CN115779100A - 一种pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，具体方法为：(1)制备ZnO‑Ag纳米颗粒，(2)制备含有巯基的叔胺化合物，(3)制备ZAN@CS纳米材料。本发明还公开了该制备方法制备的ZAN@CS纳米材料在靶向清除幽门螺杆菌的应用，该纳米材料pH从酸性到中性都会有电荷转变的响应性，同时首次将ZnO‑Ag用于胃部幽门螺杆菌的感染；本发明的ZAN@CS纳米材料解决了现阶段抗生素治疗幽门螺杆菌的难点，即抗生素难以穿透粘液屏障，幽门螺杆菌生物膜的形成降低了抗生素的疗效，幽门螺杆菌对抗生素会产生耐药性，应用抗生素会破坏肠道正常菌群，引起肠道疾病等问题。
Description
技术领域
本发明属于新型纳米材料制备，具体涉及一种pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌是人类感染的最常见原因之一，特别是在发展中国家，其患病率可达到人口的90％。幽门螺杆菌每年都与高发病率和重大死亡率有关，被认为具有传染性，并与胃腺癌的发生有关。幽门螺杆菌是一种螺旋状的革兰氏阴性细菌，定植于人类胃肠道，主要是胃粘膜下层。它释放的尿素酶可以将尿素转化为氨，以增加菌体周围的pH值，抵抗胃酸的破坏，这也是长期定植于胃粘膜的一个重要原因。主要的毒力因子包括尿素酶的产生、运动能力、基因相关的细胞毒素(CagA)、空泡细胞毒素(VacA)和形成生物膜的能力。幽门螺杆菌产生的毒力因子可以直接作用于胃粘膜，刺激粘膜细胞、中性粒细胞和巨噬细胞分泌大量的炎症趋化因子，从而引起严重的炎症反应。目前针对幽门螺杆菌感染的一线治疗方案包括三联疗法，即两种抗生素(阿莫西林加克拉霉素或甲硝唑)和质子泵抑制剂，然而由于胃部特殊环境，抗生素的利用率较低，抗生素难以穿透粘液屏障，治疗幽门螺杆菌后还会影响正常肠道菌群，从而产生肠道疾病。另外，针对抗生素耐药的幽门螺杆菌也越来越多，这些都大大降低了抗生素的疗效，而且三联疗法中患者需大量用药，导致患者依从性变差。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种制备方法简单，pH从酸性到中性都会有电荷转变响应的pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法以及所制备的ZAN@CS纳米材料在靶向清除幽门螺杆菌中的应用。
技术方案：为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，具体制备方法如下：
(1)制备ZnO-Ag纳米颗粒：将NaOH溶液加入含有Zn(CH3COO)2 2H2O溶液中，加热反应后得到的ZnO纳米颗粒；将ZnO和DA加入到Tris-HCL中，离心反应后得到ZnO@PDA；将ZnO@PDA和AgNO3分别溶解于有机溶剂中，混合后室温反应，离心后收集沉淀即得ZnO-Ag；
(2)制备含有巯基的叔胺化合物：将DCC、NHS和含有巯基的酸混合，再加入含有氨基的叔胺化合物反应，得到沉淀后旋蒸、洗涤，得到含有巯基的叔胺化合物；
(3)制备ZAN@CS纳米材料：将步骤(1)制备的ZnO-Ag和步骤(2)制备的含有巯基的叔胺化合物在有机溶剂中混合，得到沉淀后，将沉淀分散在水中，加入壳聚糖混合、离心，所得沉淀为ZAN@CS纳米材料。
进一步地，步骤(1)所述NaOH水溶液缓慢加入含有Zn(CH3COO)2 2H2O的甲醇溶液中，速度为每分钟加0.5～1mL，在80～90℃加热反应，反应5-8h后得到。
作为优选，步骤(1)所述NaOH水溶液缓慢加入含有Zn(CH3COO)2 2H2O的甲醇溶液中，速度为每分钟加0.5mL，在85℃加热反应为反应6h后得到ZnO纳米颗粒。
进一步地，步骤(1)ZnO与DA质量比为8～10:1mg，在800-1000rpm下搅拌反应2-3小时。
作为优选，步骤(1)ZnO与DA质量比为9:1mg，在800rpm下搅拌反应2小时。
进一步地，步骤(1)所述AgNO3和ZnO@PDA分别加入乙醇溶液中，室温下600-1000rpm混合反应时间为5～7小时。
作为优选，步骤(1)所述AgNO3和ZnO@PDA分别加入乙醇溶液中，室温下800rpm混合反应时间为6小时。
进一步地，步骤(2)中在甲醇溶液中加入DCC、NHS和含有巯基的酸室温反应1～3h，再加入含有氨基的叔胺化合物室温反应20～24h。
进一步地，步骤(3)中ZnO-Ag和含有巯基的叔胺化合物在乙醇体系中，800-1000rpm混合4-6小时。
进一步地，步骤(3)所述沉淀与低分子量的壳聚糖质量比为1～5:1～5mg，室温混合5～7h。
作为优选，步骤(2)制备的含有巯基的叔胺化合物为SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2，具体制备方法为：将DCC、NHS和巯基乙酸混合，再加入N,N-二乙基乙二胺反应，得到沉淀后旋蒸、洗涤，得到SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2；
作为优选，步骤(3)制备ZAN@CS纳米材料的具体方法为：将步骤(1)制备的ZnO-Ag和步骤(2)制备的SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2在有机溶剂中混合，得到沉淀ZnO-Ag-N(C2H5)2后，将沉淀分散在水中，加入壳聚糖混合、离心，所得沉淀为ZnO-Ag-N(C2H5)2@CS(ZAN@CS纳米材料)。
作为优选，步骤(2)中在甲醇溶液中加入DCC、NHS和巯基乙酸室温反应2h催化活化巯基乙酸的羧基，再加入N,N-二乙基乙二胺室温反应24h。
作为优选，步骤(3)中ZnO-Ag和SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2在乙醇体系中，800rpm混合4小时。
作为优选，步骤(3)所述ZnO-Ag-N(C2H5)2与低分子量的壳聚糖质量比为1:1mg，室温混合6h。
其中，本发明一种pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法所制备的ZAN@CS纳米材料pH响应范围从酸性到中性。
作为优选，pH4酸性响应的是H.pylori生存环境，ph7中性响应的是肠道环境。
本发明还提供一种pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法所制备的ZAN@CS纳米材料在靶向清除幽门螺杆菌的应用。
进一步地，所述靶向清除幽门螺杆菌的应用为靶向清除胃部幽门螺杆菌的应用。
发明原理：壳聚糖外壳可以粘附在胃粘膜上并携带纳米颗粒穿透粘液屏障。壳聚糖降解后，叔胺在酸性条件下带正电，使纳米粒子通过静电作用与带负电的幽门螺杆菌结合；而在肠道的中性条件下，叔胺带负电，使纳米粒子对肠道内的正常菌群产生排斥作用，不影响肠道内的正常菌群。ZnO在酸性条件下具有弱过氧化物酶活性，可以产生ROS以清除细菌，中性条件下无催化活性。ZnO-Ag到达幽门螺杆菌部位后，释放出Ag+和Zn2+，破坏幽门螺杆菌的生物膜，抑制细菌毒力因子，缓解炎症反应，同时抑制尿素酶活性，使胃酸恢复正常，与纳米材料一起裂解细菌，使细菌内容物流出，从而清除幽门螺杆菌。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
1、本发明制备的ZAN@CS纳米材料制备方法简单，pH从酸性到中性都会有电荷转变的响应性，同时基于ZnO-Ag抑制幽门螺杆菌，现有技术中ZnO-Ag大多被用于光学方面的应用，相对少量用于抗菌，本发明首次将ZnO-Ag用于胃部幽门螺杆菌的感染。
2、本发明首次合成的ZAN@CS(ZnO-Ag-N(C2H5)2@CS)纳米材料，可以穿透胃粘液屏障，靶向幽门螺杆菌，抑制毒力因子调节炎症反应，清除幽门螺杆菌生物膜，增加幽门螺杆菌细菌膜通透性，清除幽门螺杆菌，同时对肠道内的正常菌群没有影响。
3、本发明制备的材料中包含有巯基的叔胺化合物，首次将含有巯基的叔胺化合物在不同pH条件下所带电荷不同的性质，用于幽门螺杆菌靶向，和纳米材料杀菌的选择性。
4、本发明制备的材料中包含SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2，将SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2在不同pH条件下所带电荷不同的性质，用于幽门螺杆菌靶向，和纳米材料杀菌的选择性，即在pH值为4时SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2带正电荷，可靶向幽门螺杆菌，而在肠道中性条件下，pH值为7时SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2带负电荷，与细菌相斥，从而不会影响肠道内有益菌群。
5、本发明首次合成的ZAN@CS纳米材料解决了现阶段抗生素治疗幽门螺杆菌的难点，即抗生素难以穿透粘液屏障，幽门螺杆菌生物膜的形成降低了抗生素的疗效，幽门螺杆菌对抗生素会产生耐药性，应用抗生素会破坏肠道正常菌群，引起肠道疾病等问题。
附图说明
图1为本发明制备出ZnO的透射电子显微镜(TEM)图；
图2为本发明ZnO@PDA的透射电子显微镜(TEM)；
图3为本发明ZnO纳米颗粒的紫外吸收峰；
图4为本发明Ag纳米颗粒的紫外吸收峰；
图5为本发明ZnO-Ag的X射线衍射(XRD)图谱；
图6为本发明ZAN@CS的傅里叶变换红外光谱(FTIR)；
图7为本发明ZAN@CS的抑菌情况；
图8为本发明共聚焦显微镜下看ZAN@CS对幽门螺杆菌生物膜的清除情况；
图9为结晶紫染色判断ZAN@CS对幽门螺杆菌生物膜的清除情况；
图10为ZAN在不同pH下的抑菌效果；
图11为幽门螺杆菌定植成功的q-PCR图谱；
图12为体内给药后胃组织幽门螺杆菌计数结果(G1：Control组、G2：ZAN组、G3:ZA@CS组、G4:ZAN@CS组、G5:MDE组)。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
ZAN@CS纳米材料的制备方法
(1)ZnO纳米颗粒的制备：将0.5mmol的Zn(CH3COO)2 2H2O(109.75mg)溶于10ml甲醇，1mmolNaOH溶于8ml水，而后在85℃下将NaOH水溶液缓慢加入含有Zn(CH3COO)2 2H2O的甲醇溶液中，每分钟加0.5ml，85℃反应6h后，8000rpm离心得到的白色沉淀即为ZnO纳米颗粒。
ZnO@PDA纳米颗粒的制备：将pH为8.5的Tris-HCL与ZnO:DA(多巴胺)以9:1的比例混合(即将40mg ZnO加到10ml 1M Tris-HCl中加入4.44mg DA)，800rpm搅拌下反应2小时，离心后收集黑色沉淀即为ZnO@PDA。
ZnO-Ag纳米颗粒的制备：将40mgZnO@PDA分散于10ml乙醇中，将1.2mg AgNO3溶解于5ml乙醇中，将含有AgNO3的乙醇溶液加入含有ZnO@PDA的乙醇溶液中，800rpm下室温反应6h后，8000rpm离心后收集棕色沉淀即得ZnO-Ag。
(2)SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2的制备：在DCC(二环己基碳二亚胺)，NHS(羟基琥珀酰亚胺)催化下活化巯基乙酸的羧基，即在15ml甲醇溶液中加入1872mg DCC与526.3mgNHS和巯基乙酸510μL，室温反应2h，后加入265μL N,N-二乙基乙二胺继续室温反应24h，得到的白色沉淀旋蒸，用无水乙醚(体积分数≥95％)洗涤，离心即得SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2沉淀。
(3)ZnO-Ag-N(C2H5)2@CS纳米材料的制备：将步骤(1)所得的ZnO-Ag沉淀(40mg)与步骤(2)制备的SH-CH2-CO-NH-(CH2)2-N(C2H5)2(400mg)加入到20ml乙醇体系中800rpm混合4小时，利用巯基与银纳米颗粒的结合制备出灰色沉淀ZnO-Ag-N(C2H5)2。将制备出的ZnO-Ag-N(C2H5)2(100mg)(ZAN)分散在20ml水中，以1:1的比例加入低分子量(＜2000)的壳聚糖(CS)(100mg)，800rpm搅拌混合6h，8000rpm离心所得灰色沉淀即为ZnO-Ag-N(C2H5)2@CS(ZAN@CS)。
实施例2
ZnO，ZnO@PDA的透射电子显微镜(TEM)图
采用实施例1步骤(1)制备的ZnO和ZnO@PDA，取4mg分别分散于1ml无水乙醇中，用200μL的移液枪滴加一滴在铜网上，进样，调焦，拍摄(JEM-F200场发射透射电子显微镜)。如图1所示，ZnO纳米颗粒呈现类似鱼的形状，分散均匀，无明显聚集，粒径在200nm左右；如图2所示，根据不同衬度(外层浅色衬度为PDA)看到ZnO表面包覆的PDA，粒径在220nm左右。透射电子显微镜(TEM)图表明了ZnO，ZnO@PDA的成功合成。
实施例3
ZnO，Ag纳米颗粒的紫外吸收峰
首先制备Ag纳米颗粒，将10mg PDA于10ml乙醇中，800rpm搅拌下加入10mg AgNO3，搅拌4h后，8000rpm离心得褐色粉末Ag纳米颗粒，利用实施例1步骤(1)制备的ZnO纳米颗粒，分别取出制备好的20μg ZnO、Ag纳米颗粒分散于200μL无水乙醇中，置于96孔板中，在酶标仪(SpectraMax M5)中检测300～700nm波长(step＝2nm)。如图3所示，紫外吸收图谱中显示在373cm-1处有一峰为ZnO的特征峰，如图4所示，紫外吸收图谱中显示在400～500cm-1处的宽峰为Ag的特征吸收峰，表明了ZnO，Ag的成功合成。
实施例4
ZnO-Ag的X射线衍射(XRD)图谱
将实施例1步骤(1)制备的ZnO-Ag粉末送公司(杭州海路医疗科技有限公司)检测，结果如图5所示，从x射线衍射(XRD)图来看，ZnO-Ag的图与ZnO(图3)和Ag(图4)的标准卡片出峰位置一致，表明了ZnO，ZnO-Ag的成功合成。
实施例5
ZAN@CS的傅里叶变换红外光谱(FTIR)
分别取10mg ZAN、CS、ZAN@CS纳米颗粒(实施例1制备)用傅立叶变换红外吸收光谱仪在4000-400cm-1的波数范围内扫描红外图谱。如图6所示，为制备的ZAN@CS纳米颗粒的红外光谱图，对于壳聚糖(CS)，FTIR光谱在1658cm-1处显示出透射峰，这归因于酰胺I带的C＝O拉伸，在1580cm-1处显示为酰胺II带的NH弯曲，这表明CS在ZAN纳米颗粒表面的成功包覆，证明ZnO-Ag-N(C2H5)2@CS(ZAN@CS)合成成功。
实施例6
幽门螺杆菌的培养
取幽门螺杆菌(江苏省肿瘤发生与干预重点实验室保存并提供)，接种到液体培养基(LB肉汤HB0218)中，培养到OD600＝1，将OD600＝1的菌涂布于幽门螺杆菌固体培养基(海博生物技术有限公司)表面，在微厌氧，37℃环境下培养直至长出雾状菌落。培养幽门螺杆菌生物膜时取OD600＝3的菌液2mL加入激光共聚焦皿或96孔板中，在微厌氧环境下培养三天，弃去上清及表面的浮游菌，得到生物膜。
实施例7
ZAN@CS纳米材料对游离幽门螺杆菌H.pylori的清除
取不同浓度的ZAN@CS纳米材料的水分散液(0、80、120、160μg/ml)50μl与OD600＝1的液体培养基中的幽门螺杆菌200μl，37℃共孵育不同时间(4、6、8、12、24h)，孵育之后分别取200μl涂于固体培养基表面，微厌氧、37℃下培养三天，将培养得到的H.pylori刮于液体培养基中，通过吸光度OD600的影响判断细菌的清除情况。如图7所示，H.pylori的清除率呈时间和浓度依赖性，160μg/ml在24h的抑菌率可达86.67％。
实施例8
ZAN@CS纳米材料对幽门螺杆菌生物膜的清除
将实施例1制备的ZnO、ZnO-Ag、ZAN(分别为80μg/ml水溶液、200μL)加入到培养的生物膜中(实施例6)共孵育36小时，对照组不加纳米材料，加200μl PBS即可，孵育结束后用1ml生理盐水溶液(0.9％NaCl)冲洗生物膜一次，将被清除的死细菌冲洗下来，同时取0.5μl染料SYTO-9置于1ml生理盐水溶液(0.9％NaCl)中，使其终浓度为2.5μM，向生物膜表面滴加SYTO-9，37℃，避光染色30min，用1mL生理盐水清洗，再进行激光共聚焦成像。如图8所示，ZAN、ZnO-Ag组相比于Control组生物膜几乎被全部清除，效果比ZnO组更加明显，说明ZAN@CS纳米材料中的ZAN、ZnO-Ag因为Zn2+、Ag+的协同作用，具有更好的生物膜清除效果，ZAN与ZnO-Ag组差别不显著，主要原因为体外环境的限制，材料与菌的靶向不明显。
除此之外，从结晶紫染色实验判断生物膜的清除效果。将实施例1制备的ZnO、ZnO-Ag、ZAN(分别为80μg/ml、200μl)加入到培养的生物膜中(实施例6)与分别孵育24、36小时，对照组不加纳米材料，加200μl PBS即可。孵育结束后首先去除上层已被清除的生物膜碎片，留下生物膜和一部分液体残留，而后轻拍干，加入200μl PBS洗涤，洗涤三次，最后轻拍干。其次，加入200μl甲醇固定底部未被洗掉的残留生物膜，室温静置20min，使甲醇完全挥发，风干。接下来，加入1％结晶紫水溶液200μl，室温静置，染色15min后再次用PBS洗涤，去除，轻拍干。最后，加入33％乙酸在37℃烘箱静置，溶解30min，取出后用酶标仪测OD570。如图9所示，生物膜的清除也有一定的时间依赖性，36h时生物膜的清除效果更明显，说明ZAN@CS纳米材料中的ZAN、ZnO-Ag组清除能力更强，效果同激光共聚焦成像结果，表明材料具有清除幽门螺杆菌生物膜的能力。
实施例9
不同pH下ZAN@CS纳米材料对细菌(E.coli)的抑制情况
取60μl大肠杆菌置于3ml液体培养基中，37℃、180rpm在摇床上摇2.5h达到细菌生长对数期，取200μl菌液与50μl不同pH(4/7)条件下溶解的不同浓度的材料的水溶液(10/20/40/80/120/160μg/ml)37℃共孵育6h，孵育后将菌液稀释108倍，取100μl涂布于固体培养基表面，37℃培养一天，进行平板计数判断细菌抑制情况，如图10所示，细菌的抑制呈浓度依赖性，且由于pH4时ZAN@CS纳米材料带正电荷，更容易与细菌结合，pH 4条件下抑菌情况明显高于pH 7(此时ZAN@CS纳米材料带负电荷)，表明ZAN@CS纳米材料具有pH响应性，在不同pH下所带电荷不同，抑菌情况也不同，在胃内酸性条件下叔胺质子化带正电荷，与带负电的幽门螺杆菌静电吸引，可靶向到幽门螺杆菌部位，当材料到达肠道后，中性条件下材料带负电，与肠道有益菌群产生静电排斥，综上可得出ZAN@CS可以抑制胃内H.pylori，而不影响肠道内有益菌群。
实施例10
H.pylori感染模型的构建：通过灌胃的方式让幽门螺杆菌定植在小鼠的胃部，灌胃前给小鼠禁食2h，而后取OD600＝3的菌300μl给小鼠灌胃，灌胃后禁食2h，灌胃三天后停止三天，H.pylori定植于胃部，三天后处死小鼠，取出小鼠胃组织，进行胃组织匀浆，而后加入消化液过夜消化胃组织，用DNA提取试剂盒(Tanon)提取胃内基因组DNA，DNA提取后溶于100μl DEPC水中，取1μl DNA，3μl纯水，前、后引物(HP-R：CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC、HP-F：TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC)各0.5μl，5μlSYBR-5酶置于q-PCR点样孔中，混合均匀后上机，如图11所示，幽门螺杆菌感染的胃组织相比于正常胃组织，具有更多H.pylori的DNA，表明H.pylori感染模型的成功构建。
实施例11
将实施例1制备出的ZnO-Ag(100mg)(ZA)分散在20ml水中，以1:1的比例加入低分子量(＜2000)的壳聚糖(CS)(100mg)，800rpm搅拌混合6h，8000rpm离心得到ZnO-Ag@CS(ZA@CS)。
ZAN@CS纳米材料对体内胃部的幽门螺杆菌的清除：首先通过实施例10的灌胃方式让幽门螺杆菌定植在小鼠的胃部，确认小鼠定植成功后，五组小鼠分别给300μl、30mg/Kg的PBS、ZAN、ZA@CS(ZnO-Ag@CS)、ZAN@CS、甲硝唑(MTT)五天，给药最后一天后间隔36h，处死小鼠，取出胃组织，进行胃组织匀浆，液体培养基重悬，取出200μl涂布于固体培养基表面，微厌氧、37℃下培养三天，将H.pylori刮于液体培养基中，通过吸光度OD600的影响判断细菌的清除情况。如图12所示，ZAN@CS(G4)纳米材料的抑菌性能最好，与甲硝唑组(G5)效果相似，ZA@CS组(G3)和ZAN组(G2)抑菌效果较差，因为分别缺少季铵盐的靶向性各壳聚糖的粘液渗透性，可体现ZAN@CS纳米材料靶向性和粘液渗透性的重要性。
Claims (10)
1.一种pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，其特征在于，具体制备方法如下：
(1)制备ZnO-Ag纳米颗粒：将NaOH溶液加入含有Zn(CH3COO)2 2H2O溶液中，加热反应后得到的ZnO纳米颗粒；将ZnO和DA加入到Tris-HCL中，离心反应后得到ZnO@PDA；将ZnO@PDA和AgNO3分别溶解于有机溶剂中，混合后室温反应，离心后收集沉淀即得ZnO-Ag；
(2)制备含有巯基的叔胺化合物：将DCC、NHS和含有巯基的酸混合，再加入含有氨基的叔胺化合物反应，得到沉淀后旋蒸、洗涤，得到含有巯基的叔胺化合物；
(3)制备ZAN@CS纳米材料：将步骤(1)制备的ZnO-Ag和步骤(2)制备的含有巯基的叔胺化合物在有机溶剂中混合，得到沉淀，将沉淀分散在水中，加入壳聚糖混合、离心，得ZAN@CS纳米材料。
2.根据权利要求1所述的pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述NaOH水溶液缓慢加入含有Zn(CH3COO)2 2H2O的甲醇溶液中，速度为每分钟加0.5～1mL，在80～90℃加热反应，反应5-8h后得到ZnO纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)ZnO与DA质量比为8～10:1mg，在800-1000rpm下搅拌反应2-3小时。
4.根据权利要求1所述的pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述AgNO3和ZnO@PDA分别加入乙醇溶液中，室温下600-1000rpm混合反应时间为5～7小时。
5.根据权利要求1所述的pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中在甲醇溶液中加入DCC、NHS和含有巯基的酸室温反应1～3h，再加入含有氨基的叔胺化合物室温反应20～24h。
6.根据权利要求1所述的pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中ZnO-Ag和含有巯基的叔胺化合物在乙醇体系中，800-1000rpm混合4-6小时。
7.根据权利要求1所述的pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述沉淀与低分子量的壳聚糖质量比为1～5:1～5mg，室温混合5～7h。
8.根据权利要求1所述的pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法制备的ZAN@CS纳米材料pH响应范围从酸性到中性。
9.一种利用权利要求1所述的pH响应型ZAN@CS纳米材料的制备方法所制备的ZAN@CS纳米材料在靶向清除幽门螺杆菌的应用。
10.根据权利要求9所述的靶向清除幽门螺杆菌的应用，其特征在于，所述靶向清除幽门螺杆菌的应用为靶向清除胃部幽门螺杆菌的应用。
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