着是一分次的局部8Gy X射线放射。在2天之后重复该TPI+8Gy RT处理。对照是不进行处理的肿瘤(无处理)或用8Gy RT(仅RT)处理的肿瘤。每隔一天测量肿瘤体积，并使用长椭球的公式(V＝a2b/2)计算，其中a和b分别为肿瘤宽度和长度(mm)。在处理之后48小时检查TME中肿瘤处理诱导的免疫景观变化。还通过生物发光成像器使KPC肿瘤成像。图47A展示KPC的处理结果，且图47B展示MC38的结果。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与所公开的本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所引用的出版物以及其所引用的材料以引用的方式具体并入。
所属领域的技术人员仅仅使用常规实验即可认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效物。意图所附权利要求书涵盖这类等效物。

Claims (36)

1.一种用于产生活化的SIRPα低巨噬细胞的方法，其包含
(a)从生物样品中的外周血单个核细胞(PBMC)中分离单核细胞；
(b)在体外分化所述单核细胞以产生巨噬细胞；以及
(c)使所述巨噬细胞与SIRPα抑制剂接触；以及
(d)使所述巨噬细胞与巨噬细胞活化剂接触，
由此产生相对于未处理的巨噬细胞，SIRPα的细胞表面表达显著降低(SIRPα低)的巨噬细胞群体，
其中所述SIRPα低巨噬细胞具有活化的对癌细胞的吞噬作用、增加的促炎性反应和增加的免疫原性抗原呈递。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述SIRPα抑制剂遏制SIRPα的表达，降低细胞表面上SIRPα的丰度，抑制SIRPα的活性，破坏SIRPα与CD47之间的相互作用，或其组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述SIRPα抑制剂包含细胞因子、TLR配体、糖皮质激素或其组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述SIRPα抑制剂选自由以下组成的群组：IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18、LPS、CpG、聚I:C、LTA、PGN、鞭毛蛋白、Pam3CSK4、酵母聚糖和HMGB1。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述巨噬细胞活化剂包含细胞因子、佛波醇酯、TLR配体或其组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的群组：IFNα、IFNβ、IL-6、IL-1、IL-17、IL-18、TNFα和IL-12。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述佛波醇酯包含佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述TLR配体选自由以下组成的群组：LPS、CpG、聚I:C、LTA、PGN、鞭毛蛋白、Pam3CSK4、酵母聚糖和HMGB1。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述糖皮质激素包含甲基泼尼松龙或地塞米松。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述SIRPα抑制剂和所述巨噬细胞活化剂为依次施用。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述SIRPα抑制剂和所述巨噬细胞活化剂为同时或并行施用。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述SIRPα抑制剂和所述巨噬细胞活化剂存在于同一组合物中。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物包含重组人干扰素-γ(IFNγ)、重组人干扰素-αA2(IFNα)、CpG寡脱氧核苷酸和聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述SIRPα抑制剂包含SHP-1抑制剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述SHP-1抑制剂选自由以下组成的群组：TPI-1(2-(2,5-二氯苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a1(2-(2,5-二氯苯基)-2,4-苯醌)、TPI-1a2(2-(3-氯苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a3(2-苯基萘醌)、TPI-1a4(2-(4-乙氧基苯基)-1,4-苯醌)、TPI-1a5(2-(4-甲氧基苯基)-1,4-苯醌)、SSG(葡萄糖酸锑钠)、PTP抑制剂I(2-溴-1-(4-羟苯基)-乙酮)、PTP抑制剂II(2-溴-1-(4-甲氧基苯基)-乙酮)、PTP抑制剂III(2-[4-(2-溴乙酰基)苯氧基]-乙酸)、PTP抑制剂IV(N,N'-[1,4-亚苯基双[(1-甲基亚乙基)-4,1-亚苯基]]双[1,1,1-三氟-甲磺酰胺)、NSC 23922(3-氨基胆甾烷)和NSC 87877(8-羟基-7-[2-(6-磺酸基-2-萘基)二氮烯基]-5-喹啉磺酸)。
16.根据权利要求1所述的方法，其还包含使所述巨噬细胞与SHP-1抑制剂接触。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述SHP-1抑制剂是不可逆SHP-1抑制剂。
18.一种组合物，其包含通过根据权利要求1所述的方法产生的活化的SIRPα低巨噬细胞。
19.一种用于产生体外扩增的肿瘤特异性外周血T(PBT)细胞的方法，其包含：
(a)从生物样品中分离外周血T(PBT)细胞；
(b)在体外将通过根据权利要求1所述的方法产生的活化的SIRPα低巨噬细胞与来自肿瘤活检的细胞共培养，以产生肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞；
(c)在体外将所述肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞与分离的PBT细胞共培养以扩增肿瘤特异性T细胞的数目，由此产生体外扩增的肿瘤特异性PBT细胞。
20.一种组合物，其包含通过根据权利要求19所述的方法产生的体外扩增的肿瘤特异性PBT细胞。
21.一种用于从肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)产生体外扩增的肿瘤特异性T细胞的方法，其包含：
(a)从肿瘤活检中分离肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)；
(b)在体外将通过根据权利要求1所述的方法产生的活化的SIRPα低巨噬细胞与来自所述肿瘤活检的肿瘤细胞共培养，以产生肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞；
(c)在体外将所述肿瘤饲养的SIRPα低巨噬细胞与分离的TIL细胞共培养以扩增肿瘤特异性T细胞的数目，由此从TIL产生体外扩增的肿瘤特异性T细胞。
22.一种组合物，其包含通过根据权利要求21所述的方法从TIL产生的体外扩增的肿瘤特异性T细胞。
23.一种用于治疗受试者的肿瘤的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求18所述的活化的巨噬细胞、根据权利要求20所述的体外扩增的肿瘤特异性PBT细胞、根据权利要求22所述的来自TIL的体外扩增的肿瘤特异性T细胞或其任何组合。
24.根据权利要求23所述的方法，其还包含用肿瘤定向辐照治疗所述受试者。
25.根据权利要求23所述的方法，其还包含向所述受试者施用治疗有效量的免疫检查点抑制剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包含抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA4抗体或其组合。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者是PD-1阻断难治的。
28.根据权利要求23所述的方法，其还包含用溶瘤病毒治疗所述受试者。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述溶瘤病毒是水泡性口炎病毒。
30.一种组合物，其包含重组人干扰素-γ(IFNγ)、重组人干扰素-αA2(IFNα)、CpG寡脱氧核苷酸和聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述IFNγ以40-200ng/ml的浓度存在。
32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述IFNα以40-200ng/ml的浓度存在。
33.根据权利要求30所述的组合物，其中所述CpG寡脱氧核苷酸以1-5μg/ml的浓度存在。
34.根据权利要求30所述的组合物，其中所述聚I:C以1-5μg/ml的浓度存在。
35.一种组合物，其包含活化的SIRPα低巨噬细胞，所述活化的SIRPα低巨噬细胞通过包含使来自受试者的巨噬细胞与有效量的根据权利要求30所述的组合物接触的方法产生。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述巨噬细胞是骨髓源性巨噬细胞或单核细胞源性巨噬细胞。
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