CN115747230A - 耐辐射异常球菌dodH基因及其提高生物抗逆性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种使用dodH基因提高生物抗逆性的方法，该方法包括：将dodH基因转入宿主生物中，并且使得宿主生物中表达所述dodH基因；所述宿主生物为植物或微生物；所述dodH基因编码如下蛋白(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有NADH依赖的脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。通过上述技术方案，本发明提高了植物或微生物的生物抗逆性，特别是提高了植物或微生物的干燥抗性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种使用dodH基因提高生物抗逆性的方法。
背景技术
植物或微生物受到胁迫后，一些被伤害致死，另一些的生理活动虽然受到不同程度的影响，但它们可以存活下来。如果长期生活在这种胁迫环境中，通过自然选择，有利性状被保留下来，并不断加强，不利性状不断被淘汰。这样，在植物或微生物长期的进化和适应过程中，不同环境条件下生长的植物或微生物就会形成对某些环境因子的适应能力，即能采取不同的方式去抵抗各种胁迫因子。植物或微生物对各种胁迫(或称逆境)因子的抗御能力，称为抗性(stress resistance)，也称抗逆性。
极端微生物是一类可以在极端环境下存活的微生物。已知的极端微生物主要包括耐辐射菌、嗜热菌、嗜盐菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜冷菌和嗜压菌等。从特殊环境中筛选极端抗性的菌株，挖掘相关抗性基因资源，可为培育优良性状的转基因作物新品种及品系等实际应用，提供丰富的抗逆功能基因来源。
异常球菌属细菌是地球上迄今为止发现的最具辐射抗性的微生物，其中耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)R1菌株是1956年首次被鉴定的异常球菌属细菌，其对于电离辐射(>15kGy)和紫外线辐射(>600J/m2)、干燥胁迫、氧化胁迫具有超强的抗性。耐辐射异常球菌R1的全基因组测序于1999年完成，基因组序列显示一半以上预测的ORF编码未知功能蛋白，在数据库中这些蛋白在其他生物中没有匹配的编码基因。
发明内容
本发明的目的是从耐辐射异常球菌基因组中发现能够增强细胞耐受干燥抗性的基因，并且进一步提高植物或微生物的生物抗逆性，特别是提高植物或微生物的干燥抗性。
为了实现上述目的，本发明提供了一种使用耐辐射异常球菌dodH基因提高生物抗逆性的方法，该方法包括：将dodH基因转入宿主生物中，并且使得宿主生物中表达所述dodH基因；所述宿主生物为植物或微生物；所述dodH基因编码如下蛋白(a)或(b)：(a)由SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有NADH依赖的脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。
通过上述技术方案，本发明提高了植物或微生物的生物抗逆性，特别是提高了植物或微生物的干燥抗性。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是构建耐辐射异常球菌缺失突变株△dodH示意图。
图2构建融合片段及验证△dodH突变株电泳图谱。
A：构建融合片段电泳图：Lane M：Trans2K plusⅡ；U：dodH基因上游同源臂的PCR扩增产物；Km：卡纳抗性基因的PCR产物；D：dodH基因下游同源臂的PCR扩增产物；U-Km-D为融合片段的PCR扩增产物；B：验证dodH突变株电泳图：Lane M：Trans 2K plusⅡ；Lane1&4野生型WT的PCR产物；Lane2&5：突变株dodH的PCR产物；Lane3&6：阴性对照。
图3为山梨醇胁迫条件下，DR野生型和△dodH突变株胁迫表型实验结果图。
图4为干燥胁迫条件下，DR野生型和△dodH突变株胁迫表型实验结果图。
图5为重组工程菌株BL21-dodH构建示意图。
图6为BL21-dodH重组工程菌株耐渗透胁迫抗性实验结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种使用dodH基因提高生物抗逆性的方法，该方法包括：将dodH基因转入宿主生物中，并且使得宿主生物中表达所述dodH基因；所述宿主生物为植物或微生物；所述dodH基因编码如下蛋白(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有NADH依赖的脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。
其中，优选地，所述dodH基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
其中，dodH基因是从耐辐射异常球菌中克隆得到的基因。dodH基因所编码的蛋白(SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列)含有NADH依赖的脱氢酶结构域(NAD-dependentdehydratase family protein)，由此命名为dodH。本发明发现，该基因转入其它生物(宿主生物)后，能够为宿主生物带来明显增强的干燥抗性。
其中，优选地，该方法还包括将所述dodH基因插入载体中得到重组载体，并且将所述重组载体转入所述宿主生物中。
其中，优选地，所述重组载体是核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子。其中，SEQ ID NO.3是含有T7启动子的完整dodH基因重组质粒pET28a-dodH，其是将dodH基因片段连接于线性化的pET28a表达载体上得到的，该质粒含有高效表达目的基因的T7启动子。
其中，优选地，所述宿主生物为大肠杆菌。
其中，优选地，所述宿主生物为大肠杆菌BL21菌株。
其中，优选地，所述宿主生物为真菌。
其中，优选地，所述宿主生物为酿酒酵母、假丝酵母或毕赤酵母。
其中，优选地，所述宿主生物为植物，优选为拟南芥、油菜、玉米、水稻、小麦、烟草、大豆或棉花。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。
以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
耐辐射异常球菌△dodH基因缺失突变菌株的构建。
本实施例使用如表1所示的引物(SEQ ID NO.4-13)。
表1
以D.radiodurans基因组为模板，PCR扩增目的基因dodH的上游片段525bp(U)和下游片段524bp(D)，以pKatAPH3质粒为模版，PCR扩增卡那霉素抗性基因片段970bp(K)，经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，目的片段切胶回收，采用一步融合法进行融合PCR反应，得到三片段的融合产物2019bpU-K-D，回收后的片段送测序公司测序。
D.radiodurans感受态细胞制备及融合片段转化：在超净工作台中，用CaCl2处理方法进行融合片段遗传转化，倒置于30℃培养箱中培养2-3d。
突变株抗性筛选：从转化后的TGY平皿中挑取单菌落，接种于新鲜TGY培养基中，在含有不同抗性压力的Km(卡那霉素)平板上筛选缺失突变株ΔdodH，确保该基因完全突变。
阳性克隆鉴定及测序验证：从完成抗性筛选的平皿中，挑取单菌落接种于新鲜TGY培养基，培养2-3d，收集菌液提取基因组，进行突变株验证。首先验证突变株是否完成突变，用dodH基因内部引物YZdodH-F/R分别扩增DR野生型和△dodH，产物长度为682bp；其次验证基因突变的位置是否正确，用外部引物YZ-dodHUD-F/R分别扩增DR野生型和△dodH，产物长度为分别为2916bp和2920bp，同时送PCR产物至测序。
实验结果显示通过同源重组方法，用Km抗性盒替代dodH目的基因策略，成功构建不含dodH基因的突变菌株△dodH(见图1，及图2)。
实施例2dodH基因提高细胞耐受山梨醇胁迫的实验分析
实验菌株为实施例1得到的含有耐辐射异常球菌dodH基因的△dodH菌株；对照菌株为耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)野生型菌株。
将D.radiodurans野生型菌株和实施例1构建成功的△dodH菌株在TGY固体培养基平板上划线活化；挑取单菌落分别接种于5mL新鲜的TGY液体培养基(重组菌株添加10μg/mLKm抗生素)中30℃培养2-3d，至指数中期；按1％重新转接到20mL新鲜的TGY液体培养基中(重组菌株添加10μg/mL Km抗生素)，培养至生长对数初期菌液OD600＝0.6～0.8左右；取出1mL菌液，室温下6000rpm离心5min收集菌体，然后用相同体积的已灭菌磷酸缓冲液(pH7.0)将菌体洗涤两次，震荡均匀；高浓度山梨糖醇胁迫实验：将重悬后的菌体进行倍比稀释(10-1-10-5)，每个稀释度各取8μL点在含有不同山梨醇浓度(0.6M、0.8M、1.0M)的TGY固体培养基表面，以不添加山梨醇的TGY固体培养基点样板作为空白对照，经30℃培养约4d左右，观察菌落形成情况。且分别进行三次独立重复实验。实验结果显示，胁迫处理前菌体的生长量基本保持一致，在含不同浓度山梨醇的TGY固体平皿中渗透胁迫处理4d后，突变株ΔdodH比野生型菌株DR对山梨糖醇的冲击更加敏感，并随着山梨醇浓度的增加，野生型和突变株间的差异逐渐增大，特别是1.0M山梨醇浓度下，突变株比野生型生存能力低1个数量级。说明dodH基因的缺失造成细胞对渗透胁迫敏感，表明该基因表达对菌体应对渗透胁迫有一定贡献。实验结论表明D.radiodurans的dodH基因具有显著提高细胞耐受渗透胁迫抗性的功能。
实施例3
耐辐射异常球菌dodH基因提高细胞干燥胁迫抗性的实验分析。
实验菌株为实施例1得到的含有耐辐射异常球菌dodH基因的△dodH菌株；对照菌株为耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)野生型菌株。
将D.radiodurans野生型菌株和实施例1构建成功的△dodH菌株在TGY固体培养基平板上划线活化；挑取单菌落分别接种于5mL新鲜的TGY液体培养基(重组菌株添加10μg/mLKm抗生素)中30℃培养2-3d，至指数中期；按1％重新转接到20mL新鲜的TGY液体培养基中(重组菌株添加10μg/mLKm抗生素)，培养至生长对数初期菌液OD600＝0.6～0.8左右；取出20mL菌液，室温下6，000rpm离心5min收集菌体，然后用相同体积的已灭菌磷酸缓冲液(pH7.0)将菌体洗涤两次，震荡均匀；干燥胁迫实验：取100μL菌液于2mL圆底离心管底部，每个样品做3个重复，然后将载有菌液的离心管敞口放置于已灭菌的干燥器内(干燥器内以硅胶作为干燥剂)，每隔10天野生型WT和△dodH突变株各取出1管，分别加1mL的磷酸缓冲液浸润30min，然后用无菌磷酸缓冲液等比稀释(10-1至10-5)。每个稀释度各取8μL点在TGY固体培养基表面，经30℃恒温培养2-3d，观察野生型和突变株在培养基上的生长情况。分别进行三次独立重复实验。
实验结果显示，突变株ΔdodH相对于野生型DR菌株来说，对干燥的抗性有所降低，并随着干燥时间的增加，野生型和突变株间的差异逐渐增大，从20d的干燥胁迫处理开始，突变株比野生型生存能力低1个数量级；直到50d干燥胁迫处理条件下，突变株比野生型生存能力低3个数量级。充分说明dodH的缺失直接造成细胞对干燥胁迫敏感，表明该基因的表达对菌株应对干燥胁迫具有显著的贡献。
实验结论证实D.radioduransdodH基因具有提高细胞抵抗干燥胁迫抗性的功能。
实施例4
重组工程菌株BL21-dodH构建实验。
表2
使用表2的含有同源臂的引物(SEQ ID NO.14-15)进行PCR扩增得到目的基因片段，以耐辐射异常球菌基因组DNA为模板扩增得到目的基因序列。
PCR反应条件包括：98℃10min，[95℃30sec，60℃30sec，72℃2min]35个循环，72℃10min。
目的片段纯化回收：PCR扩增反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，约为30min，在紫外照胶仪下观察到条带分离清晰时，切胶并参照美基生物HiPure Gel Pure Micro Kit说明书进行产物纯化操作。
质粒双酶切：分别用HindⅢ和BamHI内切酶将载体pET28a进行双酶切。将体系置于37℃PCR仪中，酶切反应2h。酶切产物进行纯化回收，纯化产物于-20℃保存备用。
目的片段重组连接：将酶切、纯化后的线性化载体与带有同源臂的目的基因进行同源重组，参照Vazyme公司Clone
UItra One Step Cloning Kit(C115)试剂盒说明书，置于55℃金属浴中，进行30min连接反应。
连接产物转化：在超净工作台中，利用热激法直接转化克隆菌株E.coli DH5α感受态细胞，倒置于37℃培养箱中过夜培养。
阳性克隆鉴定及测序验证：从转化后的平皿中挑取单菌落，进行菌落PCR、酶切验证，并送华大基因生物公司测序。测序成功后，提取重组质粒重新转化E.coli BL21(DE3)表达菌株。将该菌株命名为BL21-dodH。含有pET28a空质粒菌株命名为BL21-0。
实验结果表明成功构建了表达dodH基因的重组大肠杆菌工程菌株BL21-dodH。
实施例5
含dodH基因重组工程菌株的胁迫抗性实验。
重组工程菌株为实施例2得到的含有dodH基因的BL21-dodH菌株；对照菌株为实施例2所述含空质粒的BL21-0菌株。
将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；挑取单菌落分别接种于5mL新鲜的LB液体培养基(重组菌株添加50μg/mLKm抗生素)中37℃过夜培养，至指数中后期；按1％重新转接到20mL新鲜的LB液体培养基中(重组菌株添加50μg/mLKm抗生素)，37℃培养1h后，加入终浓度为0.1mMIPTG诱导表达，继续培养至菌液OD600＝0.6～0.8左右；取出1mL菌液，室温下6,000rpm离心5min收集菌体，然后用相同体积的已灭菌磷酸缓冲液(pH7.0)将菌体洗涤两次，震荡均匀；高浓度山梨糖醇胁迫实验：将重悬后的菌体进行倍比稀释(10-1-10-5)，每个稀释度各取8μL点在含有1.0M山梨醇浓度的LB固体培养基表面，以不添加山梨醇的LB固体培养基点样板作为空白对照，经37℃培养约5d左右，观察菌落形成情况。且分别进行三次独立重复实验。
实验结果如图6所示，在长时间(5d)的不同高浓度山梨醇胁迫处理条件下，含有dodH基因的重组工程菌株BL21-dodH生长状况良好。在1.0M山梨醇胁迫条件下，重组工程菌株BL21-dodH菌落数与空质粒菌株BL21-0菌落数相差一个数量级，约10倍差异。表明重组工程菌株BL21-dodH具有较好的耐渗透抵抗力。
实验结论证实dodH基因的表达显著增强了原核生物抵抗渗透胁迫的能力(见图6)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种使用dodH基因提高生物抗逆性的方法，其特征在于，该方法包括：
将dodH基因转入宿主生物中，并且使得宿主生物中表达所述dodH基因；所述宿主生物为植物或微生物；所述dodH基因编码如下蛋白(a)或(b)：
(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有NADH依赖的脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述dodH基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，该方法还包括将所述dodH基因插入载体中得到重组载体，并且将所述重组载体转入所述宿主生物中。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述重组载体是核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主生物为大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述宿主生物为大肠杆菌BL21菌株。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主生物为真菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述宿主生物为酿酒酵母、假丝酵母或毕赤酵母。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主生物为植物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主生物为拟南芥、油菜、玉米、水稻、小麦、烟草、大豆或棉花。
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2022
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王文涛;周正富;陈明;林敏;张维;: "耐辐射异常球菌的胁迫应答反应及信号转导系统", 生物技术进展, no. 02, pages 96 - 102 * |
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