CN115803005A - 减轻口腔生态失调和促进生态平衡的益生元和益生菌治疗 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一种包含硝酸盐的组合物，用于通过改变哺乳动物中口腔生物膜的细菌组成及其功能、通过减少疾病相关细菌的量和增加健康相关细菌的量来减少或预防口腔生态失调和/或增强口腔生态平衡，从而在生物膜介导的口腔疾病(例如龋齿、牙周病(牙龈炎、牙周炎或种植体周围炎)和口臭)的24小时之前获得有效的急性治疗或预防，并且其中所述组合物被口服给药到所述哺乳动物，从而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度。所述组合物还可以包含属于罗氏菌属(Rothia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或金氏菌属(Kingella)的细菌菌株，用于提高哺乳动物的硝酸盐还原能力。

Description

减轻口腔生态失调和促进生态平衡的益生元和益生菌治疗
技术领域
本发明涉及医学、口腔护理和微生物学领域，具体来说涉及用于减轻口腔生态失调和促进生态平衡的包含硝酸盐和/或益生细菌的组合物。
背景技术
口腔生态失调/龋齿、牙周病和口臭/当前的治疗
已知口腔微生物区系是多样化的微生物群落，每位个体具有100-200+种细菌物种，并且在全球已在口腔中鉴定到700+种细菌物种。个体之间的变化由年龄、宿主因素(例如遗传和免疫)、环境和习惯的差异造成。口腔为微生物定植和生物膜形成提供了几种不同的栖息地，如牙齿、舌头、颊粘膜(脸颊内部)、唇腭和牙龈，并且每种栖息地中的物种比例显著不同。唾液接种了来自于所有口腔表面的细菌，并且在生物膜去除(例如通过口腔护理)后，来自于唾液的细菌迅速开始在已清洁的表面上形成新的生物膜。
与人体的其他群落相比，口腔微生物区系在健康成年人中在数年的时间段内保持相对稳定。尽管口腔微生物区系稳定，但它是一个活的生态系统，其组成和活性可能经历波动。某些疾病驱动因素会导致口腔微生物组的物种和功能受到干扰，这能够引发口腔疾病。这些与疾病相关的宿主-微生物扰动被称为生态失调，并由微生物组成和活性的变化引起。生态失调可能由例如年龄和唾液腺功能障碍或生活方式的改变如饮食、不良卫生条件或吸烟引起的生理变化造成。
多年来，人们认为在微生物区系中存在引起感染和疾病的“致病”细菌。目前，已知的是，被认为是病原体的细菌是常驻微生物区系的一部分，并且在健康状态下也存在，尽管数量较少。口腔疾病的发生是由于微生物区系平衡的有害变化导致疾病相关物种的丰度增加，而不是引起感染的外源病原体的结果。在生态失调中，疾病相关细菌可以生长到比在健康条件下更高的比例。此外，细菌可以转换新陈代谢并激活促进生态失调和疾病发展的功能。总之，当疾病驱动因素足够强或足够持久时，干扰会导致口腔疾病。
复原力是在疾病驱动因素存在时抵抗干扰或从干扰中恢复的能力，并且这种能力在易感个体和耐受个体之间存在差异。例如在龋齿中，主要的疾病驱动因素是可发酵的碳水化合物例如糖。口腔微生物区系可以将这些碳水化合物发酵成有机酸(主要是乳酸)，从而导致局部pH下降。随着时间的推移，这会产生更耐酸并且更高效发酵碳水化合物的微生物区系，产生正反馈回路，如果pH水平变得低于pH～5.5，则会导致牙釉质脱矿质化。某些物种与在龋齿中观察到的龈上牙菌斑的生态失调状态有关，包括乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Oribacterium、奇异菌属(Atopobium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、放线菌属(Actinomyces)和某些酵母的耐酸代表。重要的是，随着龋齿病的发展，其他与健康相关的物种数量减少，包括奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)和金氏菌属(Kingella)物种。
在牙周病中，主要的疾病驱动因素是由于缺乏口腔卫生，由积累的牙菌斑(即牙齿表面上的生物膜)引起的先天宿主免疫激活。在这种情况下，也存在一个可以破坏微生物区系并导致牙周病的正反馈回路。在所述回路中，菌斑积聚导致厌氧条件的增加以及随后厌氧物种的生长。此外，宿主利用牙龈炎症对积聚的细菌做出响应，这选择耐炎症的物种。炎症还导致温度略微升高和龈沟液(GCF，即从龈缝渗出的血清样流体)渗漏更多。GCF含有大量血清蛋白，无意中充当蛋白水解物种的营养物质。蛋白质的降解导致中性或微碱性pH，刺激嗜碱性物种的生长。
牙周病始于细菌、生物膜引起的牙齿周围软组织的炎症(即牙龈炎)。牙菌斑外观为不同深浅的白色，并与通常在与牙齿邻接的牙龈边缘处存在的食物残渣结合。生物膜也常见于牙齿之间，需要通过使用例如牙线和邻间刷等的额外努力才能去除。定期的口腔护理对于预防炎症是必要的，因为不进行口腔护理会毫无例外地导致牙龈炎，通常在2-3周的时间后导致牙龈炎。牙龈炎的反复或长期持续发作可导致牙周炎，这是一种慢性破坏性炎症，在其中会丧失宿主组织。
与牙周炎相关的生态失调的龈下菌斑微生物区系是复杂的。与牙周炎相关(即在疾病中一贯更丰富)的经典细菌包括牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、中间普氏菌(Prevotella intermedia)、微小微单胞菌(Parvimonas micra)和放线共生凝聚杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans)。然而，在最近的一项系统性概述中，将17个其他物种与所述疾病相关联，包括选自真杆菌属(Eubacterium)、新月形单胞菌属(Selenomonas)、小杆菌属(Dialister)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、密螺旋体属(Treponema)和普氏菌属(Prevotella)的(其他)物种(Perez-Chaparro等，2014)。重要的是，在牙周病发展过程中，健康相关物种也会减少或消失，它们尤其包括代表性的奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)或金氏菌属(Kingella)。就此而言，奈瑟氏菌属(Neisseria)和罗氏菌属(Rothia)与抗炎介导物相关，这表明这些物种防止有害的炎症。在发生在牙齿种植体周围组织中的病理状态的种植体周围炎的情况下，发现相关的微生物学与牙周炎极为相似，并且也被认为是微生物生态失调的结果，这导致种植体周围黏膜的强烈炎症和支撑骨的累进性丧失。
口腔异味，也被称为口臭，是一种存在明显令人不快的口气气味的症状。在90％的病例中口臭是口腔内的，主要由导致微生物生态失调的舌头微生物区系的组成和活性的变化引起。这种生态失调状态导致含硫氨基酸的细菌降解，其导致挥发性硫化合物(VSC)例如硫化氢(H2S)、甲硫醇以及较小程度的二甲基硫醚的产生。除了舌头微生物区系之外，口臭也与牙周炎有关，牙周袋可能是VSC形成的来源。然而，大多数口臭个体并未患牙周炎，他们的舌苔是VSC的唯一来源。采用不同检测方法的不同研究已鉴定到与VSC产生和口臭相关的广泛的细菌。一些始终与舌头微生物区系的生态失调状态相关的细菌为代表性的普氏菌属(Prevotella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)和纤毛菌属(Leptotrichia)以及经典的口臭生物标志物Solobacteriummoorei。有趣的是，S.moorei也与牙周炎有关。与龋齿和牙周病一样，存在一些健康相关物种可以预防口臭，包括罗氏菌属(Rothia)和奈瑟氏菌属(Neisseria)物种。口臭的病变对那些患有口臭的人在个人和社交方面有重大影响，据估计它是继蛀牙和牙周病之后寻求牙科帮助的第三大常见原因。
值得注意的是，所述健康相关和疾病相关的细菌群落在不同的表面及其对应的疾病之间存在差异。然而，在不同的疾病之间可以发现一些重叠。例如，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)与牙周炎中的炎症有关，但也与口臭中VSC的产生有关。重要的是，始终与健康相关的两个口腔种属是罗氏菌属(Rothia)和奈瑟氏菌属(Neisseria)。这些种属的代表在健康状态下始终比疾病状态下更丰富，并且随着疾病的发展而减少，不论在何种表面上。从龋齿、牙龈炎、牙周炎、种植体周围炎和口臭的角度来看，这是相关的。第三个种属是与牙齿和牙周健康有关的金氏菌属(Kingella)。这三个还原硝酸盐的种属的增加可以被认为是口腔生物膜的生态平衡，这意味着具有更高水平的有益细菌的微生物区系的组成。
牙周治疗通常涉及生物膜的物理去除并引起炎症减轻和整体牙周状况的改善。其他治疗方式包括手术清创、使用四环素或局部用他汀类试剂或全身性抗生素的处方。也经常使用抗菌口腔含漱液，例如葡萄糖酸氯己定、三氯生、三氯生加柠檬酸锌或氟化物。它们对口腔病原体具有广谱抗微生物活性，因此漱口水可用于治疗不同的口腔疾病(例如牙周病、龋齿和口臭)。然而，这些抗微生物化合物具有不同的相关副作用，例如口腔黏膜的刺激和损伤、牙齿变色和染色、味觉改变、内分泌紊乱或抗生素耐药性。
确切地说，杀菌剂最相关的不良影响之一与作为它们的非选择性消毒效果的结果而导致的口腔微生物区系的改变有关。重要的是，口腔微生物区系通过将硝酸盐还原成亚硝酸盐而对全身一氧化氮水平有贡献。已显示，消毒漱口水通过破坏口腔细菌对硝酸盐的还原而提高血压。此外，饮食硝酸盐的摄入刺激口腔微生物区系还原硝酸盐，这具有几种有益效果，包括降低血压、提高运动表现和抗糖尿病效果。有鉴于此，已显示消毒漱口水会干扰运动表现。此外，非处方漱口水与糖尿病和糖尿病前期发展相关。
总之，由于目前的杀菌剂没有明确的细菌细胞作用靶标，因此杀菌剂的(长期)使用、尤其是在高浓度下，可以除去生物膜和/或杀死疾病相关细菌，但同时也杀死健康相关细菌并破坏常驻口腔微生物区系的天然和有益特性。此外，通常保护宿主表面的微生物区系的破坏可能导致疾病的(机会致病性)病原体的定植，例如念珠菌病和其他真菌感染。因此，目前没有降低与牙周病相关的生态失调的治疗方法，而杀菌剂治疗具有严重的负面副作用。
在口臭的情况下，目前的治疗还包括减少细菌数量的物理或化学手段、掩盖气味的产品或改变产生气味的分子的化学物质。抗细菌含漱液可能有所帮助。它们通常含有抗细菌剂，包括氯化十六烷基吡啶鎓、氯己定、葡萄糖酸锌、精油、过氧化氢和二氧化氯，它们与上述对于牙周病提到的抗细菌剂具有相同的问题，因此无法解决生态失调，并且可能杀死有益口腔细菌。
在预防牙科的观点中目前认为，修改或调节口腔生物膜而不是完全消除它，是预防口腔疾病的最有希望的策略。然而，关于益生元调节口腔生物膜的正面效果的数据非常有限。具有最高证明力的案例是精氨酸，这是一种被几种健康相关细菌能够转化为氨的氨基酸，其由于碱性特性而能够缓冲唾液和牙菌斑的pH。因此，已发现高的口腔精氨酸分解活性与低龋齿经历有关。然而，尚未推荐精氨酸对通常受益于碱性环境和高蛋白质或氨基酸水平的存在的其他口腔疾病如牙周炎或口臭有效。事实上，临床证据表明，精氨酸提高龋齿风险，但会增加与牙周病和口臭密切相关的几种细菌例如密螺旋体属(Treponema)、真杆菌属(Eubacterium)或普氏菌属(Prevotella)细菌的水平(Koopman等，2016)。这意味着精氨酸给药实际上可能会增加口腔中的生态失调，并且只能处方用于预防龋齿。因此，存在寻找预防口腔疾病并同时不增加与其他口腔疾病相关的细菌的益生元和益生菌组合物的需求。
总之，据信目前没有针对减少与口腔疾病相关的生态失调而无负面副作用的治疗方法，因此希望寻找专注于生态失调处理的替代品或改进的产品。
口腔中的硝酸盐途径
人类在他们的身体中具有少量硝酸盐，因为某些人体细胞从氨基酸产生一氧化氮，然后氧化成硝酸盐。来自于我们的饮食的硝酸盐(NO3 -)可提高硝酸盐浓度。我们从水果和蔬菜中获得超过90％的硝酸盐，在绿叶蔬菜和甜菜根中存在的量特别高。人体本身不能对硝酸盐做任何有意义的事情。然而，某些口腔细菌将硝酸盐转化成亚硝酸盐，而人体可以通过几种酶促和非酶促方法将亚硝酸盐有效转化成一氧化氮。一氧化氮(NO)相关的发现者于1998年获得诺贝尔奖，这种重要分子参与人体的许多重要功能，例如神经元的通讯、胃的抗微生物活性以及通过血管舒张调节血压。
不同的研究组专注于硝酸盐的全身的、主要是心血管的益处，但探究硝酸盐在口腔内的作用的研究有限。
如下文所讨论且不受理论限制，本发明人人为，没有现有技术文献直接且明确地描述使用硝酸盐来预防或减少生态失调和促进牙菌斑和其他口腔生物膜的生态平衡。
在心血管领域中，本文中论述文章Velmurugan等，2016和Vanhatalo等，2018中的内容。
Velmurugan等，2016记载了一项聚焦于膳食硝酸盐的心血管益处的临床试验，其中测量了唾液中的口腔细菌谱。在每天食用每份含有372mg(即每日可接受摄入量ADI的1.7倍，所述ADI即60kg的成年人摄入222mg)硝酸盐的富含硝酸盐的甜菜根汁6周后，78种细菌类群受到影响，并且两种还原硝酸盐的物种黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)和浅黄奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)显著增加。该文件未提及细菌物种的其他变化。他们得出结论，在高胆固醇血症患者中持续的膳食硝酸盐摄入可改善血管功能。这些变化与唾液微生物区系、特别是硝酸盐还原菌属的改变有关。
Vanhatalo等，2018记载了在补充硝酸盐后在唾液中检测到的口腔微生物区系的变化及其对血管内皮功能以及因此血压的影响。他们检查了口腔微生物区系与NO生物可利用度的生理指标之间的关系，以及在补充甜菜根汁10天后这些变量的可能变化。10天后，与安慰剂相比，唾液微生物组发生了改变，罗氏菌属(Rothia)(+127％)和奈瑟氏菌属(Neisseria)(+351％)的相对丰度提高，并且普氏菌属(Prevotella)(-60％)和韦荣氏球菌属(Veillonella)(-65％)的相对丰度降低。NO3 -的补充提高亚硝酸盐(NO2 -)血浆浓度，并在老年人而不是年轻参与者中降低全身血压。罗氏菌属(Rothia)和奈瑟氏菌属(Neisseria)的高丰度以及普氏菌属(Prevotella)和韦荣氏球菌属(Veillonella)的低丰度与对硝酸盐的补充做出响应的血浆[NO2 -]更高地增加相关。值得注意的是，在这项研究中，甜菜根汁在10天期间给药，并且仔细阅读文章确认了他们只在唾液中发现了这些细菌的这些显著变化，因为舌头的测量只在0时但没在较晚时候进行：“在基线时收集舌背的口腔拭子。在安慰剂和甜菜根补充期后，3次在5分钟时间内通过咳出而不是刺激收集唾液样品(～1ml)。”而相反：
-本发明人获得的细菌变化的结果是在生物膜中，而Vanhatalo以及Velmurugan等人的结果是在唾液中。
-口腔疾病是生物膜介导的疾病(Kuang等，2018)，因此由不同的生物膜引起。唾液中的含量与任何特定口腔生物膜的组成无关(参见Mira 2018或Simon-Soro等，2013)；因此，作为硝酸盐补充的结果，唾液的微生物变化不能预测特定生物膜的变化，也不能预测生物膜介导的疾病的健康结果。
-Vanhatalo中的唾液样品在每个补充期的第8、9和10天收集。这是一种横断面设计，10天的治疗，冲洗期为3-47天(平均18天)，第二次10天治疗期。Vanhatalo中硝酸盐的补充在10天期间进行。
-Vanhatalo的研究是在心血管疾病的背景中。
-正如将在下文中解释的，本发明人的细菌变化的结果显著不同于在Vanhatalo中得到的结果。
-Vanhatalo使用了极高剂量的硝酸盐(即每天770mg)，大约为ADI(即对于60kg的成年人来说222mg)的3.5倍。在本发明中，唾液的生理浓度范围(实施例1)和硝酸盐组合物摄入的ADI(实施例2和4)需要重视，并且使用单次低剂量的硝酸盐观察效果。
Koopman等，2016在摘要中写道：“硝酸盐正在成为一种可能的健康施予者。尤其是口腔中硝酸盐向亚硝酸盐的微生物转化以及随后在胃中向一氧化氮的转化在这方面是令人感兴趣的。然而，硝酸盐如何影响口腔生态系统的组成和生物化学性能尚不完全清楚。为了研究硝酸盐对口腔生态的影响，作者使用多菌斑人工口腔(MAM)生物膜模型进行了为期4周的实验。”他们向来自于两位个体的在1mM硝酸盐的持续供应下生长的1-4周龄的口腔微观世界施加6分钟的5mM硝酸盐脉冲，每个口腔微观世界在细菌组成变化方面对硝酸盐的反应不同。未检测pH缓冲、氨或乳酸盐产生的影响，并且参与者人数太少，不足以得出生物膜组成如何变化的结论。因此，Koopman没有提供任何可以被解释为硝酸盐供应可以通过消除口腔病原体和/或缓冲pH和/或减少乳酸盐产生来减少生态失调、促进生态平衡的证据的结果。
Jockel-Schneider等，2016记载了慢性牙龈炎患者中的牙龈炎症在摄入硝酸盐14天后减轻。文章在第607页记录到：“由于该试验主要关注摄入膳食硝酸盐的临床影响，因此只能推测上述机制和途径中的哪些部分促成了目前的发现。”值得注意的是，这项研究基本上是临床研究，没有分析口腔微生物组。
Li等，2007指出，“在存在硝酸盐/亚硝酸盐底物和葡萄糖的情况下，含有口腔细菌混合物的唾液的厌氧温育导致pH高于没有硝酸盐/亚硝酸盐的对照组”。应当谨记，在他们的体外实验中使用的来自于13位不同供体的所有唾液样品在使用前都经过修改。具体而言，所有样品均用等体积的水稀释，用氮气脱气或富氧，并通过添加2mol NaOH和/或HCl将样品的pH调节至7.0。此外，在大多数实验中，在添加葡萄糖(110mM＝2％)和硝酸盐或亚硝酸盐(均为1.5mM)之前将唾液在30℃预温育12h。在与人体不同的温度下预温育12h将显著改变样品中微生物的组成，为在那些实验条件下生长或存活最好的物种亚群提供选择性优势。因此，在他们的修改后的样品中的观察到的结果不一定反映出初始样本中发生的情况，当然也不反映口腔中发生的情况。在其他剩余实验中，样品在初始修改后没有预温育，他将唾液离心并在PBS中清洗3次，然后将唾液颗粒(含有微生物)在PBS中重悬浮至原始体积，这意味着所有其他唾液成分(包括营养物质和pH缓冲盐)被丢弃。同样，这并不能反映出体内的真实情况。通过在他们的研究中修改唾液样本，体外条件不能很好地代表体内情况。此外，通过测量唾液中微生物的影响，没有考虑口腔生物膜(例如牙菌斑和舌苔)代谢对唾液pH的可能影响。最后，作者仅发现当样品在无氧条件下生长时硝酸盐对酸化的影响。然而，在口腔中存在具有不同氧气水平的生态位(niches)。因此可以得出结论，Li等人工作中的非自然实验条件使得无法预测暴露到硝酸盐的口腔生物膜的自然活性。
Rosier等，2018指出，“另一种潜在的益生元是硝酸盐，但目前在人类中的体内证据有限。在最近一项聚焦于膳食硝酸盐对心血管益处的临床试验中，测量了口腔细菌谱(Velmurugan等，2016)。在每天食用富含硝酸盐的甜菜根汁6周后，78种细菌类群受到影响，并且两种还原硝酸盐的物种黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)和浅黄奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)显著增加”。然而，这些测量是在唾液上不是在口腔生物膜上进行的，并且是在临床工作的背景中测试心血管健康而不是口腔健康。此外，观察到的变化是在长期每日高剂量补充后测量的(6周)，因此补充硝酸盐的短期影响(即<24h)仍然未知。这篇综述还提到“益生元可以推动口腔微生物组的有益变化，并可以提高对生态失调的抵抗力和健康的恢复”，但仅提供了精氨酸的证据。
总之，上述文章没有提到生物膜中的变化，只提到了唾液中的变化。他们还聚焦于补充硝酸盐的长期影响(1-6周之间)。因此，本发明人相信，他们是第一次在体外生长5h和9h后的生物膜中或在人体上不到24h后观察到相同细菌和其他更相关的细菌和细菌功能的变化，并提出其对所有生物膜介导的口腔疾病的有益效果。
显示了生物膜(舌头样品)中的变化的唯一文章来自于Burgleigh等，2019。他们观察到在食用甜菜根7天后，唾液pH提高并且舌头上的细菌发生变化：奈瑟氏菌属(Neisseria)增加，普氏菌属(Prevotella)、放线菌属(Actinomyces)和链球菌属(Streptococcus)减少。值得注意的是：
-它是在7天内每天摄入硝酸盐后的变化(长期影响)，而在本文中显示的是在5小时后(短期、即时影响)。
-Burgleigh使用极高剂量的硝酸盐(即每天770mg：早上385mg，下午385mg)，约为ADI的3.5倍。同样地，在本发明中，唾液的物理浓度范围(实施例1)和硝酸盐组合物摄入的ADI(实施例2和4)需要考虑，并且使用单次低剂量的硝酸盐观察效果。
-在Burgleigh的研究中使用的安慰剂是含有大量糖的不含硝酸盐的甜菜根汁，没有硝酸盐的存在这显著降低口腔生物膜的pH。已表明，低pH会选择特定的耐酸微生物，这可能会影响它们的结果，特别是因为他们每天给予两剂(安慰剂)浆汁，并且糖摄入频率是微生物区系调节和龋齿发展中的重要因素。
-他们将在舌头微生物区系中观察到的变化与龋齿和牙周病联系起来，而本领域技术人员知道，所述疾病是由牙菌斑而不是舌头的变化引起的。
-在论述中，他们提出了一些令人困惑的关联，例如观察到的微生物区系的变化可以防止酸化，以及酸化与龋齿和牙周病有关。这不能被认为是事实的：酸化只与龋齿有关，并且会阻止周围病原体的生长而不是刺激它。此外，普氏菌属(Prevotella)与酸化没有任何关系。相反，普氏菌(Prevotella)是一种蛋白水解物种，并且蛋白水解代谢会提高pH(Takahashi 2005)。因此，Burgleigh的普氏菌属(Prevotella)的增加与酸化的关联是错误的。
正如所见，现有技术在使用唾液而不是发生口腔疾病之处的口腔生物膜中的细菌组成方面存在混淆。此外，当考虑口腔生物膜时，他们使用与龋齿或牙周病无关的舌头生物膜。此外，仅研究了在心血管健康临床研究的背景下长期(>1周)补充后唾液或舌头细菌组成的变化，而不是旨在通过细菌生态失调研究硝酸盐对口腔健康的影响。现有技术在记载补充硝酸盐后发生变化的潜在功能时也不清楚，要么通过显示相互矛盾的证据，要么未通过提供减少生态失调所涉及的机制的证据，而本发明人显示这是通过几种功能例如氨的产生、一氧化氮的产生或乳酸盐的消耗来实现的。同样相关的是，硝酸盐对口腔健康的潜在益处从未针对所有口腔疾病一起提出，并且当它们被单独提出时，口腔疾病的疾病驱动因素被混淆地用于指称其他口腔疾病(例如错误地指出酸性pH可能引起牙周病)。总之并且不受限于理论，本发明人认为，没有现有技术文献直接和明确地记载了从龋齿、牙周病和口臭的角度来看硝酸盐用于预防或减少细菌生态失调或促进生态失调的用途。此外，本文还证明，硝酸盐可以通过促进生物膜中的健康相关细菌和减少疾病相关细菌和功能而具有益生急性效应，这产生对包括龋齿、牙周炎、口臭和种植体周围炎的所有生物膜介导的口腔疾病的有益效果。
发明内容
本发明待解决的问题可被看作是提供一种减少或预防口腔生态失调和增加口腔生态平衡的方法，从而提供一种治疗或预防生物膜介导的口腔疾病例如龋齿、牙周病(例如牙龈炎、牙周炎或种植体周围炎)和口臭的改进的方法。
正如在本文的工作实施例中所述的，本发明人认为硝酸盐可用于在口腔生物膜中减少生态失调和促进生态平衡。
如上所述，本发明人认为没有现有技术文献直接和明确地记载硝酸盐用于在口腔生物膜中减少生态失调和促进生态平衡的用途。
显然，本文所述的硝酸盐用于减少生态失调和促进生态平衡的新用途可以被视为本领域可改变技术人员行为的贡献；例如，根据本文的教导，由于减少生态失调和促进生态平衡，例如包含本文相关量的硝酸盐(例如代替或除了今天使用的氟化物之外)的新型牙膏将适合于龋齿、牙周病或口臭的治疗和/或预防，这一点是可信的。
与上文在精氨酸作为治疗方案的情况下提到的缺陷相反，令本发明人吃惊的是，在口腔生物膜中给药硝酸盐提供了pH缓冲作用和龋齿相关细菌的减少，同时降低了牙周炎相关和口臭相关细菌的水平。因此，本发明人认为，鉴于本文提供的证据，硝酸盐可以被认为是真正减少口腔生物膜中的生态失调和/或促进生态平衡细菌组成的产品，这与增加与牙周病和口臭相关的细菌的精氨酸不同。
引人注目的是，这使得硝酸盐治疗成为同时用于几种疾病的有效治疗方式，这可能被视为对本领域例如口腔护理行业中的巨大贡献，因为使用单一组合物(例如牙膏)就可能治疗和预防龋齿和牙周病以及口臭。
总之，根据本文提供的结果，人们可以发现，通过例如减少或预防口腔生态失调和增加口腔生态平衡，硝酸盐可以用作益生元以改善全球口腔健康，从而提供一种治疗或预防生物膜介导的口腔疾病例如龋齿、牙周病(例如牙龈炎、牙周炎或种植体周围炎)和口臭的改进的方法，这一点似乎是可信的。
因此，本发明的第一方面涉及一种包含硝酸盐的组合物，用于通过改变哺乳动物中口腔生物膜的细菌组成和功能、通过减少疾病相关细菌的量和增加健康相关细菌的量来减少或预防口腔生态失调和/或增强口腔生态平衡，从而在生物膜介导的口腔疾病的24小时之前获得有效的急性治疗或预防，并且其中所述组合物被口服给药到所述哺乳动物，从而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度。
术语“生态失调”用于描述与疾病相关的细菌物种和功能的转变。不同的疾病例如龋齿、牙龈炎、牙周炎、种植体周围炎和口臭具有不同的生态失调组成。此外，虽然龋齿、牙龈炎和牙周炎由牙齿生物膜(牙菌斑)的生态失调组成引起，但口臭由舌头生物膜(舌苔)的生态失调组成引起，并且种植体周围炎由种植体上的生物膜的生态失调组成引起。
在生态失调中，除了疾病相关物种和功能的增加之外，还失去了健康相关物种和功能。如果去除了所有口腔生物膜，则来自于唾液的细菌在该表面上形成新的生物膜。在实施例1和6中，本发明人获得了第一个证据，表明硝酸盐的存在通过减少生态失调和增加健康相关物种和功能而迅速改善所述新的生物膜(例如刷牙后的牙菌斑或刮舌后的舌苔)的组成。
实施例2和7提供了第一个体内证据，表明富含硝酸盐的补充剂在单次摄入后直接影响细菌活性(即急性效应)。表明这种效应通过局部施用和产品摄入而发生。因此，表明了硝酸盐提供对抗生态失调的恢复力。具体而言，发明人显示，含硝酸盐的补充剂防止或限制在摄入补充剂后立即(1h)、1h 45min和4h由于糖的消耗而导致的pH下降。这是硝酸盐防止龋齿相关代谢的第一个体内证据。4h后效果最强，此时口腔生物区系有最多时间因硝酸盐而发生变化(减少龋齿相关的生态失调或增加牙齿健康相关的生态平衡)。重要的是，与其他营养物不同，由于唾液腺的血浆硝酸盐再循环活性，在4h后唾液中的硝酸盐和亚硝酸盐水平仍然升高。
在本文中，正如本领域技术人员所理解的，根据本发明的第一方面的硝酸盐用于减少口腔生物膜中的生态失调和促进生态平衡的用途，是与硝酸盐在例如上文讨论的现有技术中的用途明显不同的用途。在本说明书中详细解释了本发明与现有技术文件之间的差异。本文中指出，现有技术涉及高于ADI的每日硝酸盐剂量的长期影响，并且最相关的观察结果是在唾液样品中。在此方面，应当谨记重要的是口腔细菌在所有口腔表面上形成生物膜。牙齿(牙菌斑)和舌头(舌层)上的生物膜肉眼可见，因为这是更多细菌聚集的地方。这就是为什么它们是对口腔健康最重要的生物膜，但在颊、上颚等部位中也存在生物膜。在唾液与口腔生物膜之间存在重要关系：一方面，所有生物膜以及有时是呼吸道的细菌(由例如滴鼻或咳嗽产生)进入唾液，导致每ml唾液有1千万至1亿个细菌；另一方面，当例如通过口腔护理从表面去除生物膜时，唾液细菌很快就会在表面定殖并形成新的生物膜。然而，每种口腔表面上的环境条件决定了细菌生长良好，这就是舌层与牙菌斑有很大不同的原因(在健康人中，特定细菌可能在牙菌斑中丰富，而在舌层中丰度低)。因此，所述两种生物膜都始于唾液中的细菌，但最终的产物却大不相同。应当谨记，重要的是，牙菌斑是龋齿和牙周病的原因，而舌生物膜是口臭的原因。疾病的原因不是唾液中细菌的特定组成。因此，在唾液样品中的现有技术观察不会导致生物膜介导的疾病的后果。相比之下，本发明人已发现硝酸盐在改变口腔生物膜的组成方面具有明显的作用，从而达成生物膜介导的口腔疾病的治疗或预防。发明人使用的离体生物膜模型反映了由唾液形成的任何生物膜，即任何口腔生物膜。
第二个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防口臭的包含硝酸盐的组合物，其中所述组合物被口服给药到哺乳动物，从而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度。通过减少产生VSC的细菌，VSC的产生量将不可避免地减少。
发明人还已发现，个体具有不同的硝酸盐还原能力(NRC，即他们的口腔微生物区系将硝酸盐还原为亚硝酸盐的能力)，并且这种能力可以用还原硝酸盐的益生菌来刺激(实施例3)。即使在NRC低或无法检出的个体中，在体外添加还原硝酸盐的益生菌也产生显著的NRC。为了获得潜在的益生菌，分离了62株硝酸盐还原菌株，并选出了10株最佳的硝酸盐还原者，它们均为罗氏菌属(Rothia)物种。从这10株菌株中选择了7株具有不同性质的分离株(5株黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)菌株、1株龋齿罗氏菌(R.dentocariosa)和1株空间罗氏菌(R.aeria)菌株)。具体来说，这7株分离株在确定的pH水平下以不同的速率还原硝酸盐和亚硝酸盐(例如，一些在酸性pH下更好地还原硝酸盐，而另一些在中性pH下更好)。每种分离株适合于针对不同的口腔疾病治疗和预防生态失调状态并提高恢复力(例如，龋齿具有酸性pH，而牙周炎具有中性至微碱性pH)。此外，还原硝酸盐但不进一步还原大部分亚硝酸盐的分离株适合于预防和治疗全身性疾病(例如高血压和糖尿病)，因为当吞咽亚硝酸盐时体内的一氧化氮水平提高。
因此，本发明的第三方面涉及一种包含硝酸盐和/或属于罗氏菌属(Rothia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或金氏菌属(Kingella)的细菌菌株的组合物，用于通过快速增加口腔生物膜中硝酸盐还原细菌的量来提高哺乳动物的硝酸盐还原能力，从而达成受益于一氧化氮供应的疾病或病态的治疗或预防。
在这方面，因此发明人鉴别具有有益特点的特定细菌，以在例如硝酸盐还原能力不佳的个体中用作益生菌。因此，本发明的另一方面涉及一种包含细菌菌株的组合物，其中所述细菌菌株属于罗氏菌属(Rothia)，并且其中所述罗氏菌属(Rothia)细菌菌株：
a)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中以0.01的光密度(OD)开始在37℃温育7h后，还原100％的硝酸盐；
b)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中以0.01的OD开始在37℃温育4h后，还原超过15％的硝酸盐；
c)在以0.01的OD开始在37℃温育7h后，不将含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基的pH降低到低于pH 6.8；
d)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中以0.01的OD开始在37℃生长7h后，生长到光密度超过0.7；并且
e)当添加1：1的BHI中的罗氏菌属(Rothia)细菌菌株(OD0.40)：唾液接种物时，能够在37℃下在5h内定植出由人类唾液生长的体外口腔生物膜，以在所述形成的生物膜中达到超过总细菌的10％的比例。
本发明的另一方面涉及一种包含细菌菌株的组合物，所述细菌菌株选自在登记号CECT 9999、CECT 30000、CECT 30001、CECT30002、CECT 30003、CECT 30004和CECT 30005下保藏在西班牙典型培养物保藏中心(Spanish Type Culture Collection)(CECT)的菌株或其组合。本发明的其他相关方面涉及包含所述细菌菌株的组合物，其用作药物。这一方面可以被可选地配制成一种用于益生菌治疗的方法，所述方法包括在需要时给药有效量的包含至少一种细菌菌株的组合物。当在本文中使用时，术语“益生菌”是指当以足够的量给药时赋予宿主健康益处的活微生物。
最后，本发明的一个方面涉及一种为生物膜介导的口腔疾病或从一氧化氮供应获益的疾病或病态选择治疗性治疗或预防策略的方法，所述方法包括：
i)测量口腔样品中受试者的硝酸盐还原能力；
ii)根据所述受试者的硝酸盐还原能力程度将所述受试者分类，其中当硝酸盐还原能力通过向0.45ml空腹口腔样品添加0.05ml80 mM硝酸盐以达到0.5ml的终体积和8mM的硝酸盐终浓度并在37℃温育2小时来测量时，
ii.1)口腔样品硝酸盐量的减少低于57mg/l示出不良的硝酸盐还原能力，
ii.2)口腔样品硝酸盐量的减少在57mg/l(含)至175mg/l(含)之间示出中等的硝酸盐还原能力，并且
ii.3)口腔样品硝酸盐量的减少高于175mg/l示出良好的硝酸盐还原能力；以及
iii)根据所述硝酸盐还原能力来选择治疗性治疗或预防策略，其中：
iii.1)将具有不良硝酸盐还原能力的受试者用包含硝酸盐和属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物给药，
iii.2)将具有中等硝酸盐还原能力的受试者用包含硝酸盐和/或属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物给药，并且
iii.3)将具有良好硝酸盐还原能力的受试者用包含硝酸盐的组合物给药。
定义
本文中相关术语的所有定义与本领域技术人员就本文相关技术背景所理解的一致。
口腔(即与口有关)疾病包括牙齿疾病(例如龋齿)或牙周病(例如牙龈炎、牙周炎或种植体周围炎)和口臭(一种存在明显令人不快的口气气味的症状)。
口腔生物膜或菌斑是生长在口腔中的表面上的生物膜或细菌团。口腔生物膜生长对口腔疾病来说是重要的。口腔疾病依赖于生态位(牙周炎的牙龈、口臭的舌头、龋齿的牙齿)并由生物膜介导。
术语“生态失调”，也被称为菌群失调，用于记载与疾病相关的细菌物种和功能的转变(或失衡)。微生物区系与宿主具有共生关系；细菌在口腔的富足环境中茁壮成长，而宿主则受益于由所述细菌提供的多种功能。口腔微生物区系的稳态平衡对宿主极为有益，但是如果微生物组成发生变化，导致有益(即健康相关)细菌与潜在致病(即疾病相关)细菌之间的严重失衡，则随着微生物的改变，口腔变得容易受到病原体侵害。这种微生物平衡的失衡被称为“生态失调”，它被进一步定义为由于区系本身的不平衡、其功能性组成和代谢活性的变化或其局部分布的变化而造成的微生物区系体内稳态的干扰。一般来说，生态失调可分为三种不同类型：1)有益生物体和/或功能的丧失，2)潜在有害生物体和/或功能的过度生长，以及3)整体微生物多样性的丧失。已发现这三种类型并不相互排斥，并且可以同时发生，这种情况最为常见。关于生态失调概念的更多细节记载在DeGruttola等，2016中。
生态失调可以被认为是一种临床实体或疾病前状态，因此需要治疗或预防。例如，在健康个体中，食用糖可以增加致龋物种和生态失调性乳酸盐的产生，将pH降低到可以使牙釉质脱矿质的水平。在健康个体中，这些变化可以被迅速逆转(恢复力)。然而，如果连续食用糖，随着时间的推移，由于更多致龋的微生物区系(即更多适应糖代谢的物种)，生态失调可变得稳定，并且可形成龋齿。一种方法是通过提高生态平衡在健康个体中提高恢复力(预防)，而另一种方法是在龋齿活跃个体中减少生态失调(治疗)。这同样适用于增加与牙周病和口臭相关的生态平衡和减少与其相关的生态失调。
术语口腔生物膜的“生态平衡”，也被称为“益生作用”，是指微生物区系组合物具有较高水平的有益细菌和/或细菌活性，尽管也存在疾病相关物种，但丰度较低。生态平衡包括对疾病的更强恢复力，这意味着对疾病驱动因素的抵抗力更强(即对任何可能导致疾病的因素的保护作用)以及更快地从疾病驱动因素引起的干扰中恢复。关于生态平衡概念的更多细节记载在Iebba等，2016中，关于生态失调和恢复力概念的更多细节记载在Rosier等，2018中。
根据本发明的第一方面的组合物减少或预防口腔生态失调。在本说明书中，表述“减少生态失调”的同义语是“逆转生态失调”、“调节生态失调”、“调节口腔生物膜组成”或具有“抗生态失调作用”。具体来说，减少生态失调涉及“减少导致挥发性硫化合物产生的细菌/细菌活性”、“减少降低pH的细菌/细菌活性”、“减少导致炎症的细菌/细菌活性”以及“增加防止挥发性硫化合物产生的细菌/细菌活性”、“增加防止pH下降的细菌/细菌活性”、“增加防止炎症的细菌/细菌活性”。
此外，根据本发明的第一方面的组合物增加口腔生态平衡。表述“增加生态平衡”的同义语是“改善体内平衡和共生”、“刺激口腔生物膜的健康组成”。它的特征在于更好的恢复力，这意味着对由微生物区系活性引起的疾病驱动因素具有更好的恢复和抵抗力。这还包括“减少导致挥发性硫化合物产生的细菌/细菌活性”、“减少导致pH降低的细菌/细菌活性”、“减少导致炎症的细菌/细菌活性”以及“增加防止挥发性硫化合物产生的细菌/细菌活性”、“增加防止pH下降的细菌/细菌活性”、“增加防止炎症的细菌/细菌活性”。
减少生态失调和增加生态平衡通常可互换使用。然而，在没有生态失调的健康个体中，应该说明如果所述组成改善，则生态平衡增加，并具有上述益处(即恢复力、保护性)。
不同疾病例如龋齿、牙龈炎、牙周炎、种植体周围炎和口臭具有不同的生态失调组成。虽然龋齿、牙龈炎和牙周炎由牙齿生物膜(牙菌斑)的生态失调组成引起，但口臭由舌头生物膜(舌苔)的生态失调组成引起，并且种植体周围炎由种植体上的生物膜的生态失调组成引起。牙齿生物膜或菌斑是牙齿上的生物膜或菌团，包括龈下菌斑或龈上菌斑。舌头上的生物膜被称为舌苔，并且在舌背上最厚。
术语“生物膜介导的疾病”是指由微生物生物膜的活性而不是由浮游或细胞内微生物引发和发展的疾病。在生物膜介导的疾病——其中生物膜由微生物区系物种形成——中，较大比例的疾病相关细菌和细菌活性以及较低比例的健康相关细菌和细菌活性提高了疾病的风险和严重程度。
根据本领域，术语“益生元”是指诱导/促进有益微生物例如细菌和真菌的生长或活性的化合物。
硝酸盐还原能力(NRC)是个体的口腔微生物区系将硝酸盐还原成亚硝酸盐的能力。
术语“疾病相关细菌”是指在某些疾病中以较高相对丰度或者相应地在健康时以较低相对丰度存在于可能发生疾病的表面处的细菌。有时已鉴定到疾病相关细菌的对口腔疾病有贡献的功能，因此“疾病相关细菌”也可被称为“致病”、“致龋”或“致牙周病”细菌。
术语“健康相关细菌”是指在某些疾病中以较低相对丰度存在并相应地在健康时以较高相对丰度存在于可以发生疾病的表面处的细菌。有时已鉴定到健康相关细菌的可以预防口腔疾病发生的功能，因此“健康相关细菌”也可被称为“有益细菌”、“益生细菌”或“益生菌”。
应注意，某些种属具有健康相关和疾病相关的物种，但所述种属仍然可以是健康相关或疾病相关的。例如：变形链球菌(Streptococcus mutans)是龋齿相关的，而齿形链球菌(Streptococcus dentisani)是健康相关的(与无龋齿相关的)。然而，在龋齿中链球菌属(Streptococcus)总是增加(不同的致龋链球菌(Streptococcus)增加许多，而齿形链球菌(S.dentisani)可能减少)，因此所述种属是疾病相关的。
术语“从一氧化氮供应获益的疾病或病态”是指人体的当全身一氧化氮水平提高时得以改善的任何病症或病态(例如高血压，更多的实例在后文中记载)。全身一氧化氮水平的提高可以通过用硝酸盐(益生元)或还原硝酸盐的细菌(益生菌)刺激口腔微生物区系对硝酸盐的还原来实现。
在整个本说明书和权利要求书中，与“硝酸盐”或“亚硝酸盐”相组合的短语“还原(reduce)”及其衍生术语(例如reduction或reducing)是指硝酸盐向亚硝酸盐的细菌转化或亚硝酸盐向一氧化氮或铵的细菌或化学转化。仅在不与“硝酸盐”或“亚硝酸盐”组合时，术语“减少(reduce)”及其衍生术语才像往常一样用于指示某物的“减少”或“降低”。
在整个本说明书和权利要求书中，短语“包含”及其变体并不打算排除其他技术特点、添加剂、组分或步骤。对于本领域技术人员来说，本发明的其他目的、优点和特点在阅读本说明书后将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来学习。此外，本发明涵盖本文记载的特定和优选实施方式的所有可能组合。在本文中提供下述实施例和附图是出于说明的目的，而不是打算限制本发明。
附图说明
图1：生物膜定量。生物膜以唾液作为接种物，在6.5mM硝酸盐条件(黑色)和对照条件(灰色)中生长。呈现的所有值均为12位供体(D13-D25)的平均值及其相应的标准偏差。A：图示出了生物膜量的平均值，被表示为在用无微生物过滤唾液标准化后的细胞指数(CI)值随时间(T)的变化，正如通过xCELLigence系统所指示的。每10分钟进行一次测量。为清楚起见，带有标准偏差的误差线仅以半小时时间间隔示出。在所有生物膜生长实验期间，在5h和9h取样进行蛋白质定量。B：在5h和9h收获的生物膜的蛋白质定量。P：蛋白质。没有观察到两种条件之间的显著差别。
图2：在含有和不含硝酸盐的情况下体外生长的口腔生物膜中的硝酸盐(A)、亚硝酸盐(B)、铵(C)、乳酸盐(D)和pH(E)测量值。条形图示出了在6.5mM硝酸盐(黑色)和对照(灰色)条件下，在生物膜生长的不同时间(0h、5h和9h)来自于12位供体(D1-D12)的上清液样品中的平均值和标准偏差。NO3：硝酸盐。NO2：亚硝酸盐。Amm：铵。Lac：乳酸盐。***p<0.005**p<0.01，根据Wilcoxon检验。
图3：唾液的酸化被硝酸盐抑制。将9位供体(D25-D33)的唾液与0.2％葡萄糖和一系列浓度范围的在人类唾液的生理范围之内的硝酸盐(0.5-8.5mM)温育5h。在这张图中，示出了平均值(黑色点)和标准偏差以及上下四分位数(灰色线)。NO3：硝酸盐。将所有不同浓度的硝酸盐与0mM硝酸盐进行比较，并根据Wilcoxon将显著性标记为*表示p<0.05，并且**表示p<0.01。
图4：细菌组成的差异，正如通过在生长5h(灰色)和9h(黑色)时对照(圆圈)和6.5mM硝酸盐(三角形)生物膜的典范对应分析(CCA)所显示的。Adonis和CCA p-值(分别为0.0017和0.001)两者均表明在四个组之间存在统计显著的差异。第一约束成分清楚地分开两个实验条件(对照和硝酸盐)，而第二成分反映出由时间(5h和9h)造成的可变性，示出硝酸盐在生物膜发展的两个时间点均影响细菌组成。
图5：在硝酸盐条件下生物膜细菌组成的变化。条形图示出了12位供体的[硝酸盐条件平均丰度]/[对照条件平均丰度]的比率的log2值。显示的种属是在5h或9h时(*未调整的p<0.05和**未调整的p<0.01，根据Wilcoxon检验)或在观察到变化的趋势时在硝酸盐和对照条件之间显著不同的种属。组I包括与口腔健康相关的细菌属，组II是与龋齿相关的属，组III是与牙周炎和/或口臭相关的属。每个组从最丰富到最不丰富的属排序。Ne：奈瑟氏菌属(Neisseria)。Ro：罗氏菌属(Rothia)。Ki：金氏菌属(Kingella)。St：链球菌属(Streptococcus)。Ve：韦荣氏球菌属(Veillonella)。At：奇异菌属(Atopobium)。Or：Oribacterium。Pr：普氏菌属(Prevotella)。Po：卟啉单胞菌属(Porphyromonas)。Fu：梭杆菌属(Fusobacterium)。Pe：消化链球菌属(Peptostreptococcus)。Al：拟普氏菌属(Alloprevotella)。Le：纤毛菌属(Leptotrichia)。Di：小杆菌属(Dialister)。Eu：真杆菌属(Eubacterium)。Pa：微单胞菌属(Parvimonas)。Tr：密螺旋体属(Treponema)。Ta：坦纳菌属(Tannerella)。So：Solobacterium。Se：新月形单胞菌属(Selenomonas)。灰色圆圈被置于牙周炎相关的红色复合细菌的属(Po、Tr和Ta)之前。L(N/C)：Log2(硝酸盐/对照)。浅灰色条：5h生物膜；深灰色条：9h生物膜。
图6：在健康供体中，在空腹条件下，在早晨在摄入富含硝酸盐的补充剂(220mg硝酸盐在200ml水中)后0h后收集的唾液中的硝酸盐水平。观察到两个峰，这说明了由局部补充剂接触造成的硝酸盐的直接增加(0.5h)和由唾液腺从血浆再循环硝酸盐的活性造成的间接增加(2.5h)。NO3：硝酸盐。T：时间。
图7：在单剂富含硝酸盐的补充剂之前和之后，用糖漱口之前和之后唾液的pH值。数据示出了在硝酸盐组合物被局部给药(A，研究2：以70ml摄入300mg硝酸盐1h后的影响，n＝6)和摄食(B，研究3：以≥150ml摄入220mg硝酸盐后4h的影响，n＝6)后对细菌活性的急性影响。BL：基线。SP：在补充后。Pre：在糖漱口之前。Post：在糖漱口之后。P-值使用SPSS(v25)中的Wilcoxon检验来确定。
图8：在单剂富含硝酸盐的补充剂之前和之后，用糖漱口之前和之后唾液的pH值。A：数据示出了在硝酸盐组合物被摄食后对细菌活性的急性影响(研究4：以200ml摄入250mg硝酸盐后1h 45min，n＝12)。B：条状图示出了这种硝酸盐补充剂与安慰补充剂(条纹条)的pH差异。BL：基线。SP：在补充后。Pre：在糖漱口之前。Post：在糖漱口之后。P-值使用SPSS(v25)中的Wilcoxon检验来确定。
图9：在37℃温育4小时(A)和7小时(B)后被所有67株分离株还原的硝酸盐的百分率。条表示在温育4h或7h后初始硝酸盐的已被消耗掉的百分率。被选择作为潜在益生菌的分离株在4h后还原至少20％的硝酸盐并在7h后还原100％的硝酸盐(灰色线)。其他在A或B中低于灰色线的分离株未被选中。在y-轴上是67株分离株的名称。NR4h：4小时后还原的硝酸盐。NR7h：在7小时后还原的硝酸盐。
图10：在不同pH水平下用硝酸盐温育5小时后被10株选中的分离株(A)还原的硝酸盐和(B)残余的亚硝酸盐的百分率。带有黑色边框的浅灰色条是pH 6，深灰色条是pH 7，黑色条是pH 7.5。A：所述条表示初始硝酸盐的已被用掉的百分率(100％＝所有硝酸盐被用掉)。B：残余的亚硝酸盐的百分率被计算为在5h后检测到的亚硝酸盐，其被表示为在该时间点消耗的硝酸盐的百分率(100％＝没有亚硝酸盐被进一步还原成其他化合物例如一氧化氮，0％＝所有亚硝酸盐均被进一步还原)，前提是硝酸盐向亚硝酸盐的转化是1:1摩尔的反应。D1P7、D1P10、D1P15A、D1P17、D3T4、D4P7、D4T4、D4T6、D4T9和D5T11A：所选的分离株名称。D1P7*：D1P7的pH 7样品丢失。NO3R：还原的硝酸盐。NO2L：残余的亚硝酸盐。All：所述条表示具有标准偏差的所有分离株的平均值。*p<0.05，**p<0.01，根据SPSS(v25)中的Wilcoxon检验。
图11：在不存在(对照：灰色条)或存在(硝酸盐：黑色条)6.5mM硝酸盐的情况下从唾液中并使用不同益生菌生长的生物膜在5h 30min后的硝酸盐(A&E)、亚硝酸盐(B&F)、pH(C&G)和铵(D&H)的测量值。供体1(A-D)还原硝酸盐并具有更加酸性的唾液pH，而供体2(E-H)不还原硝酸盐并具有中性pH。None：未添加益生菌。D1P7、D3T4、D4T4、D4T6、D4T9、D5T11：生物膜使用这些益生菌之一来生长。All：具有标准偏差的不同益生菌的平均值(*对照与硝酸盐条件之间p<0.05，根据SPSSv25中的Wilcoxon检验)。Cnt：含有(黑色条纹条)或不含(灰色条纹条)6.5mM硝酸盐的培养基中的测量值。在黑色或灰色条缺失时，测量值为0。NO3：硝酸盐。NO2：亚硝酸盐。Amm：铵。图11中的D5T11对应于D5T11A。
图12：在两位健康供体中，在空腹条件下，在早晨摄入含有溶解在200ml水中的220mg硝酸盐的含3％硝酸盐的甜菜根提取物(Beta vulgaris)药剂后收集的唾液中的硝酸盐(A)和亚硝酸盐(B)水平。甜菜根提取物在0h后立即服用。一位供体(D1，良好的硝酸盐还原者，灰色线)表现出还原来自于补充剂的硝酸盐，产生亚硝酸盐。另一位供体(D25，不良的硝酸盐还原者，黑色线)的唾液硝酸盐没有增加那么多，并且未检测到亚硝酸盐，表明缺少硝酸盐还原。NO3：硝酸盐。NO2：亚硝酸盐。T：时间。
图13：在硝酸盐(N)和硝酸盐加益生菌(NP)条件下离体牙周生物膜与无硝酸盐和无益生菌的对照生物膜(C)相比细菌组成的差异。在NP条件中添加的益生菌是空间罗氏菌(Rothia aeria)D1P7(CECT9999)。条形图显示了从来自于11位患有牙周病的供体的龈下样品生长的生物膜，在厌氧生长7小时后[硝酸盐条件的平均丰度]/[对照条件的平均丰度]的比率的log2值。示出了属(图A和B)和种(图C和D)的变化，从硝酸盐与对照条件之间差异最大到差异最小的细菌分类。具有正值的属和种是在硝酸盐处理后的水平相对于它们在对照(无硝酸盐)条件下的水平更高的属和种。具有负值的属和种是在硝酸盐处理后的水平相对于它们在对照(无硝酸盐)条件下的水平更低的属和种。L(N/C)：Log2(硝酸盐的平均丰度/对照的平均丰度)。L(NP/C)：Log2(硝酸盐+益生菌的平均丰度/对照的平均丰度)。
Figure BDA0003777929340000241
Figure BDA0003777929340000251
Figure BDA0003777929340000261
图14：离体生长的牙周样品中的硝酸盐还原能力。条形图示出了由源自于牙周样品(n＝11)的生物膜残余的硝酸盐(图14A)和产生的亚硝酸盐(图14B)的量。将生物膜在不存在硝酸盐(对照条件，C)、不存在硝酸盐但存在益生菌分离株空间罗氏菌(Rothia aeria)D1P7(对照+益生菌条件，CP)、存在6.5mM硝酸盐(益生元硝酸盐条件，N)或存在硝酸盐加益生菌分离株空间罗氏菌(Rothia aeria)D1P7(共生硝酸盐+益生菌条件，NP)的情况下厌氧生长7小时。添加的硝酸盐的量用Cntr条指示(250mg/L)。NO3：硝酸盐；NO2：亚硝酸盐。图14C-F示出了从牙周炎患者的龈下样品作为接种物，在5mM硝酸盐条件(N，黑色)和含有0mM硝酸盐的对照条件(C，灰色)下生长7h的生物膜。图14C：所有患者的平均生长曲线。呈现的值是具有他们相应的标准偏差的所有11位患者的平均值。图14D：患者4的个体生长曲线。图14E：患者5的个体生长曲线。图14F：患者6的个体生长曲线。所述图示出了在用含有5mM硝酸盐(对于N条件)或0mM硝酸盐(对于C条件)的BHI培养基标准化后的生物膜量，表示为细胞指数(CI)值随以小时(h)为单位的时间(T)的变化，正如通过xCELLigence系统所指示的。每10分钟进行一次测量，但在图14C中，为清楚起见带有标准偏差的误差条仅以半小时的时间间隔示出。
图15：摄食富含硝酸盐的补充剂4小时后收集的唾液样品中的细菌组成(研究3：摄入在≥150ml中的220mg硝酸盐后4h，n＝6)。细菌组成通过16S rRNA基因的Illumina测序获得。所述图示出属(图A)和种级别(图B)分配的细菌。具有正值的属和种是摄食硝酸盐后相对于在对照日摄食≥150ml水(无硝酸盐)后4小时的水平更高的属和种。细菌按照4小时样品与对照之间差异最大至差异最小分类。Log2(N/C)：Log2(硝酸盐的平均丰度/对照的平均丰度)。
Figure BDA0003777929340000271
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发明详述
用于减少或预防口腔生态失调和/或增加口腔生态平衡的包含硝酸盐的组合物
本发明的第一方面的主要特点已在上文发明内容和定义部分中解释。
正如讨论的，本发明的组合物不仅减少口腔生态失调而且增加口腔生态平衡，这可以被认为是对本领域的极大贡献。
口腔生物膜中的健康相关细菌是奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)和金氏菌属(Kingella)。
口腔生物膜中的龋齿相关细菌是链球菌属(Streptococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Oribacterium和奇异菌属(Atopobium)。
口腔生物膜中的牙周病/口臭相关细菌是卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、普氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小杆菌属(Dialister)、真杆菌属(Eubacterium)、微单胞菌属(Parvimonas)、新月形单胞菌属(Selenomonas)和Solobacterium。
与牙周炎相关的经典细菌包括牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、中间普氏菌(Prevotella intermedia)、微小微单胞菌(Parvimonas micra)和放线共生凝聚杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans)。然而，在最近的系统性概述中，17个其他物种与所述疾病相关，包括选自真杆菌属(Eubacterium)、新月形单胞菌属(Selenomonas)、小杆菌属(Dialister)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、密螺旋体属(Treponema)和普氏菌属(Prevotella)的(其他)种。
卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)和普氏菌属(Prevotella)也与口臭相关，口臭是由微生物产生的挥发性硫化合物(VSC)引起的难闻口气。此外，口臭的经典生物标志物是产VSC的Solobacteriummoorei，其也与牙周炎相关。
正如在本文的工作实施例1的“结果和结论”部分中所述，本发明人进行了离体研究以测试硝酸盐对口腔生物膜生长的影响，并鉴定到例如在“急性”治疗后(添加硝酸盐后5h和9h)，所述给药的硝酸盐：
-增加口腔生物膜中选自奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)和金氏菌属(Kingella)的至少一种口腔生物膜的健康相关细菌的量，和/或
-减少口腔生物膜中选自链球菌属(Streptococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Oribacterium和奇异菌属(Atopobium)的至少一种口腔生物膜的龋齿相关细菌的量，和/或
-减少口腔生物膜中选自卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、普氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小杆菌属(Dialister)、真杆菌属(Eubacterium)、微单胞菌属(Parvimonas)、新月形单胞菌属(Selenomonas)和Solobacterium的至少一种口腔生物膜的牙周病/口臭相关细菌的量。
因此，在特定实施方式中，所述给药的硝酸盐增加口腔生物膜中选自奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)和金氏菌属(Kingella)的至少一种口腔生物膜的健康相关细菌的量，从而增加口腔生态平衡。这些细菌量的增加对所有口腔疾病有益。这是第一次显示在5h后化合物已将健康相关细菌的水平提高数倍。这是硝酸盐的独特性质，以前任何其他化合物均未显示过。
在更特定实施方式中，所述给药的硝酸盐增加口腔生物膜中选自奈瑟氏菌属(Neisseria)和罗氏菌属(Rothia)的至少一种口腔生物膜的健康相关细菌的量。更具体来说，所述给药的硝酸盐增加口腔生物膜中奈瑟氏菌属(Neisseria)和罗氏菌属(Rothia)细菌的量。
在特定实施方式中，所述给药的硝酸盐减少口腔生物膜中选自链球菌属(Streptococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Oribacterium和奇异菌属(Atopobium)的至少一种口腔生物膜的龋齿相关细菌的量。这是第一次显示化合物减少所有这些龋齿相关细菌以及它们的代谢物乳酸盐龋齿发展涉及的主要酸)的量，这显示出硝酸盐的强烈抗致龋潜力。此外，令人吃惊的是这在单剂硝酸盐后<24h发生。
在更特定实施方式中，所述给药的硝酸盐减少口腔生物膜中选自链球菌属(Streptococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Oribacterium和奇异菌属(Atopobium)的至少一种口腔生物膜的龋齿相关细菌的量。更具体来说，所述给药的硝酸盐减少口腔生物膜中链球菌属(Streptococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)和Oribacterium细菌的量，更特别地也减少奇异菌属(Atopobium)细菌的量。引人注目的是，所述列表不仅包括经典与龋齿相关的细菌，而且包括更罕见或最近使用现代测序技术才与所述疾病相关的其他细菌例如Oribacterium和奇异菌属(Atopobium)。
在另一个实施方式中，所述给药的硝酸盐减少口腔生物膜中选自卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、普氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小杆菌属(Dialister)、真杆菌属(Eubacterium)、微单胞菌属(Parvimonas)、新月形单胞菌属(Selenomonas)和Solobacterium的至少一种口腔生物膜的牙周病/口臭相关细菌的量。引人注目的是，所述列表不仅包括经典与牙周炎样红色复合细菌相关的细菌(卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、密螺旋体属(Treponema)和坦纳菌属(Tannerella))，而且包括更近些时候使用现代测序技术才与所述疾病相关的其他细菌例如真杆菌属(Eubacterium)和拟普氏菌属(Alloprevotella)。这是首次显示化合物一起减少所有这些牙周病和口臭相关细菌，这显示出硝酸盐针对这些疾病的强烈益生潜力。这是硝酸盐的独特性质，以前任何其他化合物均未显示过。此外这是首次同时减少不同的龋齿相关和牙周炎相关细菌。有鉴于此，这是第一次表明某一种化合物能够减少牙周致病细菌，同时增加铵并减少乳酸盐。最后，令人吃惊的是所有这些都在单剂硝酸盐后<24h发生。
在更特定实施方式中，所述给药的硝酸盐减少口腔生物膜中选自卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、普氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella)和拟普氏菌属(Alloprevotella)的至少一种口腔生物膜的牙周病/口臭相关细菌的量。更具体来说，所述给药的硝酸盐减少口腔生物膜中卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、普氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella)和拟普氏菌属(Alloprevotella)细菌的量，更特别地也减少一种或多种消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小杆菌属(Dialister)、真杆菌属(Eubacterium)、微单胞菌属(Parvimonas)、新月形单胞菌属(Selenomonas)和Solobacterium细菌的量。
在特定实施方式中，所述给药的硝酸盐：
-增加口腔生物膜中选自奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)和金氏菌属(Kingella)的至少一种口腔生物膜的健康相关细菌的量，和
-减少口腔生物膜中选自链球菌属(Streptococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Oribacterium和奇异菌属(Atopobium)的至少一种口腔生物膜的龋齿相关细菌的量，和
-减少口腔生物膜中选自卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、普氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小杆菌属(Dialister)、真杆菌属(Eubacterium)、微单胞菌属(Parvimonas)、新月形单胞菌属(Selenomonas)和Solobacterium的至少一种口腔生物膜的牙周病/口臭相关细菌的量。
正如所述，硝酸盐的给药改变口腔生物膜的细菌组成，而且改变其功能。因此，正如在实施例1中所示，在特定实施方式中：
1)所述给药的硝酸盐减少口腔生物膜中乳酸盐的产生并提高铵的水平，这与预防和治疗龋齿发生相关；
2)所述给药的硝酸盐减少口臭和牙周炎涉及的挥发性硫化合物(VSC)和产VSC的细菌；
3)出乎意料地，即使铵增加，牙周病/口臭相关细菌也减少，尽管它们喜欢中性或微碱性pH。这是为什么可以说硝酸盐刺激总体共生组成，并且不在预防一种疾病的同时促使另一种疾病(使用精氨酸时情况如此)的原因；
4)所述给药的硝酸盐增加亚硝酸盐产生，与从全身一氧化氮水平提高获益的全身性病症和病态相关；
5)所述给药的硝酸盐通过增加与口腔健康相关的硝酸盐还原细菌来提高口腔微生物区系的硝酸盐还原能力；和/或
6)所述给药的硝酸盐减少引发牙龈炎症的细菌(例如卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella))并增加减轻牙龈炎症的细菌(例如罗氏菌属(Rothia)和奈瑟氏菌属(Neisseria))。
对于第(2)点，CSV例如硫化氢(H2S)和甲硫醇(CH3SH)一方面是口臭的直接原因，另一方面在牙周炎中损害牙周组织，因为这些气体除了气味难闻之外，还是基因毒性的并引起炎症。这是在口臭与牙周炎之间存在明显相关性的原因。正如在实施例1中所述，硝酸盐减少产生这些气体的细菌。除此之外，硝酸盐改变微生物群落的代谢，因为细菌可以利用硫酸盐或硝酸盐，并且硝酸盐提供比硫酸盐更多的能量。换句话说，硝酸盐在其存在并观察细菌群落的硝酸盐还原时是有利的，如在实施例1中所示，可以得出结论，硫酸盐还原成H2S被抑制，所述硫酸盐被某些细菌转变成CH3SH。因此，硫酸盐还原的终产物H2S和CH3SH(难闻且有毒)被一氧化氮(抗微生物且有益的)代替。对于细菌而言，硝酸盐的给药有利于硝酸盐还原和/或一氧化氮抗性细菌，并且不利于还原硫酸盐和/或对一氧化氮敏感的细菌。总而言之，实施例1的结果显示存在着从与口臭和牙周炎相关的细菌和代谢向与健康相关的细菌和代谢的重要转变。
因此，在特定实施方式中，所述包含硝酸盐的组合物被用作益生元以减少产VSC的细菌和VSC的产生。
硝酸盐在改变口腔生物膜的细菌组成和功能中的作用可以通过本领域中已知的任何方法来试验。一种适合的方法是在实施例1中记载的方法。
在一个实施方式中，所述生物膜介导的口腔疾病是龋齿，并且所述给药的硝酸盐减少口腔生物膜中选自链球菌属(Streptococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Oribacterium和奇异菌属(Atopobium)的至少一种龋齿相关细菌的量。
在一个实施方式中，所述生物膜介导的口腔疾病是牙周病/口臭，并且所述给药的硝酸盐减少口腔生物膜中选自卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、普氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小杆菌属(Dialister)、真杆菌属(Eubacterium)、微单胞菌属(Parvimonas)、新月形单胞菌属(Selenomonas)和Solobacterium的至少一种口腔生物膜的牙周病/口臭相关细菌的量。
一个实施方式涉及本文提供的包含硝酸盐的组合物，其用于减少生物膜的量(即牙菌斑或舌苔的量)，从而在生物膜介导的口腔疾病的24小时前获得有效的急性治疗或预防，并且其中所述组合物被口服给药到哺乳动物，从而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度。这种效果已在例如实施例6中得到证实。
在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类。在另一个实施方式中，所述哺乳动物是动物，例如猫、狗、马、奶牛、猪、山羊、绵羊、驴、水牛、公牛、美洲驼或骆驼。在另一个实施方式中，所述生物膜介导的口腔疾病是牙周病或口臭。
用于提高哺乳动物的硝酸盐还原能力的益生细菌
在实施例3中，显示了个体具有不同的硝酸盐还原能力(NRC，即他们的口腔微生物区系将硝酸盐还原成亚硝酸盐的能力)，并且获得了这种能力可以用还原硝酸盐的益生菌刺激的体外证据。此外，本发明人鉴定到具有有益特点的特定细菌，其可以在例如硝酸盐还原能力不佳的个体中用作益生菌。即使在具有低到不可检出的NRC的个体中，添加还原硝酸盐的益生菌也在体外产生显著的NRC。
取决于每位个体的NRC，所述待给药的组合物包含不含益生细菌的硝酸盐、不含硝酸盐或硝酸盐的益生细菌和益生细菌。因此，正如上文所述，本发明的一个方面涉及一种组合物，其包含硝酸盐和/或属于罗氏菌属(Rothia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或金氏菌属(Kingella)的细菌菌株，用于通过快速增加口腔生物膜中还原硝酸盐的细菌的量来提高哺乳动物的硝酸盐还原能力，从而获得从硝酸盐还原获益的口腔疾病(龋齿、牙周病和口臭)和从全身一氧化氮水平提高获益的疾病或病态的治疗或预防。
据信没有现有技术报道了还原硝酸盐的益生菌能够恢复或改善个体的NRC。本发明人已鉴别出在不同条件下具有相关硝酸盐还原能力并具有可用作益生菌的其他相关特点的特定细菌。因此，本发明的另一方面涉及一种包含细菌菌株的组合物，其具有下述特点：
a)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中以0.01的光密度(OD)开始在37℃温育7h后，还原100％的硝酸盐；
b)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中以0.01的OD开始在37℃温育4h后，还原超过15％的硝酸盐；
c)在以0.01的OD开始在37℃温育7h后，不将含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基的pH降低到低于pH 6.8；
d)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中以0.01的OD开始在37℃生长7h后，生长到光密度超过0.7；并且
e)当添加1：1的BHI中的细菌菌株(OD 0.40)：唾液接种物时，能够在37℃下在5h内定植出由人类唾液生长的体外口腔生物膜，在所述形成的生物膜中达到超过总细菌的10％的比例。上述步骤的详情在实施例3的第21-25节中。
应该理解，所述细菌菌株是分离的细菌菌株。正如本领域技术人员所理解的，术语“分离的”是指所述细菌菌株已从其自然环境中分离，即它不存在于它的自然环境中，因此其游离于自然环境中存在的其他生物体和物质。
在特定实施方式中，所述细菌菌株属于罗氏菌属(Rothia)，并具有上述特点(a)-(e)。在其他实施方式中，所述细菌菌株属于空间罗氏菌(Rothia aeria)、龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)和黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)。
基于以上所述(步骤(a)-(e))和例如实施例3中的测定，专业技术人员能够常规重复所述测定以客观地确定特定菌株是否包含在本发明中。因此，本发明的另一方面涉及一种筛选具有硝酸盐还原能力的细菌的方法，所述方法包括上述提到的步骤(a)-(e)。
通过实施例，提供了符合上述特征的不同菌株。除了所述菌株之外，利用详细记载的方法，在细菌库中鉴定和分离出具有相同特点的其他菌株是合理的。通过实施例还证明了这些特点对于本发明的目的是有益的。因此，尽管已经测试并鉴别出一些具有这些有益特点的特定菌株，但没有理由将本发明的范围限制于这些菌株，因为获得其他良好菌株的方法的所有步骤都合理地记载在本文中。因此，本发明还提供了除了在实施例中使用的之外的具有相同特点的菌株的库。应注意到，重要的是，并非所有细菌菌株都具有上述特点；因此，本发明提供了一种识别它们的方法。类似地，值得注意的是，上述方法并不限制本发明的范围。所述测定是适合测试所需特征的测定法。
特定细菌菌株从未患有龋齿和牙周炎的供体受试者中分离。由牙科医生收集菌斑或舌苔样品并重悬浮在1mLPBS中。物种水平的鉴定如实施例3第23节中所述通过测序16SrRNA基因来进行。
所述菌株于2019年11月23日(23.10.2019)保藏在西班牙典型培养物保藏中心(Spanish Type Culture Collection)(Universitat de València,Campus deBurjassot,Edif.de Investigación,46100Burjassot,València,Spain)。所述保藏的菌株是活的，并保持它们与保藏物相关的所有特点。
在特定实施方式中，所述细菌菌株是选自下述的细菌菌株：
-在登记号CECT 9999下保藏在西班牙典型培养物保藏中心的空间罗氏菌(Rothiaaeria)(内部代码D1P7)。它的16S rRNA序列对应于SEQ ID NO：1，并且当与公共数据库比较时，它与空间罗氏菌(Rothia aeria)A1-17B显示出99.72％的核苷酸同一性。
-以CECT 30000保藏的龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)(内部代码D1P17)。它的16S rRNA序列对应于SEQ ID NO：2，并且当与公共数据库比较时，它与龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)ATCC 17931显示出99.87％的核苷酸同一性。
-以CECT 30001保藏的黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)(内部代码D3T4)。它的16S rRNA序列对应于SEQ ID NO：3，并且当与公共数据库比较时，它与黏液罗氏菌(Rothiamucilaginosa)DSM 20746显示出99.07％的核苷酸同一性。
-以CECT 30002保藏的黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)(内部代码D4T4)。它的16S rRNA序列对应于SEQ ID NO：4，并且当与公共数据库比较时，它与黏液罗氏菌(Rothiamucilaginosa)DSM 20746显示出99.20％的核苷酸同一性。
-以CECT 30003保藏的黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)(内部代码D4T6)。它的16S rRNA序列对应于SEQ ID NO：5，并且当与公共数据库比较时，它与黏液罗氏菌(Rothiamucilaginosa)DSM 20746显示出99.20％的核苷酸同一性。
-以CECT 30004保藏的黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)(内部代码D4T9)。它的16S rRNA序列对应于SEQ ID NO：6，并且当与公共数据库比较时，它与黏液罗氏菌(Rothiamucilaginosa)DSM 20746显示出99.20％的核苷酸同一性。
-以CECT 30005保藏的黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)(内部代码D5T11A)。它的16S rRNA序列对应于SEQ ID NO：7，并且当与公共数据库比较时，它与黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)DSM 20746显示出99.07％的核苷酸同一性。
上述菌株从未患有龋齿、牙龈疾病和口臭，具有健康的血压并且没有可见的口腔黏膜改变的健康个体的口腔中分离(P＝牙菌斑，T＝舌，正如在内部代码D-数字-(P或T)-数字中指示的)。
本发明的一个方面涉及一种包含细菌菌株的组合物，所述细菌菌株选自在登记号CECT 9999、CECT 30000、CECT 30001、CECT 30002、CECT 30003、CECT 30004和CECT 30005下保藏在西班牙典型培养物保藏中心(Spanish Type Culture Collection)(CECT)的菌株或其组合。在特定实施方式中，所述组合物包含104至1013cfu/g细胞的至少一种所述细菌菌株。本发明的组合物可以包含单一菌株或不同细菌菌株的组合。
显然，通过使用所述保藏菌株作为起始材料，本领域技术人员可以常规地通过传统诱变或重新分离技术获得保留或增强了形成本发明的组合物的菌株的本文所述的相关特点和优点的其他变体或突变体。因此，本发明还涉及本文公开的菌株的变体。当在本文中使用时，术语菌株的“变体”或“突变体”是指从参考菌株X获得的任何天然存在的或主要通过突变而特异性开发的维持上述特征的菌株。例如，本文考虑的“变体”菌株的16S rRNA基因可以与本文公开的菌株的16S rRNA序列SEQ ID NO：1-SEQ ID NO 7享有例如约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个特定实施方式中，所述突变体通过使用重组DNA技术来获得。在另一个实施方式中，所述突变体通过随机诱变来获得。因此，本发明的另一方面涉及一种获得保藏菌株的突变体的方法，其中所述方法包括使用保藏菌株作为起始材料并施用诱变，并且其中所得到的变体或突变体还至少保留或增强了所述保藏菌株的特点。
在特定实施方式中，将所述菌株在人工培养基中发酵，在发酵后进行后处理以得到细菌细胞，所得到的细菌细胞置于液体培养基中或为固体形式。具体来说，所述后处理选自干燥、冷冻、冷冻干燥、流化床干燥、喷雾干燥和在液体培养基中冷冻，更具体而言是冷冻干燥。
本发明的菌株通过将所述细菌在适合的人工培养基和适合的条件下培养来产生。表述用于微生物的“人工培养基”应该被理解为是含有天然物质和任选的合成化学品例如可以再现血清的某些功能的聚合物聚乙烯醇的培养基。常用的适合人工培养基是营养肉汤，其含有细菌生长所需的要素，包括碳源(例如葡萄糖)、氮源(例如氨基酸和蛋白质)、水和盐类。生长培养基可以是液体形式，或者经常与琼脂或其他胶凝剂混合以获得固体培养基。所述菌株可以单独培养以形成纯培养物，或与其他微生物一起作为混合培养物，或分别培养不同类型的细菌然后将它们以所需比例合并。在培养后，并且取决于最终配方，所述菌株可以作为纯化的细菌使用，或者可以将细菌培养物或细胞悬液原样直接使用或在适当的后处理后使用。在本说明书中，术语“生物质”被理解为在培养后获得的细菌菌株培养物。
在本发明的上下文中，术语“后处理”应理解为是对生物质进行的任何处理，目的是获得可储存的细菌细胞。后处理的目的是降低生物质中细胞的代谢活性，从而减慢细胞有害反应的速度。作为后处理的结果，细菌细胞可为固体或液体形式。在固体形式中，储存的细菌细胞可以是粉末或颗粒。在任何情况下，含有细菌细胞的固体和液体形式两者都不存在于自然界中，因此不是天然存在的，因为它们是人工后处理过程的结果。在特定实施方式中，所述后处理过程可能需要使用一种或多种所谓的后处理剂。在本发明的上下文中，表述“后处理剂”是指用于进行本文所述的后处理过程的化合物。后处理剂应包括但不限于脱水剂、抑菌剂、冷冻保护剂(低温防护剂)、惰性填充剂(也被称为冻干保护剂)、载体材料(也被称为核心材料)等，它们被单独或组合使用。
存在两种基本方法可以降低细菌细胞的代谢活性，因此有两种方法可以进行后处理。第一种方法是降低所有化学反应的速率，这可以通过使用冰箱、机械冷冻机和液氮冷冻机进行冷藏或冷冻以降低温度来实现。或者，可以通过添加抑制细菌细胞生长的物质即制菌剂(缩写为Bstatic)来降低所有化学反应的速率。
所述进行后处理的第二种方法是从生物质中去除水，所述过程可能涉及使用冻干机使水升华。从生物质中除去水的适合技术是干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或流化床干燥。产生固体形式的后处理可以是干燥、冷冻、冷冻干燥、流化床干燥或喷雾干燥。
所述后处理优选为冷冻干燥，其涉及通过在减压下升华从冷冻的细菌悬液中除去水。该过程由三个步骤组成：将产物预冷冻以形成冷冻结构，初次干燥以除去大部分水，和二次干燥以除去结合水。由于用于制造和分离冻干细菌培养物的工业过程的客观和预期可变性，所述冻干细菌培养物通常含有一定量的惰性填料，也被称为冻干保护剂。它的作用是将产品中活益生细菌的含量标准化。在可商购的冻干培养物中使用下述惰性填充剂：蔗糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、玉米淀粉、菊粉和其他可药用非吸湿性填充剂。任选地，其他稳定剂或防冻剂例如抗坏血酸，也用于形成粘稠糊状物，其被冷冻干燥。在任何情况下，可以将如此获得的材料研磨到适合的尺寸，包括研磨成粉末。
形成本发明的组合物的菌株优选地采取活细胞的形式。然而，本发明的菌株也可以采取非活细胞的形式，例如含有由本文鉴定的菌株产生的有益因子(例如酶和抗细菌肽)的灭活培养物或组合物。这可能包括热灭活微生物或通过暴露于改变的pH、超声处理、辐射或经受压力而灭活的微生物。非活细胞产品的制备更加简单，细胞可以容易地掺入到商业化产品中，并且储存要求比活细胞的限制要少得多。
本发明的组合物的医学/口腔护理用途
正如所述，本发明的第一方面涉及包含硝酸盐(特别是也可以包含益生细菌)的组合物，用于通过改变哺乳动物中口腔生物膜的细菌组成及其功能、通过减少疾病相关细菌和细菌功能的量和增加健康相关细菌和细菌功能的量来减少或预防口腔生态失调和/或增加口腔生态平衡，从而在生物膜介导的口腔疾病的24小时之前获得有效的急性治疗或预防，并且其中所述组合物被口服给药到所述哺乳动物，从而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度。可选地，这一方面可以被表述为本发明的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于上述条件中减少或预防口腔生态失调和/或增加口腔生态平衡。还或者，本发明提供在哺乳动物(包括人类)中在上述条件下减少或预防口腔生态失调和/或增加口腔生态平衡的方法，其包括向需要其的所述哺乳动物给药所限定的组合物。
在特定实施方式中，所述生物膜介导的口腔疾病选自牙周病、口臭和龋齿。
牙周病又称牙龈疾病，是一组影响牙齿周围组织的炎性病症。在其被称为牙龈炎的早期阶段，牙龈变得肿胀、红肿并可能流血。在其被称为牙周炎的更严重形式中，宿主组织由于破坏性炎症和生态失调的微生物区系的蛋白水解活性而损失。由于代谢出龈沟液蛋白和组织分解产物的细菌的蛋白水解活性，pH保持中性或微碱性。在牙周炎中，牙龈可能从牙齿脱离，骨骼可能丧失，并且牙齿可能松动或脱落。也可能出现难闻口气。当这种疾病与种植体相关时，它被称为种植体周围炎，其中骨骼丧失倾向于发展得更快。
更具体来说，所述牙周病选自牙周炎、牙龈炎和种植体周围炎。
在特定实施方式中，所述生物膜介导的口腔疾病是口臭。这种疾病导致明显令人不快的呼吸气味。在90％的病例中口臭是口腔内的，并且主要由导致微生物生态失调的舌头微生物区系的组成和活性的变化引起。这种生态失调状态导致蛋白水解活性和/或含硫氨基酸的细菌降解的增加，导致挥发性硫化合物例如硫化氢(H2S)、甲硫醇以及较小程度的二甲基硫醚的产生。由于蛋白水解作用，pH保持中性或略微提高。此外，较少的VSC被生态失调的舌头群落中和，促进了VSC释放和难闻的口气。
在特定实施方式中，所述生物膜介导的口腔疾病是龋齿，由于糖分解活性(即碳水化合物、主要是糖类的微生物代谢)，产生乳酸盐并且pH降低。当pH降低到低于pH 5.5左右的临界水平时，牙釉质被脱矿化并且会发生龋齿。
在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类。在另一个实施方式中，所述哺乳动物是动物，例如猫、狗、马、奶牛、猪、山羊、绵羊、驴、水牛、公牛、美洲驼或骆驼。在另一个实施方式中，所述生物膜介导的口腔疾病是牙周病或口臭。
本发明还涉及包含至少一种上文定义的细菌菌株的组合物。具体来说，所述组合物用于治疗或预防生物膜介导的口腔疾病例如牙周病、口臭和龋齿。所述鉴别的罗氏菌属(Rothia)细菌菌株提高针对不同口腔生物膜介导的疾病的恢复力，因为它们在与不同疾病相关的非常不同的条件下(例如龋齿具有酸性pH，而牙周炎具有中性至微碱性pH)表现出NRC。例如，所述鉴定的分离株在任何pH下还原硝酸盐。因此，每种菌株均可用于同时治疗或预防龋齿、牙周病和口臭。因此，包含所述鉴定到的菌株之一的产品可用于治疗或预防任何生物膜介导的疾病。此外，口腔微生物区系的硝酸盐还原增加了全身一氧化氮水平的量，因此，每种菌株均可用于预防从一氧化氮获益的全身性病症。
然而，本发明人观察到某些细菌菌株在特定条件下表现好得多(即具有“超级NRC”)，因此对于特定疾病来说特别好(参见实施例3的表3)。因此，在特定实施方式中：
-细菌菌株D1P7/CECT9999、D4T4/CECT30002、D4T6/CECT30003和D4T9/CECT3004在pH 6下具有良好的NRC(即高于中位数)，因此特别适合于治疗龋齿。
-细菌菌株D1P7/CECT9999、D3T4/CECT30001和D4T9/CECT3004在pH 7.5下具有良好的NRC(即高于中位数)并且在该pH下也很好地还原亚硝酸盐，因此特别适合于治疗牙周病和口臭。
-细菌菌株D1P17/CECT30000、D3T4/CECT30001、D4T4/CECT30002、D4T6/CECT30003和D5T11A/CECT30005在3种测试的pH水平(即pH 6、pH 7和/或pH 7.5)中的全部或2种pH下产生很多亚硝酸盐(即高于中位数)，因此特别适合于治疗从一氧化氮获益的全身性病症或病态，因为可以吞服亚硝酸盐以提高全身一氧化氮水平。
所述鉴定到的罗氏菌属(Rothia)细菌菌株可用于改善个体的NRC，并因此可用于治疗或预防在生物膜介导的口腔疾病之外的从一氧化氮供应获益的疾病或病态。在特定实施方式中，所述鉴定到的菌株可用于治疗或预防心血管疾病、代谢综合征、糖尿病、勃起功能障碍、尿路感染，改善运动表现，改善/提高胃的抗微生物活性、改善/提高巨噬细胞的抗微生物活性。具体来说，所述心血管疾病是高血压，因此所述鉴定到的菌株降低血压。所述鉴定到的菌株还改善内皮功能。
局部施用的组合物(直接效果)和摄入的组合物(间接效果)
正如本领域专业技术人员所理解的，如果所述组合物是局部施用的包含本文相关量的硝酸盐的组合物(即它使用在口腔中，因此执行“直接效果”，例如牙膏的情况)，则所述组合物的使用自动/固有地满足所述第一方面的要求；即牙膏是在口中溶解和/或分解的组合物，从而由于所述组合物本身中硝酸盐的存在而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度。如果所述组合物是例如漱口水、浆汁或适合的凝胶(例如施用到牙周袋的硝酸盐凝胶)，情况同样如此。
另一方面，所述组合物可以是摄入的组合物，例如在通过胃环境之前几乎不溶解/分解的肠溶包衣片剂。在这种情况下也应该理解，此类肠溶包衣片剂组合物是在所述第一方面的范围内的组合物，因为它是由于唾液腺的硝酸盐再循环活性从而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度的组合物。这可以被称为“间接效果”。
因此，在特定实施方式中，所述组合物是选自下述的局部施用的组合物：
-牙膏；
-嗽口水；
-口腔凝胶剂，例如施用到牙周袋中；
-食物提取物，例如浆汁；
-口香糖；
-咀嚼片剂；和
-补充粉剂；或者
其中所述组合物是选自下述的摄入的组合物：
-片剂、丸剂或胶囊；
-食物提取物；
-口香糖；
-咀嚼片剂；
-补充粉剂；和
-静脉内施用的肠胃外营养物。
可以看出，存在一些使用局部和摄入给药的产品形式，例如食物提取物、口香糖、咀嚼片剂或补充粉剂。在这种情况下，所述组合物(例如浆汁)首先与口接触，一部分组合物在口中溶解和/或分解，从而由于所述组合物本身中硝酸盐的存在而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度。然后所述组合物(例如浆汁)被吞咽，引入到消化道中，并且口腔唾液中硝酸盐浓度的提高是由于唾液腺的硝酸盐再循环活动。
在特定实施方式中，所述组合物是包含富含硝酸盐的植物提取物、抗氧化剂和/或硝酸盐还原酶辅因子的食品补充剂。
富含硝酸盐的植物提取物包括来自于植物或水果的提取物。富含硝酸盐的蔬菜的实例是绿色多叶蔬菜，例如菠菜、唐莴苣、芥菜、芝麻菜、羽衣甘蓝和生菜。其他富含硝酸盐的蔬菜是甜菜根、萝卜、西兰花、芹菜或卷心菜。富含硝酸盐的水果的实例是香蕉或葡萄。在一个实施方式中，所述组合物是包含富含硝酸盐的植物提取物的食品补充剂。
在特定实施方式中，所述富含硝酸盐的植物提取物是甜菜根提取物。在其他实施方式中，硝酸盐采取盐的形式例如硝酸钠或硝酸钾。
在特定实施方式中，所述包含富含硝酸盐的植物提取物的组合物还包含硝酸盐还原酶辅因子。辅因子的实例是钼或铜。
更具体来说，所述富含硝酸盐的植物提取物是甜菜根提取物，所述抗氧化剂是维生素C，并且所述硝酸盐还原酶辅因子是钼、钼盐或富含钼的植物提取物例如芸豆粉。具体来说，所述组合物采取液体形式(例如添加上述要素的甜菜根汁)，或者采取诸如丸剂、片剂、口香糖、粉剂、口腔分散片剂或用水溶解的泡腾片剂的形式。
基于富含硝酸盐的植物提取物的产品的实例记载在实施例4.1中。此外，作为给药形式的实例，受试者可以像往常一样在早晨刷牙。从含有92g甜菜根提取物/维生素C/钼补充剂(表5)的罐子中用伴随罐子提供的塑料勺并填充它直至25ml线，取出11.5g的剂量。将所述药剂溶解在200ml水中，混合并摄食。一剂补充剂含有天然存在于甜菜根提取物中的250mg硝酸盐和成人每日推荐剂量的维生素C(80mg)和钼(50μg)。这种产品每日以单剂，优选在早晨，以作为植物提取物粉的食品补充剂的形式提供，并提供即时效果(在1小时内，由于在吞咽期间硝酸盐保留在口腔中)和由硝酸盐再循环造成的急性但间接的效果(1至6小时之间)，在此期间可减少餐后pH的下降，并因此提供针对口腔疾病(例如龋齿)的保护。
24小时前有效的急性治疗或预防
正如提到的，所述提供的结果显示了在施用(作为补充剂、牙膏等)时硝酸盐的直接(即时)局部效果，以及在组合物被吞咽并被身体再循环以浓缩在唾液中时的短期效果(数小时)。唾液中硝酸盐浓度升高数小时的优点在于在硝酸盐存在下微生物区系朝向与健康更加相关的组成和活动改变，正如在实施例1中在5h后离体观察到的。在两种情况下在使用本发明的组合物的治疗后24h内效果都是急性的。
不受理论限制，对于本发明人来说，令人吃惊的是在服用硝酸盐组合物后直接(1h)至4h糖漱口之前和之后，唾液pH均存在改善(碱化)。糖漱口模拟进餐，在这种情况下已知pH降低，因此实施例2令人吃惊地显示，通过硝酸盐的给药可以提供急性保护以免于例如餐后的pH下降。此外，所述结果提供了唾液中的硝酸盐水平在高浓度下(即高于供体的空腹硝酸盐水平)保持至少6小时的体内证据。这证实了例如包含硝酸盐的食品补充剂、牙膏或片剂在单剂后和24h内具有减少口腔生态失调的正面效果，即急性效果，这与现有技术相反，在现有技术中只有在1-4周的治疗后才显示出体内口腔微生物区系组成的变化，即慢性效果。
所述提供的结果(实施例2)显示了正面快速效果，与所述现有技术的使用硝酸盐补充剂的所有临床试验相反，在现有技术中参加者进行至少一周并最长1.5个月的治疗，每日服用较高的剂量(例如每日385-770mg)。本发明人发现，使用低于ADI(例如对于60kg的成人来说<222mg，对于70kg的成人来说<252mg)的单剂，患者在数小时内改善其pH(体内和离体)。这允许例如在早晨采取治疗(例如“抗龋齿丸剂”以获得即时效果，并在一整天内针对龋齿提供保护。
在特定实施方式中，在摄入本发明的具有直接和间接急性效果的组合物后24h看到治疗效果；更具体来说，在摄入组合物后1-12h内看到效果；更具体来说，在1-9h内看到效果；更具体来说，在1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h或23h内看到效果。
在实施例1提供的离体实验中，观察到在250μl的小体积中浓度为6.5mM的硝酸盐，足以在5h和9h后将口腔生物膜组成和活动急剧改变到与健康相关的生态平衡。也已显示，添加微摩尔范围内的极低浓度的硝酸盐阻止了由糖引起的pH下降。在这些结果的基础上可以确定，对于具有直接效果的组合物(即在口中局部施用)来说，硝酸盐的最低剂量应该在唾液中产生0.1mM硝酸盐(除了可能已经天然存在的硝酸盐之外)。考虑到我们在口中具有最少～0.5ml唾液并且硝酸根的分子量为62g/mol，实现0.1mM的硝酸盐浓度提高的剂量将是3.1μg硝酸盐(3.1μg/0.5ml[x2000]＝6.2mg/1L[÷62]＝0.1mM硝酸盐)。75％左右的硝酸盐从身体通过肾脏排出到尿液中，而其余25％被唾液腺再循环到唾液中。因此，对于间接急性效果(即从摄入和唾液腺的再循环产生的)来说，硝酸盐剂量应该为4倍高才能达到唾液中额外的0.1mM硝酸盐，这是12.4μg硝酸盐。两种剂量(对于直接和间接施用来说)均可以是纯的硝酸盐或存在或不存在其他分子的任何形式的植物硝酸盐。
因此，在一个实施方式中，在组合物给药后口腔中的唾液硝酸盐浓度高于空腹唾液水平：当所述组合物是局部施用的组合物时，给药30s后高出至少0.1mM，并且当所述组合物是摄入的组合物时，给药至少2h后高出至少0.1mM。这表示组合物给药后口腔中的唾液硝酸盐浓度相比于空腹唾液水平的提高，即作为给药之前和之后的相对值。
或者，组合物给药后口腔中的硝酸盐的唾液浓度的量可以用绝对值表示。因此，在一个实施方式中，考虑到空腹唾液硝酸盐水平开始为0.1mM，在组合物给药后口腔中的硝酸盐的唾液浓度：当所述组合物是局部施用的组合物时，给药后30s为至少0.2mM，并且当所述组合物是摄入的组合物时，给药后2h为至少0.2mM。在每种情况下，如果空腹唾液硝酸盐水平高于0.1mM，则在组合物给药后检测到的绝对值将比检测到的空腹水平高0.1mM(以mM为单位表示的空腹唾液硝酸盐+0.1mM)。如果例如在空腹期间检测到0.5mM硝酸盐，则所述绝对值当所述组合物是局部施用的组合物时，在给药后30s是0.6mM，并且当所述组合物是摄入的组合物时，在给药后2h是至少0.6mM。在特定实施方式中，在组合物给药后口腔中的唾液硝酸盐浓度，当所述组合物是局部施用的组合物时，给药后30s为至少3.5mM，并且当所述组合物是摄入的组合物时，给药后2h为至少3.5mM。
为了在唾液中实现所述硝酸盐浓度，必须给药一定量的硝酸盐，这取决于产品的类型、给药时间表和治疗时间。在这种意义上，在其他实施方式中，每剂组合物的硝酸盐量：当所述组合物是局部施用的组合物时为至少3μg，并且当所述组合物是摄入的组合物时为至少12μg。这些是观察到所需效果的最低硝酸盐量。在特定实施方式中，每剂组合物的硝酸盐量：当所述组合物是局部施用的组合物时为3μg至222mg，并且当所述组合物是摄入的组合物时为12μg至222mg(更具体来说是35mg)。在某些特定实施方式中，当每剂组合物的硝酸盐量为190、195、200、205、210、215或220mg时，获得最佳结果。
包含益生细菌的组合物
在一个实施方式中，所述第一方面的包含硝酸盐的组合物与属于罗氏菌属(Rothia)的至少一种细菌菌株相组合给药，其中所述罗氏菌属(Rothia)细菌菌株具有上文提到的特点(a)-(e)。具体来说，所述包含硝酸盐的组合物与选自CECT 9999、CECT 30000、CECT 30001、CECT 30002、CECT 30003、CECT 30004和CECT 30005或其组合的至少一种细菌菌株相组合给药。
本发明的细菌菌株和硝酸盐可以配制用于分开、顺序、伴随给药或混合给药。例如，给药方案和形式将由本领域技术人员根据例如待治疗的病症来确定。硝酸盐和细菌的给药可以分开(在细菌和硝酸盐给药之间等待一段时间)、顺序(一个接一个)、伴随(同时)或混合(一起)给药。在一个实施方式中，硝酸盐和本发明的菌株在不超过12小时的时间间隔内给药。具体来说，所述时间间隔不超过6小时。更具体来说，所述时间间隔不超过1小时。更具体来说，所述时间间隔不超过5分钟。在更特定实施方案中，治疗服药法基于硝酸盐和菌株的同时给药。一种特定的给药服法由给药硝酸盐并随后给药本发明的菌株组成。在某些实施方式中，硝酸盐和所述菌株被同时给药。当硝酸盐和所述菌株同时给药到患者时，它们可以作为分开的形式或作为单一组合物的一部分给药。当所述产品在分开的剂型中给药时，所述剂型可以在相同或不同的容器中。
下文记载了包含硝酸盐和/或本发明的细菌菌株的特定产品。产品的类型也将取决于例如待治疗的疾病。
口腔护理产品
在特定实施方式中，本发明的组合物采取口腔护理产品的形式，其包含硝酸盐和/或所述菌株以及药物赋形剂或美容用赋形剂或其他可食用成分。应该理解，本发明的组合物为有效量。术语“口腔护理产品”是指用于保持口腔和牙齿清洁以防止牙齿问题，最通常为龋齿、牙龈炎、牙周(牙龈)疾病和口臭的产品。在这种意义上，口腔卫生产品不被有意吞咽以用于特定治疗剂的全身给药，而是在口腔中保留足够的时间以基本上接触所有的牙齿表面和/或用于口腔活动目的的口腔组织。此类产品的非限定性实例是牙膏、洁牙剂、牙粉、局部口腔凝胶、漱口水、义齿产品、口腔喷剂、口香糖、牙线、牙带、喷粉、抛光膏、牙科清漆、窝沟封闭剂、填充材料、口腔霜剂或凝胶、糖果、锭剂、口腔分散片剂或条剂，或可以直接洒入口腔的粉剂。
在特定实施方式中，所述口腔护理产品选自牙膏、漱口水、口腔凝胶剂例如施用到牙周袋中的口腔凝胶剂、口香糖和咀嚼片剂。
所述口腔护理产品还可以包含调味剂和掩味剂。用于口腔护理产品的这些试剂的非限定性实例包括肉桂醛、丁香酚、桉树脑、薄荷醇、N-乙基-对-薄荷烷-3-甲酰胺、茴香脑、胡椒薄荷油、留兰香油和玉米薄荷油。所述口腔护理产品可以任选地包含保湿剂、胶凝剂、研磨剂、氟化物源、脱敏剂、调味剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、结构剂、表面活性剂、抗牙垢剂和抗菌斑剂。所述口腔护理产品还可以包含其他口腔活性剂例如牙齿美白活性剂，包括漂白剂或氧化剂如过氧化物、过硼酸盐、过碳酸盐、过氧酸、过硫酸盐、金属亚氯酸盐及其组合。在可用于本发明的口腔护理活性物质中也可以考虑牙齿颜色修饰物质。
牙膏的配方为本领域技术人员所熟知。在牙膏组合物中，优选地使用非离子(例如脂肪酸与糖的酯)或两性(例如可可衍生的甜菜碱)表面活性剂，因为阴离子表面活性剂对牙龈的脆弱上皮组织有负面影响。在牙膏的情况下，使用碳酸氢钠来中和口腔酸度也是特别优选的。此外，牙膏可以含有增稠剂例如黄原胶、研磨二氧化硅填料以及除牙膏工业中通常使用的之外的其他增补剂。优选地，细菌被包封或以其他形式保护以引入牙膏中。
正如本领域技术人员所知，当在本文中使用时，“漱口水”、“漱口液”、“牙科冲洗液”、“口腔冲洗液”或“漱口水”是指通过口腔周围肌肉的收缩和/或头部的运动而被动保持在口中或围绕口腔冲洗的液体组合物，并且可以漱喉，此时头部向后倾斜并且液体在口腔后部冒泡。通常，漱口水是一种旨在减少口腔中的微生物负荷的消毒溶液，尽管其他漱口水可能出于其他原因例如它们的镇痛、抗炎或抗真菌作用而被提供。此外，一些漱口水充当唾液替代品，以中和酸并在口干症(口干)中保持口腔湿润。除了水之外，还可以包括多羟基化合物例如甘油或二醇(例如丙二醇、非离子表面活性剂等)以及其他添加剂以改善外观、风味和防腐。
口香糖的典型配方包含胶基、甜味剂、软化剂/增塑剂、调味剂、着色剂以及通常硬质或粉状多元醇包衣。胶基被认为是每个口香糖制造公司的专有信息，但构成所有胶基的三种主要组分是树脂(例如萜烯，其是主要组分)、蜡(其软化口香糖)和弹性体(其增加柔性)。
喷剂是与漱口水相同或相似的组合物，但在喷雾瓶中分配，以方便地施用润湿和保护口腔所需的剂量，而无需随后冲洗。
口腔凝胶包括允许直接、稳定地施用到口腔的聚合物。关于这些聚合物，出于本发明的目的，优选地使用一般被称为聚卡波非和卡波姆的聚合物的组合，因为它们在极端温度条件下保持凝胶结构稳定很长时间。所述凝胶还可以包括一定量的天然非致龋甜味剂例如山梨糖醇。
药品和食品补充剂
在特定实施方式中，本发明的组合物被配制成药品，特别是食品补充剂。在本说明书中，术语“药品”以其广泛的含义理解，包括任何包含活性成分，在本情况下是优选地采取组合物形式的本发明的菌株，和任选的至少一种防腐剂以及药学上可接受的赋形剂的组合物。该术语不限于药物。
术语“药学上可接受”是本领域公认的，并包括在合理的医学判断范围内适用于与受试者(例如人类)的组织接触而没有过大的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物、载体、介质和/或剂型。每种载体、赋形剂等在与制剂的其他组分相容的意义上也必须是“可接受的”。适合的载体、赋形剂等可以在标准的制药学文本中找到。可充当药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；可可脂和栓剂用蜡；油类，例如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和用于药物制剂的其他无毒相容性物质。
赋形剂选自但不限于：填充剂/稀释剂/增量剂，粘合剂，抗粘附剂，分解剂，包衣剂，抗结块剂，抗氧化剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，着色剂，界面活性剂，以及其他类别的药学上可接受的和可兽医用赋形剂。
填充剂选自但不限于：菊粉，低聚果糖，果胶，改性果胶，微晶纤维素，乳糖，淀粉，麦芽糖糊精，蔗糖，葡萄糖，果糖，甘露糖醇，木糖醇，非结晶山梨糖醇，碳酸钙，磷酸二钙，其他惰性无机和有机药学上可接受的填充剂，以及这些物质的混合物。在口服混悬剂的剂型中，填充剂或稀释剂选自：植物油，油酸，油醇，液体聚乙二醇，其他药学上可接受的惰性液体，或这些物质的混合物。
粘合剂用于固体剂型中，以例如将片剂中的成分保存一起，以确保可以形成具有所需机械强度的片剂和颗粒剂，并为低活性物质剂量片剂提供体积。固体剂型如片剂中的粘合剂是：乳糖、蔗糖、玉米(corn(maize))淀粉、改性淀粉、微晶纤维素、改性纤维素(例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羟乙基纤维素)、其他水溶性纤维素醚、也被称为聚维酮(povidone)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇和磷酸氢二钙、其他适合的药学上可接受的粘合剂，或这些物质的混合物。
抗粘附剂用于减少粉末(颗粒)与冲头表面之间的附着，从而防止粘附到片剂冲头。它们还用于帮助保护药片不粘连。最常用的是硬脂酸镁。
作为固体剂型如片剂和胶囊剂中的分解剂和超级分解剂，使用但不限于下述物质：交联聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙和甲醛-酪蛋白、其他适合的药学上可接受的分解剂和超级分解剂，或它们的混合物。
包衣剂在固体剂型例如片剂和用于胶囊填充的颗粒剂的情况下保护成分免于被空气中的湿气劣化，使大而且口味令人不快的片剂更容易吞咽，和/或在肠溶包衣的情况下确保完整地通过胃液的强酸性介质(pH 1左右)，并允许在十二指肠或回肠(小肠)中释放。对于大多数包衣片剂来说，使用纤维素醚羟丙基甲基纤维素(HPMC)薄膜包衣。有时使用其他包衣材料例如合成聚合物和共聚物，如聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯(PVAP)，丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸的共聚物，甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸的共聚物，虫胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白或其他多糖，蜡或蜡样物质如蜂蜡、硬脂酸，长链脂肪醇如鲸蜡醇或硬脂醇，固体石蜡，单硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，或它们的组合。胶囊用明胶或羟丙基甲基纤维素包衣。
肠溶包衣控制药物释放速率并决定药物在消化道中的何处释放。用于肠溶包衣的材料包括脂肪酸、蜡、虫胶、塑料和植物纤维及其混合物，也可与其他上述包衣剂结合使用。
抗结块剂是置于粉状或颗粒状物料中以防止团块形成(结块)和便于包装、运输和食用的添加剂。作为固体剂型如片剂、胶囊剂或粉剂中的抗结块剂，使用下述物质：硬脂酸镁、胶体二氧化硅、滑石、其他药学上可接受的抗结块剂，或它们的混合物。
润滑剂在固体剂型特别是片剂和胶囊中用于防止成分团聚在一起和粘到片剂冲头或胶囊填充机上，并且也用于硬胶囊中。作为润滑剂，滑石或二氧化硅和脂肪例如植物脂、硬脂酸镁或硬脂酸及其混合物，是片剂或硬明胶胶囊中最常用的润滑剂。
添加甜味剂是为了使成分更加适口，特别是在固体剂型例如咀嚼片剂以及在液体剂型例如止咳糖浆中。甜味剂可以选自人造、天然或合成或半合成的甜味剂；甜味剂的非限定性实例是阿斯巴甜、乙酰磺胺酸钾、甜蜜素、三氯蔗糖、糖精、糖或它们的任何混合物。
调味剂可用于掩盖任何剂型中口味令人不快的活性成分。调味料可以是天然(例如水果提取物)或人造的。例如，为了改善：(1)苦味产品，可以使用薄荷、樱桃或茴香调味剂；(2)咸味产品，可以使用桃或杏或甘草调味剂；(3)酸味产品，可以使用覆盆子调味剂；(4)过甜的产品，可以使用香草调味剂。
除了选自赋形剂类别的辅助物质之外，本发明的制剂可以含有其他药理活性或营养物质，包括但不限于维生素，例如采取药学上可接受的化学形式的维生素D(钙化醇)、盐或衍生物；采取药学上和营养上可接受的化学形式的矿物质；和L-氨基酸。关于本发明制剂的制备是在本领域普通技术人员的范围之内，并将取决于最终剂量配方。例如但不限于，当最终剂型是口服固体剂型例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、口服混悬剂等时，制备制剂的固体剂型的过程包括将(1)包含有效量的本发明的至少一种或多种后处理的益生细菌的活性成分与(2)一种或多种赋形剂均化，以形成均质混合物，将其例如根据要求用硬脂酸镁或其他润滑剂进行润滑，得到粉剂的最终剂型。将这种均匀的粉剂填充到普通明胶胶囊中或者填充到抗胃胶囊中。在片剂的情况下，它们通过直接压制或造粒来制造。在第一种情况下，制备活性成分和适合的赋形剂例如无水乳糖、非结晶山梨糖醇等的均匀混合物。在第二种情况下，片剂以颗粒形式在所述混合物上加工。颗粒通过将制剂的活性成分与适合的填充剂、粘合剂、分解剂和少量纯化水进行造粒过程来制备。将这样制备的颗粒筛分并干燥，直到水含量<1％w/w。
关于液体剂型(例如口服混悬剂)的制备方法，它涉及将包含有效量的本发明的至少一种或多种处理后的益生细菌的制剂活性成分在惰性液体稀释剂(填充剂)中均化，所述惰性液体稀释剂例如各种植物油如葵花籽油、大豆油或橄榄油，油酸，油醇，液体聚乙二醇如PEG 200、PEG 400或PEG 600，或其他惰性药学上可接受的液体。所述方法还包括用选自下述的一种或多种方法处理均质混合物：(1)通过添加并均化悬浮稳定剂如蜂蜡、胶体二氧化硅等，使所述制剂稳定；(2)通过添加并均化甜味剂使所述制剂变甜；(3)通过添加并均化调味剂对所述制剂调味。此类形式的制剂还可以含有本领域中常用的其他赋形剂或成分。
所述药品根据产品的审批途径以及国家可以采用不同的形式或名称。例如，药物是一种特殊药品。医疗食品是另一种特殊药品。在某些国家使用术语“医疗食品”或“特殊医疗用途食品”来指称专门配制并旨在用于具有仅靠正常饮食无法满足的独特营养需求的疾病的饮食管理的食品。它们被定义在法规中，例如美国食品和药物监督管理局1988年的孤儿药法案修正案，以及欧洲的委员会指令1999/21/EC。医疗食品不同于更广泛的食品补充剂类别和带有健康声明的传统食品。因此，在特定实施方式中，将本发明的菌株配制成医疗食品。
也被称为膳食补充剂或营养补充剂的食品补充剂被认为是另一种特殊药品。这是一种旨在补充饮食的制剂或产品，由通常在食物中使用的化合物制成，提供在正常饮食中通常不被摄取或可能不以足够的量摄入的营养或有益成分。大多数情况下，食品补充剂被视为食品，但有时它们被定义为药物、天然保健品或营养品。在本发明的意义上，食品补充剂也包括营养品。食品补充剂通常以“柜台销售”的形式出售，即不需处方。如果食品补充剂采用丸剂、胶囊、片剂或粉剂的形式，则它包含与在药物中使用的相同的赋形剂。然而，食品补充剂也可以采取用某些营养物强化的食品的形式(例如能量棒或酸奶)。
因此，在特定实施方式中，本发明的组合物被配制成食品补充剂。所述食品补充剂可以原样给药，可以与适合的可饮用液体例如水、酸奶、牛奶或果汁混合，或者可以与固体或液体食品混合。在这种情形中，所述食品补充剂可为片剂或锭剂、丸剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、混悬剂、香囊、糖果、棒、糖浆和相应的给药形式，通常采取单位剂量的形式。更具体来说，本发明的组合物被配制成片剂、丸剂、胶囊、食物提取物(正如上文解释的，特别是基于甜菜根提取物)和补充粉剂。
本发明的组合物也可以包含在各种不同食品中，例如乳制品(酸奶、奶酪、发酵奶、奶粉、基于奶的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于奶的粉剂)、面包、能量棒、涂抹酱、饼干和谷物、饮料、不同类型的油或调味品。术语“食品”在本文中以其最广泛的含义使用，包括可以被动物摄取的以任何形式呈现的任何类型的产品，但不包括药物和兽医产品。其他食品的实例是肉制品、巧克力涂抹酱、馅料和糖霜、巧克力、糖食、烘焙食品、酱汁和汤、果汁和咖啡增白剂。特别是目标食品是食品补充剂和婴儿配方食品。食品优选地包含载体材料，例如燕麦粉粥、乳酸发酵食品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白质和糖基化蛋白质。在特定实施方式中，本发明的菌株被包封或包被。
特定产品的实例
在特定实施方式中，所述组合物还包含钼和/或维生素C和/或(其他)抗氧化剂和/或用于硝酸盐还原细菌的任何碳源。
此类产品、包含的成分和给药形式的实例记载在实施例4中。
在特定实施方式中，本发明的组合物为咀嚼片剂的形式，其提供直接和间接效果。具体来说，所述咀嚼片剂是例如在实施例4.2中记载的咀嚼片剂。含有硝酸盐(例如如果1剂的话222mg，如果2剂的话111mg，如果3剂的话74mg)的咀嚼片剂(例如0.5-3g)可以每日在早晨早餐和口腔护理后通过咀嚼并吞咽来摄取，如果分成两剂的话，也在午餐后摄取，并且如果分成三剂的话，也在当天结束时在晚餐和口腔护理后摄取。1、2或3剂片剂的某些变体也分别含有例如80mg、40mg或26.67mg维生素C，和/或例如50μg、25μg或16.67μg钼。最后，所述片剂的某些变体含有每日可接受量的可商购抗氧化剂，其被分到1、2或3剂中。例如在摄取后0-6h的时间段内，这种产品理想地获得对口腔疾病的急性直接和间接效果。
具体来说，所述咀嚼片剂是抗龋齿咀嚼片剂，例如在实施例4.3中所记载的。含有例如量在3.1μg-74mg之间的硝酸盐的片剂(例如0.5-3g)通过在进餐前吞咽来摄取。每天最多可以摄取3个片剂，并且推荐在三餐或含糖最多的零食之前1h摄取它们，优选地在一天的不同时段(早晨、中午和晚上)各摄取一剂。这种产品可用于例如在摄取后0-6h的时间段内，获得对口腔疾病的急性间接效果，以及改善受到一氧化氮缺乏影响的所有健康状况。
在特定实施方式中，本发明的组合物采取口香糖的形式，其提供直接和间接效果。具体来说，所述口香糖是例如在实施例4.3中记载的口香糖。含有例如量为3.1μg-37mg的硝酸盐的口香糖(例如1-2g)通过在进餐前吞咽来摄取。每天最多可以摄取6块口香糖，并且推荐在进餐或零食后立即摄取它们，优选地在一天的不同时段(早晨、中午和晚上)摄取至少一块。基于实施例4.2添加了其他分子。这种产品理想地用于例如在摄取后0-6h的时间段内，获得对口腔疾病的急性间接效果，以及改善受到一氧化氮缺乏影响的所有健康状况。
在特定实施方式中，本发明的组合物采取牙膏的形式，其提供直接效果。具体来说，所述牙膏是例如在实施例4.5中记载的牙膏。基于实施例4.2的例如0.2-1g的牙膏剂量含有例如量为3.1μg-74mg的硝酸盐、例如26.67mg维生素C和例如6.67μg钼和其他分子，其被个体例如正常使用，但每天刷牙不超过三次。这种产品与标准牙膏一样，在刷牙时通过与牙齿和牙龈接触来给药，提供了硝酸盐直接向口腔生物膜的局部施用，一部分硝酸盐也保留在口腔中，直至唾液的清除作用将它消除。推荐在施用后不漱口或仅用水简短漱口一次。
在特定实施方式中，本发明的组合物采取漱口水的形式，其提供直接效果。具体来说，所述漱口水是例如在实施例4.6中记载的漱口水。待使用的漱口水体积是例如5-30ml，特别是15ml。进行例如1-60s的漱口，由此向舌头、牙齿、口腔粘膜和牙龈提供硝酸盐产品的局部施用，因此硝酸盐被直接提供到口腔生物膜，一部分所述硝酸盐也保留在口腔中，直至唾液的清除作用将它消除。推荐在施用后不漱口。
在特定实施方式中，本发明的组合物采取用于牙周袋的口腔凝胶剂的形式，其提供直接效果。具体来说，所述口腔凝胶剂是例如在实施例4.7中记载的口腔凝胶剂。颊粘附凝胶由专业人员使用注射器施用到牙周病患者的牙周袋内，其在施用到一个至几个牙周袋的整个体积中含有例如量为3.1μg-222mg的硝酸盐浓度，并含有或不含还原硝酸盐的益生菌。它在患者的基线、治疗和随访时施用到牙周袋内部作为初始治疗。推荐在施用后1小时不吃不喝。可以组合维持治疗，其中在早晨提供每日硝酸盐补充剂或片剂，持续例如1至4周。当所述组合物包含益生细菌时，不推荐将所述产品用于免疫抑制的患者。
在特定实施方式中，本发明的组合物为每日剂量的胶囊或丸剂的形式，其提供间接效果。具体来说，所述胶囊或丸剂是例如在实施例4.8中记载的胶囊或丸剂。含有硝酸盐(例如如果1剂的话222mg，如果2剂的话111mg，如果3剂的话74mg)的胶囊(例如0.1-3g)每日在早晨早餐和口腔护理前通过摄食来摄取，如果分成两剂的话，也在午餐前摄取，并且如果分成三剂的话，也在当天结束时在晚餐和口腔护理前摄取。1、2或3剂胶囊的某些变体也分别含有例如80mg、40mg或26.67mg维生素C，和/或例如50μg、25μg或16.67μg钼。最后，所述胶囊的某些变体含有每日可接受量的可商购抗氧化剂，其被分到1、2或3剂中。为了选择分子的最佳组合和量，测试了不同的胶囊。例如在摄取后0-6h的时间段内，这种产品理想地用于获得对口腔疾病的急性直接和间接效果。
具体来说，所述丸剂、胶囊或咀嚼片剂是在会面之前服用的抗口臭丸剂。如上文记载的丸剂可以例如在早晨，在会面发生之前2-4小时服用。对于会面之前的快速效果来说，硝酸盐可为具有高剂量(例如222mg)的咀嚼片剂的形式，并且在即将会面之前服用。
在特定实施方式中，本发明的组合物包含益生细菌并用套管施用。具体来说，所述组合物是例如在实施例4.9中记载的组合物。还原硝酸盐的益生菌以冻干形式，与维生素C和钼以及增稠剂一起提供。将这种组合物与水混合，并使用套管施用在牙齿中5-30分钟，以允许牙齿生物膜的细菌定植。这种组合物在晚上，在标准的口腔护理之后至少30分钟施用，在施用后避免进食或饮水至少1小时。这特别适合于治疗和预防牙科疾病(龋齿或牙龈疾病)。在另一种特定施用模式中，将益生菌制剂施用到舌头例如1-5分钟，这特别适合于治疗口臭。这种产品不推荐用于免疫抑制的患者。
在特定实施方式中，本发明的组合物为用于在重症监护室(ICU)静脉内施用的肠胃外营养物的形式，其提供间接效果。具体来说，所述肠胃外营养物是例如在实施例4.10中记载的肠胃外营养物。含有盐或植物提取物形式的硝酸盐(例如12.4μg-222mg的量)的肠胃外营养物(患者依赖性剂量，例如10-1600ml)可用于在ICU患者中预防口腔疾病发展。所述肠胃外营养物的某些变体还含有额外的维生素C、抗氧化剂和钼。一些变体更适合婴儿，一些更适合幼儿，一些更适合婴儿，一些更适合青少年，一些更适合成人。
在特定实施方式中，本发明的组合物为用于儿童和成人的糖果的形式，例如在实施例4.11中记载的糖果。
在特定实施方式中，本发明的组合物为含淀粉和含糖产品的形式，例如在实施例4.12中记载的产品。
在特定实施方式中，本发明的组合物为宠物和牲畜食品和零食的形式，例如在实施例4.13中记载的那些。
在特定实施方式中，本发明的组合物为舌膏的形式，例如在实施例4.15中记载的舌膏。
在特定实施方式中，本发明的组合物为牙线的形式，例如在实施例4.16中记载的牙线。
选择治疗性治疗或预防策略的方法
本发明还设想了根据待治疗的受试者的硝酸盐还原能力(NRC)来选择个性化疗法或预防策略。本文提供的实施例5显示了受试者可以根据他们的NRC分层或分段。然后可以根据他们的NRC建立个性化疗法或预防策略。
因此，本发明的另一方面涉及一种为生物膜介导的口腔疾病或从一氧化氮供应获益的疾病或病态选择治疗性治疗或预防策略的方法。所述方法包括第一步(i)其中测量口腔(优选为唾液)样品中受试者的硝酸盐还原能力。在第二步(ii)中，将所述受试者根据受试者的硝酸盐还原能力程度进行分类。
受试者的硝酸盐还原能力可以例如通过实施例5中记载的方法来测量。例如，将无菌80mM(4960mg/l)硝酸盐水溶液在空腹唾液样品中进行1:10稀释，产生添加的浓度为8mM(496mg/l)。例如，向0.45ml空腹唾液样品添加0.05ml80 mM硝酸盐以达到0.5ml的终体积，产生8mM的硝酸盐终浓度。将一个样品在-20℃直接冷冻，并将另一个样品在37℃温育2小时。如实施例5中所述测量两个样品中的硝酸盐，并且所述两个样品之间的mg/l差值对应于被还原的硝酸盐。
使用硝酸盐值，将所述受试者根据硝酸盐还原能力的程度分类，其中：
ii.1)相对于未温育的口腔样品硝酸盐量的减少低于57mg/l(或用还原百分率表示低于15％)示出不良的硝酸盐还原能力，
ii.2)相对于未温育的口腔样品硝酸盐量的减少为57mg/l(含)至175mg/l(含)(15％(含)至35％(含))示出中等的硝酸盐还原能力，并且
ii.3)相对于未温育的口腔样品硝酸盐量的减少高于175mg/l(或高于35％)示出良好的硝酸盐还原能力。
所述方法还包括(iii)根据所述硝酸盐还原能力来选择治疗性治疗或预防策略，其中：
iii.1)将具有不良硝酸盐还原能力的受试者用包含硝酸盐和属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物给药，
iii.2)将具有中等硝酸盐还原能力的受试者用包含硝酸盐和/或属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物给药，并且
iii.3)将具有良好硝酸盐还原能力的受试者用包含硝酸盐的组合物给药。
生物膜介导的口腔疾病或从一氧化氮供应获益的疾病或病态已在上文定义。所述受试者特别是哺乳动物，更特别是人类。具体来说，具有良好硝酸盐还原能力的受试者最可能从包含硝酸盐的组合物的给药获益，因为所述受试者已经具有执行该功能的细菌，因此只需要所述反应的底物。相反，具有正常硝酸盐还原能力的受试者最可能从包含硝酸盐和/或属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物的给药获益，因为底物水平和细菌水平两者均可改善NRC。并且具有不良硝酸盐还原能力的受试者最可能从包含硝酸盐和属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物的给药获益，因为该受试者需要两者才能够还原硝酸盐。
在特定实施方式中，方法的步骤(i)即测量口腔样品中哺乳动物的硝酸盐还原能力，包括下述步骤：
1)收集唾液样品；
2)添加已知量的硝酸盐；
3)在37℃温育至少1小时；和
4)测量所述唾液样品中剩余的硝酸盐的量；
其中剩余的硝酸盐的量较高示出不良的硝酸盐还原能力。
用于测量口腔样品中哺乳动物的硝酸盐还原能力的方法的实例记载在实施例5中。
具体来说，包含硝酸盐和/或属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物是在上面的章节中记载的组合物。
所述选择适合的治疗性治疗或预防策略的方法可以被可选地制定成用于选择患有生物膜介导的口腔疾病或从一氧化氮供应获益的疾病或病态的受试者，以接受选自包含硝酸盐和/或属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物的不同组合的治疗性治疗或预防策略的方法，所述方法包括(i)测量口腔样品中哺乳动物的硝酸盐还原能力，和(ii)基于上述设定的硝酸盐还原能力(即不良、正常和良好的硝酸盐还原能力)，选择所述受试者接受所述治疗性治疗或预防策略。这也可被称为根据NRC对受试者分层或分段的方法。
因此，本文提供了一种在口腔中重新建立受试者的NRC的方法。
为避免疑义，本发明的方法不涉及对人体或动物体实施的诊断；具体来说，所述方法在以前已从受试者取出的样品上进行。
实施例
实施例1：离体研究-硝酸盐对健康人类个体的口腔生物膜生长的影响材料和方法
1.未经刺激的唾液取样
对于本研究来说，在公共卫生研究中心(CSISP-FISABIO,Valencia,Spain)征召了自称全身健康的成年人。个体如果自称具有龋齿或任何牙周炎病史，则被排除在外。
早晨，在安静的房间里，通过在无菌试管中流涎(Navazesh&Christensen，1982)从三组供体中收集未经刺激的唾液，直至达到5ml的体积。第一组和第二组均由12名供体(分别为D1-D12和D13-D24)组成。这些供体被指示食用正常的早餐，并在唾液收集前的早晨放弃口腔护理。首先，在早餐后至少一小时收集D1-D12的唾液，并作为接种物用于体外生物膜生长。然后，用D13-D24的唾液重复该实验以进行额外的测量。第三组由9名供体(D25-D33)组成，他们被要求在空腹(即放弃早餐和口腔护理)时捐献唾液。这组的唾液被用于确定硝酸盐对葡萄糖发酵造成的酸化的影响。
新鲜的未经刺激的唾液总是被直接用于实验，或在使用前保持在4℃至多1h。所有供体在收集临床材料之前均给出书面知情同意书，并且所述方案得到DGSV-CSISP(Valencian Health Authority)的伦理委员会批准。
2.体外口腔生物膜生长和基于阻抗的定量
D1-D12的生物膜在xCELLigence系统(ACEA Biosciences)中，在“E-Plate 96”96孔板(ACEA Biosciences)中从未经刺激的唾液中生长。每个E-Plate 96在孔的底部镀有金层，其与微电极相连，允许实时测量生物膜生长(Mira等，2019)。已显示，由生物膜附着形成的阻抗与单一物种生物膜的量成正比，并且生物膜质量的度量由以任意单位表示的相应的细胞指数提供(Ferrer等，2017)。
制备了含有额外的0.05mg/L氯高铁血红素、0.005mg/L甲萘醌和0.2mM维生素K(都来自于Sigma-Aldrich)的BHI培养基(Biolife)，向每个孔添加100μl所述培养基用于背景阻抗测量。向硝酸盐或对照条件的每个孔分别额外地添加25μl65 mM硝酸盐水溶液或仅仅是水。然后添加125μl新鲜收集的唾液，产生在硝酸盐条件下6.5mM硝酸盐的终浓度。将所述E-Plate 96置于37℃温箱内的xCELLigence系统中。每10分钟获取细胞指数测量值。所有实验均在无搅拌情况下进行，并通过用粘性铝箔(VWR)密封所述孔以有利于厌氧条件，这种方法以前允许严格厌氧细菌的生长(数据未示出)。对于0h测量值来说，使用1:1的培养基与唾液的混合物。然后，在生长5h和9h后获取上清液和生物膜的平行样。上清液被取样并储存在-20℃下，直至进行pH、硝酸盐、亚硝酸盐、铵和乳酸盐测量。在此之后进行PBS清洗步骤，并将生物膜的平行样一起重悬浮在200μl PBS中用于在-20℃下储存，直至进行用于测序的DNA分离。
第二组12名供体(D13-D24)的生物膜与第一组相同进行生长，在5h和9h取样而不进行PBS清洗步骤，并分别储存在75μl PBS中，以定量蛋白质和DNA。观察到硝酸盐影响xCELLigence系统的阻抗，并且这种效应依赖于供体的唾液。因此，对于D13-D24来说，将含有无微生物的过滤唾液的对照用于细胞指数测量值的标准化。为此，将唾液首先用5μm滤器过滤，然后用0.1μm滤器过滤。所有样品均在Eppendorf管中立即储存在-20℃下，直至进一步分析。
3.将唾液与硝酸盐和葡萄糖温育
D25-D33的未经刺激的唾液被用于测试在温育5h后不同浓度的硝酸盐对由0.2％葡萄糖引起的pH下降的影响。对于每位供体来说，向标准的96孔板的每个孔添加187μl唾液和22μl葡萄糖(2％，在水中稀释)。然后添加11μL不含或含有不同浓度的硝酸盐的水，使得硝酸盐终浓度为0mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2.5mM、3.5mM、4.5mM、5.5mM、6.5mM、7.5mM和8.5mM。将所述孔板用粘性铝箔(VWR)密封并在37℃温育5h。在温育后，将样品储存在-20℃直至进行pH测量。
4.硝酸盐、亚硝酸盐、铵、乳酸盐和pH测量
对于硝酸盐、亚硝酸盐、铵、乳酸盐和pH测量来说，使用
Figure BDA0003777929340000621
10
Figure BDA0003777929340000622
(Merck Millipores)这种测量变色试纸条的反射的反射仪。用于pH的试纸条(Merck Millipores参考1.16996.0001)具有pH 4至9的范围，在试纸条上的温育时间为10秒，用于硝酸盐的试纸条(参考1.16995.0001)具有3-90mg/l的范围并且温育时间为1min，用于亚硝酸盐的试纸条(参考1.16973.0001)具有0.5-25mg/l的范围并且温育时间为15sec，用于铵的试纸条(参考1.16899.0001)具有5-20mg/l的范围并且温育时间为4min，用于乳酸盐的试纸条(参考1.16127.0001)具有3-60mg/l的范围并且温育时间为6min。所有反射计方法的准确性通过使用具有已知浓度的不同测量化合物的对照来确认。
在硝酸盐、亚硝酸盐、铵和乳酸盐测量的情况下，将培养上清液用水1:10稀释，以最小化培养基化合物的干扰。在某些情况下，上清液必须被稀释更多，以使化合物在试纸条的检测范围内。对于pH测量来说，使用未稀释的上清液。对于除了铵之外的所有测量来说，将15μl(稀释的)上清液添加到试纸条上的两个反应贴片上，通过将试纸条的一侧倾斜在纸巾上来除去过量液体，每种测量使用相应的温育时间，并将试纸条放入反射计内。
首先测量亚硝酸盐。将其中检测到0.5mg/l或更多亚硝酸盐的稀释的上清液用氨基硫酸处理，以在硝酸盐测量之前除去亚硝酸盐。为此，将35μl稀释的上清液与1.5μl氨基硫酸溶液(10％)混合并直接添加到试纸条。
对于铵测量来说，制备50μl稀释的上清液的等分试样，向其首先添加10μl试剂盒的试剂1并充分重悬浮。然后，直接添加15μl通过将一勺试剂2(两者均由试剂盒提供)溶解在1.25ml水中而新鲜制备的混合物，并充分重悬浮。然后将该溶液直接添加到试纸条并温育。在测量前5秒除去过量液体。所有测量到的浓度均用稀释倍数进行调整。
5.生物膜蛋白质定量
将生长5h和9h的生物膜重悬浮在75μl PBS中。对于蛋白质定量来说，使用Bradford蛋白质测定法，所述测定法是基于考马斯亮蓝染料(G-250)在与蛋白质结合时的颜色变化。将15μl重悬浮的沉积物的两份平行样添加到标准96孔板的不同孔。然后添加240μl含有G-250的Bradford试剂(Sigma-Aldrich)，在暗处温育5分钟后，使用Infinite F200读板器(TECAN)在600nm处测量吸光值。蛋白质浓度使用每块板上用已知浓度的BSA(范围：0至1.5mg/ml，Sigma-Aldrich)制作的校准曲线来确定。
6.通过16rDNA测序确定的生物膜组成
6.1.用于测序的DNA提取
对于DNA提取来说，将生物膜重悬浮在100μl PBS中，并在超声波水浴(型号RaypaVCI-50)中以低超声强度解聚30s。然后，通过MagNA Pure LC 2.0仪器(RocheDiagnostics)，使用用于细菌和真菌的MagNA Pure LC DNA分离试剂盒III(RocheDiagnostics)，按照制造商的说明书分离DNA，并使用了额外的酶裂解步骤：向100μl PBS中的唾液颗粒中添加130μl裂解缓冲液和2.5μl酶混合物，所述酶混合物含有20mg/ml溶菌酶(Thermomixer comfort)、5mg/l溶葡球菌酶(Sigma-Aldrich)和0.625mg/ml变溶菌素(Sigma-Aldrich)，并在37℃温育60min。将DNA重悬浮在100μl洗脱缓冲液中并在-20℃下冷冻，直至进一步分析。为了确定用于测序的DNA的量，按照制造商的说明书，使用Quant-iTTM
Figure BDA0003777929340000641
dsDNA测定试剂盒(ThermoFisher)和QubitTM 3荧光计(ThermoScientific)。
6.2.16 rDNA测序
按照Dzidic等，2019进行16S rRNA基因的V1-V5区的预扩增步骤。按照16S rDNA基因宏基因组测序文库制备Illumina方案(Part#15044223Rev.A)制备Illumina扩增子文库。在该方案中使用的基因特异性引物序列是靶向16S rDNA基因V3和V4区的16S扩增子F(SEQID NO：8)和16S扩增子R(SEQ ID NO：9)，产生460bp的单一扩增子。突出接头序列一同用于与Illumina索引和测序接头相容。在16S rDNA基因扩增后，在MiSeq测序仪上按照制造商的说明书(Illumina)，使用2x300 bp成对末端方案对DNA测序。
6.3.分类学分类
序列按照Boix-Amorós等，2016进行分析。简而言之，使用Prinseq在10bp窗口中对读出序列进行质量过滤和末端修剪。按照Edgar等，2011使用UCHIME除去PCR嵌合体。使用核糖体数据库项目(Ribosomal Database Project)的分类器(Wang等，2007)，使用80％的置信区间，只将>250bp的过滤后的序列用于在属水平上进行分类指派。使用VSEARCH(Rognes，2016)以97％的序列同一性进行操作分类单元(OTU)挑选。每个OTU使用BLAST以97％的同一性和100％的查询覆盖率对齐质心，并且只检索那些与先前通过RDP分类器提供的属水平上的质心分类相一致的物种。
6.4.统计分析
将全面R编程语言用于统计计算以执行下游分析。从所有组中除去丰度<0.01％的属。对于多变量分析来说，使用由R的Vegan库提供的Adonis检验(使用距离矩阵的置换多变量方差分析)(Oksanen，2017)进行组间比较。为了在二维图中可视化各组及它们的差异，通过也是Vegan库的一部分的约束对应分析(CCA)来计算约束的主成分。对于单变量分析来说，进行配对非参数Wilcoxon检验以测试各组之间的属、OTU和所有其他参数的差异(5h对照相比于5h硝酸盐，9h对照相比于9h硝酸盐)。将未调整的p-值用于分类比较。
结果
7.硝酸盐对生物膜生长的影响
在生物膜生长的实时阻抗测量中，与对照生物膜相比添加6.5mM硝酸盐(即403mg/L)未显示出显著变化(图1A)。与此相一致，在不同条件之间蛋白质水平没有显著差异(图1B)。
8.生物膜生长期间硝酸盐、亚硝酸盐、铵、乳酸盐和pH的变化
分析了生长之前唾液与含有或不含6.5mM硝酸盐的BHI培养基的混合物(0h)和生长5h和9h后的上清液。在0h时，由于个体特异性唾液特性，在不同供体之间存在测量参数的差异(图2A-E)。
在含有额外6.5mM硝酸盐(即403mg/l)的条件下，大多数硝酸盐在5h后被用掉(图2A)：在5h后在7位个体中没有可检测的硝酸盐，而其余5位供体的硝酸盐减少76-85％。反过来，亚硝酸盐的平均值从0h的1.64mg/l提高到5h的64.68mg/l，而在9h时它大部分也被代谢(图2B)。
5h后，铵的平均值在对照条件下提高1.72倍，并且在硝酸盐条件下提高2.21倍(两者均p<0.005)，并且硝酸盐与对照条件之间的差异是显著的(p<0.01，图2C)。9h后，在两种条件下铵进一步增加(p<0.005)，在硝酸盐组中仍然明显更高(p<0.005)。在5h后，两种条件下乳酸盐平均值显著提高(在对照条件下提高4.74倍并且在硝酸盐条件下提高3.40倍，两者均p<0.005)，但在硝酸盐条件下明显更低(p<0.005，图2D)。9h后，乳酸盐似乎已被部分代谢，在两种条件下均显著减少(p<0.005)，但在硝酸盐条件下仍明显更低(p<0.005)。在9h时，在乳酸盐与铵之间存在负相关性，这在硝酸盐条件下更加明显(在对照中R＝-0.71，p<0.05，并且在硝酸盐条件下R＝-0.87，p<0.0005)。
根据铵的产生量更高和乳酸盐的量更低，在5h和9h时硝酸盐条件中的pH明显更高(两者均p<0.005，图2E)。与此相比，在对照条件中5h后pH显著下降(p<0.005)，但在硝酸盐条件中没有(p＝0.056)。有趣的是，在5h时，在硝酸盐条件中pH与亚硝酸盐之间存在负相关性(R＝-0.82，p<0.005)：具有0mg/L亚硝酸盐，可能全都用掉的个体具有最高的pH。同样地，在硝酸盐条件中，在5h时铵与亚硝酸盐负相关(R＝-0.64，p<0.05)。
为了观察在不存在培养基的情况下硝酸盐是否对由糖引起的唾液的酸化有影响，将未经刺激的唾液与0.2％葡萄糖和0.5-8.5mM浓度的硝酸盐温育5h(图3)。生长前的唾液pH为7.17(SD 0.41)。在没有硝酸盐的情况下与0.2％葡萄糖温育5h后，pH下降到pH 4.71(SD 0.29，LQ 4.49，UQ 4.96)。0.5mM至8.5mM的所有硝酸盐浓度与0mM硝酸盐相比在5h后产生更高的pH(对于1mM和1.5mM，p<0.05；对于最高达8.5mM的高浓度，p<0.01)。
9.硝酸盐强烈影响生物膜组成
硝酸盐的添加对生物膜的细菌组成具有显著影响(复合聚类分析，CCA，Adonis p-值：0.001)，解释了与生物膜取样时间无关的大部分数据可变性(图4)。
在对照条件中，在生物膜生长5h后5个最常见的属(表1)是链球菌属(Streptococcus)(48.02％SD 9.93％)、韦荣氏球菌属(Veillonella)(18.43％SD8.01％)、嗜血杆菌属(Haemophilus)(7.33％SD 4.52％)、奈瑟氏菌属(Neisseria)(6.56％SD 2.98％)和普氏菌属(Prevotella)(3.82％SD 5.19％/SE 1.50％)。在硝酸盐条件中，5h后最丰富的属是链球菌属(Streptococcus)(45.29％SD 9.53％)、奈瑟氏菌属(Neisseria)(20.65％SD 8.36％)、韦荣氏球菌属(Veillonella)(10.84％SD 8.11％)、嗜血杆菌属(Haemophilus)(7.30％SD 4.27％)和孪生球菌属(Gemella)(2.03％SD 1.60％)。在9h时，百分率略有变化，但5个最丰富的属的顺序保持一致，除了在硝酸盐条件中普氏菌属(Prevotella)比孪生球菌属(Gemella)略微更普遍。在用作接种物的唾液中，发现了具有相近百分率的可比优势属，链球菌属(Streptococcus)(43.38％，SD 2.97％)排在首位，然后是奈瑟氏菌属(Neisseria)、孪生球菌属(Gemella)和韦荣氏球菌属(Veillonella)(数据未示出)。
表1：含有和不含6.5mM硝酸盐的情况下口腔生物膜中的细菌丰度
Figure BDA0003777929340000671
Figure BDA0003777929340000681
与对照条件相比，在硝酸盐条件中在5h和9h时韦荣氏球菌属(Veillonella)的更低丰度是显著的(p<0.01，图5)，并且在9h时链球菌属(Streptococcus)的更低百分率也是显著的(p<0.01)。链球菌属(Streptococcus)和韦荣氏球菌属(Veillonella)均与龋齿相关(即这些属在龋齿中增加)。有趣的是，在这些属中观察到OTU的迁移，包括在5h时副血链球菌(S.parasanguinis)的增加和9h时殊异韦荣氏球菌(V.dispar)的增加(两者均p<0.05，数据未示出)。在对照条件中，5h时牙周炎和口臭相关属普氏菌属(Prevotella)更低(3.82％，SD 5.19％，相比于在硝酸盐条件中1.99％，SD 3.43％，p<0.01)。9h时在属水平上没有观察到普氏菌属(Prevotella)的显著差异，但在OTU水平上，在硝酸盐条件中观察到相对更高百分率的最丰富物种淡色普氏菌(P.pallens)(p<0.05，数据未示出)。在两种条件中，在嗜血杆菌属(Haemophilus)与孪生球菌属(Gemella)之间没有观察到显著差异。
与对照条件相比，在硝酸盐条件中健康相关的奈瑟氏菌属(Neisseria)在5h时提高3.5倍和9h时提高4.9倍是显著的(两者均p<0.01，图5)。尽管奈瑟氏菌属(Neisseria)的数量明显增加，但鉴定到的OTU浅黄奈瑟氏菌(N.flavescens)、微黄奈瑟氏菌(N.subflava)、杆状奈瑟氏菌(N.bacilliformis)和长奈瑟氏菌(N.elongata)在相对丰度方面没有显著变化。罗氏菌属(Rothia)是另一个与健康相关的还原硝酸盐的属，以分类为“空间罗氏菌(R.aeria)或龋齿罗氏菌(R.dentocariosa)”的OTU为主，其丰度更低(即在所有条件下的平均值为0.3％SD 0.34％，范围为0.01-1.7％)，但在硝酸盐条件中在5h和9h时高2.7倍(分别为p<0.01和p<0.05)。最后，与健康相关的属金氏菌属(Kingella)在5h后显著增加(p<0.05)。出乎意料地，罗氏菌属(Rothia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和金氏菌属(Kingella)从龋齿、牙周病和口臭的角度来说都是健康相关的。
在硝酸盐条件中明显更低(在5h和/或9h时p<0.05)的其他属是与牙周炎和口臭相关的卟啉单胞菌属(Porphyromonas)(包括OTU“牙髓卟啉单胞菌(P.endodontalis)或口腔分类单元285”)、梭杆菌属(Fusobacterium)(包括牙周梭杆菌(F.periodonticum)和具核梭杆菌(F.nucleatum))、纤毛菌属(Leptotrichia)(包括OTU“韦德纤毛菌(L.wadei)或口腔分类单元417”和香港纤毛菌(L.hongkongensis))、拟普氏菌属(Avoprevotella)(包括A.rava和A.tannerae)、小杆菌属(Dialister)和微单胞菌属(Parvimonas)。此外，与龋齿相关的奇异菌属(Atopobium)和Oribacterium(包括O.parvum和O.sinus)显著减少(在5h或5h和9h分别地p<0.05)。还存在牙周炎和口臭相关细菌消化链球菌属(Peptostreptococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella)、Solobacterium和新月形单胞菌属(Selenomonas)减少的趋势，但差异不显著(图5)。
当将两种条件(对照和硝酸盐)下来自于12位供体(D1-D12)的测序的生物膜一起分组时，在5h时纤毛菌属(Leptotrichia)和Oribacterium与乳酸盐正相关(R＝0.72和R＝0.70，两者均p<0.05)。在硝酸盐条件中，在9h时韦荣氏球菌属(Veillonella)与pH负相关(分别为R＝-0.77和R＝-0.76，两者均p<0.005)。相反，在两种条件中，在9h时奈瑟氏菌属(Neisseria)与pH正相关(对照条件：R＝0.75，p<0.005，硝酸盐条件：R＝0.84，p<0.001)。
结论
10.试验了在体外口腔生物膜发生期间6.5mM硝酸盐的影响。结果显示在硝酸盐存在下生长的生物膜含有水平高几倍的健康相关的还原硝酸盐的属奈瑟氏菌属(Neisseria)和罗氏菌属(Rothia)。这包括黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)和浅黄奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)的总丰度的提高。似乎罗氏菌属(Rothia)和奈瑟氏菌属(Neisseria)的种在硝酸盐存在下具有选择优势。奈瑟氏菌属(Neisseria)与抗炎介导物相关，并与实验性牙龈炎之后牙龈的更好恢复相关。罗氏菌属(Rothia)通常也与牙周健康有关，并且最近已将龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)与无口臭个体相关联。此外，已将罗氏菌属(Rothia)和奈瑟氏菌属(Neisseria)两者与无龋齿个体相关联。因此，奈瑟氏菌属(Neisseria)和罗氏菌属(Rothia)的增加可以被认为是与总体口腔健康相关的正向变化。
11.实验中的另一个重要观察是在存在硝酸盐的情况下生长的生物膜中，在5h后与牙周病相关的卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普氏菌属(Prevotella)、纤毛菌属(Leptotrichia)和拟普氏菌属(Alloprevotella)明显更低。卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)和普氏菌属(Prevotella)含有经典的“红色和橙色复合体”的物种，它们在该研究中是与牙周炎关联最强的细菌，包括也在我们的研究中鉴定到的牙周梭杆菌(Fusobacterium periodonticum)、中间普氏菌(Prevotella intermedia)和变黑普氏菌(Prevotellanigrescens)。同样地，纤毛菌属(Leptotrichia)与牙周炎强烈相关，同时最近确认了拟普氏菌属(Alloprevotella)在疾病中也更加丰富。出乎意料地是注意到在硝酸盐条件中也发现所述“红色复合体”的其他两个成员即坦纳菌属(Tannerella)和密螺旋体属(Treponema)水平更低，但差异不显著。
出乎意料地是注意到卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)和普氏菌属(Prevotella)也与口臭这种由挥发性硫化合物(VSC)的微生物产生导致的难闻口气相关。这些VSC包括硫化氢和甲硫醇。已知硫化氢是基因毒性的(即它损伤人类细胞的DNA)并在结肠和口腔中引起炎症。就此而言，认为硫化氢产生对牙周病的发展有贡献，将口臭与牙周炎产生联系。
12.在硝酸盐条件中显示出减少趋势的其他属是消化链球菌属(Peptostreptococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、Solobacterium和新月形单胞菌属(Selenomonas)，它们全都与牙周炎和口臭相关。总之，添加硝酸盐降低了牙周病和口臭相关物种的丰度。
13.数据还显示，与在对照条件中相比，在硝酸盐条件中在5h和9h产生更少的乳酸盐和更多的铵，并且因此pH更高(均为p<0.01)。此外，在生物膜生长9h后，在乳酸盐与铵之间存在强烈负相关，这在硝酸盐条件下更加明显。这支持了下述假设，即硝酸盐还原群落的碱产生和乳酸盐消耗限制了当碳水化合物被发酵时的pH下降。在体内，这可以潜在地减少牙齿组织处于脱矿化pH下的时间，这是蛀牙的关键因素。在这项研究中发现，从0.5mM起的硝酸盐浓度在5h后阻止由葡萄糖发酵造成的唾液的酸化，而高于3.5mM的浓度没有观察到额外的益处。
14.关于细菌组成，观察到韦荣氏球菌属(Veillonella)、链球菌属(Streptococcus)、奇异菌属(Atopobium)、Oribacterium的减少，它们是在硝酸盐条件中在5h或9h后与乳酸盐、酸化和龋齿相关的属(p<0.05)。
15.在本研究中，亚硝酸盐的代谢和铵的产生示出口腔物种的异化性硝酸盐还原成铵(DNRA)活性。在5h时亚硝酸盐与铵和pH负相关(代谢所有亚硝酸盐的生物膜产生最多铵并具有最高pH)这一观察进一步支持了这一点。与对照条件中相比，在硝酸盐条件中9h后铵的量高出4.75mM。在化学计量上，这可以占添加的6.5mM硝酸盐的73.1％，而(一部分)其余的26.9％硝酸盐必定已被反硝化成一氧化氮和其他含氮产物。
16.因此，硝酸盐给药被用作益生元，其被某些口腔微生物转变成铵，提高局部pH，从而在体内具有抗龋齿作用。除了铵的产生之外，亚硝酸盐转变成一氧化氮可以进一步限制龋齿发展。在牙周炎的情况下，硝酸盐补充可以导致一氧化氮产生，限制牙周病原物种的生长。这与增加牙周致病细菌如密螺旋体属(Treponema)、普氏菌属(Prevotella)和真杆菌属(Eubacterium)的精氨酸补充(Koopman等，2016)相比是一个优点。
17.本研究的结果显示，硝酸盐引起口腔群落对人类宿主有益的结构和功能变化。在所述结果的基础上可以得出结论，硝酸盐对于健康的口腔微生物区系来说是必需的，并且可用作益生元，降低致龋、牙周病原和口臭相关物种的水平，同时提高与健康相关的还原硝酸盐的物种的水平。这种生物膜组成变化的强度通过下述观察得到反映，即硝酸盐可以解释与生物膜取样时间无关的大部分细菌组成数据的可变性。此外得出结论，通过增加乳酸盐消耗和铵的产生，硝酸盐代谢提供了针对糖代谢引起的酸化的恢复力。在硝酸盐存在下生长的生物膜中，利用乳酸盐作为碳源的韦荣氏球菌属(Veillonella)与pH负相关，而奈瑟氏菌属(Neisseria)与pH正相关。奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)和金氏菌属(Kingella)通过唾液硝酸盐的还原，在维持口腔微生物区系与宿主之间的健康共生关系中具有必不可少的作用。
实施例2：体内研究–硝酸盐向人类的口服给药
概述：进行了临床研究，在其中获得了首个体内证据，表明富含硝酸盐的补充剂在单次摄入后直接影响细菌活动(即急性效果)。显示出这种效果通过局部施用和通过产品的摄入而发生。
18.方法
研究1：唾液硝酸盐的局部(直接)和摄入(间接)效果
如实施例1中所述测量不同唾液样品中的硝酸盐，所述样品由空腹条件下的个体在摄入200ml体积中的220mg硝酸盐后在6小时内每30分钟收集。
研究2：局部硝酸盐组合物对细菌活动的影响
如实施例1中所述测量不同唾液样品中的硝酸盐、亚硝酸盐和pH，所述样品按照下述方案从6位个体中收集：
-在10％蔗糖漱口之前和之后10分钟收集唾液
-摄入高度浓缩的富含硝酸盐的补充剂(70ml体积中的300mg硝酸盐)
-不吃不喝等待1小时
-在10％蔗糖漱口之前和之后10分钟收集唾液。
研究3：摄入的硝酸盐组合物对细菌活动的影响
如实施例1中所述测量不同口腔样品中的硝酸盐、亚硝酸盐和pH，所述样品按照下述方案从6位个体中收集：
第1天(对照天)
-在早晨，在10％蔗糖漱口之前和之后10分钟收集唾液样品，
-不进食等待4小时
-在10％蔗糖漱口之前和之后10分钟收集唾液样品
第二天(补充剂天)
早晨：
-在早晨，在10％蔗糖漱口之前和之后10分钟收集唾液样品，
-服用富含硝酸盐的补充剂(每剂220mg)
-不进食等待4小时，并且每小时收集唾液样品(1h、2h和3h样品)
-在4小时时，在10％蔗糖漱口之前和之后10分钟收集唾液。研究4：摄入的硝酸盐组合物和安慰剂的对照效果(盲法横断面研究)
如实施例1中所述测量不同口腔样品中的硝酸盐、亚硝酸盐和pH，所述样品按照下述方案从12位个体中收集：
-在早晨，在10％蔗糖漱口之前和之后10分钟收集唾液样品，
-服用富含硝酸盐的补充剂(200ml水中的250mg硝酸盐)或安慰剂(200ml水中的0mg硝酸盐)
-不吃不喝等待1h 45mins
-在10％蔗糖漱口之前和之后10分钟收集唾液样品。
19.结果
在研究1中，测试了富含硝酸盐的补充剂如何影响唾液硝酸盐水平(图6)。数据显示在摄入补充剂后，作为产品与口腔组织局部接触的结果，唾液硝酸盐直接增加，其通过唾液清除作用和吞咽缓慢减少。在2.5小时后作为唾液腺的再循环活动的结果观察到第二个峰，唾液腺将硝酸盐从血浆浓缩到唾液中，使得在测试的6小时期间硝酸盐浓度提高。
因此，进行了研究2和研究3以分别研究在直接(局部给药)和间接(摄入给药)唾液硝酸盐增加期间含硝酸盐产品的单次使用对细菌活动的急性效果。为此，测试了富含硝酸盐的补充剂对由10％糖漱口引起的细菌产酸代谢的影响，所述产酸代谢降低唾液pH。在这两项研究中，在基线和补充剂后唾液样品中pH、硝酸盐和亚硝酸盐的糖前和糖后测量值示出在表2中。
表2：研究2和3中的唾液硝酸盐、亚硝酸盐和pH水平
Figure BDA0003777929340000741
Figure BDA0003777929340000751
两项研究均显示，在补充剂后硝酸盐和亚硝酸盐总是显著增加，并且在糖漱口后硝酸盐和亚硝酸盐总是立即显著减少。这表明单剂硝酸盐对硝酸盐唾液水平具有急性影响，并且它通过诱导硝酸盐还原和亚硝酸盐还原活性而对微生物活动具有急性影响。
关于pH值，在研究2中观察到在摄入浓缩补充剂后1小时，硝酸盐已阻止通过糖漱口的pH的第二次下降(图7A)。然而，基线唾液pH未显著提高。在研究3中，数据显示在4h后基线pH显著提高(图7B)。此外，在服用补充剂后pH下降不再显著。因此数据表明，局部给药的硝酸盐组合物对细菌活动的影响是显著的，但强度低于摄入的硝酸盐组合物的间接影响，并且在4小时后在体内观察到的强烈效果与在实施例1中离体观察到的效果匹配。
在研究4中，与安慰补充剂相比，在硝酸盐补充剂后pH下降有限(图8B)。此外，存在着基线pH升高的趋势(p＝0.098，图8A)。这些数据表明硝酸盐组合物需要作为摄入结果的间接效果来影响细菌活动的基线变化，而局部给药的硝酸盐组合物足以影响细菌活动的糖后变化。此外，补充剂与安慰剂相比的显著效果证实了在体内观察到的效果是由硝酸盐而不是水摄入造成的。
20.结论
从不同的体内研究获得的数据证实，在单次施用硝酸盐补充剂后硝酸盐和亚硝酸盐在唾液中检测到，并且它们在糖漱口后立即下降(仅仅10分钟时间)。此外，单次硝酸盐给药总是减轻糖漱口后的pH下降。这暗示了单次施用硝酸盐产品足以修改口腔微生物区系的活动，提供对抗酸化的恢复力。这种恢复力可以通过等待更长时间(4h)使得硝酸盐还原细菌增加来提高，如在5h后离体观察到的(实施例1)。阻止糖后pH下降的可能机制包括酸中和剂铵的产生、抗微生物分子一氧化氮的产生和乳酸盐被硝酸盐还原细菌的消耗，如实施例1中所示。因此，我们的体内结果支持了实施例1中示出的离体结果：急性硝酸盐施用限制pH下降，并因此通过减少与糖相关的细菌生态失调(这是蛀牙的主要疾病驱动因素)，可以成为对抗龋齿的有效益生元。
不受理论限制，令本发明人吃惊的是在糖漱口之前和之后均存在唾液pH的改善(碱化)，并且这种改善在1-4小时后急性观察到。糖漱口模拟进餐，已知在其中pH会下降，因此本实施例令人吃惊地显示，通过硝酸盐的给药可以在例如进餐后提供保护以免于pH下降。此外，所述结果提供了体内证据，表明唾液中的硝酸盐水平在高浓度(即高于供体的空腹水平)仍保持至少6小时。这使得下述情况是合理的，即诸如含有硝酸盐的食品补充剂、牙膏或片剂在单剂后和24h内具有减少口腔生态失调的正面效果，即急性效果，与此相反在当前现有技术中，仅在1-4周治疗后才显示出体内口腔微生物区系组成的变化，即慢性效果。此外，220mg和250mg(分别低于60或70kg成年人的ADI)硝酸盐的剂量足以阻止由糖代谢造成的pH下降，而在现有技术中，使用1-4周的每日剂量为372-770mg(60kg成年人的ADI的1.7-3.5倍)。
实施例3：从健康供体分离还原硝酸盐的物种用作益生菌
材料和方法
21.供体选择和样品程序
征募没有龋齿和牙周炎的受试者作为供体。所有参与者均需要具有由牙科医生评估的良好口腔健康和使用M6 Comfort IT型号的自动血压监测仪(OMRON HealthcareEurope B.V)测量的健康血压。由牙科医生收集菌斑或舌苔样品并重悬浮在1mLPBS中。
22.还原硝酸盐的物种的分离
将PBS中的菌斑或舌头样品稀释102至107倍，并铺于脑心浸液(BHI)1.4％琼脂平板(Merck Millipore)上。将平板在37℃温育2天，以在某些稀释度下获得分开的菌落。使用改编自Doel等，2005和Mashimo等，2015的方案在平板上直接检测硝酸盐还原活动。它是基于染色亚硝酸盐的Griess反应的双层琼脂覆盖法。具有硝酸盐还原能力的菌落由于存在亚硝酸盐而产生红色。然后将这些菌落转移到新的BHI琼脂板，并在37℃继续温育2天。对于每个分离株来说，重复双层琼脂覆盖法来确认分离株的硝酸盐还原能力。随后，将一个菌落转移到5mL液体BHI中，并在37℃有氧温育2天。在2天后，将一部分培养基用于产生每种分离株的甘油储用物，用于将来的实验。将其余培养基以4000rpm离心15min，将颗粒物重悬浮在100μL PBS中并储存在-20℃下，直至DNA提取。
23.从还原硝酸盐的分离株提取DNA和分类学分类
DNA提取使用MagNA Pure LC DNA分离试剂盒III(Bacteria,Fungi)(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)，按照制造商的方案来进行，DNA浓度使用NanoDrop 1000分光光度计(ThermoScientific)测量。进行PCR来扩增每个分离株的16S rRNA基因，使用了用于16S rRNA基因的包含超变区V1-V2-V3-V4的通用引物8-F和785-R(SEQ ID NO：9和10)进行。然后PCR产物使用平底96孔过滤板(NucleoFast 96PCR，Macherey-Nagel)来纯化，并通过Sanger技术来测序。为了对分离株进行分类分配，将序列使用BLASTn针对NCBI nr数据库的16S核糖体RNA序列进行分析。
24.细菌分离株的硝酸盐还原测试
测量用过的培养基中硝酸盐、亚硝酸盐和铵(氨的离子)的浓度，以确定每个分离株还原或产生这些化合物的能力。为此，将分离株侧重它们的储用物中取出，并在5mLBHI液体培养基中在37℃温育过夜。第二天，将分离株在BH中稀释到OD为0.01，并且硝酸盐终浓度为6.5mM。然后将试管温育7小时，并在4和7小时在涡旋振荡后取样1mL。在4和7小时测量OD，并在其他测量之前将样品在-20℃下冷冻。以5h生长进行了相同的实验，使用了三种类型的缓冲培养基(100mM MES，pH 6.0；100mM HEPES，pH 7.0；100mM HEPES，pH 7.5)以保持稳定的pH，并观察不同pH水平对所选分离株的硝酸盐还原能力的影响。
25.硝酸盐、亚硝酸盐、铵和pH测量
硝酸盐、亚硝酸盐、铵和pH如实施例1中所述使用反射仪来测量。
25.1.分离株对体外生物膜的影响
对在前述实验结果的基础上被选为最佳潜在益生菌的6个分离株进行了体外研究，以确定这些分离株在被添加到口腔生物膜时的效果。这些分离株如下进行测试：使用来自于两个不同供体(我们的数据库中的D2和D25)的唾液在96孔板中使它们生长。对于每个实验来说有4种条件：对照、硝酸盐(即6.5mM硝酸盐)、对照+分离株和硝酸盐+分离株。对于所有一式两份制备的样品来说，向每个孔添加100μLBHI(含有0.05mg/L氯高铁血红素，0.005mg/L甲萘醌和0.2mM维生素K)。然后添加100μL唾液(或对于阴性对照来说BHI)，并且对于硝酸盐条件，添加10μL65 mM的硝酸盐溶液(或对于对照条件，添加10μLBHI)。在每个实验中加入阴性对照：仅有BHI培养基和BHI培养基+硝酸盐。在添加到96孔板之前，将分离株生长24h。然后向每个孔添加40μL在BHI溶液中具有OD 1.5的分离株(或在不含分离株的条件中仅仅40μLBHI)。硝酸盐的终浓度为6.5mM，并且分离株的起始OD为0.24。将96孔板密封以防止氧气存在，并在37℃温育5h 30min。然后收集上清液，将颗粒重悬浮在30μLPBS中，并将两者储存在-20℃下直至进行测量。如实施例1中所述提取DNA并对生物膜进行测序。
结果
26.还原硝酸盐的物种的鉴定
将来自于5位不同健康供体的舌头和菌斑样品铺板。通过由Griess反应产生的红色调检测还原硝酸盐的菌落。总共鉴定到67个还原硝酸盐的分离株的储用物。
27.在硝酸盐还原能力的基础上选择最佳益生菌分离株
当将每个分离株与6.5mM硝酸盐温育4和7小时时，不同百分率的硝酸盐被它们还原。在温育4小时后，只有D3T4还原100％的硝酸盐。相比之下，另外6个分离株在此时尚未还原任何比例的硝酸盐(图9A)。
选出了在7小时还原100％的硝酸盐并在4小时还原>19％的硝酸盐的33个分离株(图9B)。从这33个分离株中，5个分离株从舌头选出(T)并5个分离株从菌斑选出(P)，它们不将培养基pH降低到低于6.8(即它们不产酸)并具有良好的生长速率(在温育7小时之后光密度高于0.7)。此外，在满足所述要求的分离株中选择了来自于不同供体的不同物种。所选的继续用于我们的研究的分离株是D1P7(CECT9999)、D1P10、D1P15A、D1P17(CECT30000)、D3T4(CECT30001)、D4P7、D4T4(CECT30002)、D4T6(CECT30003)、D4T9(CECT30004)、D5T11A(CECT30005)。
28.硝酸盐还原能力依赖于pH
当将10个所选分离株与6.5mM硝酸盐在三种不同pH水平(pH6.0、7.0和7.5)下温育5小时时，显示出在不同pH之间硝酸盐还原能力不同，并且这是分离株依赖性的。例如，分离株D1P7在pH7.5下温育5小时后还原100％的硝酸盐，但在pH为6.0时仅还原约52％的硝酸盐。与D1P7相反，D4T6在pH为6.0时还原77％的硝酸盐，但在pH 7.5下仅还原35％的硝酸盐(图10A，表3)。
在温育5h后，表示为硝酸盐减少的百分率的进一步还原成一氧化氮和其他化合物的亚硝酸盐的量根据pH而不同(图10B)。一些分离株将大部分亚硝酸盐转变成一氧化氮或其他化合物，但在分离株之间最优的pH水平不同。与pH 7和7.5相比，在pH 6下亚硝酸盐还原受到刺激(分别为p<0.05和p<0.01)，但亚硝酸盐还原程度也是菌株依赖性的。
根据1:1摩尔的反应，确定了在5h后还原的硝酸盐的百分率(图10A)有多少作为亚硝酸盐被检测出(表3)。其余未作为亚硝酸盐被检测出的还原的硝酸盐已被进一步还原成其他化合物。亚硝酸盐可以被还原成氨和一氧化氮。产生最多亚硝酸盐的分离株被认为适合于全身应用(例如降低高血压)，而产生最多一氧化氮和其他化合物的分离株被认为适合于预防口腔疾病。其中检测出这些化合物的pH进一步决定了每种分离株适合于哪种优选的口腔疾病(龋齿由酸性pH引起，而牙周病和口臭在中性至微碱性pH水平下发生)。
表3.由使用6.5mM硝酸盐在不同pH生长5h的分离株产生的亚硝酸盐和一氧化氮
Figure BDA0003777929340000801
Figure BDA0003777929340000811
Figure BDA0003777929340000821
*高于中位数的数字
*1在培养物保藏中心登记并包含在本专利中
*2一氧化氮和可能从亚硝酸盐还原产生的其他化合物(例如铵)
*3由于蛋白质降解，口臭也在中性至碱性pH下发生，并且可以应用与为牙周病提出的相同的益生菌
29.分离株对口腔生物膜发展的影响
在体外测试了10株所选分离株中的6株(5株黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)和1株空间罗氏菌(Rothia aeria))对口腔生物膜发展的影响。为此，从两位不同供体(用编号D2和D25命名，图11)的唾液中生物膜生长5h 30min。从开始就添加的分离株似乎成功地定植生物膜，正如由通过测序检测到的它们的相应物种的最终百分率所指示的(表4)。所有分离株均在硝酸盐存在下生长更好。对在存在或不存在分离株的情况下使用和不使用硝酸盐生长的生物膜进行比较(图11)。此外，将结果与含有和不含硝酸盐的生长培养基的对照(Cnt，图11)进行比较。
表4：在来自于具有不同NRC的两位供体的样品中，在施用益生菌后生长5h时生物膜中的益生菌的百分率。
Figure BDA0003777929340000822
Figure BDA0003777929340000831
30.向没有口腔NRC的供体(D25)添加分离株
从具有碱性pH(在将唾液与生长培养基1:1混合之前pH 7.8)的D25的唾液生长的体外口腔生物膜，与对照相比硝酸盐没有减少，并且产生的亚硝酸盐很少，显示出该供体的口腔微生物区系具有极低的硝酸盐还原能力(NRC)。然而，在硝酸盐+分离株条件中大部分硝酸盐被还原(图11E)，并且亚硝酸盐浓度也显著提高(图11F)。这表明添加益生菌能够补偿硝酸盐还原能力的缺乏。
与当将硝酸盐添加到仅仅BHI(无，图11E，Cnt，带条纹的黑色条)时相比，当将硝酸盐添加到BHI中的唾液(图11E，无，黑色条)时硝酸盐浓度更高，表明唾液含有一些硝酸盐。当将硝酸盐添加到唾液时(硝酸盐条件)pH维持稳定，但当添加分离株但无硝酸盐时pH降低。当分离株和硝酸盐一起添加时，pH下降明显更少(p<0.05)，并且对于某些分离株来说它甚至升高(例如D3T4，图11G)。
31.向具有正常口腔NRC的供体(D2)添加分离株
当使用具有更低唾液pH(在将唾液与BHI生长培养基1:1混合之前pH 6.8)的供体D2的唾液进行相同的实验时，显示出在存在或不存在分离株的情况下当添加硝酸盐时pH升高(图11C)。在一种情况下(D3T4)，一起添加分离株和硝酸盐比单独的硝酸盐提高pH更多。出乎意料地是，对于该供体来说，与对照条件相比没有硝酸盐的分离株似乎也阻止pH下降。
使用硝酸盐生长的D2的生物膜在5h 30min后几乎还原所有的硝酸盐，甚至在没有添加分离株时也是。这表明供体具有良好的硝酸盐还原能力，并且单独添加硝酸盐足以促进它的还原。
在两位供体的情况下，当将所有分离株分组在一起时，与不存在硝酸盐相比在存在硝酸盐的情况下pH明显更高(p<0.05)。观察铵，对于两位供体来说在所有条件下铵的浓度相近，并且没有观察到显著变化(图11D&H)。解释当硝酸盐被还原时阻止pH下降的其他因素是乳酸盐消耗和明显的一氧化氮产生，正如在实施例1中所观察到的。
结论
32.选择将大部分亚硝酸盐进一步还原成其他化合物的分离株作为对抗口腔疾病的潜在益生菌，这是因为考虑到了可以产生作为抗微生物化合物(特别是对抗严格厌氧菌)的一氧化氮，并且也可以产生氨(其将缓冲酸性pH)。根据分离株将亚硝酸盐还原成其他化合物时的pH水平选择优选的应用，即总体口腔健康(所有pH水平：D1P15A、D4P7、D4T9)、龋齿(酸性pH：D1P10、D4T6)或牙周病和口臭(中性至微碱性pH：D1P7、D3T4)。产生最多亚硝酸盐的分离株(D1P17、D3T4、D4T4、D5T11A)被认为适合于通过亚硝酸盐摄入提高全身一氧化氮水平。已显示这具有广泛的益处，包括降低血压、改善内皮功能、提高运动表现和逆转代谢综合征，以及抗糖尿病作用(Lundberg等，2018)。重要的是，也在不同pH水平下单独测试了分离株。当向口腔生物膜添加分离株时，其他细菌可以进一步还原亚硝酸盐，这可以产生局部益处和口腔疾病的预防。除了一氧化氮之外还可以产生可预防龋齿的发展的铵，如实施例1中所述。
33.所有这些结果共同表明，在不同个体的口腔中可以发现不同类型的硝酸盐还原细菌。这些还原硝酸盐的分离株可以用作益生菌和共生体(即益生菌和作为益生元的硝酸盐的来源)，旨在提高硝酸盐还原能力受损的个体的硝酸盐和亚硝酸盐还原能力，正如上述D25所示。硝酸盐和亚硝酸盐还原能力的提高可以改善口腔和心血管健康，但对于某些个体来说，单独的硝酸盐可能足以实现健康相关状态，正如在上述实施例中个体D2所示。因此，可以根据给定个体的NRC来指导使用作为益生元的硝酸盐、还原硝酸盐的益生菌或共生体(益生元+益生菌)的个性化治疗。
实施例4：产品和给药形式
4.1.富含硝酸盐的植物提取物补充剂应用(直接和间接效果)
参加者在早晨像往常一样刷牙。然后，从含有92g甜菜根提取物/维生素C/钼补充剂(表5)的罐子中，通过用随罐子提供的塑料勺并填充它直至25ml线，来取出11.5g的剂量。将所述药剂溶解在200ml水中，混合并摄食。补充剂的剂量含有250mg天然存在于甜菜根提取物中的硝酸盐(低于70kg成年人的259mg ADI)和当前成人每日推荐剂量的维生素C(80mg)和钼(50μg)。维生素C是一种刺激亚硝酸盐还原成一氧化氮的抗氧化剂，防止形成有毒的N-亚硝基化合物，而钼是细菌硝酸盐还原酶的辅因子。这些分子的组合刺激反硝化，特别是在缺乏这些营养物的个体中。在两位个体中，在5小时内，每小时测量硝酸盐，并且在整个时间段内唾液硝酸盐浓度保持在高位。在实施例2中，12位个体服用这种补充剂，与安慰补充剂相比，其在所有个体中在1.5h后提高硝酸盐和亚硝酸盐水平，并防止由糖漱口引起的pH下降。安慰补充剂具有相同的组成，区别在于甜菜根提取物被相同重量的橙提取物(即具有不显著硝酸盐含量的植物，图8)代替。
这种产品每日以单剂，优选在早晨，以作为植物提取物粉的食品补充剂的形式提供，并提供即时效果(在1小时内，由于在吞咽期间硝酸盐保留在口腔中)和由硝酸盐再循环造成的急性但间接的效果(1至6小时之间)，在此期间减少餐后pH的下降，并因此提供针对口腔疾病(例如龋齿)的保护。
表5：甜菜根补充剂组成
Figure BDA0003777929340000861
4.2.每日剂量的咀嚼片剂应用(直接和间接)
含有硝酸盐(如果1剂的话222mg，如果2剂的话111mg，如果3剂的话74mg)的咀嚼片剂(1g)每日在早晨早餐和口腔护理后通过咀嚼并吞咽来摄取，如果分成两剂的话，也在午餐后摄取，并且如果分成三剂的话，也在当天结束时在晚餐和口腔护理后摄取。1、2或3剂片剂的某些变体也分别含有80mg、40mg或26.67mg维生素C，和/或50μg、25μg或16.67μg钼。最后，所述片剂的某些变体含有每日可接受量的可商购抗氧化剂，其被分到1、2或3剂中。为了选择分子的最佳组合和量，测试了不同片剂。这种产品理想地在摄取后0-6h的时间段内获得对口腔疾病的急性直接和间接效果。
4.3.抗龋齿咀嚼片剂应用(直接和间接)
含有74mg硝酸盐的片剂(1g)通过在进餐前吞咽来摄取。每天最多可以摄取3个片剂，并且推荐在三餐或含糖最多的零食之前1h摄取它们，优选地在一天的不同时段(早晨、中午和晚上)各摄取一剂。基于实施例4.2添加其他分子。这种产品理想地在摄取后1-6h的时间段内获得对口腔疾病的急性间接效果，以及改善受到一氧化氮缺乏影响的所有健康状况。
4.4.口香糖应用(直接和间接)
含有37mg硝酸盐的口香糖(1g)通过在进餐前吞咽来摄取。每天最多可以摄取6块口香糖，并且推荐在进餐或零食后立即摄取它们，优选地在一天的不同时段(早晨、中午和晚上)摄取至少一块。基于实施例4.2添加其他分子。这种产品理想地在摄取后1-6h的时间段内获得对口腔疾病的急性间接效果，以及改善受到一氧化氮缺乏影响的所有健康状况。
4.5.牙膏应用(直接)
0.3g的牙膏剂量含有74mg硝酸盐、26.67mg维生素C和16.67μg钼和基于实施例4.2的其他分子，其被个体像正常一样使用，但每天刷牙不超过三次。这种产品与标准牙膏一样，在刷牙时通过与牙齿和牙龈接触来给药，提供了硝酸盐直接向口腔生物膜的局部施用，一部分硝酸盐也保留在口腔中，直至唾液清除作用将它消除。推荐在施用后不漱口。
4.6.漱口水应用(直接)
15ml漱口水含有(在总体积中111mg硝酸盐)，进行10s的漱口，由此向舌头、牙齿、口腔粘膜和牙龈提供硝酸盐产品的局部施用，因此硝酸盐被直接提供到口腔生物膜，一部分所述硝酸盐也保留在口腔中，直至唾液清除作用将它消除。推荐在施用后不漱口，并且通过每天使用漱口水超过两次，不超过60kg成年人的222mg的ADI(或每kg体重3.7mg硝酸盐)。
4.7.用于牙周袋的口腔凝胶剂应用(直接)
颊粘附凝胶由专业人员使用注射器施用到牙周病患者的牙周袋内，含有浓度为222mg的硝酸盐分到所有牙周袋中，并含有或不含还原硝酸盐的益生菌。在优选的制剂中，所述凝胶也含有钼+维生素C。它在患者的基线、治疗和随访时施用到牙周袋内部作为初始治疗。推荐在施用后1小时不吃不喝。可以联合维持治疗，其中在早晨提供每日硝酸盐补充剂或片剂，持续1至4周。当所述组合物包含益生细菌时，不推荐将所述产品用于免疫抑制的患者。
4.8.每日剂量的胶囊或丸剂应用(间接)
含有硝酸盐(如果1剂的话222mg，如果2剂的话111mg，如果3剂的话74mg)的胶囊(1g)每日在早晨早餐和口腔护理前通过摄食来摄取，如果分成两剂的话，也在午餐前摄取，并且如果分成三剂的话，也在当天结束时在晚餐和口腔护理前摄取。1、2或3剂胶囊的某些变体也分别含有80mg、40mg或26.67mg维生素C和/或50μg、25μg或16.67μg钼。最后，所述胶囊的某些变体含有每日可接受量的可商购抗氧化剂，其被分到1、2或3剂中。为了选择分子的最佳组合和量，测试了不同的胶囊。这种产品理想地用于在摄取后0-6h的时间段内获得对口腔疾病的急性直接和间接效果。
4.9.益生菌应用
还原硝酸盐的益生菌以冻干形式，与维生素C和钼以及增稠剂一起提供。将这种产品与水混合，并使用套管施用在牙齿中5-30分钟，以允许牙齿生物膜的细菌定植。这种产品在晚上，在标准的口腔护理之后至少30分钟施用，在施用后至少1小时避免进食或饮水。这特别适合于治疗和预防牙科疾病(龋齿或牙龈疾病)。在另一种优选施用模式中，将益生菌制剂施用到舌头1-5分钟，这特别适合于治疗口臭。这种产品不推荐用于免疫抑制的患者。
4.10.用于在重症监护室静脉内施用的肠胃外营养物(间接)
向在重症监护室(ICU)中的患者提供用于静脉内施用的肠胃外营养物(35ml/kg体重/天)，其含有患者依赖性营养物、222mg硝酸盐和80mg维生素C。ICU中的患者患有炎症、龋齿和口臭，并且这些病症在他们抵达ICU时迅速恶化。向肠胃外营养物添加硝酸盐阻止了这些病症中的一者或多者的发展。
4.11.用于儿童和成人的含糖糖果
使用了不同类型的糖果，包括小熊软糖或其他动物软糖(每个动物软糖2-5g)和其他基于明胶或果胶的糖果(2-25g)、小棒棒糖(每根棒棒糖4-25g)、大棒棒糖(每根棒棒糖25-150g)、巧克力和块状糖(20-70g)、口香糖或泡泡糖(1-5g)、金币巧克力和其他巧克力(2-50g)、甘草糖(2-25g)、花生酱糖果(2-25g)、焦糖糖果(2-25g)、水果味硬糖和耐嚼糖果(2-25g)、牛轧糖(20-70g)、太妃糖(4-25g)、奶糖(4-25g)、糖果棒(4-25g)、棉花糖(2-20g)、心形糖果(2-20g)和其他类型的糖果。以硝酸盐或植物提取物的形式向上述糖果添加不同量的硝酸盐，以获得每颗糖果100微克至222毫克的最终硝酸盐量。有时将硝酸盐和植物提取物与维生素C和/或可商购的抗氧化剂(如实施例4.1-4.10中所述)组合。为了找到糖与硝酸盐之间的最佳平衡，以在食用糖时获得防止唾液和口腔生物膜酸化的pH缓冲效果(如在实施例1和2中观察到的)，施用具有不同量的硝酸盐的每种糖果。在某些情况下，将推荐每日剂量的钼和铜的一部分作为辅因子添加到每种糖果，以改善因硝酸盐还原而产生的pH缓冲效果和抗微生物效果。
4.12.含有淀粉和糖的产品
向其他含有淀粉和糖的产品添加硝酸盐(每份100微克至222微克)，并且在某些情况下添加硝酸盐和辅因子(如实施例4.11中所述)，以限制它们的致龋潜力。这些产品包括面包、蛋糕、饼干、干果、水果饮料、果汁、冰淇淋、面条、米饭、加糖谷物、加糖运动饮料、蛋白质棒、预制汤、谷物棒、水果罐头、(低脂)酸奶、烧烤酱、番茄酱、意大利面酱和其他酱料、加糖汽水和其他加糖饮料，以及添加到茶、咖啡和其他产品中的糖本身。
4.13.宠物和牲畜食品和零食
在人类之外的哺乳动物包括猫、狗、马、奶牛、猪、山羊、绵羊、驴、水牛、公牛、美洲驼和骆驼中，使用含有硝酸盐补充剂的其他实施方式来改善口腔健康(例如治疗口臭、牙龈疾病、牙石或龋齿)或作为口腔疾病和一氧化氮相关的全身疾病的预防策略。向适合于动物食用的不同产品添加硝酸盐(推荐剂量为每kg动物体重1.43微克至3.3微克)以及在某些情况下，添加硝酸盐和辅因子。对于狗和猫来说，这些产品是干粮和湿粮、咀嚼物、饼干、牙棒、湿零食和其他零食。对于马、奶牛、猪、山羊、绵羊、驴、水牛、公牛、美洲驼和骆驼来说，这些产品是干粮、盐块、水果块、饼干和其他零食。将硝酸盐以硝酸盐或植物提取物的形式添加到上述食品，以获得每份食品或零食100微克至222微克的最终硝酸盐量。
4.14.在用于口腔健康的产品中低每日剂量的硝酸盐
生产了具有低剂量硝酸盐的所有实施例4.1-4.12所记载的局部施用产品，使得在每天使用产品一次或几次后施用或摄入的硝酸盐的总量仍远低于ADI(例如每天100微克至74微克硝酸盐)，但足以高为口腔健康提供有益效果。所述有益的口腔效果从第一剂开始。然而，实施由在一周或几周或几个月内每日给药构成的治疗计划，以获得对硝酸盐还原能力改善的累积效果，以及口腔生物膜中健康相关硝酸盐还原细菌(例如罗氏菌属物种(Rothia spp.)和奈瑟氏菌属物种(Neisseria spp.))的增加和疾病相关细菌(例如变形链球菌(Streptococcus mutans)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis))的减少。
4.15.舌膏应用(直接)
0.3、0.5或1g的舌膏剂量含有111mg硝酸盐，并且在某些情况下基于实施例4.2还含有40mg维生素C、25μg钼、0.5mg铜和/或其他分子，它们被个体使用，所述个体根据指示用牙刷或舌刷每天刷舌头两次，每次3分钟。为了提高有益的口腔效果和全身一氧化氮水平，推荐在施用后不漱口。
4.16.含有硝酸盐的牙线(直接)
牙线涂层有111mg硝酸盐/50cm，并且在某些情况下基于实施例4.2还具有40mg维生素C/50cm、25μg钼/50cm、0.5mg铜/50cm和/或其他分子，它们被个体使用，所述个体根据指示像往常一样用牙线清洁牙齿，不超过推荐的每日两次牙线清洁。
实施例5：硝酸盐还原能力(NRC)的确定
有经验的牙科医生评估20位参加者的口腔健康。没有检测到活跃龋齿和任何牙周炎病史，并且所有参加者被认为是口腔健康的。此外，在参加者中未报告全身性疾病，也没有检测到高血压。要求供体在早晨停止口腔护理和早餐(只允许饮水)，并在早9点左右捐献～4ml唾液。制备两个Eppendorf管的含有8mM硝酸盐的唾液(450μl唾液和50μl无菌80mM硝酸盐水溶液)。将一管直接在-20℃冷冻，另一管在37℃温育2小时。如实施例1中所述测量硝酸盐，并比较两个时间点以确定已还原多少mg/l。
平均112.20mg/l(SD 87.43mg/l)的硝酸盐被还原(中位数：91mg/l)。将不同参加者中2h后还原的硝酸盐(NO3R2h)分成三分之一百分位数(33.33％)和三分之二百分位数(66.67％)，其分别为56mg/l和176mg/l(表6)。当表示为检测到的初始硝酸盐的百分位数时，这分别为15％和35％(表6)。然后，将受试者划分成不良硝酸盐还原者(低于57mg/l)、中等硝酸盐还原者(在57-175mg/l(含)之间)和良好硝酸盐还原者(高于175mg/l)，在每个组中分别具有8、6和6位参加者。
表6.NRC1：基于三分法的划分
Figure BDA0003777929340000921
实施例6：离体研究-硝酸盐对人类牙周炎患者的口腔生物膜生长的影响
除了在实施例1中提供的来自于健康个体的口腔生物膜之外，使用生态失调群落(来自于牙周炎患者的龈下菌斑样品)进行了离体实验。11位被诊断为患有牙周炎的患者被纳入研究。通过在最深的牙周袋中插入8至10根无菌纸尖来收集龈下菌斑。然后将所述纸尖转移到含有还原运输介质(RTF)的2mL试管中，并在4℃左右的冷藏箱中储存最多18小时。对于生物膜生长来说，使用含有维生素K和血红素的BHI(如实施例1中所述)。通过离心除去运输介质(1min，12000rpm)，然后重悬浮在1mL BHI中。使用在实施例1中记载的xCELLigence系统。将患者样品在四种不同条件下温育：对照、硝酸盐、对照+益生菌和硝酸盐+益生菌。首先，向孔添加100μl在BHI中的牙周菌斑。然后，对于硝酸盐条件，向孔添加5μl BHI中的250mM硝酸盐，以获得5mM硝酸盐浓度。对于对照+益生菌和硝酸盐+益生菌条件，向孔添加45μlOD(600nm)＝0.417的空间罗氏菌(R.aeria)D1P7培养物，导致每个孔的最终OD(600nm)为0.075。添加BHI以达到250μl的终体积。使用含有硝酸盐的培养基对照(不含患者样品或益生菌)(Cntr)来确定培养基中硝酸盐和亚硝酸盐的初始量。在温育7小时后，收获上清液和生物膜，分别用于硝酸盐/亚硝酸盐测量和16S rRNA基因测序(两者均记载在实施例1中)。
在该实验中，向样品添加6.5mM硝酸盐改善了生物膜组成，降低了牙周病原菌例如卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、艾肯菌属(Eikenella)和坦纳菌属(Tannerella)等的水平(图13A)。然而，当施用共生治疗(即作为益生元的硝酸盐与作为益生菌的空间罗氏菌(Rothia aeria)D1P7一起)时，实现了细菌组成的高效改善，其中罗氏菌属(Rothia)(有益物种)显著增加并且包括梭杆菌属(Fusobacterium)、依赖杆菌属(Fretibacterium)和密螺旋体属(Treponema)在内的牙周病原菌显著减少(图13B)，这示出了生态失调被逆转。因此，使用共生治疗减少了更多牙周病原菌，并且与仅添加硝酸盐时的结果相比所述减少更大。这种进一步改善是由于像在牙周袋中的那些高度生态失调的细菌群落中硝酸盐还原细菌的水平低，使得益生菌的添加高度有效。当在物种分类水平上分析样品时观察到了相同的结果，其中与仅仅硝酸盐的治疗相比在共生治疗中牙周病原体的减少更大(图13C和13D)。从该实验可得出结论，来自于纯培养物的结果不能预见硝酸盐或硝酸盐还原细菌对复杂口腔生物膜的影响。相反，所述影响需要在真实的生物样品即生态失调的细菌口腔生物膜中测试。当分析硝酸盐还原能力时，也看到了硝酸盐+益生菌治疗与单独的硝酸盐相比同样优异的益处。在硝酸盐治疗中，在这些牙周样品中生长7小时后20％左右的硝酸盐被还原。当硝酸盐与益生菌空间罗氏菌(Rothia aeria)D1P7一起施用时，90％的硝酸盐被还原，这表明尽管两种治疗都使得硝酸盐还原，但共生治疗优越(图14A)。在测量产生的亚硝酸盐时，硝酸盐+益生菌治疗为在只添加硝酸盐时得到的值的三倍(图14B)。因此，添加硝酸盐改善生态失调和还原硝酸盐的能力，而添加硝酸盐加上本申请中记载的益生菌之一在几位患者中进一步逆转生态失调并恢复硝酸盐还原能力。
此外，与对照条件(C)相比，在硝酸盐条件(N)中牙周炎生物膜的平均生长曲线更低。这示出在图14C-F中，其显示了所有11位患者的平均生长曲线(图14C)和三位个体患者的不同类型的曲线(图14D-F)。这显示了硝酸盐对生态失调生物膜具有抗生物膜积累效果(或抗菌斑效果)。总而言之，在该实施例中，我们表明了硝酸盐减少生态失调，而且也减少生物膜的量(即牙菌斑)。
实施例7：来自于实施例2中收集的人类样品的细菌的鉴定(体内研究–硝酸盐向健康人类个体的口服给药)
使用在实施例2中收集的口腔样品，通过16S rRNA基因Illumina测序(如实施例1点6.1-6.3中记载的方法)确定细菌组成。数据显示，在摄入220mg硝酸盐补充剂后4小时，人类受试者显示出硝酸盐还原细菌罗氏菌属(Rothia)和奈瑟氏菌属(Neisseria)的增加和包括韦荣氏球菌属(Veillonella)、奇异菌属(Atopobium)或Oribacterium的几种龋齿病原体的减少，以及包括小杆菌属(Dialister)、依赖杆菌属(Fretibacterium)、Saccharimonas、密螺旋体属(Treponema)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、新月形单胞菌属(Selenomonas)、普氏菌属(Prevotella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)和梭杆菌属(Fusobacterium)的牙周和口臭病原体的减少(图15A)。物种水平上的结果证实了其中许多龋齿相关、牙周炎相关和口臭相关的物种减少的结果(图15B)。这证实了单剂摄入的硝酸盐在体内减少口腔牙周和口臭病原体。此外，显示了在实施例1和6中使用的复杂多物种生物膜模型中的结果通过实施例2和7中的体内数据得以确认。这强调了使用耐抗且代表性的生物膜模型重现口腔中的真实条件的重要性，这与单物种纯培养相反，后者的结果不能外推到复杂的口腔微生物群落。
实施例8：在实施例3中鉴定到的硝酸盐还原物种的表征
将100％的亚硝酸盐当作所有样品中存在的最高亚硝酸盐水平，进行了实施例3中产生的亚硝酸盐和一氧化氮的另一项更简单的计算。结果示出了不同分离株的亚硝酸盐和一氧化氮的估算水平以及它们的潜在应用(表7)。重要的是，所有益生菌均还原硝酸盐并产生亚硝酸盐和亚硝酸盐的还原产物(例如一氧化氮和/或氨)。因此，所有益生菌都适合于治疗所有不同病症(即龋齿、牙周病、口臭、心血管疾病和其他全身性病症)，但某些菌株可能比其他菌株更高效地治疗一种病症。
表7.使用6.5mM硝酸盐在不同pH下生长5h的分离株产生的亚硝酸盐和一氧化氮。计算是基于检测到的最高亚硝酸盐浓度为100％。
Figure BDA0003777929340000951
Figure BDA0003777929340000961
Figure BDA0003777929340000971
*高于中位数的数字
*1在培养物保藏中心登记并包含在本专利中
*2一氧化氮和可能从亚硝酸盐还原产生的其他化合物(例如铵)
*3注意所有益生菌都可用于改善所有提高的病症，因为硝酸盐还原刺激总体口腔和全身性健康。
*4由于蛋白质降解，口臭也在中性至碱性pH下发生，并且可以施用与对牙周病建议的相同的益生菌。
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序列表
110 瓦伦西亚地区促进健康与生物医学研究基金会
120 减轻口腔生态失调和促进生态平衡的益生元和益生菌治疗
130 PD10205PC00
160 11
170 BiSSAP 1.3.6
210 1
211 752
212 RNA
213 Rothia dentocariosa
220
223 D1P7 CECT9999
400 1
taatcctgtt cgctccccat gctttcgctt ctcagcgtca gttacagccc agagacctgc 60
cttcgccatc ggtgttcctc ctgatatctg tgcattccac cgctacacca ggaattccag 120
tctcccctac tgcactctag ttagcccgta cccactgcaa aaccggagtt aagccccggc 180
ctttcacagc agacgcgacc aaccgcctac aagctcttta cgcccaataa ttccggacaa 240
cgctcgcgcc ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccggcg ctttctctgc 300
acctaccgtc actttcgctt cttcgatgct aacagaggtt tacaacccga aggccgtcat 360
ccctcacgcg gcgtcgctgc atcaggcttg cgcccattgt gcaatattcc ccactgctgc 420
ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccggtcaccc tctcaggccg 480
gctacccgtc gtcgccttgg taagccatta cctcaccaac aagctgatag gccgtgagcc 540
catctaaaac cactccataa cgctttccac caacacccca tgcagagatt ggtcgtatcc 600
ggtattagac ccagtttccc aggcttatcc cagagtcaaa ggtaggtcac tcacgtatta 660
ctcacccgtt cgccactaat ccacggtgca agcaccgctt catcgttcga cttgcatgtg 720
ttaagcacgc cgccagcgtt cgtcctgagc ct 752
210 2
211 752
212 RNA
213 Rothia aeria
220
223 D1P17 CECT30000
400 2
ctaatcctgt tcgctcccca tgctttcgct tctcagcgtc agttacagcc cagagacctg 60
ccttcgccat cggtgttcct cctgatatct gcgcattcca ccgctacacc aggaattcca 120
gtctccccta ctgcactcta gttagcccgt acccactgca aaaccagggt taagccccag 180
cctttcacag cagacgcgac caaccgccta caagctcttt acgcccaata attccggaca 240
acgctcgcgc cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggc gctttctctg 300
cacctaccgt cactttcgct tcttcgatgc taacagaggt ttacaacccg aaggccgtca 360
tccctcacgc ggcgtcgctg catcaggctt gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg 420
cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccggtcacc ctctcaggcc 480
ggctacccgt cgtcgccttg gtaagccatt acctcaccaa caagctgata ggccgtgagc 540
ccatctaaaa ccactccata acgctttcca ccaacacccc atgcggagat tggtcatatc 600
cggtattaga cccagtttcc caggcttatc ccagagtcaa aggtaggtca ctcacgtatt 660
actcacccgt tcgccactaa tccacctagc aagctaggct tcatcgttcg acttgcatgt 720
gttaagcacg ccgccagcgt tcgtcctgag ca 752
210 3
211 752
212 RNA
213 Rothia mucilaginosa
220
223 D3T4 CECT30001
400 3
taatcctgtt cgctccccat gctttcgctt ctcagcgtca gttacagccc agagacctgc 60
cttcgccatc ggtgttcctc ctgatatctg cgcattccac cgctacacca ggaattccag 120
tctcccctac tgcactctag tctgcccgta cccactgcaa tacacggagt taagctccgg 180
cctttcacag cagacgcgac aaaccgccta caagctcttt acgcccaata attccggaca 240
acgctcgcgc cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggc gctttctctg 300
caggtaccgt caatctctct tcttccctgc taacagaggt ttacaacccg aaggccgtca 360
tccctcacgc ggcgtcgctg catcaggctt gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg 420
cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccggtcacc ctctcaggcc 480
ggctacccgt cgtcgccttg gtgagccatt acctcaccaa caagctgata ggccgtgagc 540
ccatctataa ccactacata acgctttcca ccaacacccc atgcggagat tggtcgtatc 600
cggtattaga cccagtttcc caggcttatc ccagagttaa aggtaggtta ctcacgtatt 660
actcacccgt tcgccactaa tccacctagc aagctaggct tcatcgttcg acttgcatgt 720
gttaagcacg ccgccagcgt tcgtcctgag ca 752
210 4
211 748
212 RNA
213 Rothia mucilaginosa
220
223 D4T4 CECT30002
400 4
taatcctgtt cgctccccat gctttcgctt ctcagcgtca gttacagccc agagacctgc 60
cttcgccatc ggtgttcctc ctgatatctg cgcattccac cgctacacca ggaattccag 120
tctcccctac tgcactctag tctgcccgta cccactgcaa tacacggagt taagctccgg 180
cctttcacag cagacgcgac aaaccgccta caagctcttt acgcccaata attccggaca 240
acgctcgcgc cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggc gctttctctg 300
caggtaccgt caatctctct tcttccctgc taacagaggt ttacaacccg aaggccgtca 360
tccctcacgc ggcgtcgctg catcaggctt gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg 420
cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccggtcacc ctctcaggcc 480
ggctacccgt cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa caagctgata ggccgtgagc 540
ccatctataa ccactacata acgctttcca ccaacacccc atgcggagat tggtcgtatc 600
cggtattaga cccagtttcc caggcttatc ccagagttaa aggtaggtta ctcacgtatt 660
actcacccgt tcgccactaa tccacctagc aagctaggct tcatcgttcg acttgcatgt 720
gttaagcacg ccgccagcgt tcgtcctg 748
210 5
211 752
212 RNA
213 Rothia mucilaginosa
220
223 D4T6 CECT30003
400 5
taatcctgtt cgctccccat gctttcgctt ctcagcgtca gttacagccc agagacctgc 60
cttcgccatc ggtgttcctc ctgatatctg cgcattccac cgctacacca ggaattccag 120
tctcccctac tgcactctag tctgcccgta cccactgcaa tacacggagt taagctccgg 180
cctttcacag cagacgcgac aaaccgccta caagctcttt acgcccaata attccggaca 240
acgctcgcgc cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggc gctttctctg 300
caggtaccgt caatctctct tcttccctgc taacagaggt ttacaacccg aaggccgtca 360
tccctcacgc ggcgtcgctg catcaggctt gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg 420
cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccggtcacc ctctcaggcc 480
ggctacccgt cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa caagctgata ggccgtgagc 540
ccatctataa ccactacata acgctttcca ccaacacccc atgcggagat tggtcgtatc 600
cggtattaga cccagtttcc caggcttatc ccagagttaa aggtaggtta ctcacgtatt 660
actcacccgt tcgccactaa tccacctagc aagctaggct tcatcgttcg acttgcatgt 720
gttaagcacg ccgccagcgt tcgtcctgag ca 752
210 6
211 752
212 RNA
213 Rothia mucilaginosa
220
223 D4T9 CECT30004
400 6
gtaatcctgt tcgctcccca tgctttcgct tctcagcgtc agttacagcc cagagacctg 60
ccttcgccat cggtgttcct cctgatatct gcgcattcca ccgctacacc aggaattcca 120
gtctccccta ctgcactcta gtctgcccgt acccactgca atacacggag ttaagctccg 180
gcctttcaca gcagacgcga caaaccgcct acaagctctt tacgcccaat aattccggac 240
aacgctcgcg ccctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgg cgctttctct 300
gcaggtaccg tcaatctctc ttcttccctg ctaacagagg tttacaaccc gaaggccgtc 360
atccctcacg cggcgtcgct gcatcaggct tgcgcccatt gtgcaatatt ccccactgct 420
gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccggtcac cctctcaggc 480
cggctacccg tcgtcgcctt ggtgagccgt tacctcacca acaagctgat aggccgtgag 540
cccatctata accactacat aacgctttcc accaacaccc catgcggaga ttggtcgtat 600
ccggtattag acccagtttc ccaggcttat cccagagtta aaggtaggtt actcacgtat 660
tactcacccg ttcgccacta atccacctag caagctaggc ttcatcgttc gacttgcatg 720
tgttaagcac gccgccagcg ttcgtcctga gc 752
210 7
211 758
212 RNA
213 Rothia mucilaginosa
220
223 D5T11A CECT30005
400 7
gagataatcc tgttcgctcc ccatgctttc gcttctcagc gtcagttaca gcccagagac 60
ctgccttcgc catcggtgtt cctcctgata tctgcgcatt ccaccgctac accaggaatt 120
ccagtctccc ctactgcact ctagtctgcc cgtacccact gcaatacacg gagttaagcc 180
ccggcctttc acagcagacg cgacaaaccg cctacaagct ctttacgccc aataattccg 240
gacaacgctc gcgccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggcgctttc 300
tctgcaggta ccgtcaatct ctcttcttcc ctgctaacag aggtttacaa cccgaaggcc 360
gtcatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gcttgcgccc attgtgcaat attccccact 420
gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccggt caccctctca 480
ggccggctac ccgtcgtcgc cttggtgagc cgttacctca ccaacaagct gataggccgt 540
gagcccatct ataaccacta cataacgctt tccaccaaca ccccatgcgg agattggtcg 600
tatccggtat tagacccagt ttcccgggct tatcccagag ttaaaggtag gttactcacg 660
tattactcac ccgttcgcca ctaatccacc tagcaagcta ggcttcatcg ttcgacttgc 720
atgtgttaag cacgccgcca gcgttcgtcc tgagcaag 758
210 8
211 50
212 DNA
213 Artificial Sequence
220
223 Primer 16S Amplicon F for 16S rRNA determination
220
221 misc_feature
222 42
223 allele=W can be any nucleotide
220
221 misc_feature
222 46
223 allele=W can be A or T
400 8
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
210 9
211 55
212 DNA
213 Artificial Sequence
220
223 Primer 16S Amplicon R for 16S rRNA determination
220
221 misc_feature
222 42
223 allele=V A or C or G
400 9
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
210 10
211 20
212 DNA
213 Artificial Sequence
220
223 Primer 8-F
220
221 misc_feature
222 12
223 allele=M A or C
400 10
agagtttgat cmtggctcag 20
210 11
211 19
212 DNA
213 Artificial Sequence
220
223 Primer 785-R
400 11
ctaccagggt atctaatcc 19

Claims (15)

1.一种包含硝酸盐的组合物，用于通过改变哺乳动物中口腔生物膜的细菌组成及其功能、通过减少疾病相关细菌的量和增加健康相关细菌的量来减少或预防口腔生态失调和/或增强口腔生态平衡，
从而在生物膜介导的口腔疾病的24小时之前获得有效的急性治疗或预防，并且
其中所述组合物被口服给药到所述哺乳动物，从而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度。
2.根据权利要求1所述的所使用的组合物，其中所述给药的硝酸盐：
增加口腔生物膜中选自奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)和金氏菌属(Kingella)的至少一种口腔生物膜的健康相关细菌的量，和/或
减少口腔生物膜中选自链球菌属(Streptococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Oribacterium和奇异菌属(Atopobium)的至少一种口腔生物膜的龋齿相关细菌的量，和/或
减少口腔生物膜中选自卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、普氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)、坦纳菌属(Tannerella)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小杆菌属(Dialister)、真杆菌属(Eubacterium)、微单胞菌属(Parvimonas)、新月形单胞菌属(Selenomonas)和Solobacterium的至少一种口腔生物膜的牙周病/口臭相关细菌的量。
3.根据权利要求1-2中的任一项所述的所使用的组合物，其中所述生物膜介导的口腔疾病选自牙周病、口臭和龋齿。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的所使用的组合物，
其中所述组合物是选自下述的局部施用的组合物：
-牙膏；
-嗽口水；
-口腔凝胶剂；
-食物提取物；
-口香糖；
-咀嚼片剂；和
-补充粉剂；或者
其中所述组合物是选自下述的摄入的组合物：
-片剂、丸剂或胶囊；
-食物提取物；
-口香糖；
-咀嚼片剂；
-补充粉剂；和
-静脉内施用的肠胃外营养物。
5.根据权利要求4所述的所使用的组合物，其中所述组合物是食品补充剂，其包含富含硝酸盐的植物提取物(甜菜根提取物)；抗氧化剂和/或硝酸盐还原酶酵素辅因子(钼、钼盐或富含钼的植物提取物)。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的所使用的组合物，其中，给药所述组合物后口腔中的唾液硝酸盐浓度高于空腹唾液水平：
当所述组合物是局部施用的组合物时，给药后30s至少0.1mM，
当所述组合物是摄入的组合物时，给药后1.5h至少0.1mM。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的所使用的组合物，其中每剂组合物中硝酸盐的量为，当所述组合物是局部施用的组合物时至少3微克，当所述组合物是摄入的组合物时至少12微克。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的所使用的组合物，其与属于罗氏菌属(Rothia)的至少一种细菌菌株联合给药，其中所述罗氏菌属(Rothia)细菌菌株：
a)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中以0.01的光密度(OD)开始在37℃温育7h后，还原100％的硝酸盐；
b)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中以0.01的OD开始在37℃温育4h后，还原超过15％的硝酸盐；
c)在以0.01的OD开始在37℃温育7h后，不将含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基的pH降低到低于pH 6.8；
d)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中以0.01的OD开始在37℃生长7h后，生长到光密度超过0.7；并且
e)当添加1：1的BHI中的罗氏菌属(Rothia)细菌菌株(OD0.40)：唾液接种物时，能够在37℃下在5h内定植于由人类唾液生长的体外口腔生物膜，在所述形成的生物膜中达到超过总细菌的10％的比例。
9.根据权利要求8所述的所使用的组合物，其中所述细菌菌株选自在登记号CECT9999、CECT 30000、CECT 30001、CECT 30002、CECT 30003、CECT 30004和CECT 30005下保藏在西班牙典型培养物保藏中心(Spanish Type Culture Collection)(CECT)的菌株。
10.一种包含细菌菌株的组合物，所述细菌菌株选自在登记号CECT 9999、CECT 30000、CECT 30001、CECT 30002、CECT 30003、CECT 30004和CECT 30005下保藏在西班牙典型培养物保藏中心(Spanish Type Culture Collection)(CECT)的菌株或其组合。
11.根据权利要求10所述的组合物，其用于预防或治疗选自牙周病、口臭和龋齿的生物膜介导的口腔疾病。
12.一种包含硝酸盐的组合物，其用于治疗或预防口臭，并且其中所述组合物被口服给药到哺乳动物，从而提高口腔唾液中的硝酸盐浓度。
13.一种组合物，其包含硝酸盐和/或属于罗氏菌属(Rothia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或金氏菌属(Kingella)的细菌菌株，用于通过急剧增加口腔生物膜中硝酸盐还原细菌的量来提高哺乳动物的硝酸盐还原能力，从而获得从一氧化氮供应获益的疾病或病态的治疗或预防。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述细菌菌株属于罗氏菌属(Rothia)并且其中所述罗氏菌属(Rothia)细菌菌株：
a)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中在37℃温育7h后，还原100％的硝酸盐；
b)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中在37℃温育4h后，还原超过15％的硝酸盐；
c)在37℃温育7h后，不将含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基的pH降低到低于pH 6.8；
d)在含有6.5mM硝酸盐的BHI培养基中在37℃生长7h后，生长到光密度超过0.7；并且
e)当添加1：1的罗氏菌属(Rothia)细菌菌株：唾液接种物时，能够在37℃下在5h内定植出由人类唾液生长的体外口腔生物膜，以在所述形成的生物膜中达到超过总细菌的10％的比例。
15.一种为生物膜介导的口腔疾病或从一氧化氮供应获益的疾病或病态选择治疗性治疗或预防策略的方法，所述方法包括：
i)测量口腔样品中受试者的硝酸盐还原能力；
ii)根据所述受试者的硝酸盐还原能力程度将所述受试者分类，其中当硝酸盐还原能力通过向0.45ml空腹口腔样品添加0.05ml80 mM硝酸盐以达到0.5ml的终体积和8mM的硝酸盐终浓度并在37℃温育2小时来测量时，
ii.1)相对于未温育的口腔样品，硝酸盐量的减少低于57mg/l示出不良的硝酸盐还原能力，
ii.2)相对于未温育的口腔样品，硝酸盐量的减少在57mg/l(含)至175mg/l(含)之间示出中等的硝酸盐还原能力，并且
ii.3)相对于未温育的口腔样品，硝酸盐量的减少高于175mg/l示出良好的硝酸盐还原能力；以及
iii)根据所述硝酸盐还原能力来选择治疗性治疗或预防策略，其中：
iii.1)将具有不良硝酸盐还原能力的受试者用包含硝酸盐和属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物给药，
iii.2)将具有中等硝酸盐还原能力的受试者用包含硝酸盐和/或属于罗氏菌属(Rothia)或奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌菌株的组合物给药，并且
iii.3)将具有良好硝酸盐还原能力的受试者用包含硝酸盐的组合物给药。
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