CN115803052A - 通过低ph保持的病毒清除 - Google Patents

Abstract

提供了基于统计实验设计的使用低pH保持的病毒清除方法。评估了几个因素以表征低pH保持步骤对病毒灭活的影响，包含pH条件、电导率条件、蛋白质类型、温度、酸滴定剂、掺入定时和掺入后过滤的因素。除了pH对病毒灭活的影响之外，通过操纵电导率增加离子强度可能也是影响病毒灭活动力学的关键因素。

Description

通过低PH保持的病毒清除

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月11日提交的美国临时专利申请号63/023,154的优先权和权益，该专利申请通过引用并入本文。

本发明总体上涉及使用低pH保持步骤来灭活蛋白质样品中的病毒颗粒的方法。并入几个因素的统计实验设计用于评估和表征低pH保持步骤对病毒灭活的影响。

背景技术

生物产品易受来自细菌、真菌和病毒的污染(内源性污染物和外来(来自外部源)污染物)。病毒清除(例如病毒灭活)是在使用哺乳动物细胞系生产的生物药物产品的制造期间的重要步骤。全球卫生当局要求对制造生物制品或生物技术产品的病毒清除进行评估，因为病毒污染可能在哺乳动物细胞培养物的生长期间加剧。有效的病毒清除研究是过程验证的重要组成部分，其对确保药物安全性也很重要。病毒污染也会影响原材料、细胞培养过程、生物反应器和下游纯化过程。

病毒验证研究被设计成记录关于产品质量的选定操作条件，以确保病毒安全性。病毒清除研究的实验设计包含制造过程的表征，以识别重要的发展因素，从而提高对处理条件的理解，并证明选择最差条件的合理性。病毒灭活或去除的过程包含pH处理、热处理、溶剂/去污剂处理、过滤或色谱法。低pH温育的病毒灭活机制包含基于pH的化学反应，导致病毒的表面糖蛋白的不可逆变性或脂质包膜的破坏。

生物药物产品的制造过程中适用的pH条件可能对病毒灭活无效。然而，病毒灭活所需的pH可能与其他制造条件中使用的pH范围明显不同。由于生物药物产品的低pH暴露可以改变蛋白质的质量或稳定性，因此使用低pH温育来获得蛋白质样品中有效的病毒灭活对于制造生物药物产品来说是具有挑战性的。应当理解，需要一些方法来评估和表征在生物药物产品的制造期间低pH保持步骤对病毒灭活的影响。这些方法应该提供有效和稳健的实验设计，以确保病毒灭活，用于设计制造过程(诸如纯化过程)。

发明内容

本申请提供了基于统计实验设计的使用低pH保持进行病毒清除的方法，该实验设计并入了几个因素以评估和表征低pH保持步骤对病毒灭活的影响。统计学设计的实验用于评估pH条件、离子强度条件、蛋白质同种型、温度、酸滴定剂、掺入定时和掺入后过滤对病毒灭活的影响。当病毒灭活步骤在约pH 3.60-3.90的范围内进行时，这些方法可以用于预测有效清除，例如通过操纵低pH起始材料的离子强度。

本公开提供了一种用于从包括一种或多种包含病毒颗粒的杂质的样品中纯化肽或蛋白质(诸如抗体)的方法。在一些示例性实施例中，本申请的方法包括：调节样品的离子强度条件，将样品的pH条件调节至酸性pH，以及随后将样品保持在离子强度条件和pH条件下持续至少约15分钟，以灭活一定量的病毒颗粒，其中样品包括一种或多种包含病毒颗粒的杂质。在一个方面中，对于使用本申请的方法，病毒颗粒灭活的量为至少约3LRF(对数减少因子)。在一个方面中，对于使用本申请的方法，病毒颗粒灭活的量为至少约4LRF。

在一个方面中，本申请的方法中样品的pH条件小于或等于约pH 3.90。在一个方面中，样品的pH条件在约pH 3.60至约pH 3.90的范围内。在另一方面中，样品的pH条件在约pH3.65至约pH 3.80的范围内。在另一方面中，样品中的肽或蛋白质是在宿主细胞中产生的抗体。在又一方面中，将本申请的方法中的样品保持在样品的离子强度条件和pH条件下持续至少约30分钟，以灭活该量的病毒颗粒。在一个方面中，将本申请的方法中的样品保持在样品的离子强度条件和pH条件下持续约15分钟至约30分钟，以灭活该量的病毒颗粒。

在一个方面中，本申请的方法进一步包括通过运行D-最优实验设计来优化该量的病毒颗粒的灭活。在另一方面中，D-最优实验设计评估以下因素：样品的pH条件和添加到样品中的盐浓度。在一个方面中，D-最优实验设计进一步评估以下因素：肽或蛋白质的类型、样品的温度、调节样品pH条件的酸滴定剂、将病毒颗粒掺入样品中的掺入定时或掺入后过滤的存在。

在一个方面中，本申请的方法中的样品是来自蛋白质A色谱法的洗脱液。在另一方面中，使用添加氯化钠来调节样品的离子强度，其中氯化钠的浓度在约1mM至约100mM、约1mM至约500mM、约25mM、约50mM、约72mM、约82mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM或约200mM的范围内。在一个方面中，使用磷酸或甘氨酸HCl来调节样品的pH条件。在另一方面中，该方法的样品中的肽或蛋白质是具有IgG1同种型或具有IgG4同种型的抗体。在一个方面中，肽或蛋白质是单克隆抗体或双特异性抗体。在又一方面中，肽或蛋白质是抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白、蛋白质药物产品或药物。

本公开提供了一种从具有感兴趣的蛋白质和传染性病毒颗粒的样品产生包括感兴趣的蛋白质和减少量的传染性病毒颗粒的制剂的方法。在一些示例性实施例中，从具有感兴趣的蛋白质和传染性病毒颗粒的样品产生包括感兴趣的蛋白质和减少量的传染性病毒颗粒的制剂的方法，包括通过添加浓度至多约100mM的盐使样品经受大于约3.60的pH的pH和离子强度条件；以及将样品在pH和离子强度条件下保持适当的时间量，以产生包括感兴趣的蛋白质和减少量的传染性病毒颗粒的制剂。

在一个方面中，样品中感兴趣的蛋白质的浓度小于约25g/L。

在一个方面中，适当的时间量为约15分钟、约20分钟、约25分钟或约30分钟。

在一个方面中，方法将来自样品的传染性病毒颗粒的量减少了约3LRF(对数减少因子)。在另一方面中，方法将来自样品的传染性病毒颗粒的量减少了约4LRF。

在一个方面中，样品的pH条件大于约pH 3.70。在另一方面中，样品的pH条件大于约pH 3.80。在又一方面中，样品的pH条件大于约pH 3.90。在又一方面中，样品的pH条件大于约pH 4.0。

在一个方面中，样品的pH条件在约pH 3.60至约pH 4.0的范围内。在另一方面中，样品的pH条件在约pH 3.70至约pH 4.0的范围内。在又一方面中，样品的pH条件在约pH3.80至约pH 4.0的范围内。

“样品”的示例性来源可以包含亲和色谱法，诸如蛋白质A洗脱液；样品可以从离子交换色谱法程序的流通级分获得；它也可以从离子交换柱的条带中获得-在纯化过程期间存在本领域技术人员熟知的可以从中获得样品的其他来源。在该实施例的一个方面中，样品是来自蛋白质A色谱法的洗脱液。

在一个方面中，通过使用添加氯化钠来调节样品的离子强度，其中氯化钠的浓度在约1mM至约200mM的范围内。

在一个方面中，通过使用浓度大于约50mM的氯化钠来调节离子强度条件。在该实施例的另一方面中，浓度大于约100mM。

在一个方面中，使用磷酸或甘氨酸HCl来调节样品的pH条件。

当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其他方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。

附图说明

图1A示出了根据示例性实施例的调节-掺入-重新调节方法，其中将样品调节/滴定至目标pH，然后在约pH 7.2下掺入病毒贮备液，随后将样品的pH重新调节至目标pH，然后在pH保持的剩余时间内保持在所需的温度。从掺入时开始定时。

图1B示出了根据示例性实施例的掺入-调节方法，其中样品首先掺入病毒贮备溶液，然后调节/滴定至目标pH。从达到样品的目标pH时开始定时。

图2A示出了根据示例性实施例的D-最优模型设计的散点图矩阵和多元相关性，以研究与用于病毒灭活的低pH保持步骤相关联的几个因素的影响。

图2B示出了对每种单克隆抗体盐条件进行的中性对照。根据示例性实施例，该对照的目的是确保所测量的病毒活性是在低pH下化学灭活的结果。

图3A示出了根据示例性实施例的在目标pH 3.65下X-MuLV的灭活动力学。根据示例性实施例，通过将LRF值针对时间点绘图来获得目标pH 3.65下的LRF曲线。

图3B示出了根据示例性实施例的在目标pH 3.73下X-MuLV的灭活动力学。根据示例性实施例，通过将LRF值针对时间点绘图来获得目标pH 3.73下的LRF曲线。

图3C示出了根据示例性实施例的在目标pH 3.80下X-MuLV的灭活动力学。根据示例性实施例，通过将LRF值针对时间点绘图来获得目标pH 3.80下的LRF曲线。

图4A示出了根据示例性实施例的在不同的目标pH条件下(例如，约pH 3.65、pH3.73或pH 3.80)在0mM NaCl下X-MuLV的灭活动力学。根据示例性实施例，对于不同的目标pH条件，通过将LRF值针对时间点绘图来获得LRF曲线。

图4B示出了根据示例性实施例的在不同的目标pH条件下(例如，约pH 3.65、pH3.73或pH 3.80)在50mM NaCl下X-MuLV的灭活动力学。根据示例性实施例，对于不同的目标pH条件，通过将LRF值针对时间点绘图来获得LRF曲线。

图4C示出了根据示例性实施例的在不同的目标pH条件下(例如，约pH 3.65、pH3.73或pH 3.80)在100mM NaCl下X-MuLV的灭活动力学。根据示例性实施例，对于不同的目标pH条件，通过将LRF值针对时间点绘图来获得LRF曲线。

图4D示出了根据示例性实施例的包含参数估计的预测的概况图，以评估在约pH3.70-3.75下含有约25mM NaCl的操作条件。

图4E示出了根据示例性实施例的包含参数估计的预测的概况仪，以评估在约pH3.70-3.75下含有约50mM NaCl的操作条件。

图4F示出了根据示例性实施例的包含参数估计的预测的概况图，以评估在约pH3.70-3.75下含有约80mM NaCl的操作条件。掺入后过滤的效应大小最小，并且未被包含在整体预测概况图中。

图5A示出了根据示例性实施例的针对15分钟时间点的LRF的多元线性回归模型的实际值相对于预测值。

图5B示出了根据示例性实施例的针对30分钟时间点的LRF的多元线性回归模型的实际值相对于预测值。

图6示出了根据示例性实施例的预测概况图，该预测概况图被创建以优化模型从而在15分钟和30分钟时间点之后均实现大于4LRF。根据示例性实施例，预测概况图将X-MuLV灭活表示为在D-最优DoE中评估的重要因素的函数。

图7示出了根据示例性实施例的预测的概况图，包含对于低pH保持在约pH 3.70-3.75的一些现有操作条件的参数估计。掺入后过滤的效应大小最小，并且未被包含在整体预测概况图中。

图8示出了根据示例性实施例的预测的概况图，其包含对于低pH保持在约pH3.65-3.70的重新设计的操作条件的参数估计。掺入后过滤的效应大小最小，并且未被包含在整体预测概况图中。

图9示出了根据示例性实施例的基于回顾性数据的针对包含IgG1和IgG2的蛋白质类型的在30分钟时间点的评估的因素的效应大小，评估的因素包含NaCl、pH、酸滴定剂、温度、蛋白质类型(mAb，单克隆抗体)、掺入定时及其组合以及X-MuLV LRF。

图10示出了根据示例性实施例的基于回顾性工业数据的对于不同温度条件的评估的因素的效应大小，评估的因素包含NaCl、pH、酸滴定剂、温度、蛋白质类型(mAb，单克隆抗体)、掺入定时及其组合和逆转录病毒LRF。

图11示出了根据示例性实施例的两种方法的评估的因素的效应大小，评估的因素包含NaCl、pH、酸滴定剂、温度、蛋白质类型(mAb，单克隆抗体)、掺入定时及其组合以及用于掺入/调节的时间。

具体实施方式

病毒清除对于制造生物药物产品非常重要，特别是对于使用哺乳动物细胞系(诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)生产的生物药物产品。对于设计纯化过程来说，确保病毒清除是很重要的。用于研究制造过程的病毒清除的典型工作流程包含：将样品负载掺入病毒，在小规模实验中运行该过程以模拟大规模步骤，以及记录清除掺入的病毒的能力。病毒灭活或去除的过程包含pH处理、热处理、溶剂/去污剂处理、过滤或色谱法。病毒清除的评估应当包含证明逆转录病毒样颗粒的特定模型病毒的去除，逆转录病毒样颗粒是CHO细胞的基因组中固有的(Anderson等人，来自重组中国仓鼠卵巢细胞系的缺陷性逆转录病毒样颗粒的内源性来源(Endogenous origin of defective retrovirus-like particles from arecombinant Chinese hamster ovary cell line)，《病毒学(Virology)》181(1):305-311,1991)。逆转录病毒是包膜RNA病毒，其使用逆转录酶从其RNA基因组产生DNA而在宿主细胞中繁殖。然后，产生的DNA被并入到宿主的基因组中进行复制。异嗜性鼠白血病病毒(X-MuLV)可以用作评估CHO细胞衍生的药物蛋白中病毒灭活的模型病毒。鼠白血病病毒(MuLV)是一种逆转录病毒并且具有经由逆转录复制的阳性单链有义RNA。MuLV可以在接种的小鼠中诱发白血病。

病毒减少或病毒清除是指在进行特定的过程步骤(诸如色谱法过程)后，输入样品和输出样品中的总病毒量或传染性病毒量之间的差异。病毒减少能力可以被定义为过程步骤的对数减少值(LRV)或对数(log₁₀)减少因子(LRF)。减少因子是基于应用清除步骤之前的总病毒负载和应用清除步骤之后的总病毒量来计算的。可以进行病毒验证研究，以记录与产品相关的已知病毒的清除，并且通过表征清除非特异性模型病毒的过程的能力来评估清除潜在的外来病毒污染物的过程的有效性。

本申请提供了一种统计学设计的实验，该实验可以用于评估和表征低pH保持步骤对病毒灭活的影响，包含评估几个因素，诸如蛋白质同种型、pH条件、温度、酸滴定剂、离子强度条件、掺入定时或掺入后过滤。当病毒灭活步骤在约pH 3.60-3.90的范围内进行时，通过经由增加低pH起始材料的电导率来操作离子强度，这些方法可以用于预测有效清除。由实验生成的模型可以用于预测在不同时间点(诸如在约15分钟和约30分钟时间点)在一系列过程条件下病毒(诸如X-MuLV)的清除。在一些示例性实施例中，除了pH条件对病毒灭活的影响之外，增加起始溶液的电导率也可以增加病毒灭活。例如，氯化钠(NaCl)浓度的增加可能是影响病毒灭活动力学以实现更大的病毒灭活的关键因素。在一个方面中，本申请提供了稳健和有效灭活病毒的优点，诸如对于X-MuLV的灭活来说大于约4LRF，这可以通过增加低pH起始材料的离子强度来实现。

根据ICH Q5A(R1)(源自人类或动物来源的细胞系的生物技术产品的病毒安全性评估(Viral safety evaluation of biotechnology products derived from celllines of human or animal origin)，《国际人用药品注册技术要求协调会议(International Conference on Harmonization of Technical Requirements forRegistration of Pharmaceuticals for Human Use)》，当前的步骤4版本，1999年9月23日)，开发了生物药物产品的下游纯化过程，以确保去除和/或灭活内源性或外来病毒污染物。典型的下游纯化过程可以并入几个正交的病毒清除步骤，包含一个灭活包膜病毒的专用步骤。低pH温育可以用于灭活包膜病毒，诸如衣壳的不可逆变性(Brorson等人，通过针对单克隆抗体和重组蛋白的低pH处理对啮齿动物逆转录病毒进行括号内的通用灭活(Bracketed generic inactivation of rodent retroviruses by low pH treatmentfor monoclonal antibodies and recombinant proteins)，《生物技术和生物工程(Biotechnol Bioeng)》82(3):321-329,2003)。过滤是基于大小的去除，其可以用于去除包膜病毒和非包膜病毒(Lute等人，在小病毒保留过滤器中延长的处理后的噬菌体传代，《生物技术和应用生物化学(Biotechnol Appl Biochem)》47(Pt 3):141-151,2007)。色谱法步骤可以用于纯化生物制品，其具有为病毒清除提供病毒减少的潜力，诸如使用蛋白质A色谱法(Bach等人，通过蛋白质A色谱法清除啮齿动物逆转录病毒XMuLV，《生物技术和生物工程》112(4):743750,2015)或阴离子交换色谱法(Strauss等人，阴离子交换色谱法提供稳健、可预测的过程以确保生物技术产品的病毒安全性(Anion exchange chromatographyprovides a robust,predictable process to ensure viral safety of biotechnologyproducts)，《生物技术和生物工程》102(1):168-175,2009a)。

低pH病毒灭活通常在蛋白质A捕获步骤之后进行，以在生物药物产品诸如单克隆抗体的纯化期间灭活病毒。从蛋白质A色谱法中洗脱的产物通常处于低pH，其被进一步酸化并保持至少30分钟以用于病毒灭活。病毒灭活的机制主要是通过基于pH的化学反应，导致病毒的表面糖蛋白的不可逆变性或脂质包膜的破坏(Brorson等人，上文)。在pH保持完成后，产物被中和并推进至进一步的下游处理。已经观察到低pH步骤可靠地产生4LRF的大包膜病毒(Miesegaes等人，单克隆抗体的病毒清除单位操作的分析(Analysis of viralclearance unit operations for monoclonal antibodies)，《生物技术和生物工程》2019；106:238-246)。先前的研究表明，离子强度可能会影响X-MuLV的灭活动力学。具有增加的离子强度的实验条件，诸如具有弱酸滴定的较高缓冲液浓度或较高蛋白质浓度，可以与pH 3.7和3.8下的较高LRV相关联(Chinniah等人，通过低pH处理的XMuLV灭活的操作参数的表征(Characterization of operating parameters for XMuLV inactivation by lowpH treatment)，《生物技术进展(Biotechnol Prog)》2016年1月至2月；32,(1),89-97,doi:10.1002/btpr.2183，电子版2015年11月5日)。

已经进行了研究来理解通过低pH保持的病毒清除。这些研究支持受pH、时间和温度影响的基于pH的化学反应(Brorson等人)。由于灭活步骤是稳健的，所以Brorson等人开发了一种“括号内的通用清除”，其中在小于或等于pH 3.8的pH条件下和在大于或等于14℃的温度下进行低pH灭活，保持最少30分钟，以实现始终大于或等于4.6log₁₀的X-MuLV清除。根据ASTM E2888-12(ASTM.E2888-12：通过pH灭活啮齿动物逆转录病毒过程的标准实施规程(Standard Practice for Process for Inactivation of Rodent Retrovirus bypH)，宾夕法尼亚西康舍霍肯(West Conshohocken,PA)：ASTM国际(ASTM International)；2012.http://www.astm.org)，ASTM(美国材料与测试协会(American Society forTesting and Materials))进一步将低pH保持的操作空间减小到小于或等于pH 3.6和大于或等于15℃的温度，以实现大于或等于5.0LRF。此外，根据ASTM E2888-12，保持时间大于或等于30分钟。

随着时间的推移，已经对指南进行了修订，以降低保持的pH，以便实现更大的LRF。为了获得ASTM E2888-12提供的通用清除，感兴趣的蛋白质应符合该文件定义的通用模式。有效的病毒灭活对于生物药物产品诸如单克隆抗体来说尤其可能具有挑战性，因为蛋白质暴露于低pH会改变蛋白质的质量或稳定性。卫生当局期望低pH保持在最坏的情况下得到验证。这表明逆转录病毒灭活是在高于实际制造范围的pH条件下确定的。当灭活步骤在这些范围之外操作时，病毒清除会受到损害。

在一些示例性实施例中，本申请提供了统计学设计的实验，例如实验设计，包含与低pH灭活步骤相关的受控因素和非受控因素，以确定蛋白质类型、pH条件、温度、酸滴定剂、NaCl含量、掺入定时或掺入后过滤在不同时间点对病毒灭活的影响。在一些方面中，本申请提供了实验因素和条件来定义可靠和有效的病毒清除的操作条件。在一些方面中，X-MuLV被选择作为模型内源性包膜病毒。在一些方面中，对两种类型的单克隆抗体(诸如IgG1或IgG4)进行各种参数测试，诸如pH、温度、酸滴定剂、离子强度、掺入定时或掺入后过滤。

用于多元分析的本申请的实验设计(例如实验的设计或DoE)包含在低pH保持下病毒灭活的表征。DoE是一种方法学，其允许在一个实验设计的范围内多个开发因素的系统变化。DoE的结果可以用于创建被检查的过程的数学模型。通过应用这些数学模型，可以识别经检查的过程的真正最优值。DoE结果的应用包含消除非实质性的开发因素，识别重要的开发因素以用于进一步研究，以及预测经检查的过程的性能。DoE是在系统的逻辑流程中进行的，包含陈述目标、选择可变因素和模型、创建实验设计以支持模型、基于设计收集数据、执行分析或使用检查点验证模型以及报告结果。DoE和所得模型的结果可以用于确认、拒绝或改变对病毒清除的低pH保持机制的现有理解。

在一些示例性实施例中，本申请提供了一种用于从包括一种或多种杂质(包含潜在传染性病毒颗粒)的样品中纯化抗体的方法，其中本申请的方法包括：调节样品的离子强度条件，将样品的pH条件调节至酸性pH，以及随后将样品在离子强度条件和pH条件下保持至少约15分钟以灭活一定量的病毒颗粒。在一个方面中，本申请的方法灭活该量的病毒颗粒的能力为至少约3LRF。在一个方面中，本申请的方法灭活该量的病毒颗粒的能力为至少约4LRF。在一个方面中，样品中的肽或蛋白质是在宿主细胞中产生的抗体。在一个方面中，抗体是单克隆抗体或双特异性抗体。在一个方面中，本申请的方法中的抗体是来自蛋白质A色谱法的洗脱液。

在一个方面中，本申请的方法中样品的pH条件小于或等于约pH 3.90。在一个方面中，样品的pH条件在约pH 3.60至约pH 3.90的范围内。在一个方面中，样品的pH条件在约pH3.65至约pH 3.80的范围内。在一些方面中，本申请的统计学设计的实验中的pH条件在约pH3.65至约pH 3.80的范围内，诸如在约pH 3.65、约pH 3.73或约pH 3.80，其大于或等于制造过程的pH范围。pH 3.65-3.80的pH范围大于并超出了ASTM E2888-12建议的pH范围，例如小于或等于pH 3.6。已知的是，更低的pH条件可以导致更快的病毒灭活(Brorson等人)。在一些方面中，本申请的统计学设计的实验中的温度在约15℃至约20℃的范围内(诸如约15℃或约20℃)，这在制造过程的温度范围的低端或更低。已知的是，更高的温度可以导致更快的灭活(Brorson等人)。约15℃至约20℃的温度范围在ASTM E2888-12建议的温度范围内，例如大于或等于15℃。在一些方面中，本申请的统计学设计的实验中的酸滴定剂是约0.25M磷酸或约0.25M甘氨酸HCl。在一些方面中，在本申请的统计学设计的实验中，添加到起始材料中的NaCl含量在约0mM至约100mM的浓度范围内。

在一些方面中，本申请的方法进一步包括通过运行D-最优DoE来优化一定量的病毒颗粒的灭活，以评估各种因素，包含样品的pH条件、样品的电导率、肽或蛋白质的类型、样品的温度、调节样品的pH条件的酸滴定剂、将病毒颗粒掺入到样品中的掺入定时或掺入后过滤的存在。在一些方面中，本申请的统计学设计的实验中的掺入定时是调节-掺入-重新调节方法或掺入-调节方法。调节-掺入-重新调节方法可以在整个保持时间期间提供恒定的期望pH范围。掺入-调节方法可以代表真实的制造条件，其中含有内源性逆转录病毒样颗粒的过程中中间体从起始pH酸化。在如图1A所示的调节-掺入-重新调节方法下，将样品调节/滴定至目标pH，然后掺入具有约pH 7.2的病毒贮备液。pH保持的定时从掺入时开始。由于在掺入病毒贮备液后观察到pH增加，因此在剩余的pH保持内保持在所需的温度之前，将样品的pH重新调节到目标pH。在如图1B所示的掺入-调节方法下，样品首先被掺入病毒贮备溶液，然后调节/滴定至目标pH。当达到目标pH时，开始pH保持的定时，并且将样品在所需的温度下温育。在本申请的统计学设计的实验的一些方面中，低pH保持可以在有或没有使用过滤器(诸如约0.2μm过滤器)的掺入后过滤的情况下进行。掺入后过滤代表真实的制造操作，其中过滤含有内源性逆转录病毒样颗粒的过程中中间体以保持无菌。过滤步骤可以产生单分散的病毒，这可以除去病毒聚集体。

在一些示例性实施例中，在不同的目标pH条件下，起始材料的电导率对影响病毒灭活动力学具有强烈影响。在一些示例性实施例中，本申请提供了在一系列过程条件下预测病毒清除的模型。在一些方面中，除了pH对病毒灭活的影响，离子强度或电导率的增加，诸如NaCl浓度，可能也是影响病毒灭活动力学的关键因素。在一个方面中，当负载材料具有低离子强度时，pH条件是重要因素。例如，X-MuLV灭活可能依赖于低离子强度下的pH条件。在一些方面中，当离子强度增加时，pH条件对病毒灭活的影响降低。例如，当离子强度增加时，X-MuLV可以在所有目标pH条件下快速灭活。在一些方面中，当存在约50mM或约100mM的NaCl时，对于约pH 3.65、约pH 3.73和约pH 3.80的目标pH条件，在约30分钟时间点观察到完全和有效的病毒清除，诸如X-MuLV的灭活。对于约pH 3.65和pH 3.73的pH条件，在15分钟后观察到X-MuLV的完全灭活。在一个方面中，使用添加氯化钠来调节样品的离子强度，其中氯化钠的浓度在约1mM至约100mM、约1mM至约500mM、约50mM或约100mM的范围内。

在生物药物产品的制造期间的低pH保持会对蛋白质(诸如单克隆抗体)的质量和稳定性产生重要影响。当通过操纵低pH起始材料的电导率在pH 3.60至pH 3.90的范围内操作病毒灭活时，本申请的模型可以用于预测有效清除。在一些方面中，本申请提供了通过向起始材料中添加NaCl来增加电导率可以在各种目标pH条件下实现快速有效的病毒灭活。在一个方面中，将本申请的方法中的样品保持在样品的离子强度条件和pH条件下持续至少约30分钟，以灭活该量的病毒颗粒。在一个方面中，将本申请的方法中的样品保持在样品的离子强度条件和pH条件下持续约15分钟至约30分钟，以灭活该量的病毒颗粒。

本申请中低pH保持的统计DoE的测试结果与ASTM标准在小于约3.60的pH时的5.0LRF X-MuLV灭活一致。结果还表明在大于约3.60的pH时稳健和有效的灭活。对于ASTM通用要求外的范围，结果表明增加NaCl含量可以实现快速和有效的X-MuLV灭活。通常，保持的pH取决于蛋白质的稳定性。当在pH 3.60和pH 3.90之间操作时，通过操纵低pH起始材料的电导率，本申请的模型提供了预测有效清除的优点。

提高生物药物产品的产品质量、功效和安全性的需求已经导致对有效和稳健的实验设计的需求不断增加，以确保病毒灭活。本公开提供了满足上述需求的方法。本文公开的示例性实施例通过提供用于从包括一种或多种杂质(包含病毒颗粒)的样品中纯化抗体的方法满足了前述需求。本申请通过增加低pH起始材料的离子强度提供了稳健和有效的病毒灭活，并且通过操纵低pH起始材料的离子强度以满足长期感觉到的需要提供了预测任何操作pH下的有效清除的模型。

术语“一个(a)”应理解为意指“至少一个”；并且术语“约(abount和approximately)”应理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的；并且在提供范围的情况下，包含端点。如本文所使用的，术语“包含(include/includes/including)”意指非限制性的并且被理解为分别意指“包括(comprise/comprises/comprising)”。

在一些示例性实施例中，本申请提供了一种用于从包括一种或多种杂质(包含病毒颗粒)的样品中纯化肽或蛋白质(诸如抗体)的方法。在一些示例性实施例中，本申请的方法包括：调节样品的离子强度条件，将样品的pH条件调节至酸性pH，以及随后将样品保持在离子强度条件和pH条件下持续至少约15分钟，以灭活一定量的病毒颗粒。在一个方面中，样品中的肽或蛋白质是在宿主细胞中产生的抗体。在一个方面中，肽或蛋白质是单克隆抗体或双特异性抗体。在一个方面中，肽或蛋白质是抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白、蛋白质药物产品或药物。

如本文所使用的，术语“蛋白质”或“感兴趣的蛋白质”可以包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体以及通过肽键连接的其合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可以包括一种或多种多肽以形成单一功能性生物分子。另一个示例性方面，蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可以包含任何生物治疗性蛋白质、用于研究或疗法的重组蛋白、陷阱蛋白和其他嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来生产，诸如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母属)、哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于最近讨论生物治疗性蛋白质及其生产的综述，参见Ghaderi等人，“用于生物治疗性糖蛋白的生产平台。非人唾液酸化的发生、影响和挑战(Production platforms for biotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,and challenges of non-human sialylation)”(Darius Ghaderi等人，用于生物治疗性糖蛋白的生产平台。非人唾液酸化的发生、影响和挑战，28《生物技术和基因工程综述(BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS)》147–176(2012))。在一些示例性实施例中，蛋白质包括修饰、加合物和其他共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包含例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其他单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAGtag、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记以及其他染料等。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白质，诸如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合蛋白，诸如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及源性蛋白质，诸如初级源性蛋白质和次级源性蛋白质。

在一些示例性实施例中，感兴趣的蛋白可以是重组蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白、scFv和其组合。

如本文所使用的，术语“重组蛋白”是指由于在已经引入到宿主细胞中的重组表达载体上携带的基因的转录和翻译而产生的蛋白质。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是融合蛋白。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是选自由以下组成的组的同种型的抗体：IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在某些示例性实施例中，抗体分子是全长抗体(例如，IgG1或IgG4免疫球蛋白)，或者可替代地抗体可以是片段(例如，Fc片段或Fab片段)。

如本文所使用的术语“抗体”包含包括四条多肽链、通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链以及其多聚体(例如，IgM)的免疫球蛋白分子。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，高变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施例中，抗大ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同或可以是天然的或经人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。如本文所使用的，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术衍生自完整抗体分子，标准技术诸如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成。可以通过化学方法或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。

如本文所使用的，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，诸如例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双功能抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域以及三功能抗体、四功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接。在一些示例性实施例中，抗体片段包括亲本抗体的足够的氨基酸序列，该氨基酸序列是该亲本抗体的片段，使得其如亲本抗体那样与同一抗原结合；在一些示例性实施例中，片段以与亲本抗体的亲和力相当的亲和力与抗原结合和/或与亲本抗体竞争以与抗原结合。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化酶促地或化学地产生和/或抗体片段可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。可替代地或另外地，抗体片段可以完全地或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包括至少约50个氨基酸，并且更通常包括至少约200个氨基酸。

短语“双特异性抗体”包含能够选择性结合两个或多个表位的抗体。双特异性抗体通常包括两条不同的重链，每条重链特异性结合两个不同分子(例如，抗原)上或同一分子上(例如，同一抗原上)的不同表位。如果双特异性抗体能够与两个不同的表位(第一表位和第二表位)选择性结合，则第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一至两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以位于相同或不同的靶标上(例如，位于相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。

典型的双特异性抗体具有两条重链，两条重链各自具有三条重链CDR，随后是CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域以及免疫球蛋白轻链，免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每条重链缔合，或可以与每条重链缔合且可以结合由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位，或可以与每条重链缔合且使得重链中的一个或两条重链能够与一个或两个表位结合。BsAb可以分成两个主要类别：一类是带有Fc区(IgG样)；以及另一类是缺乏Fc区，后者通常小于包括Fc的IgG和IgG样双特异性分子。IgG样bsAb可以具有不同的形式，诸如但不限于三功能抗体、旋钮成孔IgG(kih IgG)、crossMab、orth-Fab IgG、双可变结构域Ig(DVD-Ig)、二合一或双功能Fab(DAF)、IgG-单链Fv(IgG-scFv)或κλ体。非IgG样不同形式包含串联scFv、双抗体形式、单链双功能抗体、串联双功能抗体(TandAb)、双亲和力再靶向分子(DART)、DART-Fc、纳米抗体或通过对接锁定(DNL)方法产生的抗体(GaoweiFan、Zujian Wang和Mingju Hao，双特异性抗体及其应用(Bispecific antibodies andtheir applications)，8《血液学与肿瘤学杂志(JOURNAL OF HEMATOLOGY&ONCOLOGY)》130；Dafne Müller和Roland E.Kontermann，双特异性抗体(Bispecific Antibodies)，《治疗性抗体手册(Handbook of Therapeutic Antibodies)》265-310(2014))。产生BsAb的方法不限于基于两种不同的杂交瘤细胞系的体细胞融合的四杂交瘤技术、涉及化学交联剂的化学缀合以及利用重组DNA技术的基因方法。bsAb的实例包含在以下专利申请中公开的bsAb，专利申请特此通过引用并入：于2010年6月25日提交的美国序列号12/823838；于2012年6月5日提交的美国序列号13/488628；于2013年9月19日提交的美国序列号14/031075；于2015年7月24日提交的美国序列号14/808171；于2017年9月22日提交的美国序列号15/713574；于2017年9月22日提交的美国序列号15/713569；于2016年12月21日提交的美国序列号15/386453；于2016年12月21日提交的美国序列号15/386443；于2016年7月29日提交的美国序列号15/22343；以及于2017年11月15日提交的美国序列号15814095。在制造双特异性抗体期间的若干个步骤中可能存在低水平的同二聚体杂质。当使用完整质量分析进行时，由于同二聚体杂质的低丰度以及当使用常规液相色谱法进行时这些杂质与主要物质的共洗脱，此类同二聚体杂质的检测可能是具有挑战性的。

如本文所使用的，“多特异性抗体”或“Mab”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。虽然此类分子通常将仅与两种抗原(即，双特异性抗体，BsAb)结合，但具有另外特异性的抗体，诸如三特异性抗体和KIH三特异性抗体也可以通过本文所公开的系统和方法来解决。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以通过本领域的任何可获得或已知的方式源自单个克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的各种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。

在一些示例性实施例中，感兴趣的蛋白质可以从哺乳动物细胞中纯化。哺乳动物细胞可以是人来源的或非人来源的，且可以包含原代上皮细胞(例如，角质形成细胞、宫颈上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾脏上皮细胞和视网膜上皮细胞)、已建立的细胞系及其细胞株(例如，293胚肾细胞、BHK细胞、HeLa宫颈上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CHO细胞、BeWo细胞、Chang细胞、Detroit562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LSI80细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK2细胞、克隆M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-1细胞、LLC-PKi细胞、PK(15)细胞、GHi细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MHiCi细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞、BSC-1细胞、RAf细胞、RK细胞、PK-15细胞或其衍生物)、来自任何组织或器官的成纤维细胞(包含但不限于心脏、肝脏、肾脏、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺、腺样、扁桃体、骨髓和血液)、脾脏以及成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系(例如，CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、邓普斯细胞、Detroit 551细胞、Detroit 510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、Midi细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C3H/IOTI/2细胞、HSDMiC3细胞、KLN205细胞、McCoy细胞、小鼠L细胞、细胞株2071(小鼠L)细胞、L-M细胞株(小鼠L)细胞、L-MTK'(小鼠L)细胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞、SIRC细胞、Cn细胞和詹森细胞、Sp2/0、NS0、NS1细胞或其衍生物)。

在一些示例性实施例中，感兴趣的蛋白质可以是VEGF拮抗剂。如本文所使用的，“VEGF拮抗剂”是与VEGF结合或相互作用，抑制VEGF与其受体(VEGFR1和VEGFR2)结合，和/或抑制VEGF的生物信号传导和活性的任何药剂。VEGF拮抗剂包含干扰VEGF和天然VEGF受体之间相互作用的分子，例如，结合至VEGF或VEGF受体并阻止或以其他方式阻碍VEGF和VEGF受体之间相互作用的分子。具体的示例性VEGF拮抗剂包含抗VEGF抗体(例如，雷珠单抗(ranibizumab)

)、抗VEGF受体抗体(例如，抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体等)和基于VEGF受体的嵌合分子或VEGF抑制融合蛋白(本文中也被称为“VEGF陷阱”或“VEGF微小陷阱”)，诸如阿柏西普(aflibercept)、ziv-阿柏西普和具有SEQ ID NO.:42的氨基酸的蛋白质。VEGF陷阱的其他实例为ALT-L9、M710、FYB203和CHS-2020。VEGF陷阱的额外实例可以在美国专利号7,070,959、7,306,799、7,374,757、7,374,758、7,531,173、7,608,261、5,952,199、6,100,071、6,383,486、6,897,294和7,771,721中找到，这些美国专利通过引用以其整体被具体地并入本文。

基于VEGF受体的嵌合分子包含嵌合多肽，嵌合多肽包括VEGF受体的两个或更多个免疫球蛋白(Ig)样结构域，诸如VEGFR1(也被称为Flt1)和/或VEGFR2(也被称为Flk1或KDR)，并且还可以包括多聚化结构域(例如，Fc结构域，其促进多聚化，诸如两个或更多个嵌合多肽的二聚化)。示例性的基于VEGF受体的嵌合分子是被称为VEGFR1R2-FcΔC1(a)的分子(也被称为阿柏西普；以产品名

销售)。

如本文所使用的，术语“蛋白质药物产品”包含性质上可以是完全或部分生物的活性成分。在一些示例性实施例中，蛋白质药物产品可以包括肽、蛋白质、融合蛋白、抗体、抗原、疫苗、肽-药物缀合物、抗体-药物缀合物、蛋白质-药物缀合物、细胞、组织或其组合。在一些其他示例性实施例中，蛋白质药物产品可以包括肽、蛋白质、融合蛋白、抗体、抗原、疫苗、肽-药物缀合物、抗体-药物缀合物、蛋白质-药物缀合物、细胞、组织或其组合的重组的、工程化的、修饰的、突变的或截短的形式。

示例性实施例

本文公开的实施例提供了用于从包括一种或多种杂质(包含病毒颗粒)的样品中纯化肽或蛋白质(诸如抗体)的方法。本文公开的实施例还提供了基于统计实验设计的使用低pH保持进行病毒清除的方法。

在一些示例性实施例中，本申请提供了一种用于从包括一种或多种杂质(包含病毒颗粒)的样品中纯化肽或蛋白质(诸如抗体)的方法。在一些示例性实施例中，本申请的方法包括：调节样品的离子强度条件，将样品的pH条件调节至酸性pH，以及随后将样品保持在离子强度条件和pH条件下持续至少约15分钟，以灭活一定量的病毒颗粒。

在一个方面中，本申请的方法中样品的pH条件是酸性pH，小于或等于约pH 7，小于或等于约pH 6，小于或等于约pH 5，小于或等于约pH 4，小于或等于约pH 3.90，小于或等于约pH 3.80，小于或等于约pH 3.70，约pH 3.60至约pH 3.90，或约pH 3.65至约pH 3.80。

在一个方面中，将本申请的方法中的样品保持在样品的离子强度条件和pH条件下，以灭活该量的病毒颗粒持续至少约30分钟，至少约15分钟，约15分钟至约30分钟，至少约10分钟，至少约20分钟，至少约25分钟，至少约35分钟，约10分钟至约30分钟，约15分钟至约35分钟，约20分钟至约30分钟，约20分钟至约35分钟，或约25分钟至约40分钟。

在一个方面中，使用添加氯化钠来调节样品的离子强度，其中氯化钠的浓度在约1mM至约200mM、约1mM至约500mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约72mM、约80mM、约82mM、约90mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM的范围内。

应当理解，该方法不限于任何前述的肽、蛋白质、抗体、D-最优实验设计、病毒、逆转录病毒、病毒灭活、病毒清除、离子强度或pH条件。

如本文所提供的用数字和/或字母连续标记的方法步骤并不意味着将方法或其任何实施例限制为特定指示顺序。在整个说明书中引用了各种出版物，包含专利、专利申请、公开的专利申请、登录号、技术文章和学术文章。这些所引用的参考文献中的每个参考文献通过引用整体并且出于所有目的并入本文。除非另外描述，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。通过参考以下实例将更充分地理解本公开，提供这些实例以更详细地描述本公开。实例旨在说明并且不应被解释为限制本公开的范围。

实例

材料和试剂

1.模型蛋白质和缓冲液

在CHO细胞中表达的不同同种型的单克隆抗体被用作模型蛋白质，mAb 1指示IgG4同种型并且mAb 2指示IgG1同种型。模型蛋白质的等电点对于mAb 1被估计为8.8，并且对于mAb 2被估计为pH 9.3。使用标准蛋白质A色谱法来纯化单克隆抗体，并用40mM乙酸洗脱，得到约pH 4.2的池。单克隆抗体的浓度为约15g/L。

2.用于掺入和传染性测定的病毒贮备液

X-MuLV用于评估病毒灭活。X-MuLV病毒贮备液由药明康德(WuXi AppTec)(宾夕法尼亚费城(Philadelphia,PA))制备。一个批次的X-MuLV病毒贮备溶液具有约10⁷PFU/mL的滴度。对于所有的运行，在将病毒贮备溶液掺入到负载材料中之前，对其进行声波处理和过滤。在15分钟的时间点取出传染性样品并进行分析，其具有0.5mL的测定体积。在30分钟的时间点取出传染性样品并进行测试，其具有7mL的更大测定体积。使用PG4指示细胞对所有样品的X-MuLV传染性进行定量。在铺板之前，将样品中和至pH 6.5-7.5。病毒LRF是通过比较负载中存在的掺入的病毒量和池中存在的病毒量来计算的，如等式1所述，其中C(病毒，负载)表示负载中的病毒浓度，C(病毒，池)表示池中的病毒浓度，V(负载)表示负载体积，并且V(池)表示池体积。

等式1.病毒Log₁₀减少因子(LRF)的计算

在执行研究之前，针对样品评估样品基质对传染性测定的指示细胞系的细胞毒性作用。在掺入研究期间进行了额外的对照，以确保病毒的灭活是由于存在低pH保持而发生的，并且与蛋白质基质本身无关。

方法和装置

1.用于pH滴定和掺入的方法：

使用0.25M磷酸或0.25M甘氨酸HCl将样品滴定至所需的pH值。使用2M Tris碱中和酸性样品。如按照实验设计的指导，使用两种掺入方法中的一种进行每个灭活实验。在掺入方法1(例如，调节-掺入-重新调节方法)下，将样品调节/滴定至目标pH，然后掺入pH为约7.2的病毒贮备液。pH保持的定时从掺入时开始。由于在掺入病毒贮备液后观察到pH增加，因此在剩余的pH保持内保持在所需的温度之前，将样品的pH重新调节到目标pH。在掺入方法2(例如，掺入-调节方法)下，首先样品被掺入病毒贮备溶液，然后调节/滴定至目标pH。使用注射泵以适当的混合时间和速度进行酸添加，以代表大规模制造。当达到目标pH时，开始pH保持的定时，并且在所需的温度下温育样品。

对于掺入方法1和2，起始负载材料均掺入2％ X-MuLV病毒贮备液(v/v)。当掺入后过滤被指示为实验设计中的因素时，使用0.2μm PES过滤器(聚醚砜过滤器)。在pH保持持续期间，将散装材料在水浴中温育。水浴的温度是实验设计中的因素，其使用校准的温度计监测。所有pH测量都是离线进行的，其中从生物安全柜中的散装材料中取出2mL样品。

2.用于pH测量的装置

使用In Lab Expert Pro pH探针和SevenCompact S220 pH计(梅特勒托利多(Mettler Toledo)，俄亥俄哥伦布(Columbus,OH))进行pH值的测量。仪表设置为线性校准模式、严格的端点格式和自动温度补偿。pH计设置为将结果显示到小数点后两位。在使用前，将探针在电极储存溶液中平衡30至60分钟。使用具有pH 1.68、pH 4.01或pH 7.00的缓冲液(VWR，宾夕法尼亚拉德诺(Radnor,PA))校准探针。3点校准斜率百分比的标准在97.0-103.0％的范围内。在成功的校准后，测量pH 3.00和pH 6.00的独立缓冲液标准品，以确认准确度在缓冲液pH的±0.03pH单位内。每天完成最终样品后，重新测量独立标准品，以确认pH保持在目标pH。按照相同的标准来校准新的pH探针，并在研究执行的每一天使用，以将探针随时间的可变性最小化。

3.低pH保持的统计实验设计(DoE)

统计实验设计(DoE)用于评估和表征低pH保持步骤对逆转录病毒灭活的影响。评估了与低pH保持步骤相关的几个因素的影响，包含蛋白质类型、pH、温度、酸滴定剂、NaCl含量、掺入定时和掺入后过滤。软件用于设计统计DoE，以研究这些因素的影响。使用JMP软件版本13(SAS，北科罗拉多凯利(Cary NC))生成D-最优模型设计，诸如15次运行或30次运行。D-最优设计的散点图矩阵和多元相关性在图2A中示出。如表1所示的七个因素被构建到研究设计中，包含：蛋白质类型，诸如不同同种型的两种单克隆抗体(mAb)，例如IgG1或IgG4；pH，诸如pH 3.65、pH 3.73或pH 3.80；温度，诸如15℃或20℃；酸滴定剂，诸如0.25M磷酸或0.25M甘氨酸HCl；起始溶液中的NaCl含量，诸如0mM、50mM或100mM；掺入定时，诸如调节-掺入-重新调节方法或掺入-调节方法；和掺入后过滤，例如有或没有掺入后过滤。掺入溶液含有2％v/v掺入的X-MuLV纯化的贮备液。表1示出了这七个因素在设计矩阵中的实施，包含每个因素的具体水平或类型。

表1.实验设计中使用的因素

该设计评估了所有主要影响和一些相互作用。由相同的分析员在4天内执行总共30次运行，15个条件，2次重复。在三种NaCl含量水平(例如，0mM、50mM或100mM NaCl)下纳入了每种单克隆抗体的额外对照。在两个时间点(T)，诸如15或30分钟，使用传染性测定来分析样品。在第15分钟和第30分钟，应答是X-MuLV LRF。使用

(来自SAS的统计软件)通过最小二乘估计进行建模。方差分析(ANOVA)用于识别具有统计学意义(P<0.05)的因素和相互作用。去除所有非显著性因素(P>0.05)、共线因素(VIF>5)和异常值运行(由刀切距离确定)。

对每种单克隆抗体条件进行如图2B所示的中性对照。进行中性对照以确保测量的病毒活性是低pH下化学灭活的结果。将负载材料的pH调节至约pH 6.5-7.5。预期观察不到清除，以便证明病毒灭活不是由单独的蛋白质基质引起的。从预过滤和后过滤步骤中获取样品，以监测过滤器上潜在的病毒损失。单克隆抗体的每种情况都具有代表性的中性对照，以用作数据分析的负载材料。环境的温度可能会影响pH测量。所有病毒处理、调节和pH测量都在室温下发生。在两种不同的温度条件下，在水浴中温育散装测试制品。使用MettlerToledo Expert Pro进行测量。

实例1.研究对低pH保持具有影响的因素

如表1所示，通过D-最优实验设计，研究了蛋白质类型、pH、温度、酸滴定剂、NaCl含量、掺入定时和掺入后过滤对低pH保持的X-MuLV灭活的影响。用相同的病毒贮备液、人员、缓冲液和设备在连续4天内进行15次重复运行。对每种单克隆抗体(mAb)条件(mAb类型和NaCl含量，N＝6)进行中性对照，并且用作数据分析的负载样品。在表2中列出了15分钟和30分钟两个时间点的每个运行条件和所得的LRF值。表2示出了实验设计的数据汇总。在30分钟后，在30次运行中的22次中没有检测到病毒。在30分钟后，除了在数据分析期间作为异常值去除的2次运行外，每次重复运行的LRF彼此在0.5LRF内。基于pH测量值、酸添加或负载材料，在数据集中没有显著的日复一日或运行至运行的可变性。

在表2中，关于目标pH，将样品调节至±0.02pH单位范围内的目标pH。关于NaCl含量，在使用酸进行滴定至低pH之前，将NaCl添加到散装材料中。“>”的符号表示病毒减少到低于测定的检测极限。P表示磷酸。G表示甘氨酸HCl。一些特定的运行被刀切距离确定为异常值，并且在进一步的数据分析之前被去除。在传染性测定之前，评估样品基质对指示细胞系中病毒繁殖的干扰，使得可以识别非干扰的稀释度。基于观察到的干扰，以3倍稀释度报告运行。一次重复运行意外干扰了3倍稀释度的传染性测定，并且报告的值为10倍稀释度，这防止了干扰。该运行通过刀切距离被确定为异常值，并从数据分析中去除。

表2.实验设计的数据汇总

实例2.在不同目标pH下X-MuLV灭活动力学的分析

统计实验设计(DoE)用于评估和表征低pH保持步骤对病毒灭活的影响，包含几个因素的评估，诸如蛋白质类型、pH条件、温度、酸滴定剂、起始溶液的离子强度、掺入定时和掺入后过滤。统计DoE用于评估和表征低pH保持步骤对病毒灭活的影响。分析了根据不同目标pH的X-MuLV的灭活动力学。测试在15分钟和30分钟的时间点的样品的X-MuLV传染性，以评估低pH保持的初始灭活(例如15分钟)和结束时(例如30分钟)的灭活。图3A-3C示出了在目标pH 3.65、pH 3.73或pH 3.80时X-MuLV的灭活动力学。通过将LRF值针对每个pH值的时间点绘图来获得LRF曲线。如图3A-3C所示，空心圆圈表示在样品中没有检测到病毒，并且十字表示在样品中检测到病毒。红色线对应于在pH 3.65±0.02下进行的每次运行；绿色线对应于在pH 3.73±0.02下进行的每次运行；并且蓝色线对应于在pH 3.80±0.02下进行的每次运行。如图3A所示，对于pH 3.65的运行，在15分钟的时间点，在任何样品中都没有检测到病毒，这表明病毒的快速灭活(检测极限为约2.5PFU/mL)。在pH 3.65运行的30分钟时间点，2次运行显示检测到病毒。然而，这两次运行的结果接近测定的检测极限(约1.0PFU/mL)。在pH 3.65±0.02时，在30分钟的时间点，所有LRF均大于5.0。对于pH 3.73和pH 3.80的运行，存在一些不一致，如图3B和图3C所示，因为在运行之间出现差异。在pH 3.73或pH 3.80下的一些运行显示出与pH 3.65运行类似的快速灭活。在pH 3.73或pH 3.80下的一次或两次运行显示在30分钟时不完全灭活。这些运行的可变性表明，另一个因素可能比pH条件具有更强的影响。

实例3.在不同NaCl含量下X-MuLV灭活动力学的分析

对表2中显示在30分钟时间点检测到逆转录病毒的运行进行了更多的分析。分析了这些在30分钟后检测到病毒的运行中的共同因素，例如NaCl含量。在起始负载材料中不添加NaCl的情况下进行运行。对于每一水平的添加的NaCl，通过将LRF值针对时间点绘图来获得LRF曲线。图4A-4C示出了在0mM(图4A)、50mM(图4B)或100mM(图4C)的NaCl含量下X-MuLV的灭活动力学。如图4A-4C所示，空心圆圈表示在样品中没有检测到病毒，并且十字表示在样品中检测到病毒。红色线对应于在约pH 3.65±0.02下进行的每次运行；绿色线对应于在约pH 3.73±0.02下进行的每次运行；并且蓝色线对应于在pH 3.80±0.02下进行的每次运行。

结果表明，在不同的目标pH条件下，起始溶液的电导率对影响X-MuLV灭活动力学具有强烈的影响。NaCl含量被确定为对逆转录病毒灭活具有最大的影响。如图4A所示，当负载材料具有低离子强度时，或者当没有额外的NaCl添加到起始材料中时，pH条件是重要的因素。数据表明，在低离子强度下，X-MuLV的灭活依赖于pH。然而，当离子强度增加时，例如NaCl浓度增加，没有观察到不同目标pH条件的影响，因为X-MuLV在所有三种目标pH条件下都迅速灭活。换句话说，当NaCl的浓度增加时，pH条件对X-MuLV灭活的影响降低。当添加50mM或100mM的NaCl时，对于分别如图4B(50mM NaCl)或图4C(100mM NaCl)所示的pH 3.65、pH 3.73和pH 3.80的目标pH条件，在30分钟时间点对于所有运行都观察到X-MuLV的完全和有效清除。在低电导率下(例如，低NaCl含量)，pH对X-MuLV灭活具有强烈的影响。在较高的电导率下(例如，较高的NaCl含量)，pH对X-MuLV灭活没有影响。与0.25M磷酸相比，0.25M甘氨酸HCl显示出增加的X-MuLV灭活。

实例4.多元线性回归模型的生成

为了研究不同因素的影响，生成了多元线性回归模型以研究所评估的因素的主要影响、二次性和相互作用。此外，还对15和30分钟时间点的离子强度对X-MuLV灭活的影响进行了量化。如表3所示，生成的模型具有约99％的经调节的R²值，包含<0.15LRF的误差估计，而报道的传染性测定的可变性为0.5LRF(ICH Q5A(R1))。在表3中，R²表示相关系数；经调节的R²表示由模型解释的变化量；并且RMSE表示该方法中误差估计的均方根误差。表4示出了每个模型的显著(P<0.05)因素的列表。图5A和图5B中示出了实际图相对于预测的图。在图5A和图5B中示出了两个时间点，例如15分钟(图5A)或30分钟(图5B)的LRF的多元线性回归模型的实际值相对于预测值的图。在图5A和图5B中，红色线表示拟合线，蓝色线表示平均值线，并且红色阴影线表示95％置信区间。

表3.适用于每个时间点的显著多元线性回归模型

时间点(min)	R<sup>2</sup>	经调节的R<sup>2</sup>	RMSE(LRF)
				15	0.99	0.99	0.08
30	0.99	0.99	0.15

表4.从每个时间点生成的LRF多元线性回归模型确定的显著因素

对于15分钟和30分钟生成的LRF模型的显著参数是相同的，显示了相似的效应大小趋势。然而，mAb和pH之间的相互作用是例外的，因为它仅对30分钟LRF模型有意义。已知pH条件对病毒灭活很重要。然而，该模型表明NaCl在15和30分钟时间点对X-MuLV灭活表现出最强的影响。当NaCl浓度增加时，X-MuLV的LRF相应增加，直到离子强度对灭活没有影响。被确定为重要的其他因素是NaCl含量的二次性、pH和NaCl含量之间的相互作用以及pH条件。根据图6可以解释NaCl浓度对灭活动力学的影响。当NaCl浓度增加时，pH对X-MuLV灭活的影响减小。

在线性回归模型中，温度、mAb、掺入后过滤、酸滴定剂、掺入方法以及pH和mAb之间的相互作用的主要影响都是显著的。然而，这些因素的效应大小小于报道的传染性测定的可变性(例如，0.5LRF)。尽管这些因素在生成的模型中是显著的(P<0.05)，但它们实际上并不显著，因为效应大小小于传染性测定的可变性。已知温度对病毒灭活具有影响，因为较低的温度与降低的灭活动力学有关。然而，由于在15℃至20℃的范围内操作，该数据集支持灭活的最小差异。

如图6所示，创建预测概况图来优化模型以在15分钟和30分钟时间点之后均实现大于4LRF。图6示出了表示作为在D-最优DoE中评估的显著因素的函数的X-MuLV灭活的预测概况图：红色线表示拟合线；蓝色线表示平均值线；红色阴影线表示95％置信区间；P表示磷酸；G表示甘氨酸HCl。在所有其他因素保持不变的情况下，通过在约pH 3.60至3.90的范围内操作病毒灭活时添加NaCl来增加电导率可以导致更大的逆转录病毒LRF。

本申请中低pH保持的统计DoE的测试结果与在小于3.60的pH时5.0LRF X-MuLV灭活的ASTM标准一致。结果还显示在大于3.60的pH时稳健和有效的灭活。对于ASTM通用要求外的范围，结果表明增加NaCl含量可以实现快速和有效的X-MuLV灭活。通常，保持的pH取决于蛋白质的稳定性。当在pH 3.60-3.90的范围内操作病毒灭活时，通过操纵低pH起始材料的电导率，本申请的模型可以用于预测有效清除。

据报道，高蛋白质浓度(诸如大于25g/L)负面地影响X-MuLV灭活(ASTM)。然而，以前的Regeneron研究表明，在其中灭活可能不完全的情况下，较高的蛋白质浓度可以潜在地改善X-MuLV灭活动力学。具有增加的离子强度的条件，诸如较高的缓冲液浓度、弱酸的滴定或较高的蛋白质浓度，与较高pH下较高的LRF相关(Chinniah等人)。尽管本申请的数据集使用了两种具有相似浓度的单克隆抗体，但是来自数据的结论与蛋白质浓度的增加会增加灭活的结论一致。由于达到所需pH所需的酸滴定剂增加，因此在滴定期间添加更多的离子。结果是溶液的离子强度增加，并且该实验将暗示更大的灭活动力学。

与蛋白质浓度的影响相似，存在通过酸滴定剂的模型观察到的显著差异，其中甘氨酸HCl酸滴定剂(弱酸)与磷酸滴定剂(强酸)的较高LRF值相关。这一结论实际上并不显著，因为效应大小小于0.5LRF。结果支持由于溶液中离子浓度的增加而增加的灭活。先前的研究表明由于病毒灭活的热力学，在较低的温度下清除较低。温度在生成的线性回归模型中具有统计学意义，但在所研究的范围内(15℃至20℃)具有最小的效应大小。先前的研究得出结论，在15℃和16+℃之间，病毒灭活没有统计学上的显著差异(Mattila等人，对来自多家公司合作的低pH病毒灭活和病毒过滤数据的回顾性评估(Retrospective evaluationof low-pH virus inactivation and viral filtration data from a multiplecompany collaboration)，《PDA制药科学与技术杂志(PDA Journal of PharmaceuticalScience and Technology)》70.3(2016):293-299)。本申请的实验支持了ASTM通用病毒清除要求，以及识别了在大于pH 3.60时实现逆转录病毒的有效灭活的溶液。在较高的pH下，增加溶液的离子强度可以促进病毒的分散。在低电导率溶液中，逆转录病毒糖蛋白可以潜在地在低pH下聚集，并保护自身免受化学损伤。在添加50mM和100mM的NaCl的情况下，在所有pH设定点的所有运行在30分钟后均显示出完全和有效的清除。总之，当实验在ASTM标准要求范围之外的pH下操作时，可以为有效的X-MuLV灭活定义操作空间。

实例5.评估现有的和重新设计的操作条件

统计实验设计(DoE)用于评估和表征低pH保持步骤对病毒灭活的影响，包含评估几个因素，诸如蛋白质类型、pH条件、温度、酸滴定剂、NaCl含量、掺入定时和掺入后过滤。用于低pH保持步骤的DoE被用于评估在pH 3.70-3.75下用于低pH保持的一些现有操作条件。如图7所示，生成了包含参数估计的预测的概况图。

用于低pH保持步骤的DoE还用于评估在pH 3.65-3.70下用于低pH保持的一些现有的重新设计的操作条件。如图8所示，生成了包含参数估计的预测的概况图。在约pH 3.65-3.70下的重新设计的操作条件在30分钟时间点以1.5％的失败率未能满足4LRF X-MuLV清除。

实例6.评估蛋白质类型的因素

统计DoE用于评估和表征低pH保持步骤对病毒(X-MuLV)灭活的影响，包含评估几个因素，诸如蛋白质类型、pH条件、温度、酸滴定剂、NaCl含量、掺入定时和掺入后过滤。DoE在蛋白质类型(诸如单克隆抗体的同种型)的多元模型的预测中显示出统计学意义，但在研究范围内，蛋白质类型(诸如IgG 1和IgG4)之间的差异没有意义，如图9所示。图9示出了评估的因素的缩放的估计LRF，包含NaCl、pH、酸滴定剂、温度、蛋白质类型(mAb，单克隆抗体)、掺入定时及其组合。现有操作条件的回顾性数据显示在同种型的单克隆抗体(诸如IgG1和IgG4)之间的显著差异。然而，这些差异可能是由于操作pH范围的差异引起的。图9还出示了基于回顾性数据的蛋白类型(包含IgG1和IgG2)在30分钟时间点的X-MuLV LRF。

实例7.评估温度的因素

统计DoE用于评估和表征低pH保持步骤对病毒(X-MuLV)灭活的影响，包含评估几个因素，诸如蛋白质类型、pH条件、温度、酸滴定剂、NaCl含量、掺入定时和掺入后过滤。DoE在温度的多元模型的预测中显示出统计学意义，但不同温度条件之间的差异对研究范围内的X-MuLV清除具有最小的影响，如图10所示。图10示出了评估的因素的缩放的估计LRF，包含NaCl、pH、酸滴定剂、温度、蛋白质类型(mAb，单克隆抗体)、掺入定时及其组合。来自在15℃到20℃范围内的工业操作条件(Mattila等人)的回顾性数据显示，在15±1℃和16+℃之间没有统计上的显著差异。图10还示出了基于回顾性工业数据的对于不同温度条件的逆转录病毒LRF。

实例8.评估掺入定时的因素

统计DoE用于评估和表征低pH保持步骤对病毒(X-MuLV)灭活的影响，包含评估几个因素，诸如蛋白质类型、pH条件、温度、酸滴定剂、NaCl含量、掺入定时和掺入后过滤。本申请的统计学上的DoE中的掺入定时是调节-掺入-重新调节方法或掺入-调节方法。在调节-掺入-重新调节方法下，将样品调节/滴定至目标pH，然后掺入具有pH 7.2的病毒贮备液。pH保持的定时从掺入时开始。由于在掺入病毒贮备液后观察到pH增加，因此在剩余的pH保持内保持在所需的温度之前，将样品的pH重新调节到目标pH。在掺入-调节方法下，首先样品被掺入病毒贮备溶液，然后调节/滴定至目标pH。当达到目标pH时，开始pH保持的定时，并且将样品在所需的温度下温育。

如图11所示，在研究范围内，两种不同方法的掺入定时的差异在X-MuLV清除上没有有意义的差异。图11示出了评估的因素的缩放的估计LRF，包含NaCl、pH、酸滴定剂、温度、蛋白质类型(mAb，单克隆抗体)、掺入定时及其组合。图11还示出了用于两种方法的掺入/调节的时间。

Claims (31)

1.一种用于从样品中纯化肽或蛋白质的方法，所述方法包括：

通过添加盐使所述样品经受增加的离子强度，

使所述样品经受酸性pH，和

随后将所述样品保持在所述离子强度条件和所述pH条件下持续至少约15分钟，以灭活一定量的病毒颗粒，

其中所述样品包括一种或多种包含所述病毒颗粒的杂质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒颗粒灭活的所述量为至少约3LRF(对数减少因子)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒颗粒灭活的所述量为至少约4LRF。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品的所述pH条件小于或等于约pH3.90。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品的所述pH条件在约pH 3.60至约pH 3.90的范围内。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品的所述pH条件在约pH 3.65至约pH 3.80的范围内。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽或蛋白质是在宿主细胞中产生的抗体。

8.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样品保持在所述离子强度条件和所述pH条件下持续至少约30分钟，以灭活所述量的所述传染性病毒颗粒。

9.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样品保持在所述离子强度条件和所述pH条件下持续约15分钟至约30分钟，以灭活所述量的所述传染性病毒颗粒。

10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过运行D-最优实验设计来优化所述样品的所述离子强度和所述pH条件以灭活所述量的所述传染性病毒颗粒。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述D-最优实验设计评估所述样品的所述pH条件和所述样品的所述离子强度，并且调节所述样品的所述pH条件和所述样品的所述离子强度以灭活一定量的传染性病毒颗粒。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述D-最优实验设计进一步评估和调节以下中的一项或多项：

所述样品的电导率；

所述肽或蛋白质的类型；

所述样品的温度；

调节所述样品的所述pH条件的酸滴定剂；

用于将所述病毒颗粒掺入到所述样品中的方法；或者

掺入后过滤的存在。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是来自蛋白质A色谱法的洗脱液。

14.根据权利要求1所述的方法，其中使用添加氯化钠来调节所述样品的所述离子强度，其中所述氯化钠的浓度在约1mM至约100mM的范围内。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述氯化钠的所述浓度在约1mM至约500mM的范围内。

16.T根据权利要求1所述的方法，其中所述氯化钠的所述浓度为约25mM、约50mM或约100mM。

17.根据权利要求1所述的方法，其中使用磷酸或甘氨酸HCl来调节所述样品的所述pH条件。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽或蛋白质是具有IgG1同种型或具有IgG4同种型的抗体。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽或蛋白质是单克隆抗体或双特异性抗体。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽或蛋白质是抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白、蛋白质药物产品或药物。

21.一种从具有感兴趣的蛋白质和传染性病毒颗粒的样品产生包括所述感兴趣的蛋白质和减少量的病毒颗粒的制剂的方法，其包括：

使所述样品经受大于约3.6的pH；

通过向起始溶液中添加盐使所述样品经受离子强度条件的增加；和

将所述样品保持在所述pH和离子强度条件下持续适当的时间量，以产生包括所述感兴趣的蛋白质和所述减少量的传染性病毒颗粒的所述制剂。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述样品中所述感兴趣的蛋白质的浓度大于约25g/L。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述适当的时间量为约15分钟、约20分钟、约25分钟或约30分钟。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法将来自样品的传染性病毒颗粒的量减少约3LRF(对数减少因子)。

25.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法将来自样品的传染性病毒颗粒的量减少约4LRF(对数减少因子)。

26.根据权利要求21所述的方法，其中所述样品的所述pH条件大于约pH 3.70、约3.80、约pH 3.90或约pH 4.0。

27.根据权利要求21所述的方法，其中所述样品的所述pH条件在约pH 3.60至约pH 4.0的范围内。

28.根据权利要求21所述的方法，其中所述样品是来自蛋白质A色谱法的洗脱液。

29.根据权利要求21所述的方法，其中使用添加氯化钠来调节所述样品的所述离子强度，其中所述氯化钠的浓度在约1mM至约200mM的范围内。

30.根据权利要求21所述的方法，其中所述盐的浓度大于约50mM，或约100mM。

31.根据权利要求21所述的方法，其中使用磷酸或甘氨酸HCl来调节所述样品的所述pH条件。

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