CN115792001A

CN115792001A - 一种利用hplc测定匹伐他汀叔丁酯有关物质的分析方法

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Publication number: CN115792001A
Application number: CN202211383828.0A
Authority: CN
Inventors: 陆海波; 吴晓桐; 郭美丽; 王冉; 刘凡
Original assignee: Jiangsu Wanbang Biopharmaceutical Group Co ltd; Xuzhou Wanbang Jinqiao Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wanbang Biopharmaceutical Group Co ltd; Xuzhou Wanbang Jinqiao Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2022-11-07
Filing date: 2022-11-07
Publication date: 2023-03-14

Abstract

本发明公开一种利用HPLC测定匹伐他汀叔丁酯有关物质分析方法，具体地说涉及一种匹伐他汀叔丁酯及其中4个杂质的HPLC分析方法。本发明方法所述的色谱柱类型和规格、检测波长、流动相类型、流动相比例、运行时间等可快速、简便、准确、高效地洗脱、分离和定量检测匹伐他汀叔丁酯中的各杂质，可实现杂质峰与主峰、杂质与杂质峰之间完全分离，达到最佳检测结果。该分析方法操作方便、运行时间短，专属性强，灵敏度高，稳定性强，在低浓度范围内具有较好的线性曲线，并具有较强的重复性和准确度，不受人员和仪器的影响，稳定可靠，为此类化合物提供了研究开发和质量检测的基础，同时该方法也具有一定的可调变性，普适性强。

Description

一种利用HPLC测定匹伐他汀叔丁酯有关物质的分析方法

技术领域

本发明属于化学药物分析方法领域，特别涉及一种利用HPLC测定匹伐他汀叔丁酯有关物质的分析方法。

背景技术

匹伐他汀钙系日本化学工业株式会社与兴和株式会社共同开发的第三代他汀类药物，于2003年9月在日本上市，2009年3月27日，由北京双鹤药业股份有限公司推出的仿制药匹伐他汀钙片(商品名：冠爽)在我国上市。根据已有的临床试验结果及与国外同类已上市产品的比较可知，匹伐他汀钙是迄今为止最强效的降脂药物，因其用量微小而疗效极好被药学界称为“超级他汀”，现已被列为全球18种销售潜力最大的新药之一，发展前景十分广阔。

(3R,5S,6E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉-基]-3,5-二羟基-6-庚酸叔丁酯，分子式：C₂₉H₃₂FNO₄分子量：477.57，简称匹伐他汀叔丁酯，是匹伐他汀钙的关键中间体。在现有的匹伐他汀钙合成路线中，大部分都需要合成此中间体，匹伐他汀叔丁酯结构式如下：

为保证药品的安全有效，需全面考察药品质量，对药品各步骤的物料进行研究、检测和监控。匹伐他汀叔丁酯作为关键中间体，对其有关物质分析方法的色谱条件进行研究具有重要意义。目前，还没有关于匹伐他汀叔丁酯有关物质分析方法的论述，亟需一种方法对其有关物质进行检测，保障准确有效地监控其质量水平。

发明内容

基于背景技术中存在的技术问题，本发明提出一种匹伐他汀叔丁酯有关物质的分析方法，本发明流动相体系简单、杂质分离度高、检出杂质多、灵敏度高、检出浓度范围低、线性范围好、可调变性强，能准确有效地监控匹伐他汀叔丁酯及其杂质的质量水平。

本发明中名词“匹伐他汀叔丁酯”表示“(3R,5S,6E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉-基]-3,5-二羟基-6-庚酸叔丁酯”。

一种匹伐他汀叔丁酯及其有关物质的定性和/或定量分析方法，所述有关物质为：

杂质A：(3R,5S,E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羟基庚-6-烯酸甲酯，

杂质B：(4R,6S,E)-6-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基-乙烯基]-4-羟基-3,4,5,6-四氢-2H-吡喃-2-酮，

杂质C：(3R,5S,E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3,5-二羟基庚-6-烯酸乙酯，

杂质D：(4R,6S)-6-[[(1E)-2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]乙烯基]-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，

所述方法包括以下步骤：

(1)供试品配制：取待测匹伐他汀叔丁酯供试品，用乙腈稀释样品，配制成0.1～0.5mg/ml的供试品溶液；

(2)对照品配制：取匹伐他汀叔丁酯对照品，用乙腈稀释样品，配制成0.1～0.5mg/ml的供试品溶液；

(3)色谱条件：

色谱柱：化学键合为固定相的色谱柱；

检测波长：220～280nm；

柱温：20～45℃；

进样量：5～20μl；

流速：0.4～1.2ml/min；

流动相：醋酸水溶液为流动相A；乙腈为流动相B；

流动相采用以下方式进行梯度洗脱：

0～8min时间范围内，流动相A的比例保持为30％～50％比例范围内的任一数值，流动相B的比例保持为50％～70％比例范围内的任一数值，流动相A和流动相B总和为100％；

8.01～13min时间范围内，流动相A的比例保持为0％～20％比例范围内的任一数值，流动相B的比例保持为80％～100％比例范围内的任一数值，流动相A和流动相B总和为100％；

13.01～20min时间范围内，流动相A的比例保持为0％～20％比例范围内的任一数值，流动相B的比例保持为80％～100％比例范围内的任一数值，流动相A和流动相B总和为100％；

22.01～30min时间范围内，流动相A的比例保持为30％～50％比例范围内的任一数值，流动相B的比例保持为50％～70％比例范围内的任一数值，流动相A和流动相B总和为100％。

进一步的，所述色谱柱的长度为150-250mm，直径为4.6mm，填料粒径为2～5μm；

优选地，色谱柱的长度为150mm，填料粒径为2.7μm；

进一步优选地，色谱柱为Agilent Phenyl Hexyl色谱柱(150mm*4.6mm，2.7μm)。

进一步的，检测波长为245nm。

进一步的，柱温为40℃。

进一步的，进样量为10μl。

进一步的，流速为1.0ml/min。

进一步的，所述的流动相A为pH为3.0～5.0的醋酸水溶液；

优选地，流动相A为pH为3.8的醋酸水溶液。

进一步的，采用醋酸钠溶液调节流动相A的pH。

进一步的，流动相A中醋酸的体积百分比为0.01％～0.5％，优选地，流动相A中醋酸体积百分比为0.06％。

进一步的，梯度洗脱0～8min时，流动相A的比例为40％；8.01～13min时，流动相A的比例保持为15％；13.01～20min时，流动相A的比例保持为15％；20.01～30min时，流动相A的比例保持为40％。

即使用流动相按下表进行梯度洗脱：

时间	流动相A	流动相B
			0min	40％	60％
8min	40％	60％
			13min	15％	85％
20min	15％	85％
			20.01min	40％	60％
30min	40％	60％

在一种实施例中，对该分析方法按上述色谱条件进行专属性试验。具体步骤为：分别配制稀释剂、匹伐他汀叔丁酯供试溶液、匹伐他汀叔丁酯定位溶液、杂质A定位溶液、杂质B定位溶液、杂质C定位溶液、杂质D定位溶液、供试混合溶液和系统适用性溶液分别进样，其中系统适用性溶液连续进样5次。记录匹伐他汀叔丁酯的出峰时间及与其相邻杂质峰之间的分离度，并计算连续进样5针的盐酸羟胺峰、杂质A峰、杂质B峰、杂质C峰和杂质D峰面积RSD。

在一种实施例中，对该分析方法进行检测限、定量限试验，按上述色谱条件进行洗脱的具体步骤为：分别配制匹伐他汀叔丁酯、杂质A、杂质B、杂质C和杂质D的检测限溶液和定量限溶液分别进样，并分别计算各组分检测限浓度和定量限浓度。

在一种实施例中，对该分析方法进行线性与范围试验，按上述色谱条件进行洗脱的具体步骤为：分别配制匹伐他汀叔丁酯、杂质A、杂质B、杂质C和杂质D的不同浓度的线性溶液(定量限浓度至限度浓度的120％)分别进样，并计算线性方程和线性范围。

在一种实施例中，对该分析方法进行重复性和中间精密度试验，按上述色谱条件进行洗脱的具体步骤为：配制重复性溶液和中间精密度溶液分别进样，并计算各自溶液中匹伐他汀叔丁酯、杂质A、杂质B、杂质C和杂质D的RSD。

在一种实施例中，对该分析方法进行准确度试验，按上述色谱条件进行洗脱的具体步骤为：分别配制杂质A、杂质B、杂质C和杂质D的20％加标回收溶液、40％加标回收溶液和120％加标回收溶液份分别进样，并计算各自溶液的回收率。

在一种实施例中，对该分析方法进行溶液稳定性试验，按上述色谱条件进行洗脱的具体步骤为：配制匹伐他汀叔丁酯系统适用性溶液和供试混合溶液，并分别于配制后0、12、24、36、48h进样，记录匹伐他汀叔丁酯及各杂质的量，并计算与0h的变化值。

本发明技术方案相对于现有技术具有以下有益效果：

本发明人通过对色谱柱类型、流动相类型、洗脱条件、进样器温度、柱温、进样量进行筛选，对匹伐他汀叔丁酯及其杂质含量进行检测，确定了本发明色谱分析方法，并对该方法进行了专属性、定量限、检测限、线性、重复性、中间精密度、准确度和溶液稳定性及方法耐用性进行验证。最终证明本发明提供的高效液相色谱分析方法，定量限可达到0.0101μg/mL，检测限可达到为0.0031μg/mL，灵敏度高，能准确有效地检测匹伐他汀叔丁酯及其杂质的含量，且分析方法专属性强，在低浓度范围内具有较好的线性曲线，并不受人员和仪器的影响，具有较强的重复性和准确度；并且，该检测方法对匹伐他汀叔丁酯及其杂质的洗脱能力强，20分钟内，主峰及杂质峰全部被洗脱，分离度较好。同时使该方法具有一定的可调变性，普适性强。

本发明方法通过综合考虑色谱柱类型和规格、检测波长、流动相类型、流动相比例、运行时间、样品配制和进样量对分离检测的综合影响，使检测结果达到最优化，组分之间的分离达到最优化，具有快速、简便、准确、高效地洗脱、分离和定量检测。分析方法操作方便、运行时间短，专属性强，灵敏度高，稳定性强，为匹伐他汀叔丁酯及其杂质的检测提供了研究开发和质量检测的基础。

附图说明

图1为匹伐他汀叔丁酯系统适用性溶液色谱图；

图2为匹伐他汀叔丁酯供试混合溶液色谱图；

图3为匹伐他汀叔丁酯定量限溶液色谱图；

图4为匹伐他汀叔丁酯检测限溶液色谱图；

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。未特别注明的试剂，均为本领域常规购买的试剂。

实施例1不同色谱柱、不同流动相的对比

高效液相色谱条件：

本实施例分为三组，分别对Welch Ultimate XB-C18色谱柱(250*4.6mm,5μm)、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250*4.6mm,3.5μm)和Agilent Phenyl Hexyl色谱柱(150*4.6mm,2.7μm)采用方法A、B、C进行试验(因三组色谱柱固定相不同，考虑其特性，选用不同的色谱条件)。方法A、B、C见表1，梯度条件同发明内容中的梯度条件。

表1流动相筛选方法对比表

样品配制：

匹伐他汀叔丁酯系统适用性溶液：称取匹伐他汀叔丁酯对照品及各杂质对照品适量，制成每1ml中约含匹伐他汀叔丁酯对照品0.3mg、杂质A 0.6μg、杂质B 0.6μg、杂质C 0.6μg及杂质D 0.6μg的混合溶液。

试验操作：取系统适用性溶液10μl分别进样，记录色谱图。分别使用这3种色谱条件对系统适用性溶液进行检测，结果见表2。

表2色谱条件筛选结果汇总表

从表2可以看出，方法C在主峰与相邻峰的分离度上和组分保留时间上明显优于方法A和方法B。方法C拥有更好的分离度、更短的运行时间。

实施例2专属性验证

高效液相色谱条件：

采用Agilent Phenyl Hexyl色谱柱(150*4.6mm,2.7μm)，以醋酸钠溶液调节的pH为3.8的百分比浓度为0.06％醋酸水溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B，检测波长245nm，流速为1.0ml/min，柱温40℃，进样量10μl，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：

时间	流动相A	流动相B
			0min	40％	60％
8min	40％	60％
			13min	15％	85％
20min	15％	85％
			20.1min	40％	60％
30min	40％	60％

样品配制：

匹伐他汀叔丁酯对照溶液：称取对照品，用乙腈定容至刻度，得每1ml中约含匹伐他汀叔丁酯0.3mg的对照溶液。

匹伐他汀叔丁酯供试溶液：称取供试品，用乙腈定容至刻度，得每1ml中约含匹伐他汀叔丁酯0.3mg的供试溶液。

组分定位溶液：称取各组分对照品适量，分别制成每1ml中约含0.6μg的杂质A定位溶液、每1ml中约含0.6μg的杂质B定位溶液、每1ml中约含0.6μg的杂质C定位溶液、每1ml中约含0.6μg的杂质D定位溶液和每1ml中约含0.6μg的匹伐他汀叔丁酯定位溶液。

系统适用性溶液：称取匹伐他汀叔丁酯对照品及各杂质对照品适量，制成每1ml中约含匹伐他汀叔丁酯对照品0.3mg、杂质A 0.6μg、杂质B 0.6μg、杂质C 0.6μg及杂质D 0.6μg的混合溶液。

供试混合溶液：称取匹伐他汀叔丁酯供试品及各杂质对照品适量，制成每1ml中约含匹伐他汀叔丁酯供试品0.3mg、杂质A 0.6μg、杂质B 0.6μg、杂质C 0.6μg及杂质D 0.6μg的混合溶液。

试验操作：取各组分定位溶液、系统适用性溶液和供试混合溶液各10μl分别进样，记录色谱图至30min。

典型色谱图见图1系统适用性溶液色谱图、图2供试混合溶液色谱图。

对本发明通过系统适用性溶液、供试混合溶液、各杂质定位溶液进行专属性验证，结果见表3、表4和图1、图2。

表3专属性试验结果1

表4专属性试验结果2

由表3和图1、图2可以看出，本发明所述的色谱条件下，匹伐他汀叔丁酯和各杂质均可有效检出，系统适用性溶液色谱图、供试混合溶液色谱图中，匹伐他汀叔丁酯及各杂质峰的保留时间(t_R)与相应定位溶液色谱图中主峰保留时间(t_R)一致。

由表4和图1可以看出，系统性溶液图谱中，出峰顺序依次为杂质A、杂质B、杂质C、匹伐他汀叔丁酯和杂质D。主峰匹伐他汀叔丁酯与杂质C峰之间的分离度大于1.5、杂质与杂质之间的分离度大于1.5。并且5针系统适用性溶液RSD均≤1.0％。

实施例3检测限、定量限验证

高效液相色谱条件同实施例2。

样品配制：

对匹伐他汀叔丁酯及各杂质定位溶液以乙腈为溶剂进行稀释，以信噪比约为3:1相应浓度的稀释溶液作为检测限溶液。

对匹伐他汀叔丁酯及各杂质定位溶液以乙腈为溶剂进行稀释，以信噪比约为10:1相应浓度的稀释溶液作为定量限溶液。

试验操作：取检测限溶液和定量限溶液各10μl分别进样，每个样品平行进样5针，记录色谱图至30min，计算每组样品各组分峰面积RSD。结果见表5。

典型色谱图见图3为匹伐他汀叔丁酯定量限溶液色谱图，图4为匹伐他汀叔丁酯定量限溶液色谱图。

表5检测限、定量限试验结果

本发明人对匹伐他汀叔丁酯及其杂质的检测限、定量限进行验证，匹伐他汀叔丁酯的检测限、定量限为单一杂质的检测限、定量限。由此可以看出匹伐他汀叔丁酯及其杂质检测限度及定量限度均很低，证明本发明具有较高的稳定的检测灵敏度。

实施例4线性及范围验证

高效液相色谱条件同实施例2。

样品配制：

溶液一：分别配制匹伐他汀叔丁酯及其杂质限度浓度120％的溶液。

溶液二：分别配制匹伐他汀叔丁酯及其杂质限度浓度100％的溶液。

溶液三：分别配制匹伐他汀叔丁酯及其杂质限度浓度80％的溶液。

溶液四：分别配制匹伐他汀叔丁酯及其杂质限度浓度40％的溶液。。

溶液五：分别配制匹伐他汀叔丁酯及其杂质定量限浓度的溶液。

试验操作：分别取匹伐他汀叔丁酯及各杂质的五个线性溶液各10μl，分别进样，记录色谱图至30min。

本发明人对匹伐他汀叔丁酯及各杂质的线性与范围进行验证，结果见表6。

表6线性与范围试验结果

由表6可以看出，本发明主峰匹伐他汀叔丁酯及其杂质在其定量限浓度至限度浓度的120％之间线性关系良好。

实施例5重复性、中间精密度验证

高效液相色谱条件同实施例2。

样品配制：

重复性为一个实验员配6份供试混合溶液；

中间精密度为两个实验员分别配6份供试混合溶液，共12份。

其中两名实验员需在在不同日期和不同型号的仪器上分别进行6份独立测试。记录色谱图。对重复性和中间精密度进行验证，结果见表7。

表7重复性和中间精密度试验结果

从表7得出匹伐他汀叔丁酯及其杂质的重复性和中间精密度测得的RSD均符合接受标准。由此可以看出，该发明不受人员和仪器的影响，具有良好的可重复性和中间精密度。

实施例6准确度验证

高效液相色谱条件同实施例2。

样品配制：

称取匹伐他汀叔丁酯供试品、各杂质对照品适量，配制限度浓度20％加标回收溶液、限度浓度50％加标回收溶液和限度浓度120％加标回收溶液。

试验操作：取20％加标回收溶液、80％加标回收溶液、120％加标回收溶液各10μl分别进样，记录色谱图至30min。本发明人通过在9份加标回收溶液图谱上读取各杂质峰含量、供试品溶液中各杂质的含量，计算各加标回收溶液中各杂质的浓度，与实际加入的理论浓度进行比较，计算各杂质的加样回收率及回收率间的相对标准偏差(RSD)，n＝9。进行方法准确度验证，结果见表8。

表8准确度试验结果

从表8可以看出杂质A、杂质B、杂质C、杂质D的加标回收率符合可接受标准，说明该发明能够准确稳定的检测匹伐他汀叔丁酯有关物质。

实施例7溶液稳定性验证

高效液相色谱条件同实施例2。

样品配制：

配制匹伐他汀叔丁酯系统适用性溶液、供试混合溶液，样品配制过程同实施例2中样品配制，配置好后放冰箱暂存。

试验操作：取匹伐他汀叔丁酯系统适用溶液和供试混合溶液分别于0、12、24、36、48h各10μl，分别进样，记录色谱图至30min。记录各匹伐他汀叔丁酯及其杂质含量，并计算各组分的量在冷处存放12h、24h、36h和48h后与0h的变化值。本发明人对匹伐他汀叔丁酯及其杂质的溶液稳定性进行验证，结果见表9。

表9准确度试验结果

溶液稳定性实验期内，匹伐他汀叔丁酯及其杂质含量在12h、24h、36h和48h与0h变化值均小于可接受标准。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。