KR20230009475A

KR20230009475A - 낮은 pH 유지에 의한 바이러스 클리어런스(clearance)

Info

Publication number: KR20230009475A
Application number: KR1020227043275A
Authority: KR
Inventors: 제나 다야; 발레리 안 쿠시크; 존 마틸라
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2021-05-11
Publication date: 2023-01-17
Also published as: CA3181779A1; IL298039A; MX2022014241A; EP4149545A1; JP2023526013A; CN115803052A; US20210348131A1; AU2021272911A1; WO2021231463A1; BR112022022288A2

Abstract

실험의 통계적 설계에 기반하여 낮은 pH 유지를 사용한 바이러스 클리어런스를 위한 방법이 제공된다. 바이러스 불활성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 영향을 특징화하기 위해, pH 조건, 전도성 조건, 단백질 유형, 온도, 산 적정제, 소량첨가 타이밍, 및 소량첨가-이후 여과의 요소를 포함하는 여러가지 요소가 평가된다. 바이러스 불활성화에의 pH의 효과에 더하여, 전도성을 조작하는 것을 통한 이온 강도의 증가는 바이러스 불활성화 동역학에 영향을 끼치는 주요한 구성요소일 수 있다.

Description

낮은 pH 유지에 의한 바이러스 클리어런스(clearance)

관련 출원의 상호-참조

본 출원은 2020년 5월 11일에 제출된 미국 가출원 특허 번호 63/023,154에 대해 우선권 및 이의 이익을 주장하며, 이 문헌은 본원에 참조로 통합된다.

본 발명은 일반적으로 낮은 pH 유지 단계를 사용하여 단백질 시료 중의 바이러스 입자를 불활성화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 여러가지 요소를 통합하는 실험의 통계적 설계가 바이러스 불활성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 영향을 평가하고 특징화하기 위해 사용된다.

생물학적 제품은 박테리아, 진균 및 바이러스로부터 오염(내인성 오염 물질 및 외래의(외부의 공급원으로부터 온) 오염 물질)되기 쉽다. 바이러스 클리어런스, 예를 들어, 바이러스 불활성화는 포유류 세포주를 사용하여 생산되는 생물약제학적 제품의 제조 동안 중요한 단계이다. 포유류 세포 배양물의 성장 동안 바이러스 오염이 증폭될 수 있으므로, 세계 보건 당국은 생물제제 또는 생명공학 제품을 제조하기 위한 바이러스 클리어런스의 평가를 요구한다. 효과적인 바이러스 클리어런스 연구는 공정 밸리데이션(validation)의 중요한 부분이며, 이는 또한 약물 안전성을 보장하는 데에 중요하다. 바이러스 오염은 원자재, 세포 배양 공정, 생물 반응기 및 다운스트림(downstream) 정제 공정에도 또한 영향을 미칠 수 있다.

바이러스 밸리데이션 연구는 바이러스 안전성을 확실하게 하기 위해 제품 품질과 관련하여 선택된 작용 조건을 문서화하도록 설계된다. 바이러스 클리어런스 연구의 실험적 설계는 유의한 개발 요소를 식별하여 공정 조건의 이해를 개선하고 최악의 경우를 고려한 조건의 선택을 정당화하기 위한 제조 공정의 특징화를 포함한다. 바이러스 불활성화 또는 제거의 공정은 pH 처리, 열 처리, 용매/계면활성제 처리, 여과 또는 크로마토그래피를 포함한다. 낮은 pH 인큐베이션의 경우 바이러스 불활성화의 메커니즘은 바이러스의 표면 당단백질의 비가역적 변성 또는 지질 외피(envelope)의 파괴를 야기하는 pH-기반 화학 반응을 포함한다.

생물약제학적 제품의 제조 공정에서 조정된 pH 조건은 바이러스 불활성화에 효과적이지 않을 수 있다. 그러나, 바이러스 불활성화에 필요한 pH는 다른 제조 조건에서 사용되는 pH 범위와 유의적으로 상이할 수 있다. 생물약제학적 제품의 낮은 pH 노출은 단백질의 질 또는 안정성을 변경시킬 수 있으므로, 단백질 시료에서 효과적인 바이러스 불활성화를 수득하기 위해 낮은 pH 인큐베이션을 사용하는 것은 생물약제학적 제품을 제조하기에 힘들다. 생물약제학적 제품의 제조 동안 바이러스 불활성화를 위한 낮은 pH 유지 단계의 영향을 평가하고 특징화하는 방법에 대한 필요성이 존재함이 인식될 것이다. 이들 방법은 제조 공정, 예컨대 정제 공정을 설계하기 위해 바이러스 불활성화를 보장하는 효과적이고 강력한 실험 설계를 제공해야 한다.

본 출원은 바이러스 불활성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 영향을 평가하고 특징화하는 여러가지 요소를 통합하는 실험의 통계적 설계에 기반하여 낮은 pH 유지를 사용한 바이러스 클리어런스를 위한 방법을 제공한다. 통계적으로 설계된 실험은 바이러스 불활성화에 대한 pH 조건, 이온 강도 조건, 단백질 아이소형(isotype), 온도, 산 적정제, 소량첨가(spike) 타이밍, 및 소량첨가-이후 여과의 효과를 평가하기 위해 사용된다. 이들 방법은, 바이러스 불활성화 단계가 약 pH 3.60-3.90의 범위에서 수행될 때, 예를 들어, 낮은 pH 시작 물질의 이온 강도를 조작함으로써, 효과적인 클리어런스를 예측하기 위해 사용될 수 있다.

본 개시내용은 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항체를, 바이러스 입자를 포함하는 하나 이상의 불순물을 포함하는 시료로부터 정제하기 위한 방법을 제공한다. 일부 예시적인 구현예에서, 본 출원의 방법은 다음을 포함한다: 시료의 이온 강도 조건을 조정하는 단계, 시료의 pH 조건을 산성 pH로 조정하는 단계, 및 후속으로 시료를 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 15분 동안 유지하여 다량의 바이러스 입자를 불활성화시키는 단계; 여기서 시료는 바이러스 입자를 포함하는 하나 이상의 불순물을 포함한다. 일 양태에서, 본 출원의 방법을 사용함에 있어서 바이러스 입자 불활성화의 양은 적어도 약 3 LRF(대수 감소 인수(logarithmic reduction factor))이다. 일 양태에서, 본 출원의 방법을 사용함에 있어서 바이러스 입자 불활성화의 양은 적어도 약 4 LRF이다.

일 양태에서, 본 출원의 방법에서 시료의 pH 조건은 약 pH 3.90 이하이다. 일 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.60 내지 약 pH 3.90의 범위 내에 있다. 또다른 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.65 내지 약 pH 3.80의 범위 내에 있다. 또다른 양태에서, 시료 중의 펩티드 또는 단백질은 숙주-세포에서 생산된 항체이다. 여전히 또다른 양태에서, 본 출원의 방법에서 시료는 시료의 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 30분 동안 유지되어 다량의 바이러스 입자를 불활성화시킨다. 일 양태에서, 본 출원의 방법에서 시료는 시료의 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 15분 내지 약 30분 동안 유지되어 다량의 바이러스 입자를 불활성화시킨다.

일 양태에서, 본 출원의 방법은 실험의 D-최적 설계(Optimal design)를 실행함으로써 다량의 바이러스 입자의 불활성화를 최적화하는 단계를 추가로 포함한다. 또다른 양태에서, 실험의 D-최적 설계는 다음의 요소를 평가한다: 시료의 pH 조건, 및 시료에 첨가된 염 농도. 일 양태에서, 실험의 D-최적 설계는 다음의 요소를 추가로 평가한다: 펩티드 또는 단백질의 유형, 시료의 온도, 시료의 pH 조건을 조정하기 위한 산 적정제, 시료에 바이러스 입자를 소량첨가(spiking)하는 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 존재.

일 양태에서, 본 출원의 방법에서 시료는 단백질 A 크로마토그래피의 용리액이다. 또다른 양태에서, 시료의 이온 강도는 염화나트륨의 첨가를 사용하여 조정되며, 여기서 염화나트륨의 농도는 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 25 mM, 약 50 mM, 약 72 mM, 약 82 mM, 약 100 mM, 약 125 mM, 약 150 mM, 약 175 mM, 또는 약 200 mM의 범위 내에 있다. 일 양태에서, 시료의 pH 조건은 인산 또는 글리신 HCl을 사용하여 조정된다. 또다른 양태에서, 방법의 시료 중의 펩티드 또는 단백질은 IgG1 아이소형을 갖거나 IgG4 아이소형을 갖는 항체이다. 일 양태에서, 펩티드 또는 단백질은 단클론성 항체 또는 이중특이적 항체이다. 여전히 또다른 양태에서, 펩티드 또는 단백질은 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체(conjugate), 융합 단백질, 단백질 약제학적 제품 또는 약물이다.

본 개시내용은 관심있는 단백질 및 감염성 바이러스 입자를 갖는 시료로부터 관심있는 단백질 및 감소된 양의 감염성 바이러스 입자를 포함하는 제제(preparation)를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 예시적인 구현예에서, 관심있는 단백질 및 감염성 바이러스 입자를 갖는 시료로부터 관심있는 단백질 및 감소된 양의 감염성 바이러스 입자를 포함하는 제제를 생산하는 방법은 시료가 약 3.60의 pH 초과의 pH 및 약 100 mM까지의 농도로 염의 첨가에 의한 이온 강도 조건을 겪도록 하는 단계; 및 시료를 pH 및 이온 강도 조건에서 적절한 양의 시간 동안 유지하여 관심있는 단백질 및 감소된 양의 감염성 바이러스 입자를 포함하는 제제를 생산하는 단계를 포함한다.

일 양태에서, 시료 중의 관심있는 단백질의 농도는 약 25 g/L 미만이다.

일 양태에서, 적절한 양의 시간은 약 15분, 약 20분, 약 25분, 또는 약 30분이다.

일 양태에서, 방법은 시료로부터 감염성 바이러스의 양을 약 3 LRF(대수 감소 인수)까지 감소시킨다. 또다른 양태에서, 방법은 시료로부터 감염성 바이러스의 양을 약 4 LRF(대수 감소 인수)까지 감소시킨다.

일 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.70 초과이다. 또다른 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.80 초과이다. 여전히 또다른 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.90 초과이다. 여전히 또다른 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 4.0 초과이다.

일 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.60 내지 약 pH 4.0의 범위 내에 있다. 또다른 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.70 내지 약 pH 4.0의 범위 내에 있다. 여전히 또다른 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.80 내지 약 pH 4.0의 범위 내에 있다.

"시료"에 대한 예시적은 공급원은 친화도 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 용출액을 포함할 수 있다; 시료는 이온 교환 크로마토그래피 절차의 통과액-분획으로부터 수득될 수 있다; 이것은 또한 이온 교환 컬럼의 스트립(strip)으로부터 수득될 수 있다 - 시료가 수득될 수 있는, 당업자에게 널리 공지된 정제 과정 동안의 기타 공급원이 있다. 본 구현예의 일 양태에서, 시료는 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

일 구현예에서, 시료의 이온 강도는 염화나트륨의 첨가를 사용함으로써 조정되며, 여기서 염화나트륨의 농도는 약 1 mM 내지 약 200 mM의 범위 내에 있다.

일 양태에서, 이온 강도 조건은 약 50 mM 초과의 농도로 염화나트륨을 사용함으로써 조정된다. 본 구현예의 또다른 양태에서, 농도는 약 100 mM 초과이다.

일 양태에서, 시료의 pH 조건은 인산 또는 글리신 HCl을 사용하여 조정된다.

본 발명의 이들, 및 기타 양태는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면과 함께 고려될 때 보다 잘 인식되고 이해될 것이다. 다음의 상세한 설명은 다양한 구현예 및 이의 다수의 특정한 세부내용을 나타내면서 제한이 아니라 예시의 방법으로서 주어진다. 많은 치환, 변형, 첨가, 및 재배열이 본 발명의 범주 내에서 이루어질 수 있다.

도 1a는 조정-소량첨가-재조정 방법을 나타내며, 여기서 시료는 표적 pH로 조정/적정되고 그후에 약 pH 7.2에서 바이러스 스톡(stock)이 소량첨가되고 이어서 예시적인 구현예에 따른 pH 유지의 나머지에 대해 바람직한 온도에서 유지되기에 앞서 시료의 pH가 표적 pH로 조정된다. 타이밍은 소량첨가의 시간에 시작된다.
도 1b는 소량첨가-조정 방법을 나타내며, 여기서 시료는 바이러스 스톡 용액이 먼저 소량첨가되고 그후에 예시적인 구현예에 따라 표적 pH로 조정/적정된다. 타이밍은 시료의 표적 pH가 달성된 시간에 시작된다.
도 2a는 예시적인 구현예에 따른 바이러스 불활성화에 대한 낮은 pH 유지 단계와 연관된 여러가지 요소의 효과를 조사하기 위한 D-최적 모델 설계의 산점도 행렬 및 다변량 상관관계를 나타낸다.
도 2b는 각각의 단클론성 항체 염 조건에 대해 수행된 중성의 제어를 나타낸다. 이 제어의 목적은 측정된 바이러스 활성이 예시적인 구현예에 따른 낮은 pH에서의 화학적 불활성화의 결과임을 보장하기 위한 것이다.
도 3a는 예시적인 구현예에 따른 표적 pH 3.65에서의 X-MuLV의 불활성화 동역학을 나타낸다. 표적 pH 3.65에서의 LRF 곡선은 예시적인 구현예에 따른 시점에 대해 LRF 값을 플롯팅(plotting)함으로써 수득되었다.
도 3b는 예시적인 구현예에 따른 표적 pH 3.73에서의 X-MuLV의 불활성화 동역학을 나타낸다. 표적 pH 3.73에서의 LRF 곡선은 예시적인 구현예에 따른 시점에 대해 LRF 값을 플롯팅함으로써 수득되었다.
도 3c는 예시적인 구현예에 따른 표적 pH 3.80에서의 X-MuLV의 불활성화 동역학을 나타낸다. 표적 pH 3.80에서의 LRF 곡선은 예시적인 구현예에 따른 시점에 대해 LRF 값을 플롯팅함으로써 수득되었다.
도 4a는 예시적인 구현예에 따라, 상이한 표적 pH 조건, 예를 들어, 약 pH 3.65, pH 3.73, 또는 pH 3.80에서 0 mM NaCl에서의 X-MuLV의 불활성화 동역학을 나타낸다. LRF 곡선은 예시적인 구현예에 따른 상이한 표적 pH 조건에 대해, 시점에 대해 LRF 값을 플롯팅함으로써 수득되었다.
도 4b는 예시적인 구현예에 따라, 상이한 표적 pH 조건, 예를 들어, 약 pH 3.65, pH 3.73, 또는 pH 3.80에서 50 mM NaCl에서의 X-MuLV의 불활성화 동역학을 나타낸다. LRF 곡선은 예시적인 구현예에 따른 상이한 표적 pH 조건에 대해, 시점에 대해 LRF 값을 플롯팅함으로써 수득되었다.
도 4c는 예시적인 구현예에 따라, 상이한 표적 pH 조건, 예를 들어, 약 pH 3.65, pH 3.73, 또는 pH 3.80에서 100 mM NaCl에서의 X-MuLV의 불활성화 동역학을 나타낸다. LRF 곡선은 예시적인 구현예에 따른 상이한 표적 pH 조건에 대해, 시점에 대해 LRF 값을 플롯팅함으로써 수득되었다.
도 4d는 예시적인 구현예에 따라 약 pH 3.70-3.75에서 약 25 mM NaCl을 함유하는 작용 조건을 평가하기 위한 파라메터 추정치를 포함하는 예측된 프로파일러(profiler)를 나타낸다.
도 4e는 예시적인 구현예에 따라 약 pH 3.70-3.75에서 약 50 mM NaCl을 함유하는 작용 조건을 평가하기 위한 파라메터 추정치를 포함하는 예측된 프로파일러를 나타낸다.
도 4f는 예시적인 구현예에 따라 약 pH 3.70-3.75에서 약 80 mM NaCl을 함유하는 작용 조건을 평가하기 위한 파라메터 추정치를 포함하는 예측된 프로파일러를 나타낸다. 소량첨가-이후 여과의 효과 크기는 최소였으며 전체적인 예측 프로파일러 내에 포함되지 않았다.
도 5a는 예시적인 구현예에 따른 15분 시점에 대해 LRF에 대한 다변량 선형 회귀 모델의 실제 값 대 예측된 값을 나타낸다.
도 5b는 예시적인 구현예에 따른 30분 시점에 대해 LRF에 대한 다변량 선형 회귀 모델의 실제 값 대 예측된 값을 나타낸다.
도 6은 예시적인 구현예에 따른 15분 및 50분 둘 다의 후 4 LRF 초과를 달성하도록 모델을 최적화하기 위해 생성된 예측 프로파일러를 나타낸다. 예측 프로파일러는 예시적인 구현예에 따른 D-최적 DoE에서 평가된 유의한 요소의 함수로서 X-MuLV 불활성화를 보여주었다.
도 7은 예시적인 구현예에 따른 낮은 pH 유지를 위해 약 pH 3.70-3.75에서 일부 기존 작용 조건에 대한 파라메터 추정치를 포함하는 예측된 프로파일러를 나타낸다. 소량첨가-이후 여과의 효과 크기는 최소였으며 전체적인 예측 프로파일러 내에 포함되지 않았다.
도 8은 예시적인 구현예에 따른 낮은 pH 유지를 위해 약 pH 3.65-3.70에서 재설계된 작용 조건에 대한 파라메터 추정치를 포함하는 예측된 프로파일러를 나타낸다. 소량첨가-이후 여과의 효과 크기는 최소였으며 전체적인 예측 프로파일러 내에 포함되지 않았다.
도 9는 예시적인 구현예에 따른 회고적 데이터에 기반하여, NaCl, pH, 산 적정제, 온도, 단백질 유형(mAb, 단클론성 항체), 소량첨가 타이밍 및 이들의 조합을 포함하는 평가된 요소 및, IgG1 및 IgG2를 포함하는 단백질 유형에 대한 30분 시점에서의 X-MuLV LRF에 대한 효과 크기를 나타낸다.
도 10은 예시적인 구현예에 따른 회고적 산업적 데이터에 기반하여, NaCl, pH, 산 적정제, 온도, 단백질 유형(mAb, 단클론성 항체), 소량첨가 타이밍 및 이들의 조합을 포함하는 평가된 요소 및, 상이한 온도 조건에 대한 레트로바이러스 LRF에 대한 효과 크기를 나타낸다.
도 11은 예시적인 구현예에 따른 2가지 방법에 대해, NaCl, pH, 산 적정제, 온도, 단백질 유형(mAb, 단클론성 항체), 소량첨가 타이밍 및 이들의 조합을 포함하는 평가된 요소 및, 소량첨가/조정에 대한 시간에 대한 효과 크기를 나타낸다.

바이러스 클리어런스는 생물약제학적 제품을, 특히 포유류 세포주, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용하여 생산되는 생물약제학적 제품의 경우에, 제조하는 데에 중요하다. 정제 공정을 설계하기 위해서 바이러스 클리어런스를 보장하는 것이 중요하다. 제조 공정의 바이러스 클리어런스를 연구하기 위한 전형적인 작업 흐름은 바이러스와 함께 시료 로드(load)를 소량첨가하는 단계, 대규모 단계를 모방하도록 규모-축소 실험 상에서 공정을 실행하는 단계 및 소량첨가된 바이러스를 제거하는 능력을 문서화하는 단계를 포함한다. 바이러스 불활성화 또는 제거의 공정은 pH 처리, 열 처리, 용매/계면활성제 처리, 여과 또는 크로마토그래피를 포함한다. 바이러스 클리어런스의 평가는 CHO 세포의 게놈 내에 내재하는 레트로바이러스-유사 입자에 대한 특이적인 모델 바이러스의 제거를 입증하는 단계를 포함해야 한다(Anderson 등, Endogenous origin of defective retrovirus-like particles from a recombinant Chinese hamster ovary cell line, Virology 181(1): 305-311, 1991). 레트로바이러스는 이의 RNA 게놈으로부터 DNA를 생산하는 역전사 효소(reverse transcriptase) 효소를 사용하여 숙주 내에서 증식되는 외피보유 RNA 바이러스이다. 생산된 DNA는 그후에 복제를 위해 숙주의 게놈 내로 혼입된다. 이종향성 뮤린 백혈병 바이러스(Xenotropic murine leukemia virus; X-MuLV)는 CHO 세포-유래된 약제학적 단백질에서 바이러스 불활성화의 평가 시 모델 바이러스로서 사용될 수 있다. 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV)는 레트로바이러스이며 역전사를 통해 복제되는 양성 단일-가닥의 센스 RNA를 갖는다. MuLV는 접종된 마우스에서 백혈병을 유발할 수 있다.

바이러스 감소 또는 바이러스 클리어런스는 특이적인 공정 단계, 예컨대 크로마토그래피 공정을 수행한 후의 투입 시료 및 산출 시료에서의 총 바이러스 양 또는 감염성 바이러스 양 사이의 차이를 지칭한다. 바이러스 감소 능력은 공정 단계의 대수 감소 값(LRV) 또는 대수(log₁₀) 감소 인수(LRF)로서 정의될 수 있다. 감소 인수는 클리어런스 단계를 적용하기 전의 총 바이러스 로드 및 클리어런스 단계를 적용한 후의 총 바이러스 양에 기반하여 계산된다. 바이러스 밸리데이션 연구가 제품과 연관된 공지된 바이러스의 클리어런스를 문서화하기 위해 및 비-특이적인 모델 바이러스를 제거하기 위한 공정의 능력을 특징화함으로써 잠재적인 외래성 바이러스 오염물질을 제거하는 공정의 유효성을 추정하기 위해 수행될 수 있다.

본 출원은 여러가지 요소, 예컨대 단백질 아이소형, pH 조건, 온도, 산 적정제, 이온 강도 조건, 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 평가를 포함하여 바이러스 불할성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 효과를 평가하고 특징화하기 위해 사용될 수 있는 통계적으로 설계된 실험을 제공한다. 이들 방법은, 낮은 pH 시작 물질의 전도성을 증가시켜 이온 강도를 조작함으로써, 바이러스 불활성화 단계가 약 pH 3.60-3.90의 범위에서 수행될 때 효과적인 클리어런스를 예측하기 위해 사용될 수 있다. 실험으로부터 생성된 모델은, 상이한 시점에서, 예컨대 약 15분 및 약 30분 시점에서 공정 조건의 범위에 걸쳐 바이러스, 예컨대 XMuLV의 클리어런스를 예측하기 위해 사용될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 바이러스 불활성화에의 pH 조건의 효과에 더하여, 시작 용액의 전도성을 증가시키는 것은 바이러스 불활성화를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 염화나트륨(NaCl) 농도의 증가는 보다 큰 바이러스 불활성화를 달성하기 위해 바이러스 불활성화 동역학에 영향을 미치는 주요한 구성요소일 수 있다. 일 양태에서, 본 출원은 낮은 pH 시작 물질의 이온 강도의 증가를 통해 달성될 수 있는 바이러스의 강력하고 효과적인 불활성화, 예컨대 X-MuLV의 불활성화의 경우 약 4 LRF 초과의 이점을 제공한다.

ICH Q5A (R1) (Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Current Step 4 version, Sep 23, 1999)에 따르면, 생물약제학적 제품의 다운스트림 정제 공정이 내인성 또는 외래의 바이러스 오염물질의 제거 및/또는 불활성화를 보장하기 위해 개발된다. 전형적인 다운스트림 정제 공정은, 외피보유 바이러스를 불활성화시키기 위한 하나의 전용 단계를 포함하여, 여러가지 상호보완적인(orthogonal) 바이러스 제거 단계를 통합할 수 있다. 낮은 pH 인큐베이션(incubation)은 외피보유 바이러스를 불활성화시키기 위해, 예컨대 캡시드의 가역적 변성을 위해 사용될 수 있다(Brorson 등, Bracketed generic inactivation of rodent retroviruses by low pH treatment for monoclonal antibodies and recombinant proteins, Biotechnol Bioeng 82(3): 321-329, 2003). 여과는 외피보유 및 외피-미보유 바이러스 둘 다를 제거하기 위해 사용될 수 있는 크기-기반 제거이다(Lute 등, Phage passage after extended processing in small-virus-retentive filters, Biotechnol Appl Biochem 47(Pt 3): 141-151, 2007). 크로마토그래피 단계, 예컨대 단백질 A 크로마토그래피(Bach 등, Clearance of the rodent retrovirus, XMuLV, by protein A chromatography, Biotechnol Bioeng 112(4):743750, 2015) 또는 음이온 교환 크로마토그래피(Strauss 등, Anion exchange chromatography provides a robust, predictable process to ensure viral safety of biotechnology products, Biotechnol Bioeng 102(1): 168-175, 2009a)가 바이러스 클리어런스를 위한 바이러스 감소를 제공할 잠재력이 있어 생물학적 제품을 정제하기 위해 사용될 수 있다.

낮은 pH 바이러스 불활성화는 생물약제학적 제품, 예컨대 단클론성 항체의 정제 동안 바이러스를 불활성화시키기 위해 단백질 A 포획 단계 후에 일반적으로 실행된다. 단백질 A 크로마토그래피로부터 용리된 제품은 전형적으로 낮은 pH에 있으며, 이는 추가로 산성화되고 바이러스 불활성화를 위해 적어도 30분 동안 유지된다. 바이러스 불활성화의 메커니즘은 주로 바이러스의 표면 당단백질의 비가역적 변성 또는 지질 외피의 파괴를 야기하는 pH-기반 화학 반응을 통한다(상기의 Brorson 등). pH 유지가 완료되면, 제품은 중성화되고 추가의 다운스트림 공정이 진행된다. 낮은 pH 단계는 큰 외피보유 바이러스의 4 LRF을 확실히 생산하는 것으로 관찰되었다(Miesegaes 등, Analysis of viral clearance unit operations for monoclonal antibodies. Biotech Bioeng. 2019; 106:238-246). 이전의 연구는 이온 강도가 X-MuLV의 불활성화 동역학에 영향을 미칠 것임을 나타낸다. 증가된 이온 강도를 갖는 실험 조건, 예컨대 약산의 적정과 함께 보다 높은 완충액 농도 또는 보다 높은 단백질 농도는 pH 3.7 및 3.8에서 보다 높은 LRV와 상관관계가 있을 수 있다(Chinniah 등, Characterization of operating parameters for XMuLV inactivation by low pH treatment, Biotechnol Prog, 2016. Jan-Feb; 32,(1), 89-97, doi: 10.1002/btpr.2183. Epub 2015 Nov 5).

연구들이 낮은 pH 유지에 의한 바이러스 클리어런스를 이해하기 위해 이루어졌다. 이들 연구는 pH, 시간, 및 온도에 영향을 받는 pH 기반 화학적 반응을 시사한다(Brorson 등). 불활성화 단계가 강력하기 때문에, 브로르손 등(Brorson 등)은, 낮은-pH 불활성화가 pH 3.8 이하의 pH 조건 및 14℃ 이상의 온도에서 최대 30분 유지 동안 수행되어 지속적으로 X-MuLV의 4.6 log₁₀ 이상의 클리어런스를 달성한 "브라캣티드 일반적 클리어런스(bracketed generic clearance)"를 개발하였다. ASTM(미국 재료 시험 협회)는 ASTM E2888-12(ASTM. E2888-12: Standard Practice for Process for Inactivation of Rodent Retrovirus by pH. 웨스트 컨쇼호켄(West Conshohocken), PA: ASTM 인터내셔널(International); 2012. http://www.astm.org)에 따라 pH 3.6 이하로 및 15℃ 이상의 온도에서 낮은 pH 유지의 작용 공간을 추가로 감소시켜 5.0 LRF 이상을 달성하였다. 게다가, ASTM E2888-12에 따르면, 유지 시간은 30분 이상이다.

시간이 지남에 따라, 지침은 보다 큰 LRF를 달성하기 위해 유지의 pH를 감소시키도록 개정되었다. ASTM E2888-12에 의해 제공되는 일반적 클리어런스를 주장하기 위해, 관심있는 단백질은 문서가 정의하는 일반적 유형에 딱 맞아야 한다. 효과적인 바이러스 불활성화는, 낮은 pH에의 단백질의 노출이 단백질의 질 또는 안정성을 변경시킬 수 있으므로, 생물약제학적 제품, 예컨대 단클론성 항체의 경우 특히 힘들 수 있다. 보건 당국은 낮은 pH 유지가 최악의 경우 조건에서 검증될 것을 기대한다. 이는 레트로바이러스 불활성화가 실제 제조 범위보다 높은 pH 조건에서 결정되었음을 나타낸다. 불활성화 단계가 이들 범위의 바깥에서 작용될 때 바이러스 클리어런스가 손상될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 본 출원은 단백질 유형, pH 조건, 온도, 산 적정제, NaCl 함량, 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 상이한 시점에서의 바이러스 불활성화에의 영향을 결정하기 위해 낮은 pH 불활성화 단계와 관련된 제어된 및 비제어된 요소들을 포함하는 통계적으로 설계된 실험, 예를 들어, 실험적 설계를 제공한다. 일부 양태에서, 본 출원은 확실하고 효과적인 바이러스 클리어런스를 위한 작용 조건을 정의하기 위한 실험적 요소 및 조건을 제공한다. 일부 양태에서, X-MuLV는 모델 내인성 외피보유 바이러스로서 선택된다. 일부 양태에서, 단클론성 항체의 2가지 유형, 예컨대 IgG1 또는 IgG4가 다양한 파라메터, 예컨대 pH, 온도, 산 적정제, 이온 강도, 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 시험을 겪는다.

다변량 분석에 대한 본 출원의 실험적 설계, 예를 들어, 실험의 설계 또는 DoE는 낮은 pH 유지 시 바이러스 불활성화의 특징화를 포함한다. DoE는 하나의 실험적인 설계의 내용 안에서 다수의 개발 요소의 체계적인 변동을 허용하는 방법론이다. DoE의 결과는 검사된 공정의 수학적 모델을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 수학적 모델을 적용함으로써 검사된 공정의 진정한 최적의 것이 식별될 수 있다. DoE 결과의 적용은 유의하지 않은 개발 요소를 제거하는 단계, 추가의 연구를 위한 중요한 개발 요소를 식별하는 단계 및 검사된 공정의 성능을 예측하는 단계를 포함한다. DoE는 목표 진술, 변수 요소 및 모델 선택, 모델을 지지하는 실험적 설계 생성, 설계를 기반으로 한 데이터 수집, 분석 실행, 또는 체크 포인트가 있는 모델 검증 및 결과 보고를 포함하는 체계적인 논리적 흐름에서 수행된다. DoE의 결과 및 결과적인 모델은 바이러스 클리어런스에 대한 낮은 pH 유지의 메커니즘의 기존 이해를 확인, 거부, 또는 변경하기 위해 사용될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 본 출원은 잠재적으로 감염성 바이러스 입자를 포함하는 하나 이상의 불순물을 포함하는 시료로부터 항체를 정제하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 본 출원의 방법은 다음을 포함한다: 시료의 이온 강도 조건을 조정하는 단계, 시료의 pH 조건을 산성 pH로 조정하는 단계, 및 후속으로 시료를 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 15분 동안 유지하여 다량의 바이러스 입자를 불활성화시키는 단계. 일 양태에서, 다량의 바이러스 입자를 불활성화시키기 위한 본 출원의 방법의 능력은 적어도 약 3 LRF이다. 일 양태에서, 다량의 바이러스 입자를 불활성화시키기 위한 본 출원의 방법의 능력은 적어도 약 4 LRF이다. 일 양태에서, 시료 중의 펩티드 또는 단백질은 숙주-세포에서 생산된 항체이다. 일 양태에서, 항체는 단클론성 항체 또는 이중특이적 항체이다. 일 양태에서, 본 출원의 방법에서 항체는 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

일 양태에서, 본 출원의 방법에서 시료의 pH 조건은 약 pH 3.90 이하이다. 일 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.60 내지 약 pH 3.90의 범위 내에 있다. 일 양태에서, 시료의 pH 조건은 약 pH 3.65 내지 약 pH 3.80의 범위 내에 있다. 일부 양태에서, 본 출원의 통계적으로 설계된 실험에서의 pH 조건은 약 pH 3.65 내지 약 pH 3.80의 범위 내, 예컨대 약 pH 3.65, 약 pH 3.73, 또는 약 pH 3.80에 있으며, 이는 제조 공정의 pH 범위 이상이다. pH 3.65 - 3.80의 pH 범위는 ASTM E2888-12에 의해 제시된 pH 범위, 예를 들어 pH 3.6 이하를 초과하며 이의 바깥에 있다. 보다 낮은 pH 조건이 보다 빠른 바이러스 불활성화를 야기할 수 있다는 사실이 공지되어 있다(Brorson 등). 일부 양태에서, 본 출원의 통계적으로 설계된 실험에서의 온도는 약 15℃ 내지 약 20℃의 범위 내, 예컨대 약 15℃ 또는 약 20℃이며, 이는 제조 공정의 온도 범위의 최하단에 있거나 이의 미만이다. 보다 높은 온도가 보다 빠른 불활성화를 야기할 수 있다는 사실이 공지되어 있다(Brorson 등). 약 15℃ 내지 약 20℃의 온도 범위는 ASTM E2888-12에 의해 제시된 온도 범위, 예를 들어 15℃ 이상의 내에 있다. 일부 양태에서, 본 출원의 통계적으로 설계된 실험에서 산 적정제는 약 0.25 M 인산 또는 약 0.25 글리신 HCl이다. 일부 양태에서, 본 출원의 통계적으로 설계된 실험에서 시작 물질에 첨가되는 NaCl 함량은 약 0 mM 내지 약 100 mM의 농도 범위 내에 있다.

일부 양태에서, 본 출원의 방법은, 시료의 pH 조건, 시료의 전도성, 펩티드 또는 단백질의 유형, 시료의 온도, 시료의 pH 조건을 조정하는 산 적정제, 시료에의 바이러스 입자를 소량첨가한 것에 대한 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 존재를 포함하는 다양한 요소를 평가하기 위해 D-최적 DoE를 실행함으로써 다량의 바이러스 입자의 불활성화를 최적화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 본 출원의 통계적으로 설계된 실험에서 소량첨가 타이밍은 조정-소량첨가-재조정 방법 또는 소량첨가-조정 방법이다. 조정-소량첨가-재조정 방법은 전체 유지 시간 동안 일정한 바람직한 pH 범위를 제공할 수 있다. 소량첨가-조정 방법은 내인성 레트로바이러스-유사 입자를 함유하는 공정-중 중간체가 시작 pH에서 산성화되는 정확한 제조 조건을 보여줄 수 있다. 도 1a에 나타난 바와 같이 조정-소량첨가-재조정 방법 하에서, 시료는 표적 pH로 조정/적정되고 그후에 약 pH 7.2를 갖는 바이러스 스톡이 소량첨가 된다. pH 유지의 타이밍은 소량첨가의 시간에 시작된다. 바이러스 스톡의 소량첨가 후 pH 증가의 관찰로 인해, 시료의 pH는 pH 유지의 나머지 동안 바람직한 온도에서 유지되기에 앞서 표적 pH로 재조정되었다. 도 1b에 나타난 바와 같이 소량첨가-조정 방법 하에서, 시료는 바이러스 스톡 용액이 먼저 소량첨가되고 그후에 표적 pH로 조정/적정된다. 표적 pH가 달성될 때, pH 유지의 타이밍이 시작되고, 시료는 바람직한 온도에서 인큐베이션된다. 본 출원의 통계적으로 설계된 실험의 일부 양태에서, 필터, 예컨대 약 0.2 μm 필터를 사용한 소량첨가-이후 여과와 함께 또는 이것 없이 낮은 pH 유지가 수행될 수 있다. 소량첨가-이후 여과는 내인성 레트로바이러스-유사 입자를 함유하는 공정-중 중간체가 여과되어 멸균율을 유지하는 정확한 제조 작용을 보여준다. 여과 단계는 바이러스 응집체를 제거할 수 있는 단분산 바이러스를 초래할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 시작 물질의 전도성은 상이한 표적 pH 조건에서 바이러스 불활성화 동역학에 영향을 미치는 것에 있어서 강한 효과를 갖는다. 일부 예시적인 구현예에서, 본 출원은 공정 조건의 범위에 걸친 바이러스 클리어런스를 예측하는 모델을 제공한다. 일부 양태에서, 바이러스 불활성화에의 pH의 효과에 더하여, 이온 강도 또는 전도성, 예컨대 NaCl 농도의 증가는 바이러스 불활성화 동역학에 영향을 끼치는 주요한 구성요소일 수 있다. 일 양태에서, pH 조건은 로드 물질이 낮은 이온 강도를 가질 때 중요한 요소이다. 예를 들어, X-MuLV 불활성화는 낮은 이온 강도에서 pH 조건에 의존할 수 있다. 일부 양태에서, 이온 강도가 증가될 때, 바이러스 불활성화에의 pH 조건의 영향은 감소한다. 예를 들어, X-MuLV는, 이온 강도가 증가될 때, 모든 표적 pH 조건에서 급격하게 불활성화될 수 있다. 일부 양태에서, 약 50 mM 또는 약 100 mM NaCl이 존재할 때, 약 pH 3.65, pH 3.73, 및 약 pH 3.80에서의 표적 pH 조건의 경우 약 30분 시점에서 완전하고 효과적인 바이러스 클리어런스, 예컨대 X-MuLV의 불활성화가 관찰된다. pH 3.65 및 pH 3.73에서의 pH 조건의 경우, 15분 후 X-MuLV의 완전한 불활성화가 관찰되었다. 일 양태에서, 시료의 이온 강도는 염화나트륨의 첨가를 사용하여 조정되며, 여기서 염화나트륨의 농도는 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 500 mM의 범위 내, 약 50 mM, 또는 약 100 mM이다.

생물약제학적 제품의 제조 동안의 낮은 pH 유지는 단백질, 예컨대 단클론성 항체의 품질 및 안정성에 중요한 영향을 가질 수 있다. 낮은 pH 시작 물질의 전도성을 조작함으로써 pH 3.60 내지 pH 3.90의 범위 내에서 바이러스 불활성화가 작용될 때 본 출원의 모델이 효과적인 클리어런스를 예측하기 위해 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 출원은 시작 물질에의 NaCl의 첨가를 통해 전도성을 증가시키는 것이 다양한 표적 pH 조건에서 급격하고 효과적인 바이러스 불활성화를 달성할 수 있다는 사실을 제공한다. 일 양태에서, 본 출원의 방법에서 시료는 시료의 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 30분 동안 유지되어 다량의 바이러스 입자를 불활성화시킨다. 일 양태에서, 본 출원의 방법에서 시료는 시료의 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 15분 내지 약 30분 동안 유지되어 다량의 바이러스 입자를 불활성화시킨다.

본 출원에서 낮은 pH 유지를 위한 통계적 DoE의 시험 결과는 약 3.60 미만의 pH에서의 5.0 LRF X-MuLV 불활성화에 대해 ASTM 표준과 일치한다. 결과는 또한 약 3.60 초과의 pH에서의 강력하고 효과적인 불활성화를 입증한다. ASTM 일반적 주장의 바깥의 범위의 경우, 결과는 NaCl 함량을 증가시키는 것이 급격하고 효과적인 X-MuLV 불활성화를 달성할 수 있음을 나타낸다. 전형적으로, pH의 유지는 단백질의 안정성에 의존한다. 낮은 pH 시작 물질의 전도성을 조작함으로써 pH 3.60 내지 pH 3.90에서 작용될 때 본 출원의 모델은 효과적인 클리어런스를 예측하는 것의 이점을 제공한다.

생물약제학적 제품의 제품 품질, 효능 및 안전성의 향상의 요구는 바이러스 불활성화를 보장하기 위한 효과적이고 강력한 실험적 설계에 대한 요구를 증가시키는 것으로 이어졌다. 본 개시내용은 상기에 언급된 요구를 만족시키는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 예시적인 구현예는 바이러스 입자를 포함하는 하나 이상의 불순물을 포함하는 시료로부터 항체를 정제하기 위한 방법을 제공함으로써 상기에 언급된 요구를 만족시킨다. 본 출원은 낮은 pH 시작 물질의 이온 강도의 증가를 통한 강력하고 효과적인 바이러스의 불활성화 및 오랫동안 느껴온 필요를 만족시키기 위해 낮은 pH 시작 물질의 이온 강도를 조작함으로써 임의의 작용 pH에서의 효과적인 클리어런스를 예측하는 모델을 제공한다.

용어 "a"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고; 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해될 바와 같이 표준 변동을 허용하는 것으로 이해되어야 하며; 범위가 제공되는 경우, 끝점이 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하다", 및 "포함하는"은 비-제한적인 것으로 여겨지며, 각각 "포함하다", "포함하다", 및 "포함하는"을 의미하는 것으로 이해된다.

일부 예시적인 구현예에서, 본 출원은 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항체를 바이러스 입자를 포함하는 하나 이상의 불순물을 포함하는 시료로부터 정제하기 위한 방법을 제공한다. 일부 예시적인 구현예에서, 본 출원의 방법은 다음을 포함한다: 시료의 이온 강도 조건을 조정하는 단계, 시료의 pH 조건을 산성 pH로 조정하는 단계, 및 후속으로 시료를 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 15분 동안 유지하여 다량의 바이러스 입자를 불활성화시키는 단계. 일 양태에서, 시료 중의 펩티드 또는 단백질은 숙주-세포에서 생산된 항체이다. 일 양태에서, 펩티드 또는 단백질은 단클론성 항체 또는 이중특이적 항체이다. 일 양태에서, 펩티드 또는 단백질은 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 단백질 약제학적 제품 또는 약물이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질" 또는 "관심있는 단백질"은 공유적으로 연결된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 단백질은, 일반적으로 당해 분야에 "폴리펩티드"로서 공지된 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩티드"는 아미노산 잔기, 관련된 자연적으로 발생하는 구조적 변이체, 및 펩티드 결합을 통해 연결된 이의 합성의 비-자연적으로 발생하는 유사체, 관련된 자연적으로 발생하는 구조적 변이체, 및 이의 합성의 비-자연적으로 발생하는 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩티드 또는 폴리펩티드'는 비-자연적으로 발생하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는, 예를 들어, 자동화 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고상 펩티드 합성 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 단백질은 하나 또는 다수의 폴리펩트를 포함하여 단일 기능 생체분자를 형성할 수 있다. 또다른 예시적인 양태, 단백질은 항체 단편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토킨, 케모카인, 펩티드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 단백질은 생체 치료제 단백질, 연구 또는 요법 시 사용되는 재조합 단백질, 트랩(trap) 단백질 및 기타 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 인간 항체, 및 이중특이적 항체의 임의의 것을 포함할 수 있다. 단백질은 재조합 세포-기반 생산 시스템, 예컨대 곤충 바큘로바이러스 시스템, 효모 시스템(예를 들어, 피치아(Pichia) sp.), 포유류 시스템(예를 들어, CHO 세포 및 CHO-K1 세포 같은 CHO 유도체)를 사용하여 생산될 수 있다. 생체치료제 단백질 및 이들의 생산을 논의하는 최근의 검토를 위해 Ghaderi 등, "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," (Darius Ghaderi 등, Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28 BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS147-176 (2012))를 참조한다. 일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 변형, 부가, 및 기타 공유적으로 연결된 모이어티를 포함한다. 이들 변형, 부가 및 모이어티는, 예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 글리칸(예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코스, 만노스, 및 기타 단당류), PEG, 폴리히스티딘, FLAG태그, 말토스 결합 단백질(MBP), 키틴 결합 단백질(CBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST) myc-에피토프, 형광 표지 및 기타 염료 등을 포함한다. 단백질은 조성 및 용해도에 따라 분류될 수 있으며 이에 따라 간단한 단백질, 예컨대 구형 단백질 및 섬유상 단백질; 접합된 단백질, 예컨대 핵단백질, 당단백질, 점액단백질, 색소단백질, 인단백질, 금속단백질, 및 지질단백질; 및 유래된 단백질, 예컨대 1차 유래된 단백질 및 2차 유래된 단백질을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심있는 단백질은 재조합 단백질, 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 단클론성 항체, 융합 단백질, scFv 및 이들의 조합물일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 단백질"은 숙주 세포 내로 도입된 재조합 발현 벡터 상에 운반된 유전자의 전사 및 번역의 결과로서 생산되는 단백질을 지칭한다. 특정한 예시적인 구현예에서 재조합 단백질은 융합 단백질일 수 있다. 특정한 예시적인 구현예에서 재조합 단백질은 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화, 또는 완전한 인간 항체일 수 있다. 특정한 예시적인 구현예에서 재조합 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아이소형의 항체일 수 있다: IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgE. 특정한 예시적인 구현예에서 항체 분자는 전-장 항체(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 면역글로불린)이거나 또는 대안적으로 항체는 단편(예를 들어, Fc 단편 또는 Fab 단편)일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 이황화 결합으로 상호-연결된 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄, 뿐만 아니라 이들의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약술됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약술됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역에 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 본 발명의 상이한 구현예에서, 항-빅(big)-ET-1 항체(또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식세포계열 서열과 동일할 수 있거나 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 보존 서열은 2개 이상의 CDR의 사이드-바이-사이드(side-by-side) 분석에 기반하여 정의될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 또한 포함한다. 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적으로 발생한, 효소적으로 수득가능한, 합성의, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 임의의 적합한 표준 기술, 예컨대 단백분해 소화, 또는 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전적 조작 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어, 상업적인 공급원, DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 용이하게 이용가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는 시퀀싱될 수 있고, 화학적으로, 또는 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 배열 내로 배열하는 것, 또는 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산 등을 변형, 부가 또는 결실시키는 분자생물학적 기술을 사용함으로써 조작될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "항체 단편"은 온전한 항체의 부분, 예컨대, 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는, 이에 제한되지는 않으나, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 영역, 뿐만 아니라 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 조합물이며, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자이다. 일부 예시적인 구현예에서, 항체 단편은 모 항체가 그런 것처럼 같은 항원에 결합하는 단편의 모 항체의 충분한 아미노산 서열을 포함한다; 일부 예시적인 구현예에서, 단편은 모 항체의 것과 비슷한 친화도로 항원에 결합하고/하거나 항원에의 결합에 대해 모 항체와 경쟁한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있고/있거나 이것은 부분적인 항체 서열을 인코딩하는 유전자로부터 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체 단편은 전체로 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 항체 단편은 임의로 단일 사슬 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체 단편은, 예를 들어, 이황화 연결에 의해 함께 연결된 다수의 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 다중-분자 복합체를 임의로 포함할 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개 아미노산을 포함하며 보다 전형적으로 적어도 약 200개 아미노산을 포함한다.

어구 "이중특이적 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 중쇄를 일반적으로 포함하며, 각각의 중쇄는 상이한 에피토프-2가지 상이한 분자(예를 들어, 항원) 또는 같은 분자(예를 들어, 같은 항원) 상의-에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 적어도 1에서 2 또는 3 또는 4 자릿수가 낮을 것이고, 그 역 또한 마찬가지이다. 이중특이적 항체에 의해 인식되는 에피토프는 같거나 상이한 표적(예를 들어, 같거나 상이한 단백질) 상에 있을 수 있다. 이중특이적 항체는, 예를 들어, 같은 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 조합함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 같은 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포 내에서 발현될 수 있다.

전형적인 이중특이적 항체는 각각 3개의 중쇄 CDR, 뒤이어 CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는 2개의 중쇄, 및 항원-결합 특이성을 주지는 않지만 각각의 중쇄와 회합될 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 회합될 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합되는 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 회합될 수 있고 하나 또는 두 중쇄가 하나 또는 두 에피토프에 결합할 수 있도록 할 수 있는 면역글로불린 경쇄를 갖는다. BsAb는 Fc 영역을 보유하는 것(IgG-유사) 및 Fc 영역이 결여된 것, 2개의 주요한 부류로 나눠질 수 있으며, 후자는 일반적으로 IgG, 및 Fc를 포함하는 IgG-유사 이중특이적 분자보다 더 작다. IgG-유사 bsAb는 상이한 형식, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 트리오맙, 놉 인투 홀(knobs into holes) IgG(kih IgG), 크로스맵, orth-Fab IgG, 이중-가변 도메인 Ig(DVD-Ig), 투-인-원(two-in-one) 이중 작용 Fab(DAF), IgG-단일-사슬 Fv(IgG-scFv), 또는 κλ-바디를 가질 수 있다. 비-IgG-유사 상이한 형식은 탠덤 scFv, 디아바디 형식, 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAbs), 이중-친화도 재표적화 분자(DART), DART-Fc, 나노바디, 또는 독-앤드-락(dock-and-lock; DNL) 방법에 의해 생산된 항체를 포함한다(Gaowei Fan, Zujian Wang & Mingju Hao, Bispecific antibodies and their applications, 8 JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY 130; Dafne Muller & Roland E. Kontermann, Bispecific Antibodies, HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES265-310 (2014)). BsAb를 생산하는 방법은 2개의 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합에 기반한 쿼드로마(quadroma) 기술, 화학적 가교제를 포함하는 화학적 접합, 및 재조합 DNA 기술을 이용한 유전적 접근법에 제한되지 않는다. bsAb의 예는 다음의 특허 출원에서 개시된 것을 포함하며, 이로써 이들 문헌은 참조로 통합된다: 2010년 6월 25일에 제출된 미국 일련 번호 12/823838; 2012년 6월 5일에 제출된 미국 일련 번호 13/ 488628; 2013년 9월 19일에 제출된 미국 일련 번호 14/031075; 2015년 7월 24일에 제출된 미국 일련 번호 14/808171; 2017년 9월 22일에 제출된 미국 일련 번호 15/713574; 2017년 9월 22일에 제출된 미국 일련 번호 15/713569; 2016년 12월 21일에 제출된 미국 일련 번호 15/386453; 2016년 12월 21일에 제출된 미국 일련 번호 15/386443; 2016년 7월 29일에 제출된 미국 일련 번호 15/22343; 및 2017년 11월 15일에 제출된 미국 일련 번호 15814095. 낮은 수준의 동종이량체 불순물은 이중특이적 항체의 제조 동안 여러가지 단계에서 존재할 수 있다. 온전한 질량 분석을 사용하여 수행될 때 동종이량체 불순물의 낮은 존재량 및 정규의 액체 크로마토그래피 방법을 사용하여 수행될 때 주요 종과 함께 이들 불순물의 동시-용리로 인해 이러한 동종이량체 불순물의 검출이 힘들 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이 "다중특이적 항체" 또는 "Mab"는 적어도 2가지 상이한 항원에 대해 결합 특이성이 있는 항체를 지칭한다. 이러한 분자는 보통 단지 2가지의 항원에 결합할 것인 반면에(즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가적인 특이성이 있는 항체, 예컨대 삼중특이적 항체 및 KIH 삼중항체(Trispecific)가 본원에 개시된 시스템 및 방법에 의해 또한 처리될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에만 제한되지 않는다. 단클론성 항체는 당해 분야에서 이용가능하거나 공지된 임의의 수단에 의해, 임의의 진핵생물, 원핵생물, 또는 파지 클론(clone)을 포함하는 단일 클론으로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 단클론성 항체는 하이브리도마의 사용, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합을 포함하여 당해 분야에 공지된 매우 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심있는 단백질은 포유류 세포로부터 정제될 수 있다. 포유류 세포는 인간 기원의 것일 수 있거나 또는 비-인간 기원은 1차 상피 세포(예를 들어, 각질형성세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포), 확립된 세포주 및 이들의 균주(예를 들어, 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁경부 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK(NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CHO 세포, BeWo 세포, Chang 세포, Detroit 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LSI80 세포, LS174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-l 세포, LLC-PKi 세포, PK(15) 세포, GHi 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MHiCi 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포, BSC-1 세포, RAf 세포, RK-세포, PK-15 세포 또는 이들의 유도체), 임의의 조직 또는 기관(이에 제한되지는 않으나, 심장, 간, 신장, 결장, 장, 식도, 위, 신경 조직(뇌, 척수), 폐, 혈관 조직(동맥, 정맥, 모세혈관), 림프 조직(림프절, 아데노이드, 편도선, 골수, 및 혈액), 비장으로부터의 섬유아세포, 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주(예를 들어, CHO 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시투룰린혈증 세포, Dempsey 세포, Detroit 551 세포, Detroit 510 세포, Detroit 525 세포, Detroit 529 세포, Detroit 532 세포, Detroit 539 세포, Detroit 548 세포, Detroit 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, Midi 세포, CHO 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, Vero 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDMiC3 세포, KLN205 세포, McCoy 세포, 마우스 L 세포, 균주 2071(마우스 L) 세포, L-M 균주(마우스 L) 세포, L-MTK'(마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, Swiss/3T3 세포, 문착(Indian muntjac) 세포, SIRC 세포, Cn 세포, 및 Jensen 세포, Sp2/0, NS0, NS1 세포 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 관심있는 단백질은 VEGF 길항제일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "VEGF 길항제"는 VEGF에 결합하거나 이와 상호작용하고/하거나, VEGF의 이의 수용체(VEGFR1 및 VEGFR2)에의 결합을 억제하고/하거나, VEGF의 생물학적 신호전달 및 활성을 억제하는 임의의 제제이다. VEGF 길항제는 VEGF와 천연 VEGF 수용체 사이의 상호작용을 방해하는 분자, 예를 들어, VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하고 VEGF와 VEGF 수용체 사이의 상호작용을 예방하거나 그렇지 않으면 저해하는 분자를 포함한다. 특이적 예시적인 VEGF 길항제는 항-VEGF 항체(예를 들어, 라니비주맙[LUCENTIS®]), 항-VEGF 수용체 항체(예를 들어, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체 등), 및 VEGF 수용체-기반 키메라 분자 또는 VEGF-억제 융합 단백질(또한 본원에서 "VEGF-트랩(trap)" 또는 "VEGF 미니(Mini)-트랩"으로도 지칭됨), 예컨대 애플리버셉트, 지브-애플리버셉트 및 서열번호 42를 갖는 아미노산을 갖는 단백질을 포함한다. VEGF-트랩의 기타 예는 ALT-L9, M710, FYB203 및 CHS-2020이다. VEGF-트랩의 추가적인 예는 미국 특허 번호 7,070,959; 7,306,799; 7,374,757; 7,374,758; 7,531,173; 7,608,261; 5,952,199; 6,100,071; 6,383,486; 6,897,294 & 7,771,721에서 발견될 수 있으며, 이들 문헌은 그들 전문이 본원에 참조로 특이적으로 통합된다.

VEGF 수용체-기반 키메라 분자는 VEGF 수용체, 예컨대 VEGFR1(Flt1로 또한 지칭됨) 및/또는 VEGFR2(Flk1 또는 KDR로 또한 지칭됨)의 2개 이상의 면역글로불린(Ig)-유사 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 포함하며, 또한 다량체화 도메인(예를 들어, 다량체화, 예컨대 2개 이상의 키메라 폴리펩티드의 이량체화를 촉진하는 Fc 도메인)을 포함할 수 있다. 예시적인 VEGF 수용체-기반 키메라 분자는 VEGFR1R2-FcΔC1(a)(애플리버셉트로 또한 공지됨; 제품명 EYLEA®로 판매됨)로 지칭되는 분자이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질 약제학적 제품"은 본질적으로 완전히 또는 부분적으로 생물학적일 수 있는 활성 성분을 포함한다. 일부 예시적인 구현예에서, 단백질 약제학적 제품은 펩티드, 단백질, 융합 단백질, 항체, 항원, 백신, 펩티드-약물 접합체, 항체-약물 접합체, 단백질-약물 접합체, 세포, 조직, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 기타 예시적인 구현예에서, 단백질 약제학적 제품은 재조합, 조작된, 변형된, 돌연변이된, 또는 절단된 버전의 펩티드, 단백질, 융합 단백질, 항체, 항원, 백신, 펩티드-약물 접합체, 항체-약물 접합체, 단백질-약물 접합체, 세포, 조직, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.

예시적인 구현예

본원에 개시된 구현예는 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항체를 바이러스 입자를 포함하는 하나 이상의 불순물을 포함하는 시료로부터 정제하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 개시된 구현예는 실험의 통계적 설계에 기반하여 낮은 pH 유지를 사용한 바이러스 클리어런스를 위한 방법을 또한 제공한다.

일부 예시적인 구현예에서, 본 출원은 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항체를 바이러스 입자를 포함하는 하나 이상의 불순물을 포함하는 시료로부터 정제하기 위한 방법을 제공한다. 일부 예시적인 구현예에서, 본 출원의 방법은 다음을 포함한다: 시료의 이온 강도 조건을 조정하는 단계, 시료의 pH 조건을 산성 pH로 조정하는 단계, 및 후속으로 시료를 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 15분 동안 유지하여 다량의 바이러스 입자를 불활성화시키는 단계.

일 양태에서, 본 출원의 방법에서 시료의 pH 조건은 산성 pH인, 약 pH 7 이하, 약 pH 6 이하, 약 pH 5 이하, 약 pH 4 이하, 약 pH 3.90 이하, 약 pH 3.80 이하, 약 pH 3.70 이하, 약 pH 3.60 내지 약 pH 3.90, 또는 약 pH 3.65 내지 약 pH 3.80이다.

일 양태에서, 본 출원의 방법에서 시료는 다량의 바이러스 입자를 불활성화시키는 시료의 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 30분, 적어도 약 15분, 약 15분 내지 약 30분, 적어도 약 10분, 적어도 약 20분, 적어도 약 25분, 적어도 약 35분, 약 10분 내지 약 30분, 약 15분 내지 약 35분, 약 20분 내지 약 30분, 약 20분 내지 약 35분, 또는 약 25분 내지 약 40분 동안 유지된다.

일 양태에서, 시료의 이온 강도는 염화나트륨의 첨가를 사용하여 조정되며, 여기서 염화나트륨의 농도는 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 500 mM의 범위 내, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 72 mM, 약 80 mM, 약 82 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 또는 약 500 mM이다.

방법은 전술한 펩티드, 단백질, 항체, 실험의 D-최적 설계, 바이러스, 레트로바이러스, 바이러스 불활성화, 바이러스 클리어런스, 이온 강도 또는 pH 조건 중 어느 임의의 것에 제한되지 않는다는 사실이 이해된다.

숫자 및/또는 문자로 본원에 제공된 바와 같은 연속적인 표지의 방법 단계는 방법 또는 이의 임의의 구현예를 특정한 지시된 순서로 제한하는 것으로 여겨지지 않는다. 특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 수탁 번호, 기술 기사 및 학술 기사를 포함하여 다양한 간행물이 명세서 전반에 걸쳐 인용된다. 이들 인용된 참조문헌의 각각은, 그들의 전문이 및 모든 목적을 위해, 본원에 참조로 통합된다. 달리 기재되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본 개시내용은 본 개시내용을 보다 상세히 기재하기 위해 제공되는 다음의 실시예를 참조하여 보다 완전히 이해될 것이다. 이들은 예시하도록 의도되며 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

실시예

재료 및 시약

1. 모델 단백질 및 완충액

CHO 세포 내에서 발현된 상이한 아이소형의 단클론성 항체를 모델 단백질로서 사용하였으며, mAb 1은 IgG4 아이소형을 나타내고 mAb 2는 IgG1 아이소형을 나타낸다. 모델 단백질의 등전점은 mAb 1의 경우 8.8 및 mAb 2의 경우 pH 9.3인 것으로 추정되었다. 단클론성 항체는 표준 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제되었고 40 mM 아세트산으로 용리되어 대략 pH 4.2의 풀(pool)을 초래하였다. 단클론성 항체의 농도는 대략 15 g/L에 있었다.

2. 소량첨가 및 감염성 분석을 위한 바이러스 스톡

X-MuLV가 바이러스 불활성화를 평가하기 위해 사용되었다. X-MuLV 바이러스 스톡은 WuXi AppTec(필라델피아, PA)에 의해 제조되었다. X-MuLV 바이러스 스톡 용액의 한 묶음(lot)은 대략 10⁷ PFU/mL의 역가를 가졌다. 모든 실행을 위해서, 바이러스 스톡 용액을 로드 물질에 소량첨가하기에 앞서 초음파 처리하고 여과하였다. 감염성 시료를 제거하고 15분의 시점에서 분석하였는데, 이는 0.5 mL의 분석 부피를 가졌다. 감염성 시료를 제거하고 30분의 시점에서 시험하였는데, 이는 7 mL의 보다 큰 분석 부피를 가졌다. 모든 시료는 PG4 지시 세포를 사용하여 X-MuLV 감염성에 대해 정량화되었다. 플레이팅에 앞서, 시료를 pH 6.5-7.5로 중성화하였다. 바이러스 LRF를, 방정식 1에 기재된 바와 같이, 로드 중에 존재하는 소량첨가된 바이러스의 양과 풀 내에 존재하는 바이러스의 양을 비교함으로써 계산하였으며, 여기서 C(바이러스, 로드)는 로드 중의 바이러스 농도를 나타내고, C(바이러스, 풀)은 풀 중의 바이러스 농도를 나타내며, V(로드)는 로드 부피를 나타내고, V(풀)은 풀 부피를 나타낸다.

방정식 1. 바이러스 Log₁₀ 감소 인수(LRF)의 계산

시료는 연구의 실행에 선행하여 감염성 분석의 지시 세포주 상에서 시료 매트릭스의 세포독성 효과에 대해 평가되었다. 바이러스 불활성화가 낮은 pH 유지의 존재로 인해 일어났으며 단백질 매트릭스 그 자체와는 연관이 없다는 사실을 보장하기 위해 소량첨가 연구 동안 추가적인 제어가 수행되었다.

방법 및 장치

1. pH 적정 및 소량첨가를 위한 방법:

시료를 0.25 M 인산 또는 0.25 M 글리신 HCl을 사용하여 바람직한 pH 값으로 적정하였다. 산성 시료를 2M 트리스 염기를 사용하여 중성화시켰다. 각각의 불활성화 실험을 실험적 설계에 의해 안내된 바와 같은 2가지 소량첨가 방법 중 하나를 사용하여 수행하였다. 소량첨가 방법 1, 예를 들어, 조정-소량첨가-재조정 방법 하에서, 시료를 표적 pH로 조정/적정하고 그후에 약 7.2의 pH를 갖는 바이러스 스톡을 소량첨가하였다. pH 유지의 타이밍은 소량첨가의 시간에 시작하였다. 바이러스 스톡을 소량첨가한 후 pH 증가의 관찰로 인해, 시료의 pH는 pH 유지의 나머지 동안 바람직한 온도에서 유지되기에 앞서 표적 pH로 재조정되었다. 소량첨가 방법 2, 예를 들어, 소량첨가-조정 방법 하에서, 시료는 먼저 바이러스 스톡 용액이 소량첨가되고 그후에 표적 pH로 조정/적정되었다. 산 첨가 단계는 대규모 제조를 대표할 적절한 혼합 시간 및 속도로 시린지 펌프를 사용하여 수행되었다. 표적 pH가 달성되었을 때, pH 유지의 타이밍이 시작하였고, 시료는 바람직한 온도에서 인큐베이션되었다.

두 소량첨가 방법 1 및 2에 있어서, 시작 로드 물질은 2% X-MuLV 바이러스 스톡(v/v)이 소량첨가되었다. 소량첨가-이후 여과가 실험 설계에서 요소로서 나타났을 때, 0.2μm PES 필터(폴리에테르술폰 필터)가 사용되었다. 벌크(bulk) 물질을 pH 유지의 지속시간 동안 중탕 냄비에서 인큐베이션하였다. 중탕 냄비의 온도는 실험 설계에서의 요소였으며, 이는 보정된 온도계를 사용하여 모니터링되었다. 모든 pH 측정은 생물학적 안정성 캐비넷에서 벌크 물질로부터 제거된 2 mL 시료와 함께 오프라인으로 이루어졌다.

2. pH 측정용 장치

pH 값의 측정은 랩 엑스퍼트 프로(Lab Expert Pro) pH 프로브 및 세븐컴팩트(SevenCompact) S220 pH 측정기(메틀러 톨레도(Mettler Toledo), 콜롬버스, OH)를 사용하여 수행하였다. 측정기를 선형 보정 모드, 엄격한 끝점 형식, 및 자동 온도 보상으로 설정하였다. pH 측정기는 결과를 소수점 이하 두 자리까지 표시하도록 설정된다. 프로브를 사용하기에 앞서 전극 보관 용액 중 30분 내지 60분 동안 평형화하였다. 프로브를 pH 1.68, pH 4.01, 또는 pH 7.00을 갖는 완충액(VWR, 라드너(Radnor), PA)을 사용하여 보정하였다. 3점 교정 기울기 백분율에 대한 기준은 97.0-103.0% 내에 있었다. 성공적인 보정 다음에, pH 3.00 및 pH 6.00에서 독립적인 완충액 표준물질을 측정하여 정확도가 완충액 pH의 ±0.03 pH 단위 내임을 확인하였다. 독립적인 표준물질을 재-측정하여 날마다 최종 시료의 완성 다음에 pH가 표적 pH에 남아있음을 확인하였다. 새로운 pH 프로브를 같은 기준에 맞게 보정하였고 시간이 지남에 따라 프로브 변동성을 최소화하기 위해 연구 실행의 날마다 사용되었다.

3. 낮은 pH 유지를 위한 실험의 통계적 설계(DoE)

실험의 통계적 설계(DoE)가 레트로바이러스 불활성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 효과를 평가하고 특징화하기 위해 사용되었다. 단백질 유형, pH, 온도, 산 적정제, NaCl 농도, 소량첨가 타이밍, 및 소량첨가-이후 여과를 포함하는, 낮은 pH 유지 단계와 연관된 여러가지 요소의 효과가 평가되었다. 소프트웨어가 통계적 DoE를 설계하여 이들 요소의 영향을 조사하기 위해 사용되었다. D-최적 모델 설계, 예컨대 15회 실행 또는 30회 실행이 JMP 소프트웨어 v.13(SAS, 캐리(Cary) NC)을 사용하여 생성되었다. D-최적 설계의 산점도 행렬 및 다변량 상관관계가 도 2a에 나타나있다. 표 1에 나타난 바와 같이 다음을 포함하는 7개의 요소가 연구 설계 안에 확립되었다: 단백질 유형, 예컨대 상이한 아이소형, 예를 들어, IgG1 또는 IgG4의 2개의 단클론성 항체(mAb); pH, 예컨대 pH 3.65, pH 3.73 또는 pH 3.80; 온도, 예컨대 15℃ 또는 20℃; 산 적정제, 예컨대 0.25 M 인산 또는 0.25 M 글리신 HCl; 시작 용액 중 NaCl 농도, 예컨대 0 mM, 50 mM, 또는 100 mM; 소량첨가 타이밍, 예컨대 조정-소량첨가-재조정 방법 또는 소량첨가-조정 방법; 및 소량첨가-이후 여과, 예를 들어, 소량첨가-이후 여과함 또는 하지 않음. 소량첨가 용액은 2% v/v 소량첨가를 위해 X-MuLV 정제된 스톡을 함유한다. 표 1은 각각의 요소의 특이적인 수준 또는 유형을 포함하여, 설계 매트릭스에의 이들 7개 요소의 구현을 나타낸다.

[표 1] 실험의 설계 시 사용된 요소

설계는 모든 주요 효과 및 일부 상호작용을 평가하였다. 총 30회 실행, 15가지 조건이 2회 반복으로 4일에 걸쳐 같은 분석가에 의해 실행되었다. 추가적인 제어가 NaCl 함량, 예를 들어, 0 mM, 50 mM 또는 100 mM NaCl의 3개 수준에서 각각의 단클론성 항체에 대해 포함되었다. 시료는 2개의 시점(T), 예컨대 15분 또는 30분에서, 감염성 분석을 사용하여 분석되었다. 반응은 15분 및 30분에서의 X-MuLV LRF였다. JMP®(SAS로부터의 통계적 소프트웨어)를 최소 자승 추정에 의한 모델링을 수행하기 위해 사용하였다. 분산 분석(ANOVA)을 통계적으로 유의한(P < 0.05) 요소 및 상호작용을 식별하기 위해 사용하였다. 모든 비-유의한 요소(P > 0.05), 공선적(collinear) 요소(VIF > 5), 및 이상치 실행(잭나이프 거리에 의해 결정됨)을 제거하였다.

도 2b에 나타난 바와 같이 중성의 제어가 모든 단클론성 항체 조건에 대해 수행되었다. 중성의 제어는 측정된 바이러스 활성이 낮은 pH에서의 화학적 불활성화의 결과임을 보장하기 위해 수행되었다. 로드 물질의 pH는 약 pH 6.5-7.5로 조정되었다. 단백질 매트릭스 단독으로부터 바이러스 불활성화가 기인하지 않았다는 사실을 입증하기 위해 어떤 클리어런스도 관찰되지 않는 것이 기대되었다. 시료를 여과-이전 및 여과-이후의 단계로부터 수득하여 필터 상에서의 잠재적인 바이러스 손실을 모니터링하였다. 단클론성 항체의 각각의 조건은 데이터 분석을 위해 로드 물질로서 역할을 하는 대표적인 중성의 제어를 가졌다. 환경의 온도는 pH 측정에 영향을 미칠 수 있다. 모든 바이러스 취급, 조정 및 pH 측정은 실온에서 발생하였다. 벌크 시험 물품을 중탕 냄비에서 2가지 상이한 온도 조건에서 인큐베이션하였다. 메틀러 톨레도 엑스퍼트 프로(Mettler Toledo Expert Pro)를 측정을 위해 사용하였다.

실시예 1. 낮은 pH 유지에의 영향을 갖는 요소의 조사

낮은 pH 유지에 대한 X-MuLV 불활성화에의 단백질 유형, pH, 온도, 산 적정제, NaCl 함량, 소량첨가 타이밍, 및 소량첨가-이후 여과의 영향을 표 1에 나타난 바와 같은 실험의 D-최적 설계를 통해 연구하였다. 같은 바이러스 스톡, 인력, 완충액 및 장비를 이용해 연속적인 4일에 걸쳐 15회 실행을 반복으로 수행하였다. 중성의 제어가 각각의 단클론성 항체(mAb) 조건(mAb 유형 및 NaCl 함량, N=6)에 대해 수행되었고 데이터 분석을 위한 로드 시료로서 역할을 하였다. 15분 및 30분 두 시점에서의 각각의 실행 조건 및 결과적인 LRF 값이 표 2에 열거되어있다. 표 2는 실험의 설계에 대한 데이터 요약을 나타낸다. 30분 후 30회의 실행 중 22회에서는 어떤 바이러스도 검출되지 않았다. 30분 후의 각각의 반복 실행의 경우에 LRF는, 데이터 분석 동안 이상치로서 제거된 2회의 실행을 제외하고, 서로의 0.5 LRF 내에 있었다. pH 측정, 산 적정제, 또는 로드 물질에 기반한 데이터세트에서 날마다 또는 실행마다의 유의한 변동성은 없었다.

표 2에서, 표적 pH과 관련하여, 시료를 ±0.02 pH 단위의 범위 내에서 표적 pH로 조정하였다. NaCl 함량과 관련하여, 산을 사용하여 낮은 pH로의 적정을 수행하기에 앞서 NaCl을 벌크 물질에 첨가하였다. ">"의 부호는 바이러스가 분석의 검출 한계 밑으로 감소되었다는 사실을 의미한다. P는 인산을 의미한다. G는 글리신 HCl을 의미한다. 일부 특이적인 실행이 잭나이프 거리에 의해 이상치로서 결정되어 추가의 데이터 분석에 앞서 제거되었다. 감염성 분석 전, 비-간섭 희석이 식별될 수 있도록, 시료 매트릭스를 지시 세포주에서의 바이러스 증식의 간섭에 대해 평가하였다. 관찰된 간섭에 기반하여, 실행이 3-배 희석에서 보고되었다. 1회의 반복 실행은 3-배 희석에서 감염성 분석을 예상치 않게 방해하였으며 보고된 값은 방해를 예방하는 10-배 희석에서였다. 이 실행은 잭나이프 거리에 의해 이상치인 것으로 결정되어 데이터 분석으로부터 제거되었다.

[표 2] 실험의 설계에 대한 데이터 요약

실시예 2. 상이한 표적 pH에서의 X-MuLV 불활성화 동역학의 분석

실험의 통계적 설계(DoE)를 여러가지 요소, 예컨대 단백질 유형, pH 조건, 온도, 산 적정제, 시작 용액의 이온 강도 조건, 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 평가를 포함하여 바이러스 불할성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 효과를 평가하고 특징화하기 위해 사용하였다. 통계적 DoE를 바이러스 불활성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 효과를 평가하고 특징화하기 위해 사용하였다. 상이한 표적 pH를 고려하여 X-MuLV의 불활성화 동역학을 분석하였다. 15분 및 30분의 시점에서 시료를 X-MuLV 감염성에 대해 시험하여 낮은 pH 유지의 초기 불활성화(예를 들어, 15분) 및 끝에서의 불활성화(예를 들어, 30분)를 평가하였다. 도 3a-3c는 표적 pH 3.65, pH 3.73 또는 pH 3.80에서 X-MuLV의 불활성화 동역학을 나타낸다. LRF 곡선은 각각의 pH 값에 대해, 시점에 대해 LRF 값을 플롯팅함으로써 수득되었다. 도 3a-3c에 나타난 바와 같이, 개방형 원은 시료 중에 어떤 바이러스도 검출되지 않았음을 의미하며 X자는 시료 중에 바이러스가 검출되었음을 의미한다. 빨간 선은 pH 3.65±0.02에서 수행된 각각의 실행에 대응한다; 초록색 선은 pH 3.73±0.02에서 수행된 각각의 실행에 대응한다; 및 파란 선은 pH 3.80±0.02에서 수행된 각각의 실행에 대응한다. 도 3a에 나타난 바와 같이, pH 3.65 실행의 경우, 15분 시점에서 어떤 시료에서도 바이러스가 검출되지 않았으며, 이는 바이러스의 급격한 불활성화를 나타낸다(대략 2.5 PFU/mL의 검출 한계). 30분 시점에서 pH 3.65 실행의 경우, 2회 실행이 검출된 바이러스를 나타내었다. 그러나, 이들 2회의 실행의 결과는 분석에 대한 검출 한계(대략 1.0 PFU/mL)에 접근하였다. pH 3.65±0.02에서, 모든 LRF는 30분 시점에서 5.0 초과였다. pH 3.73 및 pH 3.80의 실행의 경우, 도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, 실행 사이에 차이가 일어났으므로 일부 불일치가 존재하였다. pH 3.73 또는 pH 3.80에서의 일부 실행은 pH 3.65 실행과 유사한 급격한 불활성화를 나타내었다. pH 3.73 또는 pH 3.80에서의 1회 또는 2회 실행은 30분에서 불완전한 불활성화를 나타내었다. 이들 실행의 변동성은 또다른 요소가 pH 조건보다 강한 효과를 가질 수 있다는 사실을 시사한다.

실시예 3. 상이한 NaCl 함량에서의 X-MuLV 불활성화 동역학의 분석

표 2에서의 30분 시점에서 검출된 레트로바이러스를 나타낸 실행에 대해 보다 많은 분석을 수행하였다. 30분 후 검출된 바이러스를 갖는 이들 실행 사이의 공통적인 요소, 예를 들어, NaCl 함량을 분석하였다. 시작 로드 물질에의 NaCl의 첨가 없이 실행을 수행하였다. LRF 곡선은 각각의 첨가된 NaCl의 수준에 대해, 시점에 대해 LRF 값을 플롯팅함으로써 수득되었다. 도 4a-4c는 0 mM(도 4a), 50 mM(도 4b) 또는 100 mM(도 4c)의 NaCl 함량에서 X-MuLV의 불활성화 동역학을 나타낸다. 도 4a-4c에 나타난 바와 같이, 개방형 원은 시료 중에 어떤 바이러스도 검출되지 않았음을 의미하며 X자는 시료 중에 바이러스가 검출되었음을 의미한다. 빨간 선은 약 pH 3.65±0.02에서 수행된 각각의 실행에 대응한다; 초록색 선은 약 pH 3.73±0.02에서 수행된 각각의 실행에 대응한다; 파란 선은 pH 3.80±0.02에서 수행된 각각의 실행에 대응한다.

결과는 시작 용액의 전도성이 상이한 표적 pH 조건에서 X-MuLV 불활성화 동역학에 영향을 미치는 것에 있어서 강한 효과를 갖는다는 사실을 나타내었다. NaCl 함량은 레트로바이러스 불활성화에 가장 큰 영향을 갖는 것으로 결정되었다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 로드 물질이 낮은 이온 강도를 가질 때 또는 어떤 NaCl도 시작 물질에 첨가되지 않을 때 pH 조건이 중요한 요소였다. 데이터는 X-MuLV 불활성화가 낮은 이온 강도에서 pH에 의존적이라는 사실을 시사하였다. 그러나, 이온 강도가 증가할 때, 예를 들어, NaCl 농도를 증가시킬 때, 모든 세 표적 pH 조건에서 X-MuLV가 급격하게 불활성화되므로, 상이한 표적 pH 조건의 효과는 관찰되지 않았다. 다시 말해서, NaCl의 농도가 증가될 때, X-MuLV 불활성화에의 pH 조건의 영향은 감소한다. 도 4b(50 mM NaCl) 또는 도 4c(100 mM NaCl) 각각에 나타난 바와 같이, 50 mM 또는 100 mM NaCl이 첨가될 때, pH 3.65, pH 3.73, 및 pH 3.80에서의 표적 pH 조건에 대해 X-MuLV의 완전하고 효과적인 클리어런스가 30분 시점에서의 모든 실행에 대해 관찰되었다. 낮은 전도성(예를 들어, 낮은 NaCl 함량)에서, pH는 X-MuLV 불활성화에 강한 효과를 갖는다. 보다 높은 전도성(예를 들어, 보다 높은 NaCl 함량)에서, pH는 X-MuLV 불활성화에 아무 효과도 갖지 않는다. 0.25M 글리신 HCl은 0.25M 인산과 비교 시 증가된 X-MuLV 불활성화를 나타내었다.

실시예 4. 다변량 선형 회귀 모델의 생성

상이한 요소들의 영향을 조사하기 위해, 다변량 선형 회귀 모델을 생성하여 평가된 요소들의 주요 효과, 2차방정식, 및 상호작용을 조사하였다. 더욱이, 15분 및 30분 시점 둘 다에서 X-MuLV 불활성화에의 이온 강도의 효과를 정량화하였다. 생성된 모델은 표 3에 나타난 바와 같이 < 0.15 LRF의 오차 추정치를 포함하여 약 99%의 조정된 R² 값을 갖는 반면에, 감염성 분석의 보고된 변동성은 0.5 LRF(ICH Q5A (R1))이다. 표 3에서, R²는 상관 계수를 의미한다; 조정된 R²는 모델에 의해 설명되는 변동의 양을 의미한다; RMSE는 방법에서 오차 추정치에 대한 제곱 평균 제곱근 오차를 의미한다. 표 4는 각각의 모델에 대한 유의한(P < 0.05) 요소의 목록을 나타낸다. 실제 대 예측된 플롯이 도 5a 및 5b에 나타나있다. 2가지 시점에 대한 LRF에 대한 다변량 선형 회귀 모델의 실제 대 예측된 값의 플롯이 도 5a 및 도 5b, 예를 들어 15분(도 5a) 또는 30분(도 5b)에 나타나있다. 빨간 선은 적합선(fit line)을 의미하고, 파란 선은 평균 선을 의미하고, 빨간 음영성은 도 5a 및 도 5b에서의 95% 신뢰구간을 의미한다.

[표 3] 각각의 시점에 대해 적합한 유의한 다변량 선형 회귀 모델

[표 4] 각각의 시점에 대해 생성된 LRF 다변량 선형 회귀 모델로부터 결정된 유의한 요소

15분 및 30분 동안 생성된 LRF 모델에 대한 유의한 파라메터가 같았고 효과 크기에서 유사한 경향성을 나타내었다. 그러나, mAb와 pH 사이의 상호작용은, 이것이 30분 LRF 모델에 대해서만 유의했으므로, 예외적이었다. pH 조건은 바이러스 불활성화를 위해 중요한 것으로 공지되었다. 그러나, 모델은 15분 및 30분 시점 둘 다에서 X-MuLV 불활성화에 NaCl이 가장 강한 효과를 나타냄을 나타냈다. NaCl 농도가 증가될 때, X-MuLV의 LRF는 이온 강도가 불활성화에 아무 영향이 없을 때까지 따라서 증가한다. 중요할 것으로 결정된 기타 요소는 NaCl 함량, pH 및 NaCl 함량 사이의 상호작용, 및 pH 조건의 2차방정식이었다. 불활성화 동역학에의 NaCl 농도의 효과는 도 6에 따라 설명될 수 있다. NaCl의 농도가 증가될 때, X-MuLV 불활성화에의 pH의 영향은 감소한다.

온도, mAb, 소량첨가-이후 여과, 산 적정제, 소량첨가 방법, 및 pH와 mAb 사이의 상호작용의 주요 효과는 선형 회귀 모델 내에서 모두 유의하였다. 그러나 이들 요소의 효과 크기는 보고된 감염성 분석 변동성(예를 들어, 0.5 LRF)보다 적었다. 이들 요소가 생성된 모델 내에서 유의하였지만(P < 0.05), 이들은 효과 크기가 감염성 분석 변동성보다 적었으므로 사실상 유의하지 않았다. 온도는, 낮은 온도가 감소된 불활성화 동역학과 상관관계가 있으므로, 바이러스 불활성화에 공지된 효과를 가졌다. 그러나, 이 데이터 세트는 15℃ 내지 20℃의 범위 사이의 작용으로 인해 불활성화의 최소의 차이를 시사하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 15분 및 30분 지점 둘 다의 후 4 LRF 초과를 달성하도록 모델을 최적화하기 위해 예측 프로파일러를 생성하였다. 도 6은 D-최적 DoE에서 평가된 유의한 요소의 함수로서 X-MuLV 불활성화를 보여주는 예측 프로파일러를 나타낸다: 빨간 선은 최적선을 의미한다; 파란 선은 평균 선을 의미한다; 빨간 음영선은 95% 신뢰 구간을 의미한다; P는 인산을 의미한다; G는 글리신 HCl을 의미한다. 모든 기타 요소들이 일정하게 남아있는 동안, 약 pH 3.60 내지 3.90의 범위에서 바이러스 불활성화 작용 시 NaCl의 첨가를 통한 전도성의 증가는 보다 큰 레트로바이러스 LRF를 초래할 수 있다.

본 출원에서 낮은 pH 유지를 위한 통계학적 DoE의 시험 결과는 3.60 미만의 pH에서의 5.0 LRF X-MuLV 불활성화에 대해 ASTM 표준과 일치하였다. 결과는 또한 3.60 초과의 pH에서의 강력하고 효과적인 불활성화를 입증하였다. ASTM 일반적 주장의 바깥의 범위의 경우, 결과는 NaCl 함량을 증가시키는 것이 급격하고 효과적인 X-MuLV 불활성화를 달성할 수 있음을 나타내었다. 전형적으로, 유지의 pH는 단백질의 안정성에 의존한다. 낮은 pH 시작 물질의 전도성을 조작함으로써 pH 3.60-3.90의 범위 내에서 바이러스 불활성화를 작용시킬 때 본 출원의 모델이 효과적인 클리어런스를 예측하기 위해 사용될 수 있다.

높은 단백질 농도, 예컨대 25 g/L 초과는 X-MuLV 불활성화에 부정적으로 영향을 미치는 것으로 보고되었다(ASTM). 그러나, 이전의 리제네론(Regeneron) 연구는 높은 단백질 농도가, 불활성화가 완료되지 않을 조건 하에서 X-MuLV 불활성화 동역학을 잠재적으로 개선할 수 있다는 사실을 입증하였다. 증가된 이온 강도, 예컨대 보다 높은 완충액 농도, 약산의 적정 또는 보다 높은 단백질 농도가 있는 조건은 보다 높은 pH에서 보다 높은 LRF와 상관관계가 있었다(Chinniah 등). 본 출원의 데이터세트는 유사한 농도를 갖는 2개의 단클론성 항체를 사용했지만, 데이터로부터의 결론은 단백질 농도의 증가가 불활성화를 증가시킬 것이라는 결론에 동의한다. 바람직한 pH를 달성하기 위해 요구되는 산 적정제의 증가로 인해 적정 동안 보다 많은 이온이 첨가되었다. 결과는 용액의 이온 강도의 증가였으며 이 실험은 보다 큰 불활성화 동역학을 시사할 것이다.

단백질 농도의 영향과 유사하게, 산 적정제에 대한 모델에 의해 관찰된 유의한 차이가 있었는데, 여기서 글리신 HCl 산 적정제(약산)는 인산 적정제(강산)의 보다 높은 LRF 값과 상관관계가 있었다. 이 결론은 효과 크기가 0.5 LRF 미만이었기 때문에 사실상 유의하지 않았다. 결과는 용액 중 이온 농도의 증가로 인해 불활성화가 증가된다는 것을 시사한다. 이전의 연구는 바이러스 불활성화의 열역학으로 인해 보다 낮은 온도에서 보다 낮은 클리어런스를 나타내었다. 온도는 생성된 선형 회귀 모델에서 통계적으로 유의했지만, 연구된 범위 내(15 내지 20℃)에서는 최소의 효과 크기를 가졌다. 이전의 연구는 15℃와 16+℃ 사이에서 바이러스 불활성화에의 통계적으로 유의한 차이가 없다고 결론내린다(Mattila 등, Retrospective evaluation of low-pH virus inactivation and viral filtration data from a multiple company collaboration, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 70.3 (2016): 293-299). 본 출원의 실험은 ASTM 일반적 바이러스 클리어런스 주장을 뒷받침할 뿐만 아니라 pH 3.60 초과에서 레트로바이러스의 효과적인 불활성화를 달성하는 용액을 식별하였다. 보다 높은 pH에서, 용액의 이온 강도를 증가시키는 것은 바이러스 분산을 촉진할 수 있다. 낮은 전도성 용액에서, 레트로바이러스 당단백질은 낮은 pH에서 잠재적으로 응집할 수 있으며 그들 스스로를 화학적 손상으로부터 보호할 수 있다. 50 mM 및 100 mM NaCl의 첨가 시, 모든 pH 세트 지점에서의 모든 실행은 30분 후 완전하고 효과적인 클리어런스를 나타내었다. 요약하면, 실험이 ASTM 모듈식 주장을 벗어나는 pH에서 작용될 때 효과적인 X-MuLV 불활성화에 대한 작용 공간이 정의될 수 있다.

실시예 5. 기존의 및 재설계된 작용 조건의 평가

실험의 통계적 설계(DoE)를 여러가지 요소, 예컨대 단백질 유형, pH 조건, 온도, 산 적정제, NaCl 함량, 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 평가를 포함하여 바이러스 불할성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 효과를 평가하고 특징화하기 위해 사용하였다. 낮은 pH 유지 단계에 대한 DoE를 낮은 pH 유지를 위한 pH 3.70-3.75에서의 일부 기존의 작용 조건을 평가하기 위해 사용하였다. 파라메터 추정치를 포함하는 예측된 프로파일러가 도 7에 나타난 바와 같이 생성되었다.

낮은 pH 유지 단계에 대한 DoE를 낮은 pH 유지를 위한 pH 3.65-3.70에서의 일부 기존의 재설계된 작용 조건을 평가하기 위해 또한 사용하였다. 파라메터 추정치를 포함하는 예측된 프로파일러가 도 8에 나타난 바와 같이 생성되었다. 약 pH 3.65-3.70에서의 재설계된 작용 조건은 1.5% 실패율로 30분 시점에서 4 LRF X-MuLV 클리어런스를 충족시키는 데 실패하였다.

실시예 6. 단백질 유형의 요소의 평가

통계적 DoE를 여러가지 요소, 예컨대 단백질 유형, pH 조건, 온도, 산 적정제, NaCl 함량, 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 평가를 포함하여 바이러스(X-MuLV) 불할성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 효과를 평가하고 특징화하기 위해 사용하였다. DoE는 단백질 유형, 예컨대 단클론성 항체의 아이소형에 대한 다변량 모델의 예측에서 통계적으로 유의함을 나타냈으나, 단백질 유형, 예컨대 IgG1 및 IgG4 사이의 차이는 도 9에 나타난 바와 같이 연구 범위에서 유의미하지 않았다. 도 9는 NaCl, pH, 산 적정제, 온도, 단백질 유형(mAb, 단클론성 항체), 소량첨가 타이밍 및 이들의 조합을 포함하여, 평가된 요소에 대해 스케일링된 추정된 LRF를 나타낸다. 기존의 작용 조건에 대한 회고적 데이터는 단클론성 항체의 아이소형, 예컨대 IgG1 및 IgG4 사이의 유의한 차이를 나타내었다. 그러나, 이들 차이는 pH 범위를 작용시키는 것에서의 차이로 인한 것일 수 있다. 도 9는 회고적 데이터에 기반하여, IgG1 및 IgG2를 포함하는 단백질 유형에 대한 30분 시점에서의 X-MuLV LRF를 또한 나타낸다.

실시예 7. 온도의 요소의 평가

통계적 DoE를 여러가지 요소, 예컨대 단백질 유형, pH 조건, 온도, 산 적정제, NaCl 함량, 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 평가를 포함하여 바이러스(X-MuLV) 불할성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 효과를 평가하고 특징화하기 위해 사용하였다. DoE는 온도에 대한 다변량 모델의 예측에서 통계적으로 유의함을 나타냈으나, 상이한 온도 조건 사이의 차이는 도 10에 나타난 바와 같이 연구 범위에서 X-MuLV 클리어런스에 최소 효과를 가졌다. 도 10은 NaCl, pH, 산 적정제, 온도, 단백질 유형(mAb, 단클론성 항체), 소량첨가 타이밍 및 이들의 조합을 포함하여, 평가된 요소에 대해 스케일링된 추정된 LRF를 나타낸다. 15℃ 내지 20℃의 범위의 산업적 작용 조건(Mattila 등)으로부터의 회고적 데이터는 15±1℃ 내지 16+℃에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 도 10은 회고적 산업적 데이터에 기반하여 상이한 온도 조건에 대한 레트로바이러스 LRF를 또한 나타낸다.

실시예 8. 소량첨가 타이밍의 요소의 평가

통계적 DoE를 여러가지 요소, 예컨대 단백질 유형, pH 조건, 온도, 산 적정제, NaCl 함량, 소량첨가 타이밍, 또는 소량첨가-이후 여과의 평가를 포함하여 바이러스(X-MuLV) 불할성화에 대한 낮은 pH 유지 단계의 효과를 평가하고 특징화하기 위해 사용하였다. 본 출원의 통계적 DoE에서 소량첨가 타이밍은 조정-소량첨가-재조정 방법 또는 소량첨가-조정 방법이다. 조정-소량첨가-재조정 방법 하에서, 시료를 표적 pH로 조정/적정하고 그후에 pH 7.2를 갖는 바이러스 스톡을 소량첨가한다. pH 유지의 타이밍은 소량첨가의 시간에 시작된다. 바이러스 스톡을 소량첨가한 후 pH 증가의 관찰로 인해, 시료의 pH는 pH 유지의 나머지 동안 바람직한 온도에서 유지되기에 앞서 표적 pH로 재조정되었다. 소량첨가-조정 방법 하에서, 시료는 먼저 바이러스 스톡 용액이 첨가되고 그후에 표적 pH로 조정/적정된다. 표적 pH가 달성될 때, pH 유지의 타이밍이 시작되고, 시료는 바람직한 온도에서 인큐베이션된다.

2가지 상이한 방법에 대한 소량첨가 타이밍에서의 차이는 도 11에 나타난 바와 같이 연구 범위에서 X-MuLV 클리어런스에 유의미한 차이를 갖지 않는다. 도 11은 NaCl, pH, 산 적정제, 온도, 단백질 유형(mAb, 단클론성 항체), 소량첨가 타이밍 및 이들의 조합을 포함하여, 평가된 요소에 대해 스케일링된 추정된 LRF를 나타낸다. 도 11은 2가지 방법에 대한 소량첨가/조정에 대한 시간을 또한 나타낸다.

Claims

시료로부터 펩티드 또는 단백질을 정제하기 위한 방법으로서,
염의 첨가에 의해 시료에 이온 강도를 증가시키는 단계,
시료를 산성 pH에 노출시키는 단계, 및
후속으로 시료를 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 15분 동안 유지하여 다량의 바이러스 입자를 불활성화시키는 단계를 포함하며;
상기 시료는 바이러스 입자를 포함하는 하나 이상의 불순물을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 바이러스 입자 불활성화의 양은 적어도 약 3 LRF(대수 감소 인수)인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 바이러스 입자 불활성화의 양은 적어도 약 4 LRF인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료의 pH 조건은 약 pH 3.90 이하인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료의 pH 조건은 약 pH 3.60 내지 약 pH 3.90의 범위 내에 있는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료의 pH 조건은 약 pH 3.65 내지 약 pH 3.80의 범위 내에 있는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 숙주-세포에서 생산된 항체인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료를 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 적어도 약 30분 동안 유지하여 다량의 감염성 바이러스 입자를 불활성화시키는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료를 이온 강도 조건 및 pH 조건에서 약 15분 내지 약 30분 동안 유지하여 다량의 감염성 바이러스 입자를 불활성화시키는, 방법.
제1항에 있어서, 실험의 D-최적 설계를 실행함으로써 다량의 감염성 바이러스 입자를 불활성화시키기 위해 시료의 이온 강도 및 pH 조건을 최적화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 실험의 D-최적 설계는 시료의 pH 조건 및 시료의 이온 강도를 평가하고 시료의 pH 조건 및 시료의 이온 강도를 조정하여 다량의 감염성 바이러스 입자를 불활성화시키는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 실험의 D-최적 설계는 다음 중 하나 이상을 추가로 평가하고 조정하는, 방법:
시료의 전도성;
펩티드 또는 단백질의 유형;
시료의 온도;
시료의 pH 조건을 조정하기 위한 산 적정제;
시료에 바이러스 입자를 소량첨가하기 위한 방법; 또는
소량첨가-이후 여과의 존재.
제1항에 있어서, 상기 시료는 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용리액인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료의 이온 강도는 염화나트륨의 첨가를 사용하여 조정되고, 상기 염화나트륨의 농도는 약 1 mM 내지 약 100 mM의 범위 내에 있는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도는 약 1 mM 내지 약 500 mM의 범위 내에 있는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도는 약 25 mM, 약 50 mM, 또는 약 100 mM인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료의 pH 조건은 인산 또는 글리신 HCl을 사용하여 조정되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 IgG1 아이소형을 갖거나 IgG4 아이소형을 갖는 항체인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 단클론성 항체 또는 이중특이적 항체인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체(conjugate), 융합 단백질, 단백질 약제학적 제품 또는 약물인, 방법.
관심있는 단백질 및 감염성 바이러스 입자를 갖는 시료로부터 관심있는 단백질 및 감소된 양의 바이러스 입자를 포함하는 제제(preparation)를 생산하는 방법으로서,
시료를 약 3.6 초과의 pH로 처리하는 단계;
시작 용액에의 염의 첨가에 의해 시료에 이온 강도를 증가시키는 단계; 및
시료를 pH 및 이온 강도 조건에서 적절한 양의 시간 동안 유지하여 관심있는 단백질 및 감소된 양의 감염성 바이러스 입자를 포함하는 제제를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 시료 중의 관심있는 단백질의 농도는 약 25 g/L 초과인, 방법.
[청구항 22]
제21항에 있어서, 상기 적절한 양의 시간은 약 15분, 약 20분, 약 25분, 또는 약 30분인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 방법은 시료로부터 감염성 바이러스의 양을 약 3 LRF(대수 감소 인수)만큼 감소시키는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 방법은 시료로부터 감염성 바이러스의 양을 약 4 LRF(대수 감소 인수)만큼 감소시키는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 시료의 pH 조건은 약 pH 3.70, 약 3.80, 약 pH 3.90 또는 약 pH 4.0의 초과인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 시료의 pH 조건은 약 pH 3.60 내지 약 pH 4.0의 범위 내에 있는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 시료는 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용리액인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 시료의 이온 강도는 염화나트륨의 첨가를 사용하여 조정되고, 상기 염화나트륨의 농도는 약 1 mM 내지 약 200 mM의 범위 내에 있는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 염의 농도는 약 50 mM, 또는 약 100 mM의 초과인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 시료의 pH 조건은 인산 또는 글리신 HCl을 사용하여 조정되는, 방법.