CN115786174A - 一株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株whh699及其发酵乳、应用 - Google Patents
一株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株whh699及其发酵乳、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，公开一株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699，于2022年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.25414，分类命名：Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus。本发明的菌株WHH699（1）发酵的发酵乳有高ACE抑制活性，可高达96%；（2）初始接种量可低至5×105CFU/mL；（3）所制备的发酵乳ACE抑制活性耐热、耐碱；（4）所制备的发酵乳4℃或室温长期储藏后，ACE抑制活性、酸度、pH值基本无变化。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699及其发酵乳、应用。
背景技术
肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)在人体血压调节过程中扮演非常重要的角色。在RAS系统中，无活性的血管紧张素原在肾素作用下转化成血管紧张素I，血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)切除血管紧张素Ⅰ的羧端His-Leu，使其最终被水解成有强效收缩血管作用的血管紧张素Ⅱ，从而引起血压升高。KKS 系统是人体的内源性降压系统，ACE在该系统中作用于具有血管舒张功能的舒缓激肽使其失活，从而抑制KKS系统的降压作用。ACE对于这两个系统的作用最终引起血压升高。ACE 抑制剂药物作用于上述两大系统后，能有效调节、控制人体血压，治疗充血性心力衰竭，可较好的预防首次心肌梗塞痊愈患者的复发病症，改善预后，显著降低患者的致残率和死亡率。目前原发性高血压治疗药物主要有利尿药、β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、ACE抑制剂药物、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂五大类。其中ACE抑制剂药物种类最多、适应证最广，是高血压合并糖尿病或心率失常患者首选治疗药物。但ACE抑制剂药物能够引起如干咳等不良反应，发生率在10％左右，不良反应现象较为突出。
近年研究发现，部分益生菌的发酵乳对高血压或正常高值血压有一定的降低作用，对正常血压没有影响，原因为这些益生菌可分解蛋白产生一定量的ACE抑制肽，相比ACE抑制剂药物更加安全可靠。目前披露的可发酵产生ACE抑制肽的益生菌主要是乳酸菌，如瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种等。研究表明，益生菌发酵产生ACE抑制肽活性具有菌种和菌株上的差异性。如杨焱炯(具有降血压功能的益生菌的筛选[D]，上海交通大学，2006，硕士学位论文)研究来源于健康青年和儿童肠道的乳杆菌和双歧杆菌，分别对这些菌株的ACE抑制活性、耐酸、耐胆盐、耐药性能以及抑菌性能进行评价，筛选得到四株性能优良的菌株：L.plantarum LP529、L.plantarum LS12、L.plantarum LS31、L.helveticus ZL51，ACE抑制率分别为：40.33％、51.85％、40.74％和80.43％。再如杨振泉等(不同益生菌发酵乳ACEI活性比较[L]，食品发酵与工业，2009，35(3):161～164)测定了6株德氏乳杆菌保加利亚亚种、6株嗜热链球菌、6株鼠李糖乳杆菌、4株双歧杆菌等不同菌种、不同菌株发酵产物的ACEI活性，结果显示发酵产物的ACEI活性呈现种属和菌株差异性，并且发酵和贮藏条件也对ACEI活性有显著影响。
当前国外市场上已经出现少量的益生菌降压产品，如Evolus为瑞士乳杆菌LBK16H发酵而成的酸乳，Calpis由瑞士乳杆菌CP790和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae混合发酵制得。这两款产品均已通过动物实验和人体实验证实其具有降高血压作用，且对正常血压人群或低血压人群的血压没有不利影响。但国内目前未有相应的产品上市，相关内容还停留在研究阶段。德氏乳杆菌作为乳酸杆菌属的典型种之一，在发酵工业中有广泛应用。但是目前德氏乳杆菌保加利亚亚种在降压方面的研究还相对较少，其发酵产品的ACE抑制率普遍较低。如吴青海(Lactobacillus delbrueckii QS306的ACE抑制活性及其抑制肽理化特性研究[D]，内蒙古农业大学，2015，硕士学位论文)提出核酸关联物质对Lb.delbrueckii QS306的蛋白质分解能力有一定的促进作用，但是添加鸟嘌呤等促进因子的情况下，ACE抑制率也仅达到 68.52％。再如吉喆(发酵羊乳产ACE抑制肽乳杆菌的筛选及产肽条件优化[D]，2013，陕西科技大学，硕士学位论文)筛选的德氏乳杆菌保加利亚亚种LB6虽然在大豆蛋白胨、葡萄糖和酪蛋白存在下的羊乳发酵产物的ACE抑制率高达92.31±0.5％，但在纯羊乳中的发酵产物的ACE抑制率为74.61％。德氏乳杆菌保加利亚亚种作为最具有经济价值的发酵乳酸菌之一，在维持机体血压健康水平方面应进行更多的挖掘和筛选，开发自主知识产权菌株发酵剂，推出基于德氏乳杆菌的高ACE抑制活性的相应产品显得意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699，其发酵乳有高血管紧张素转换酶抑制活性。
本发明提供如下的技术方案：
一株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)，命名为 WHH699，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699由发明人团队从青海西宁牦牛酸奶中筛选得到，于2022年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.25414，命名为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus。发明人在研究中发现，菌株WHH699具有如下优点：(1)发酵乳有高血管紧张素转换酶抑制活性，抑制率可以达到96％；(2)可以在低接种量下发酵获得高ACE抑制活性，接种量可低至5×105CFU/mL；(3)面向不同类型的基料发酵所得发酵乳均有高ACE抑制活性，如在牛奶粉或羊奶粉中发酵所得发酵乳的ACE 抑制率均可达90％以上。
一种发酵乳，使用上述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699在含乳粉的基料中发酵获得。本发明的发酵乳由菌株WHH699利用乳粉发酵制备得到，具有高ACE抑制活性，表现在以下方面：(1)ACE抑制率可以达到96％；(2)ACE抑制活性具有高耐热性，发酵乳经 95℃/10min处理后ACE抑制活性基本无影响，可保持在94％以上；(3)ACE抑制活性具有高耐碱性，将加热处理后的发酵乳调节pH值至8.30时，AEC抑制率仍可高达80％以上； (4)ACE抑制活性具有长期储藏稳定性，发酵乳室温放置3个月后ACE抑制活性基本无变化；(5)以乳粉/水体系为基料发酵制备的发酵乳的后酸化稳定。
作为本发明的优选，所述基料中蛋白含量≥3.5wt％。
作为本发明的优选，所述乳粉为牛乳粉或羊乳粉。
作为本发明的优选，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699在基料中接种量≥5×105 CFU/mL。本发明的发酵乳可由菌株WHH699在低接种量下发酵制备，接种量明显低于现有的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌或其他乳酸菌，如杨振泉等在研究不同益生菌发酵乳ACEI活性中的益生菌接种量达到4％，吉喆在利用不同的乳酸菌发酵获得ACE抑制活性的发酵乳时，乳酸菌的接种量达到5％，而且本发明提供的发酵乳ACE抑制活性更高。
作为本发明的优选，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699在基料中的接种量为5× 105～5×106CFU/mL。
作为本发明的优选，发酵温度40～43℃；发酵时间8～12h。
一种上述发酵乳在制备抑制血管紧张素转换酶活性的产品上的应用。
作为本发明的优选，所述产品为发酵奶粉、饮品或片剂。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699从青海西宁牦牛酸奶中筛选得到，(1) 在含乳粉基料中发酵制备的发酵乳有高ACE抑制活性，可高达96％，发酵乳后酸化稳定；(2) 所需的初始接种量可低至5×105CFU/mL，远远低于现有的德氏乳杆菌菌株，但ACE抑制活性更高；(3)所制备的发酵乳耐热、耐碱，经加热和碱化处理后的ACE抑制活性仍高于85％； (4)所制备的发酵乳在4℃或室温下长期储藏后，ACE抑制活性、酸度、pH值基本无变化。
附图说明
图1为菌株WHH699在显微镜下观察的形态图。
图2为菌株WHH699在不同基料中的产酸曲线。
图3为菌株WHH699在不同温度(3a)和不同接种量(3b)下的产酸曲线。
图4为菌株WHH699在不同初始接种量下发酵乳的ACE抑制活性随时间的变化曲线。
图5为菌株WHH699的发酵乳在不同加热处理条件下的ACE抑制活性结果图。
图6为菌株WHH699的发酵乳在不同加热和碱处理条件下的ACE抑制活性结果图。
图7为菌株WHH699的发酵乳成品在不同储藏条件下ACE抑制活性结果图。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
一株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699，由发明人团队从青海西宁牦牛酸奶中筛选得到，于2022年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：CGMCC No.25414，命名为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus。
菌株WHH699在在MRS琼脂培养基中培养，显微镜下观察的形态如图1所示，其形态学特征为：在MRS琼脂培养基中生长形态为浅乳白色菌落，半透明、圆形、表面粗糙、边缘不整齐、平展。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动。
菌株WHH699培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。
菌株WHH699的API50CHL系统鉴定：菌株WHH699发酵菌液1mL离心，菌泥用生理盐水重悬。调整OD600至5mL重悬菌液的OD600为0.5左右。离心去上清，用API50培养基5mL重悬。加入API50板中，每孔100μL，37℃孵育24h和48h。
菌株WHH699可利用4种碳源：D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖和D-乳糖。
一种发酵乳，由德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699在含乳粉的基料中发酵获得，优选的基料中蛋白含量≥3.5wt％；德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699在基料中的接种量≥5×105CFU/mL，优选的接种量为5×105～5×106CFU/mL；发酵温度40～43℃；发酵时间8～12h，乳粉优选为牛乳粉或羊乳粉；也可在在基料中加入浓缩乳清蛋白、酪蛋白中的一种或两种。该发酵乳有高的ACE抑制活性，ACE抑制率可达96％，而且发酵乳的ACE抑制活性具有良好的耐热、耐碱以及储藏稳定性，长期储藏(4℃冷藏或室温储藏3个月)后ACE 抑制活性、pH和酸度基本无变化。
将上述发酵乳应用于制备抑制血管紧张素转换酶活性的产品上，如不同形式的发酵图、发酵奶粉、饮品或片剂。
1、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699发酵乳的高ACE抑制活性从新疆、青海、西藏、四川、贵州等地传统发酵食品中分离得到如下表1所示的59株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，均保存于杭州娃哈哈科技有限公司。将59株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株甘油管200μL接种至10mL MRS液体试管中，37℃培养24h。一代种子液200μL 接种至10mL MRS液体试管中，37℃培养过夜。二代种子液1mL离心去上清，生理盐水洗一次，重悬至1mL生理盐水中。200μL重悬液接至10mL脱脂乳中(大约107CFU/mL的接种量)，37℃发酵18h。破乳，取适量发酵乳高速低温离心后，取乳清，以马尿酰-组氨酰- 亮氨酸(HHL)为ACE反应底物，反应所生成的马尿酸为测定指标，未加酶抑制剂的反应为空白对照，测试ACE抑制活性，测试方法如下：
1.1试剂配置：
分别配置0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液、0.1U/mL ACE溶液、5mmol/L的HHL溶液；
1.2样品处理：
在1.5mL离心管中加200μL、5mmol/L的HHL溶液和80μL的发酵乳上清液，对照加80μL 的缓冲液，于37℃水浴保温5min后，加入20μLACE溶液，混匀后37℃水浴中保温30min，加入250μL、1mol/L的盐酸溶液以终止反应。通过高效液相色谱仪waters e2695色谱系统(D18SM7963A)采用外标法进行定量。平行实验3次，结果取平均值；
ACEi＝(A-B)/A*100％；
ACEi：发酵乳样品对ACE的抑制率；
A：空白对照品中马尿酸的浓度；
B：添加发酵乳样品组中马尿酸的浓度。
表1不同德氏乳杆菌发酵乳的ACE抑制率(ACEi％)
由上表结果可知，不同菌株之间的ACE抑制活性差别较大：菌株771的ACE抑制活性仅有 5.2％，菌株WHH3887(杭州娃哈哈集团有限公司自主菌株，微生物保藏编号为：CGMCCNo.20090)的ACE抑制活性为83.7％，菌株WHH699的ACE抑制活性最高，可达95.8％。导致ACE抑制活性差别大的原因应该是ACE抑制肽为乳酸菌在发酵过程中分解蛋白产生的活性肽，不同乳酸菌分泌的蛋白酶种类和活性不同，即使是同一种属不同菌株也有明显差异，因此ACE抑制活性表现出明显的菌株差异性。
2、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699对于不同种类乳粉的适应性
将菌株WHH699的菌粉接种至下表2所示的4种发酵基料中(其中酪蛋白来自ingredia；浓缩乳清蛋白WPC80来自glanbia；羊奶粉为杭州娃哈哈科技有限公司的莫尔希亚羊奶粉)，基料中蛋白含量3.5％，初始接种量为5×106CFU/mL，发酵温度42±1℃，发酵12h，结果见表2所示。
表2菌株WHH699在不同基料中发酵的发酵乳性能
从上表2中可知，采用全脂乳粉或羊奶粉发酵时，所得发酵乳的ACE抑制率不低于90％，发酵乳风味较好、质构细腻，同时在羊奶粉基料中不同接种量发酵后的羊乳风味较好，无膻味，菌株WHH699表现出良好的基料适应性。而在全脂乳粉中加入乳糖和酪蛋白，或者进一步引入浓缩乳清蛋白后，ACE抑制活性有所下降。同时基料1和3、4对应的产酸曲线如图2所示。从图2中可以看出，在基料1中发酵8～12h左右，发酵乳酸度合适，后酸化稳定，在基料3、4中相对产酸较慢，后酸化不稳定。这表明本申请的菌株WHH699在乳粉基料中发酵即可获得高ACE抑制活性的发酵乳，酪蛋白等应该不是菌株WHH699发酵获得高ACE抑制活性的促进因子。
3、菌株WHH699在不同初始接种量、不同温度下的发酵产酸情况
在终蛋白3.5％全脂乳粉基料中，初始接种量分别为5×105CFU/mL、1×106CFU/mL、2.5 ×106CFU/mL、5×106CFU/mL，分别在37℃、40℃和43℃温度中发酵，追踪发酵曲线。结果发现，温度为40℃时，同一初始接种量的发酵速度均快于43℃和37℃，且后酸化稳定，是菌株WHH699最合适的发酵温度，见图3(a)。温度为40℃时，不同初始接种量的发酵速度差别不大，后酸化均较稳定，见图3(b)。初始接种量为5×105CFU/mL时即可达到较为理想的结果。
4、菌株WHH699在不同初始接种量、不同发酵时间的ACE抑制活性变化
在终蛋白3.5％全脂乳粉基料中，发酵温度42±1℃，初始接种量分别为5×105CFU/mL、1 ×106CFU/mL、2.5×106CFU/mL、5×106CFU/mL，分别发酵6h、8h、10h、12h、14h、16h和18h，见图4。可以看出，不同初始接种量发酵8～10h得到的发酵乳ACEi％(ACE 抑制率)均可达到比较高的水平(＞90％)；初始接种量为5×105CFU/mL，发酵时间10h后 ACEi％高达96％。
5、菌株WHH699发酵乳的ACE抑制活性的耐热特性
200mL终蛋白3.5％全脂乳合适条件灭菌处理后，WHH699冻干菌粉按5×105CFU/mL初始活菌数接种，42±1℃发酵10～12h，离心得上清原液。分别对上清原液进行95℃/10min、 85℃/10min和65℃/30min三种条件加热处理，检测ACE抑制活性，见图5。从结果可以看出，95℃/10min、85℃/10min和65℃/30min这三种处理条件下的ACEi％和原样(发酵乳未做任何处理)一样处于比较高的水平，均大于92％。
6、菌株WHH699发酵乳的ACE抑制活性同时耐热、耐碱特性
200mL终蛋白3.5％全脂乳合适条件灭菌处理后，WHH699冻干菌粉按5×105CFU/mL初始活菌数接种，42±1℃发酵10～12h，离心得上清原液。分别对上清原液进行95℃/10min、 85℃/10min和65℃/30min三种条件加热处理后，用合适浓度的NaOH溶液调节pH至8.30，检测ACE抑制活性，见图6。从结果可以看出，95℃/10min、85℃/10min和65℃/30min这三种加热条件处理后，再通过碱调节pH至8.30，ACEi％略有下降，但仍处于较高水平，均大于80％。
7、菌株WHH699发酵乳成品的储藏稳定性
200mL终蛋白3.5％全脂乳合适条件灭菌处理后，WHH699冻干菌粉按5×105CFU/mL初始活菌数接种，42±1℃发酵10～12h，均质后的酸奶样品风味优良，色泽均匀一致，呈乳白色。通过调配制得终蛋白2.3％的风味发酵乳成品。检测pH和酸度。结果显示风味发酵乳成品pH4.0左右，酸度75°T左右。通过口感测试，87％以上的品尝者认为该款风味发酵乳成品口感柔滑，很喜欢。将终蛋白2.3％的风味发酵乳成品置于4℃和室温存放，定期观察产品的质构、风味、酸度和pH变化。三个月结果显示产品的质构、风味、酸度和pH较初始无明显变化。
8.菌株WHH699发酵乳成品不同储藏条件下ACE抑制活性变化
将上述终蛋白2.3％的风味发酵乳成品95℃/10min灭菌处理，分装成小样后分别置于4℃和室温(RT)保存。定期检测风味发酵乳成品的ACEi％。储存3个月的ACE抑制活性变化情况见图7。不管是4℃还是室温保存，发酵乳成品的ACEi％均保持较高的水平，储存3个月的 ACE抑制活性仍大于88％。该发酵乳成品或对维持机体健康血压水平有一定的功效。
Claims (9)
1.一株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699，其特征在于，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699于2022年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.25414，分类命名：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus。
2.一种发酵乳，其特征在于，使用如权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699在含乳粉的基料中发酵获得。
3.根据权利要求2所述的发酵乳，其特征在于，所述基料中蛋白含量≥3.5wt%。
4.根据权利要求2或3所述的发酵乳，其特征在于，所述乳粉为牛奶粉或羊奶粉。
5.根据权利要求2或3所述的发酵乳，其特征在于，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699在基料中的接种量≥5×105 CFU/mL。
6.根据权利要求5所述的发酵乳，其特征在于，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株WHH699在基料中的接种量为5×105～5×106 CFU/mL。
7.根据权利要求2或3所述的发酵乳，其特征在于，发酵温度40～43 ℃；发酵时间8～12h。
8.一种如权利要求2至7任一所述的发酵乳在制备抑制血管紧张素转换酶活性的产品上的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品为发酵奶粉、饮品或片剂。
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