CN115785267A

CN115785267A - 一种靶向IL-23p19的抗体或其抗原结合片段及其应用

Info

Publication number: CN115785267A
Application number: CN202111062736.8A
Authority: CN
Inventors: 郎国竣; 胡宇豪; 刘婵娟; 曹国庆; 王文蓉; 闫鑫甜; 吴琪
Original assignee: Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2021-09-10
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-09-10
Also published as: CN115785267B; WO2023036127A1

Abstract

本发明公开了一种靶向IL‑23p19的抗体或其抗原结合片段及其应用。所述靶向IL‑23p19的抗体或其抗原结合片段特异性结合IL‑23的p19亚基而不结合p40亚基，且与IL‑23的结合能力与对照抗体Guselkumab相当或更佳。在阻断IL‑23与受体IL‑23R结合的能力与对照抗体Guselkumab相当或者更佳，在抑制IL‑23激活细胞STAT3磷酸化的能力以及抑制IL‑23激活小鼠脾细胞分泌IL‑17的能力比对照抗体Guselkumab更佳。

Description

一种靶向IL-23p19的抗体或其抗原结合片段及其应用

技术领域

本发明属于抗体领域，具体地涉及一种IL-23结合分子，特别是特异性识别IL-23p19亚基的抗体和其片段。此外，本发明还涉及包含此类抗体或其片段的核酸或宿主细胞，以及应用这些抗体和片段的治疗和诊断方法或用途。

背景技术

白细胞介素-23(IL-23)是活化的树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞等产生的细胞因子，由p19和p40两个亚基组成，其中p40亚基也是IL-12的组成部分。当p19和p40两个亚基组成异源二聚体时，可以发挥生物学功能，而单独存在时不具有生物学功能。

IL-23可以结合细胞表面的受体，激活下游信号通路并发挥物学功能。IL-23的受体由IL-23R和IL12β1两个亚基组成，分别结合IL-23的p19和p40两个亚基。IL-23主要作用在Th17细胞上，在Th17细胞稳定和增殖中发挥重要作用，并能够促进Th17细胞分泌IL-17A、IL-17F和IL-22等炎症相关的细胞因子并作用于角质形成细胞，导致其过度活化和增殖。活化的角质形成细胞会产生大量的细胞因子、趋化因子和抗菌肽，招募并活化T细胞等免疫细胞，最终造成银屑病表型。

目前，临床上针对该靶点的药物研究还十分有限，因此开发针对该靶点的新的且药效理想的抗体药，具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明公开了一种靶向IL-23的抗体或其抗原结合片段及其应用，特别是特异性结合p19亚基而不结合p40亚基的IL-23结合分子。

本发明因此提供了一种新的结合IL-23p19的抗体，以及其抗原结合片段。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体具有以下一个或多个或全部的特性：

(i)特异性结合IL-23的p19亚基而不结合p40亚基；

(ii)具备优异的与人、鼠(例如小鼠)和食蟹猴IL-23交叉结合的特性；

(iii)阻断IL-23与受体IL-23R结合的能力与已知的对照抗体(例如Guselkumab)相当或者更佳；

(iv)抑制IL-23激活细胞STAT3磷酸化的能力比已知的对照抗体(例如Guselkumab)更佳；

(v)抑制IL-23激活脾细胞(例如小鼠脾细胞)分泌IL-17的能力比已知的对照抗体(例如Guselkumab)更佳。

在一些实施方案中，本发明提供了结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段，包含如SEQ ID NO:12所示的序列的3个重链CDR(HCDR)，和/或如SEQ ID NO:16所示的序列的3个轻链CDR(LCDR)。

在一些实施方案中，本发明提供了结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段，包含如SEQ ID NO:20所示的序列的3个重链CDR(HCDR)，和/或如SEQ ID NO:16所示的序列的3个轻链CDR(LCDR)。

在一些实施方案中，本发明提供了结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段，包含如SEQ ID NO:23所示的序列的3个重链CDR(HCDR)，和/或如SEQ ID NO:27所示的序列的3个轻链CDR(LCDR)。

在一些实施方案中，本发明提供了编码本发明抗体或其片段的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了制备本发明抗体或其片段的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明抗体的免疫缀合物、药物组合物和组合产品。

本发明还提供了利用本发明抗体在受试者中阻断IL-23介导的信号通路的方法，以及预防或治疗IL-23相关疾病，例如免疫系统疾病(例如自身免疫疾病或炎症)的方法。

本发明还涉及在样品中检测IL-23p19的方法。

在下面的附图和具体实施方案中进一步说明本发明。然而，这些附图和具体实施方案不应被认为限制本发明的范围，并且本领域技术人员容易想到的改变将包括在本发明的精神和所附权利要求的保护范围内。

附图说明

图1显示抗体A44与重组蛋白人IL-23的结合。

图2显示抗体A44阻断人IL-23与人IL-23R的结合。

图3A-3B显示抗体工程改造后抗体与重组蛋白人IL-23的结合。

图4A-图4B显示抗体工程改造后抗体阻断重组蛋白人IL-23与人IL-23R的结合。

图5A-图5C显示抗体工程改造后抗体与人IL12-p40亚基的结合。

图6A-图6C显示抗体工程改造后抗体与猴IL-23的结合。

图7A-图7C显示抗体工程改造后抗体与小鼠IL-23的结合。

图8A-图8B显示抗体工程改造后抗体与Guselkumab竞争结合IL-23。

图9A-图9B显示抗体工程改造后抗体抑制细胞内STAT3磷酸化。

图10A-图10C显示抗体工程改造后抗体抑制小鼠脾细胞分泌IL-17。

发明详述

I.定义

在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。

如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

IL-23的p19亚基(在本文中亦称为“IL-23p19”及“p19亚基”)为一种具有189个氨基酸的多肽，其含有具有21个氨基酸的前导序列(Oppmann等人,Immunity 13:715(2000))，并且包含称为A、B、C和D的4个被压缩的(packed)α螺旋，具有上-上-下-下拓扑结构。4个螺旋通过3个多肽环连接。A-B和C-D环被制作得相对较长，因为它们连接平行螺旋。短B-C环连接反向平行的B和C螺旋。IL-23的p19亚基是螺旋状细胞因子的IL-6家族成员。该细胞因子家族通过3个保守表位(位点I、II和III；Bravo和Heath(2000)EMBO J.19：2399-2411)与其同族受体结合。p19亚基与3个细胞因子受体亚基相互作用，以形成感受态信号转导复合物。当在细胞中表达时，p19亚基首先与p40亚基形成复合物，p19亚基与IL-12共用p40亚基。p19p40复合物作为异二聚蛋白从细胞中分泌出来，并被称为IL-23。在一个实施方案中，本发明的IL-23p19来自人(UNIPROT登录号Q9NPF7)或食蟹猴(UNIPROT登录号G7PIH8)或鼠(例如小鼠，UNIPROT登录号：Q9EQ14)。

本文所用的术语“抗IL-23p19抗体”、“抗IL-23p19”、“IL-23p19抗体”或“结合IL-23p19的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合(人或食蟹猴或鼠)IL-23p19亚基或其片段以致所述抗体可以用作靶向(人或食蟹猴或鼠)IL-23p19中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗IL-23p19抗体不与IL-12的p40亚基结合。

“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

II.抗体

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其片段以高亲和力结合IL-23p19(例如人IL-23中的人IL-23p19亚基或食蟹猴IL-23中的食蟹猴IL-23p19亚基或鼠IL-23中的鼠IL-23p19亚基)，例如，以以下平衡解离常数(K_D)与IL-23p19结合，所述K_D小于约1nM，优选地，小于或等于约0.5nM、0.4nM、0.3nM或0.2nM，最优选地，所述K_D小于或等于约0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM。在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体以0.01-0.2nM，优选地0.05nM-0.15nM的K_D结合IL-23p19。在一些实施方案中，IL-23p19为人IL-23p19。在一些实施方案中，IL-23p19为食蟹猴IL-23p19。在一些实施方案中，IL-23p19为鼠IL-23p19，例如小鼠IL-23p19。在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用生物光干涉测定法(例如表面等离子共振(Biacore)测量)测定的。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其片段结合人IL-23p19、食蟹猴IL-23p19和/或鼠IL-23p19。在一些实施方案，本发明的抗IL-23p19抗体或其片段结合人IL-23p19、食蟹猴IL-23p19和鼠IL-23p19。在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其片段阻断人或食蟹猴或鼠IL-23与其受体IL-23R结合。在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其片段阻断人、食蟹猴和鼠IL-23与其受体IL-23R结合。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其片段，以高亲和力结合人IL-23(IL-23p19)(优选地结合能力优于已知的抗IL-23p19抗体，例如Guselkumab)，和/或以高亲和力结合食蟹猴IL-23(IL-23p19)(优选地结合能力与已知的抗IL-23p19抗体相当或更优，例如Guselkumab)，和/或以较好的亲和力结合鼠IL-23(IL-23p19)。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其片段抑制IL-23(例如人IL-23、食蟹猴IL-23或鼠IL-23)激活细胞STAT3磷酸化的能力，优选地，所述抑制优于已知的抗IL-23p19抗体，例如Guselkumab。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其片段具有更好的组织特异性，与细胞表面膜蛋白基本无结合。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段通过与IL-23p19结合而抑制细胞(例如脾细胞)分泌IL-17，例如，本发明的抗体或其片段对细胞分泌IL-17的抑制率达到50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、99％、100％。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段(任选地与治疗方式和/或其它治疗剂，例如免疫调节剂组合)能够预防或治疗IL-23相关疾病，例如免疫系统疾病(例如克罗恩病、中度至严重活动性溃疡性结肠炎、银屑病关节炎、掌跖脓疱症和银屑病)。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。

在一些方面中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)。在一些方面中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含抗体重链(HC)。在一些实施方案中，本发明抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链(LC)。在一些实施方案中，本发明抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链。

在一些实施方案中，本发明的抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区。

在一些实施方案中，本发明的重链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:12、20、23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:12、20、23的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:12、20、23的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明的轻链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:16、27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(ii)包含选自SEQ ID NO:16、27的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:16、27的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明的3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3选自

(i)如SEQ ID NO:12所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(ii)如SEQ ID NO:20所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(iii)如SEQ ID NO:23所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

或

(iv)相对于(i)-(iii)中任一项的序列，在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。

在一些实施方案中，本发明的3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3选自

(i)如SEQ ID NO:16所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

(ii)如SEQ ID NO:27所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

或

(iii)相对于(i)-(ii)中任一项的序列，在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。

在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO:2或18的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与SEQ ID NO:2或18的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO:11、19或22的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与11、19或22的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:14或25的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与SEQ ID NO:14或25的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO:15或26的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR3包含与SEQ ID NO:15或26的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，优选的IgG1的重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链恒定区为lambda或Kappa轻链恒定区，优选的lambda轻链恒定区。

在一些优选的实施方案中，本发明的抗体重链恒定区

(i)包含与选自SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:31的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，所述氨基酸改变发生在Fc区。

在一些实施方案中，本发明的抗体轻链恒定区

(i)包含与选自SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:32的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含：

(i)如SEQ ID NO:12所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:16所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(ii)如SEQ ID NO:20所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:16所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(iii)如SEQ ID NO:23所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:27所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3。

(i)分别如以下氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3：SEQ ID NO:1、2和11，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:14、7和15；

(ii)分别如以下氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3：SEQ ID NO:1、18和19，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:14、7和15；或

(iii)分别如以下氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3：SEQ ID NO:1、2和22，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:25、7和26。

(i)包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VH，和包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VL；

(ii)包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VH，和包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VL；或

(iii)包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VH，和包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VL。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中

(a)重链

(i)包含与选自SEQ ID NO:13、21或24的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:13、21或24的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:13、21或24的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在重链可变区中；

和/或

(b)轻链

(i)包含与选自SEQ ID NO:17或28的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含选自SEQ ID NO:17或28的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:17或28的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链可变区中。

在优选的实施方案中，本发明提供抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述抗体或其抗原结合片段包含的重链和轻链包含如下所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：

(i)SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:17；

(ii)SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:17；或

(iii)SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:28。

在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。

在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。

在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。

在某些实施方案中，置换发生在抗体的CDR区。通常，获得的变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体。

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体的亲和力或治疗疾病的有效性。Fc区变体可包括在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸改变(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。

在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段还包括具有以下一个或多个特性的抗体或抗原结合片段：

(i)显示与本发明抗体对IL-23p19相同或相似的结合亲和力和/或特异性；

(ii)抑制(例如，竞争性抑制)本发明抗体与IL-23p19的结合；

(iii)与本发明抗体结合相同或重叠的表位；

(iv)与本发明抗体竞争结合IL-23p19；

(v)具有本发明抗体的一个或多个生物学特性。

在一些实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG4形式的抗体。

在一些实施方案中，抗IL-23p19抗体是单克隆抗体。

在一些实施方案中，抗IL-23p19抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol 5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol 20：450-459(2008)。

在一些实施方案中，抗IL-23p19抗体是嵌合抗体。

在一些实施方案中，至少部分的抗IL-23p19抗体的框架序列是人共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗IL-23p19抗体还涵盖其抗体片段，优选地选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)或(Fab’)₂、单结构域抗体、双价抗体、片段化抗体dAb或线性抗体。

在某些实施方案中，抗IL-23p19抗体分子处于双特异性或多特异性抗体分子形式。在一个实施方案中，第二结合特异性也包括可以特异性结合如促炎性细胞因子和趋化因子等类别的抗原蛋白。如本文所用，术语“促炎性细胞因子”指由免疫细胞或其他类型的细胞分泌的一类促进炎症的细胞因子。促炎性细胞因子主要由辅助性T细胞(Th)和巨噬细胞产生并参与炎症反应的上调。促炎性细胞因子的实例包括但不限于IL-1β、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TNF-α。趋化因子包括但不限于IL-8、GRO-α和MCP-1。在一个实施方案中，第二抗原结合部分特异性结合IL-1β、IL-6、IL-13、TNF-α或BAFF。在一个实施方案中，双特异性抗体分子具有针对IL-23p19的第一结合特异性和针对TNF(例如TNFα)的第二结合特异性。在一个实施方案中，双特异性抗体分子与IL-23p19和TNF结合。多特异性抗体分子可以具有任何针对前述分子的结合特异性的组合。

如本文所述定义的，术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中，抗体片段为抗原结合片段。“抗原结合片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)₂；dAb(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。

如本文所述定义的，与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。

如本文所述定义的，与参照抗体竞争结合其抗原的抗体是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定、生物光干涉测定法(例如Fortebio)或表面等离子共振(Biacore)等。

如本文所述定义的，抑制(例如竞争性抑制)参照抗体与其抗原的结合的抗体是指这样的抗体，其抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。抗体与其抗原的结合可以亲和力(例如平衡解离常数)衡量。测定亲和力的方法是本领域已知的。

与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。

如本文所述定义的，“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal ofMolecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(Universityof Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。

例如，根据不同的CDR确定方案，每一个CDR的残基如下所述。

CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。

除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据AbM编号系统的编号位置。

在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR按照AbM规则确定。

在一个实施方案中，本发明抗体的轻链可变区CDR按照AbM规则确定。

应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR(在同一指派系统下)。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的CH2和CH3的恒定区域，该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。

“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG4形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG4，或者IgG1形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG1。

“人抗体”或“全人抗体”或“全人源抗体”可以互换使用，其指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法(Biacore)或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。

III.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞

在一方面，本发明提供了编码以上任何抗IL-23p19抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

在一方面，本发明提供了编码本文所述任何抗IL-23p19抗体或其片段的核酸。所述核酸可以包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列的核酸，或包含编码抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列的核酸。

例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:12、13、16、17、20、21、23、24、27或28中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:12、13、16、17、20、21、23、24、27或28中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。

在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是pcDNA3.3。

在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。

在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。例如，糖基化途径已经进行“人源化”的真菌和酵母菌株导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293HEK或293F或293细胞，如例如Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：216(1980)、CHO-S细胞等；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，Methodsin Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。

IV.本发明的抗体分子的生产和纯化

在一个实施方案中，本发明提供制备抗IL-23p19抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗IL-23p19抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。

在一个实施方案中，提供了制备抗IL-23p19抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。为了重组产生抗IL-23p19抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并将其插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

V.测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗IL-23p19抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹，等来进行。可使用本领域已知方法来测定对IL-23p19的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用生物光干涉测定法(例如Fortebio亲和测量)或MSD测定法。

另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文中公开的任何抗IL-23p19抗体竞争对IL-23p19的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本文中公开的任何抗IL-23p19抗体所结合表位相同或重叠的表位(例如线性或构象表位)。

本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗IL-23p19抗体的测定法。生物学活性可以包括例如结合IL-23p19(例如结合人和/或食蟹猴和/或鼠IL-23p19)，抑制IL-23对IL-17分泌的诱导，阻断IL-23信号通路(例如抑制IL-23激活细胞STAT3磷酸化)等。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。

供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达IL-23p19或经改造而表达IL-23p19细胞系。此类细胞还包括表达IL-23p19和并非正常情况下表达IL-23p19的编码IL-23p19 DNA转染的细胞系。

可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换或补充抗IL-23p19抗体来进行任何上述测定法。

可以理解的是，能够使用抗IL-23p19抗体和别的活性剂来进行任何上述测定法。

VI.免疫缀合物

在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何抗IL-23p19抗体和其它物质，例如治疗剂，包括细胞因子、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如抗炎剂或免疫抑制剂)。

在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗IL-23相关疾病，例如免疫系统疾病(例如自身免疫疾病或炎症)。

VII.药物组合物和药物制剂

在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗IL-23p19抗体或其片段(优选地其抗原结合片段)或其免疫缀合物的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的抗IL-23p19抗体或其片段或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂的组合。

本发明还包括包含抗IL-23p19抗体或其免疫缀合物的组合物(包括药物组合物或药物制剂)，或包含编码抗IL-23p19抗体的多核苷酸的组合物(包括药物组合物或药物制剂)。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种结合IL-23p19的抗体或其片段，或一种或多种编码一种或多种抗IL-23p19的抗体或其片段的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。

如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。

对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。

本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。

可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。

本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，例如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

VIII.药物组合和药盒

在一些实施方案中，本发明还提供了药物组合或药物组合产品，其包含本发明的抗IL-23p19抗体或其片段(优选的抗原结合片段)，或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂等)。

本发明的另一个目的是提供一种成套药盒，其包含本发明的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。

在一个实施方案中，本发明的成套药盒在同一包装内包含：

-含有包含抗IL-23p19抗体或其片段的药物组合物的第一容器；

-含有包含其它治疗剂的药物组合物的第二容器。

在一些实施方案中，所述组合产品用于预防或治疗IL-23相关疾病，例如免疫系统疾病(例如自身免疫疾病或炎症)。

IX.用途和方法

本发明一方面提供了在受试者中治疗IL-23相关疾病的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗IL-23p19的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物或组合产品。

在一些实施方案中，本文所述的IL-23相关疾病包括免疫系统疾病，例如自身免疫疾病及炎症疾病，例如克罗恩病、中度至严重活动性溃疡性结肠炎、银屑病关节炎、掌跖脓疱症和银屑病。

在一个实施方案中，本发明的免疫系统疾病是具有升高的核酸/蛋白质水平的IL-23(例如IL-23p19)的疾病。

在一个实施方案中，免疫系统疾病是表达升高水平的IL-23(例如IL-23p19表达水平升高)的疾病。

在其他方面，本发明提供抗IL-23p19抗体或其片段在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗本文提及的相关疾病或病症。

在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段或免疫缀合物或组合物或产品会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。

在一些实施方案中，本文所述的预防或治疗方法还包括向所述受试者或个体组合施用本文公开的抗体分子或药物组合物或免疫缀合物，以及一种或多种其它疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂。

在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术、放射疗法(例如，外粒子束疗法，它涉及其中设计照射区域的三维适形放射疗法)、局部照射(例如，指向预选靶或器官的照射)或聚焦照射)等。

在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。示例性的免疫调节剂包括免疫抑制剂或抗炎剂。

如本文所使用的，“化疗剂”包括在治疗免疫系统疾病中有用的化学化合物。

如本文所使用的，术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。

本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包含免疫抑制剂。

本文使用的“免疫抑制剂”是在免疫抑制治疗中用于抑制或阻止免疫系统活性的治疗剂。

在一些实施方案中，本文中描述的抗体组合可以分别施用，例如，作为单独的抗体分别施用，或连接时(例如作为双特异性或三特异性抗体分子)施用。

此类组合疗法涵盖组合施用(例如两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或药剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。

IX.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段可以用于检测IL-23(特别是IL-23p19)在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自免疫系统疾病(例如自身免疫疾病或炎症)相关病灶。

在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗IL-23p19抗体。在另一个方面中，提供检测IL-23p19在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测IL-23p19蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，IL-23p19是人IL-23p19或食蟹猴或鼠(例如小鼠)IL-23p19。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗IL-23p19抗体在允许抗IL-23p19抗体与IL-23p19结合的条件下接触，并检测在抗IL-23p19抗体和IL-23p19之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在IL-23p19。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗IL-23p19抗体被用于选择适合利用抗IL-23p19抗体的治疗的受试者，例如其中IL-23p19是用于选择所述受试者的生物标记物。

本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1原材料准备

本实施例中，制备或购买了如下7种重组蛋白：人IL-23-His(人IL-23序列：UniProt登录号#Q9NPF7-1：Arg20-Pro189(IL-23A)和UniProt登录号#P29460-1：Ile23-Ser328(IL-23B))、人IL-23-His-生物素、人IL-23-Fc、猴IL-23(购自AcroBio，ILB-CM52W8)、鼠IL-23(Novoprotein，CI18)、人IL-12-His(UniProt登录号#P29460-1：Ile 23-Ser 328(IL-12B)和UniProt登录号#P29459-1：Arg 23-Ser 219(IL-12A))和人IL-23R(UniProt登录号#Q5VWK5-1：Gly 24-Gly 355)。

本实施例中，制备了如下对照抗体：Guselkumab(Janssen Biotech，US7491391，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:33、34所示)、IL-12抗体(乌司奴单抗(Ustekinumab)，购自强生)。

1.1质粒构建

将各条人IL-23序列、人IL-23R序列、人IL-12序列和Guselkumab的轻/重链序列，进行目的片段基因合成，拿到目的片段后进行PCR扩增，然后通过同源重组的方法构建至真核表达载体pcDNA3.4，其中人IL-23-Fc为在合成的人IL-23基因片段的C端带上Fc标签(所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示)，人IL-23-His和人IL-12-His为在合成的人IL-23基因或者人IL-12基因片段的C端带上His标签。

1.2质粒准备

将构建好的表达载体分别转化到大肠杆菌SS320中，37℃过夜培养，利用无内毒素质粒抽提试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒抽提，得到无内毒素的质粒以供真核表达使用。

1.3重组蛋白表达纯化

人IL-23-His、人IL-23R-His、人IL-23-Fc和人IL-12-His是通过Expi-HEK293瞬转表达系统(ThermoFisher，A14635)进行表达的，具体方法如下：转染当天，确认细胞密度为每毫升4.5×10⁶至5.5×10⁶个活细胞左右，细胞活率大于95％，此时用37℃预热的新鲜Expi293表达培养基将细胞调整到终浓度为每毫升3×10⁶个细胞，用4℃预冷的Opti-MEM^TM稀释目的质粒(质粒用量与表达体积比为1μg/mL)，同时用Opti-MEM^TM稀释ExpiFectamine^TM293试剂，再将两者混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamine^TM293试剂/质粒DNA混合液，室温孵育10-20分钟，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃，8％CO₂条件下培养。

在转染后18-22小时内添加ExpiFectamine^TM293 Transfection Enhancer 1和2，摇瓶放置于32℃摇床和5％CO₂条件下继续培养，在转染5-7天，将细胞上清进行15000g高速离心10分钟，Fc标签的抗原表达上清用MabSelect SuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH 3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和，最后洗脱下来的蛋白均通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得蛋白置换至PBS(pH 7.4)缓冲液中；His标签的抗原表达上清采用镍柱Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司，SA036050)纯化，并采用咪唑溶液进行洗脱，最后洗脱下来的蛋白均通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得蛋白置换至PBS(pH 7.4)缓冲液中。经SDS-PAGE鉴定和活性鉴定合格后入库冻存。

1.4人IL-23抗原生物素化

将实施例1.3制备的人IL-23-His与活化生物素(Thermofisher，21335)进行1:20的摩尔比混合，反应管置于冰内并反应2小时以完成生物素偶联。在4℃和5000g下，使用超滤离心管(PALL，OD010C35)将标记后蛋白置换至PBS缓冲液中以去除未偶联的生物素。经SDS-PAGE鉴定和活性鉴定合格后入库冻存。

1.5对照抗体表达纯化

对照抗体Guselkumab采用Expi-CHO瞬转表达系统进行表达，其中，用到的主要材料包括：Gibco培养基(货号：A29100-01)，Gibco转染试剂盒(货号：A29129)。

将含有Guselkumab抗体轻链的质粒和重链的质粒按照2:1的摩尔比进行混合，在25mL表达体系内，按照标准流程将上述质粒混合物(5μg)与转染试剂进行混合并滴加入25mL的Expi-CHO细胞表达体系中。充分混匀后，于37℃细胞培养箱内表达18-22小时。随后，向上述转染混合物中添加补料培养基并置于32℃细胞培养箱内继续培养。转染后第5天，添加第二次补料，并将细胞置于32℃细胞培养箱内继续培养10-12天。

将表达好的细胞混悬液进行高速离心并取上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后，采用Protein A/G亲和层析柱亲和法进行纯化。纯化后，用100mM甘氨酸盐(pH 3.0)洗脱目的蛋白，浓缩，置换缓冲液(pH7.4)，分装，经SDS-PAGE鉴定、SEC鉴定和活性鉴定合格后入库冻存。对照抗体Guselkumab的生物素化方法参见实施例1.4，制备得到Guselkumab-生物素。

实施例2抗体文库海选

在本实施例中，以人IL-23-His为正筛抗原，以人IL-12-His为负筛抗原，通过文库海选、单克隆初筛和测序等过程，最终从全人源抗体库中获得了多个特异性结合IL-23p19亚基的抗体分子。

2.1噬菌体展示抗体基因文库的构建

噬菌体展示抗体基因文库的构建参见专利CN202010236256.8。

2.2抗体基因噬菌体展示文库的筛选

2.2.1磁珠法筛选抗体基因噬菌体展示文库

用浓度为100nM的人IL-23His-生物素(实施例1制备的人-IL-23-His-生物素)与链霉亲和素偶联的磁珠孵育，使得IL-23-His-生物素结合到磁珠上。将结合人IL-23-His-生物素的磁珠和构建的噬菌体库室温下孵育2小时。经PBST洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体，继续加入胰酶(Gibco，25200072)轻轻混匀并反应20分钟，以洗脱特异性结合的抗体展示噬菌体。将洗脱下来的噬菌体侵染对数期的SS320菌体(Lucigen,MC1061 F)并静置30分钟，然后在220rpm条件下培养1小时，再加入VSCM13辅助噬菌体并静置30分钟，继续在220rpm条件下培养1小时，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继续用于下一轮的海选。从第二轮海选开始，增加人IL-12-His作为负筛，去除特异性结合p40亚基的噬菌体。用于第二轮、第三轮和第四轮的人IL-23-His-生物素浓度依次递减，分别为30nM、10nM和1nM，PBS润洗强度也逐渐加大，PBS洗脱次数依次为12次、16次和20次。

对每轮洗脱下来的噬菌体库进行ELISA检测来评价富集的效果，并从每轮筛选的库中随机挑选10个克隆进行序列分析以评估独特序列的比例。

2.2.2免疫管法筛选噬菌体展示抗体基因噬菌体文库

具体实施方法如下：

第一轮筛选时，在免疫管中加入1mL浓度为100μg/mL的人IL-23-His(实施例1制备)，4℃包被过夜，第二天弃去包被液，加入5％脱脂牛奶封闭2小时，PBS润洗两次后加入总量为10¹⁴的全人源抗体库噬菌体，孵育2小时，用PBS和PBST先后润洗8遍和2遍以去除非特异性结合的噬菌体，然后往免疫管中加入0.8mL浓度为0.05％的EDTA胰酶消化液，用于洗脱特异性结合目标抗原的噬菌体，接着将其侵染生长到对数期的SS320菌体(Lucigen，60512-1)，37℃静置30分钟，然后220rpm条件下培养1小时，再加入VSCM13辅助噬菌体，静置30分钟，继续在220rpm条件下培养1小时，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，并于30℃，220rpm环境下继续培养过夜。从第二轮海选开始，增加人IL-12-His作为负筛，以去除特异性结合p40亚基的噬菌体。用于第二轮、第三轮和第四轮的人IL-23-His包被浓度依次递减，分别为30μg/mL，10μg/mL和3μg/mL，PBS润洗强度也逐渐加大，PBS洗脱次数依次为12次，16次和20次。

对每轮洗脱下来的噬菌体库进行ELISA检测来评价富集的效果，并从每轮筛选的文库中随机挑选10个克隆进行序列分析以评估独特序列的比例。

2.3单克隆的挑选

对第三轮和第四轮洗脱下来的噬菌体感染大肠杆菌后进行涂板，挑选单克隆、ELISA结合评价、测序和序列分析，最终将1个最优克隆的序列进行全长构建。

实施例3抗体全长构建、表达和纯化

在本实施例中，将实施例2中获得的1个具有亲和活性的Fab构建为人IgG1型，轻链为Lambda，抗体类型为全人源抗体。

质粒构建：从筛选获得的含有Fab抗体菌株中，PCR扩增获取抗体轻、重链可变区片段(序列参见序列表)，通过同源重组方法，分别构建至含有轻、重链恒定区片段(SEQ IDNO：32和SEQ ID NO：31)的真核表达载体质粒(pcDNA3.0)上，组成分别包含完整的抗体轻、重链全长基因的表达质粒。

质粒准备：将构建好的包含抗体轻重链全长基因的表达质粒分别转化到大肠杆菌SS320中，37℃过夜培养，利用无内毒素质粒抽提试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒抽提，得到无内毒素的抗体轻链质粒和重链质粒以供真核表达使用。

抗体的表达纯化：通过Expi-CHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)，利用获得质粒进行表达，具体方法如实施例1.5所示，制备得到的含完整抗体轻链重链恒定区的抗体编号为A44。

实施例4抗体的亲和阻断能力

在本实施例中，检测了抗体A44对重组蛋白人IL-23的亲和活性和阻断人IL-23与人IL-23R结合的能力。

4.1基于ELISA检测抗体的亲和能力

在96孔ELISA板上，包被抗人IgG(Fab特异性)山羊抗体(Sigma，I5260-1ML)，2μg/mL，4℃孵育过夜。次日，将孔板用PBST清洗3次，加入2％BSA(生工，A600332-0100)封闭2小时。随后，将孔板用PBST清洗3次后，加入梯度稀释的上述制备的抗体A44和对照抗体Guselkumab(梯度稀释的起始浓度为10μg/mL，稀释倍数为3倍稀释，梯度稀释8次)，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗3次，加入如上实施例1制备的人IL-23-His-生物素，2μg/mL，孵育1小时。随后，加入1:5000稀释的亲和素-HRP(Thermo Fisher，434423)，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)并避光显色5-10分钟，根据显色情况，加入2M的HCl终止反应。通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)读取OD450下的数值并采用四参数拟合，结果显示在图1中，结果表明，抗体A44与人IL-23的结合能力略弱于Guselkumab。

4.2基于ELISA检测抗体的阻断能力

在本实施例中，应用兼具灵敏度及信噪比的阻断体系参数，对A44检测其阻断人IL-23与人IL-23R结合的能力，具体如下：

在96孔ELISA板上，包被如上制备的人IL-23R蛋白，8μg/mL，4℃孵育过夜。次日，将孔板用PBST清洗3次，加入2％BSA(生工，A600332-0100)封闭2小时。随后，将孔板用PBST清洗3次，在加入孔板前将抗原IL23-生物素(实施例1.4制备)分别和抗体A44或Guselkumab进行等体积预混，其中抗原终浓度为0.5μg/mL，抗体A44或Guselkumab进行梯度稀释(起始浓度为10μg/mL，3倍梯度稀释，稀释8次)，之后向PBST清洗过的孔板加入上述抗原和抗体的混合物并孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗3次，加入1:5000稀释的亲和素-HRP(ThermoFisher，434423)，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)并避光显色5-10分钟，根据显色情况，加入2M的HCl终止反应。通过酶标仪(MolecularDevices，SpecterMax 190)读取OD450下的数值并采用四参数拟合，结果显示在图2中，结果表明，抗体A44阻断人IL-23与人IL-23R结合的能力略弱于Guselkumab。

实施例5抗体工程改造

为了提升抗体在抑制细胞内STAT3磷酸化的能力，本实施例对抗体A44进行了抗体工程改造。

本实施例中，对母本分子A44进行亲和力成熟改造，用于提高亲和力和生物学活性。亲和力成熟改造过程如下：对采用AbM定义的CDR进行改造，亲和力成熟改造是基于M13噬菌体展示技术，采用codon-based引物(引物合成过程中，单个密码子由NNK组成)引入CDR区突变，共构建4个噬菌体展示文库，文库1和文库2为单点组合突变，文库1为CDRL1+CDRL3+CDRH3组合突变，文库2为CDRL2+CDRH1+CDRH2组合突变；文库3和文库4为双点饱和突变，文库3为CDRL3的双点饱和突变，文库4为CDRH3的双点饱和突变。文库的库容大小见表1。

以母本分子为模板通过PCR方式获得单个CDR区突变片段，再通过重叠PCR方式获得Fab全长抗体(VL-CL-接头-VH-CH1),再通过双酶切(HindⅢ和NotⅠ)和双粘端连接将点突变抗体连接到噬菌体展示载体中，最后通过电转将带有突变位点的抗体序列转入大肠杆菌(SS320)中。

构建好的4个文库包装成噬菌体后，进行淘筛，液相淘筛：展示抗体Fab的噬菌体与生物素化的靶点抗原结合，磁珠通过捕获生物素化的靶点抗原，将噬菌体吸附，通过降低投入生物素化的抗原量压力淘选亲和力更高的抗体，经过淘洗，洗脱，侵染大肠杆菌(SS320)进行下一个循环的淘选；固相淘筛：以包被在免疫管上的抗原结合展示抗体Fab的噬菌体，通过降低包被抗原量压力淘选亲和力高的抗体，经过淘洗，洗脱，侵染大肠杆菌(SS320)进行下一个循环的淘选；筛选方法参考实施例2.2中的筛选部分，淘选2-3个循环后，挑选单克隆进行亲和ELISA检测，筛选亲和力较强克隆构建全长IgG进行哺乳动物细胞表达。至此完成1轮亲和力成熟改造过程。

重复上述亲和力成熟过程2-3轮后获得的改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L的序列参见序列表。

表1文库设计及库容表

文库名称	文库设计	突变设计	库容大小
				库1	CDRL1+CDRL3+CDRH3	单点组合突变	1E+8
库2	CDRL2+CDRH1+CDRH2	单点组合突变	1E+8
				库3	CDRL3	双点饱和突变	1E+3
库4	CDRH3	双点饱和突变	1E+3

实施例6改造后抗体的亲和阻断能力

在本实施例中，检测了改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L对重组蛋白人IL-23的亲和活性和阻断人IL-23与人IL-23R结合的能力。

6.1基于ELISA检测改造后抗体的亲和能力

在96孔ELISA板上，包被人IL-23-His(实施例1制备)，2μg/mL，4℃孵育过夜。次日，将孔板用PBST清洗3次，加入5％脱脂牛奶封闭2小时。随后，将孔板用PBST清洗3次后，分别向不同孔加入梯度稀释的改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L或对照抗体Guselkumab(起始浓度1μg/mL，从起始浓度开始，第2、第8浓度点是在前一浓度的基础上9倍稀释，其他浓度点为前一浓度点的3倍稀释)，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗3次，加入1:5000稀释的山羊抗人λ链抗体-HRP(Abcam，ab200966)，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)并避光显色5-10分钟，根据显色情况，加入2M的HCl终止反应。通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)读取OD450下的数值并采用四参数拟合。结果显示在图3A-图3B中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L和人IL-23的结合能力优于Guselkumab。

6.2基于ELISA检测抗体的阻断能力

检测方法参见实施例4.2，结果显示在图4A-图4B中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L阻断人IL-23和人IL-23R结合的能力略弱于Guselkumab。

实施例7改造后抗体和人IL12-p40亚基的结合

在本实施例中，检测了改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L对p40亚基的结合能力。

在96孔ELISA板上，包被人IL-12-His(实施例1制备)，2μg/mL，4℃孵育过夜。次日，将孔板用PBST清洗3次，加入5％脱脂牛奶(伊利)封闭2小时。随后，将孔板用PBST清洗3次后，加入梯度稀释(起始浓度3μg/mL，从起始浓度开始第2浓度点,第8浓度点分别是在上一浓度的基础上进行9倍稀释，其他浓度点是在上一浓度点基础上进行3倍稀释)的改造后的抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L、对照抗体Guselkumab和IL-12的阳性抗体抗人IL-12抗体和同亚型对照IgG1，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗3次，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG-Fc-HRP(Abcam，ab97225)，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)并避光显色5-10分钟，根据显色情况，加入2M的HCl终止反应。通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)读取OD450下的数值并采用四参数拟合，结果显示在图5A-图5C中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L对人IL-12的p40亚基不结合，即S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L特异性结合人IL-23的p19亚基。

实施例8改造后抗体和猴IL-23的结合

在本实施例中，检测了改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L对猴IL-23的结合。

在96孔ELISA板上，包被猴IL-23-His(AcroBio，ILB-CM52W8)，2μg/mL，4℃孵育过夜。次日，将孔板用PBST清洗3次，加入5％脱脂牛奶封闭2小时。随后，将孔板用PBST清洗3次后，加入梯度稀释(起始浓度3μg/mL，第2浓度点,第8浓度点是在前一浓度点基础上进行9倍稀释，其他浓度点是在上一浓度点基础上进行3倍稀释)的改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L、对照抗体Guselkumab和同亚型对照IgG1，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗3次，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG-Fc-HRP(Abcam，ab97225)，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)并避光显色5-10分钟，根据显色情况，加入2M的HCl终止反应。通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)读取OD450下的数值并采用四参数拟合，结果显示在图6A-图6C中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L与猴IL-23的结合能力与Guselkumab相当。

实施例9改造后抗体和鼠IL-23的结合

在本实施例中，检测了改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L对鼠IL-23的结合。

在96孔ELISA板上，包被鼠IL-23-His(Novoprotein，CI18)，2μg/mL，4℃孵育过夜。次日，将孔板用PBST清洗3次，加入5％脱脂牛奶(伊利)封闭2小时。随后，将孔板用PBST清洗3次后，加入梯度稀释(起始浓度3μg/mL，第2浓度点,第8浓度点是在前一浓度点基础上进行9倍稀释，其他浓度点是在上一浓度点基础上进行3倍稀释)的改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L、对照抗体Guselkumab和同亚型对照IgG1，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗3次，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG-Fc-HRP(Abcam，ab97225)，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)并避光显色5-10分钟，根据显色情况，加入2M的HCl终止反应。通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)读取OD450下的数值并采用四参数拟合，结果显示在图7A-图7C中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L与小鼠IL-23有较好的结合能力，而Guselkumab基本与鼠IL-23不结合。

实施例10改造后抗体表位分析

在本实施例中，检测了改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL和S5-4H6L与Guselkumab在结合人IL-23表位上的差异。

在96孔ELISA板上，包被人IL-23-His(实施例1制备)，2μg/mL，4℃孵育过夜。次日，将孔板用PBST清洗3次，加入5％脱脂牛奶封闭2小时。随后，将孔板用PBST清洗3次后，加入梯度稀释(起始浓度5μg/mL，3倍系列稀释，稀释8次)的改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L、对照抗体Guselkumab和同亚型对照IgG1，孵育1小时。随后，各孔继续加入Guselkumab-生物素(与生物素(Thermofisher)偶联的Guesekumab，制备方法参见实施例1.4)并孵育1小时。将孔板用PBST清洗3次，加入1:5000稀释的NeutrAvidin-HRP(ThermoFisher，434423)，孵育1小时。随后，将孔板用PBST清洗6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)并避光显色5-10分钟，根据显色情况，加入2M的HCl终止反应。通过酶标仪(MolecularDevices，SpecterMax 190)读取OD450下的数值并采用四参数拟合，结果显示在图8A-图8B中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L与Guselkumab结合人IL-23相同的表位，改造后抗体更小的IC50值可能与其更高的亲和力有关。

实施例11改造后抗体抑制细胞内STAT3磷酸化

在本实施例中，检测了改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L在抑制人IL-23激活细胞STAT3磷酸化的效果。

IL-23与其受体结合刺激TyK2和JAK2信号通路，激活STAT3的磷酸化，随后产生SEAP分泌型碱性磷酸酶。通过抗体中和IL-23，可以抑制STAT3信号通路的激活从而抑制分泌型碱性磷酸酶的产生。本实施例基于上述原理，选择了荧光素酶基因报告系统HEK-Blue^TMIL-23细胞(InvivoGen，hkb-il23)。

收集指数生长期的HEK-Blue^TM IL-23细胞，将细胞消化计数，离心去上清，用10％FBS/DMEM培养基重悬后计数，用10％FBS/DMEM将细胞密度调整为5×10⁵个/mL，按100μL/孔的细胞量加入到96孔平底细胞培养板中。用10％FBS/DMEM梯度稀释抗体或配制实施例1制备的IL-23-His，将梯度稀释好的抗体((起始浓度1μg/mL，3倍系列稀释，稀释8次))改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L、对照抗体Guselkumab和同亚型对照IgG1分别与人IL-23-His预混30分钟后，加入96孔平底细胞培养板，每孔100μL，37℃培养箱孵育20-24小时(其中，人IL-23-His的终浓度为8ng/mL)。提前配制QUANTI-Blue Solution，其中，QBreagent:QB buffer:sterile water＝1:1:98，涡旋震荡混匀，室温孵育10分钟。将配制好的QUANTI-Blue Solution加入到96孔平底细胞培养板中，每孔20μL，37℃培养箱孵育3-6小时后检测OD630。结果显示在图9A-图9B中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L在抑制IL-23激活细胞STAT3磷酸化的能力上远远优于Guselkumab。

实施例12改造后抗体抑制小鼠脾细胞分泌IL-17

在本实施例中，检测了改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L在抑制IL-23激活小鼠脾细胞分泌IL-17的能力。

IL-23是介导机体炎症反应的一个重要的细胞因子。人IL-23能够促进小鼠脾细胞IL-17的分泌。本实施例将IL-23和IL-23的中和性抗体(即改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L)一起加入到小鼠脾细胞，IL-23的抗体能中和IL-23的活性，抑制IL-23诱导小鼠脾脏细胞IL-17的分泌。通过测定培养上清中小鼠IL-17A的浓度可以检测IL-23抗体的中和活性。

提取小鼠(C57/BL6小鼠，上海杰思捷)脾脏，研磨后用100μm细胞滤网过滤，离心去上清，加入红细胞裂解液裂解5分钟，离心去上清，用小鼠脾脏细胞培养基洗一遍。用小鼠脾脏细胞培养基重悬并计数，用检测培养基将细胞密度调整为2.5×10⁶个/mL，其中检测培养基成分为RPMI-1640培养基、10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、1％青霉素/链霉素、50μMβ-巯基乙醇、50ng/mL rhIL-2。用检测培养基梯度稀释抗体(起始浓度0.5μg/mL，三倍连续稀释，共6个点)或IL-23-His，将梯度稀释的改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L、对照抗体Guselkumab和同亚型对照IgG1分别与实施例1制备的人IL-23-His预混30分钟后，加入96孔平底细胞培养板，每孔100μL(其中，人IL-23-His的终浓度为8ng/mL)。随后，将小鼠脾细胞加入96孔平底板中，每孔100μL，37℃培养4天后吸取细胞上清，用ELISA预包板(R&D，DY421-05)按照标准流程(按照试剂盒说明书标准操作流程)对小鼠IL-17A的含量进行定量。结果显示在图11A-图11C中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL在0.063μg/mL剂量浓度下、改造后抗体S5-15HWTL在0.167μg/mL剂量浓度下、改造后抗体S5-4H6L在0.056μg/mL剂量浓度下，即可达到更优于Guselkumab的抑制IL-23激活小鼠脾细胞分泌IL-17的能力。

实施例13改造后抗体热稳定性检测

在本实施例中，检测了改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L的热稳定性。

制备抗体溶液，0.25mg/mL，19μL/孔，每个供试品设置三个平行孔，并以PBS和IPI作为参比。然后在每个孔中加入1μL浓度为100×的SYPRO orange染料，准备上机。利用ABI7500FAST RT-PCR仪器进行测试，试验类型选择熔解曲线，采用连续模式，扫描温度范围为25～95℃，升温速率为1％，25℃平衡5分钟，在升温过程中采集数据，报告基团选择ROX，淬灭基团选择None，反应体积20μL，以熔解曲线一阶导数的第一个峰谷对应的温度确定为候选抗体的变性温度。结果显示在表2中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL的Tm值接近70℃，成药性非常好。

表2抗体理化性质汇总表

	DSF(℃)
		S5-5HWTL	69.9
S5-15HWTL	68.2

实施例14改造后抗体亲和力检测

在本实施例中，利用Biacore检测了改造后抗体S5-5HWTL、S5-15HWTL、S5-4H6L与实施例1制备的人IL-23-His的亲和力。结果显示在表3中，结果表明，改造后抗体S5-5HWTL和S5-4H6L在K_on上优于Guselkumab，在K_off上稍差于Guselkumab，整体的K_D与Guselkumab相当。

表3抗体亲和动力学汇总表

	KD(M)	Ka(1/MS)	Kd(1/S)
				Guselkumab	2.46E-11	8.74E+04	2.15E-06
S5-5HWTL	6.25E-11	1.11E+05	6.97E-06
				S5-15HWTL	1.08E-10	1.09E+05	1.18E-05
S5-4H6L	5.89E-11	1.02E+05	6.03E-06

表4：序列表

序列表

<110> 三优生物医药（上海）有限公司

<120> 一种靶向IL-23p19的抗体或其抗原结合片段及其应用

<130> PF 210457CNI

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Asp Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Thr Gly Ser Ser Ser Ser Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Gln

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Arg Ser Thr Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Gly Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Ser Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val Gln Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Arg Ser Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Gly Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 10

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Ser Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val Gln Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Arg Ser Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Gly Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Asp Arg Phe Gly Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Phe Gly Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Phe Gly Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Thr Gly Gly Ser Ser Ser Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Gln

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 15

Val Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Gly Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 16

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 16

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Ser Ser Ser Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val Gln Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Arg Ser Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Gly Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 17

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 17

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Ser Ser Ser Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val Gln Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Arg Ser Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Gly Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 18

Gly Phe Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn

1 5 10

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 19

Asp Arg Thr Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 20

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 20

Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Thr Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 21

Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Thr Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 22

Asp Arg Phe Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 23

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Phe Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Phe Ser Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 25

Thr Gly Gly Gln Ser Ser Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Gln

1 5 10

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 26

Val Ser Tyr Asp Ala Ser Leu Gly Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 27

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 27

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Gln Ser Ser Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val Gln Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Arg Ser Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ser Tyr Asp Ala Ser

85 90 95

Leu Gly Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 28

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 28

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Gln Ser Ser Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val Gln Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Arg Ser Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ser Tyr Asp Ala Ser

85 90 95

Leu Gly Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 29

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Asp Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 30

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Asn Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 31

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 31

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 32

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 33

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asn Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Tyr Tyr Lys Pro Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 34

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 34

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Thr Asp Gly

85 90 95

Leu Ser Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 35

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成的

<400> 35

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

1 5 10 15

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

20 25 30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

35 40 45

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

50 55 60

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

65 70 75 80

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

85 90 95

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

100 105 110

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

115 120 125

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

130 135 140

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

145 150 155 160

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

165 170 175

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

180 185 190

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

195 200 205

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

Claims

1.抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段，其包含：

(i)如SEQ ID NO:12所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:16所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或者在所述6个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的变体；

(ii)如SEQ ID NO:20所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:16所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或者在所述6个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的变体；或

(iii)如SEQ ID NO:23所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:27所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或者在所述6个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的变体。

2.抗IL-23p19抗体或其抗原结合片段，其包含：

3.权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中重链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:12、20、23的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与选自SEQ ID NO:12、20、23的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；和/或

轻链可变区

(i)包含与选自SEQ ID NO:16、27的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

4.权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段，其包含：

5.权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段，其还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。

6.权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其中

重链恒定区

(iii)包含与选自SEQ ID NO:31的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或

轻链恒定区

7.权利要求1至6中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1形式或IgG2形式或IgG3形式或IgG4形式的抗体或抗原结合片段。

8.权利要求1至7中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1形式的抗体或抗原结合片段。

9.权利要求1至8中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。

10.权利要求1至9中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人抗体或嵌合抗体。

11.权利要求1至10中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)₂、单结构域抗体例如VHH、dAb(domain antibody)或线性抗体。

12.权利要求1至11中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有一种或多种以下性质：

(i)特异性结合IL-23的p19亚基而不结合p40亚基；

(ii)具备优异的与人、鼠和食蟹猴IL-23交叉结合的特性；

(iii)阻断IL-23与受体IL-23R结合的能力与对照抗体Guselkumab相当或者更佳；

(iv)抑制IL-23激活细胞STAT3磷酸化的能力比对照抗体Guselkumab更佳；

(v)抑制IL-23激活小鼠脾细胞分泌IL-17的能力比对照抗体Guselkumab更佳。

13.分离的核酸，其编码权利要求1至12中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区或重链可变区，或轻链或重链。

14.包含权利要求13的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。

15.包含权利要求13的核酸或权利要求14的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如293细胞或CHO细胞，例如CHO-S细胞或HEK293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

16.制备结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至12中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养权利要求15的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段。

17.免疫缀合物，其包含权利要求1至12中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段和其它物质，例如细胞毒性剂。

18.药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段或权利要求17的免疫缀合物，以及任选地一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂，以及任选地药用辅料。

19.药物组合，其包含权利要求1至12中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段或权利要求17的免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。

20.预防或治疗受试者中免疫系统疾病(例如自身免疫疾病或炎症，例如克罗恩病、中度至严重活动性溃疡性结肠炎、银屑病关节炎、掌跖脓疱症和银屑病)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至12中任一项的结合IL-23p19的抗体或其抗原结合片段、或权利要求17的免疫缀合物、或权利要求18的药物组合物、或权利要求19的药物组合。

21.权利要求20的方法，其中所述方法还包括向患者施用一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂，优选地，治疗方式包括手术治疗和/或放射疗法，其它治疗剂选自化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。

22.检测样品中IL-23p19的方法，所述方法包括

(a)将样品与根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求17的免疫缀合物接触；以及

(b)检测抗体或其抗原结合片段与IL-23p19间的复合物的形成；任选地，抗体是被可检测地标记的。