CN115747136A - 一种人脐静脉血管内皮细胞huvec的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，包括以下：步骤一、取新鲜的健康产妇新生儿脐带，冲洗、消化离心，分离出HUVEC细胞；步骤二、采用二氧化碳培养箱和完全培养基培养HUVEC细胞，获得原代内皮细胞；步骤三、将正常的内皮细胞继续消化、离心后传代培养。本发明采用新鲜的健康产妇新生儿脐带，采用I型胶原酶消化分离得到脐静脉血管内皮原代细胞，细胞长得快，长满后的HUVEC按照1：3传代，2‑3天即可长满；细胞传代次数增多，按照1：3传代，细胞可以传至19代；细胞功能状态较好，细胞传代19代，细胞对DIL‑Ac‑OXLDL的吸收效率>90%。同时经济实用，简便易行，有利于获得所需的体外实验模型细胞。

Description

一种人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法。

背景技术

人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，简称HUVEC)，是由足月分娩的胎儿脐带静脉血管中分离得来并可体外培养的细胞，由于其对药物或刺激的反应性最接近人体而且相对容易获得，同时具有重要的生理功能，广泛参与了炎症反应、血管新生、免疫应答、动脉粥样硬化、血管张力调节等生理及病理过程，因此，体外成功培养血管内皮细胞，为体外研究大血管内皮细胞功能的提供重要的研究载体。

然而，人脐静脉血管内皮细胞体外生长能力较差，原代培养不易成功。通常存在细胞传代次数少、细胞长得慢的问题。目前，酶消化法是获取血管内皮细胞的主要方法之一，此法获得的细胞较纯，且能较好地保持其生物活性。但现有的酶消化法存在一定的缺陷：（1）内皮细胞代次数少；（2）细胞长得慢，原代培养周期过长。

胶原酶对细胞间质有较强的消化作用，能使内皮细胞与胶原组织成功分离，且不损伤内皮细胞，分离出的血管内皮细胞数量多，杂细胞污染少，且细胞贴壁能力强，作为最理想的血管内皮细胞分离酶，能够保持细胞活性和结构完整性。

发明内容

针对现有技术中细胞传代次数少、细胞长得慢的技术问题，本发明的目的在于提供了人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法。

为了达到上述目的，本发明技术方案如下：

一种人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，包括以下步骤：

步骤一、取新鲜的健康产妇新生儿脐带，冲洗、消化离心，分离出HUVEC细胞；

步骤二、采用二氧化碳培养箱和完全培养基培养HUVEC细胞，获得原代内皮细胞；

步骤三、将正常的内皮细胞继续消化、离心后传代培养。

进一步的，所述步骤一，具体过程如下：

1）选材：取健康新生儿的新鲜脐带，长15-20cm，离体时间<4小时，放入无菌含双抗的PBS溶液中于冰桶中冷藏储存；

2）冲洗：用一只灌胃针头扎入脐带静脉血管中，用血管钳夹住脐带，用无菌含双抗的PBS溶液冲洗至流出液体中无可见血液；

3）消化：将冲洗后的脐带加入消化液A中，并置于二氧化碳培养箱内，在37℃温度下消化10-15分钟；

4）终止消化：将消化后的液体收集到一个50ml无菌离心管中，用DMEM培养基冲洗脐带1次，再用含5%FBS的DMEM冲洗脐带1次并终止反应；

5）离心：将收集液以2500转/分的转速离心10分钟；倒去上清，加入10ml完全培养基，用滴管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，即获得分离出的HUVEC细胞液。

进一步的，所述消化液A采用10-15ml的I型胶原酶，其浓度lmg/ml。

进一步的，所述步骤二，具体过程如下：

1）初次培养：将步骤一分离出的HUVEC细胞，于二氧化碳培养箱内在37℃下，培养24小时；

2）清洗：初次培养后，倒掉培养基，并用无菌含双抗的PBS溶液清洗2-3次，洗掉血细胞和死细胞；

3）二次培养：再次加入10ml新鲜的ECM完全培养基，每3天换一次培养基，直至细胞汇合至70%；之后，每2天换一次培养基，直到观察到内皮细胞长满，外观如同鹅卵石，获得原代内皮细胞。

更进一步的，所述原代内皮细胞培养3-4天，细胞可长满至90%单层，为合格品。

进一步的，所述步骤三，具体过程如下：

1）二次消化：倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2ml消化液B消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，将消化液B从培养瓶转移到15ml离心管中，此时一小部分细胞可能已经脱落；并继续在37℃下孵育培养瓶一分钟，此时培养瓶中没有溶液；孵育结束时，轻轻敲击培养瓶的侧面以将细胞从表面脱落；在显微镜下观察，以确保所有细胞脱落下来；向培养瓶中加入2ml DMEM培养基，该DMEM培养基不含血清，并将脱落的细胞转移到15ml离心管中；用另外3毫升含5%FBS的DMEM培养基冲洗培养瓶终止消化并收集残留的细胞；

2）离心：将所消化的细胞转移到一个15ml无菌离心管中，1000转/分，离心5分钟；

3）传代培养：倒掉上清，加入6ml新鲜培基，分装到提前准备好完全培养基的新培养瓶中，一瓶细胞可传代3瓶；根据需求培养传代的HUVEC细胞。

进一步的，所述消化液B采用含有0.02% EDTA的0.05%胰酶。

进一步的，所述HUVEC细胞选择3-14代用于实验。

进一步的，所述完全培养基采用sciencell品牌ECM培养基，含有1x ECGS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、5% FBS。

进一步的，所述培养瓶采用T25透气培养瓶；使用1%明胶包被细胞培养瓶，将2毫升1%明胶加到T25透气培养瓶，37℃培养箱孵育培养瓶30分钟以上，弃去培养瓶中的液体，培养瓶晾干。

有益效果：本发明采用新鲜的健康产妇新生儿脐带，采用I型胶原酶消化分离得到脐静脉血管内皮原代细胞，细胞长得快，长满后的HUVEC按照1：3传代，2-3天即可长满；细胞传代次数增多，按照1：3传代，细胞可以传至19代；细胞功能状态较好，细胞传代19代，细胞对DIL-Ac-OXLDL的吸收效率>90%。同时经济实用，简便易行，有利于获得所需的体外实验模型细胞，为进一步研究血管内皮细胞的生物学特性及其与各种疾病的关系提供帮助，为心脑血管相关疾病以及肿瘤的研究具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中内皮细胞在培养基中扩增和传代的光镜照片(100x)；

图2为本发明实施例中P5代和P14代内皮细胞鉴定的免疫荧光图；

图3为本发明实施例中P14代和P19代内皮细胞对Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）的吸收效率鉴定图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

一种人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，包括：

步骤一、取新鲜的健康产妇新生儿脐带，冲洗、消化离心，分离出HUVEC细胞，如下：

S101）选材：取健康新生儿的新鲜脐带，长15-20cm，离体时间<4小时，放入无菌含双抗的PBS溶液中于冰桶中冷藏储存；

S102）冲洗：用一只灌胃针头扎入脐带静脉血管中，用血管钳夹住脐带，用无菌含双抗的PBS溶液冲洗至流出液体中无可见血液；

S103）消化：将冲洗后的脐带加入消化液A（10-15ml的I型胶原酶，其浓度lmg/ml）中，并置于二氧化碳培养箱内，在37℃温度下消化10-15分钟；

S104）终止消化：将消化后的液体收集到一个50ml无菌离心管中，用DMEM培养基冲洗脐带1次，再用含5%FBS的DMEM冲洗脐带1次并终止反应；

S105）离心：将收集液以2500转/分的转速离心10分钟；倒去上清，加入10ml ECM完全培养基，用滴管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中；

步骤二、采用二氧化碳培养箱和ECM完全培养基培养HUVEC细胞，获得原代内皮细胞，如下：

S201）初次培养：将步骤一分离出的HUVEC细胞，于二氧化碳培养箱内在37℃下，培养24小时；

S202）清洗：初次培养后，倒掉培养基，并用无菌含双抗的PBS溶液清洗2-3次，洗掉血细胞和死细胞；

S203）二次培养：再次加入10ml新鲜的ECM完全培养基，每3天换一次培养基，直至细胞汇合至70%；之后，每2天换一次培养基，直到细胞长满至90%单层，为合格品。

步骤三、将正常的内皮细胞继续消化、离心后传代培养，如下：

S301）二次消化：倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2ml消化液B（含有0.02% EDTA的0.05%胰酶）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，将消化液B从培养瓶转移到15ml离心管中，并继续在37℃下孵育培养瓶一分钟，孵育结束时，轻轻敲击培养瓶的侧面以将细胞从表面脱落；在显微镜下观察，以确保所有细胞脱落下来；向培养瓶中加入2ml DMEM培养基，该DMEM培养基不含血清，并将脱落的细胞转移到15ml离心管中；用另外3毫升含5%FBS的DMEM培养基冲洗培养瓶终止消化并收集残留的细胞；

S302）离心：将所消化的细胞转移到一个15ml无菌离心管中，1000转/分，离心5分钟；

S303）传代培养：倒掉上清，加入6ml新鲜培基，分装到提前准备好完全培养基的新培养瓶中，一瓶细胞可传代3瓶；根据需求培养传代的HUVEC细胞；选择3-14代HUVEC细胞用于实验。

具体的，所述完全培养基采用sciencell品牌ECM培养基，含有1x ECGS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、5% FBS。

具体的，所述培养瓶采用T25透气培养瓶；使用1%明胶包被细胞培养瓶，将2毫升1%明胶加到T25透气培养瓶，37℃培养箱孵育培养瓶30分钟以上，弃去培养瓶中的液体，培养瓶晾干。

实施例2

如图1所示为实施例1中内皮细胞在培养基中扩增和传代的光镜照片(100x)。把实施例1的内皮细胞传至第5代后，免疫荧光进行表面标志物的鉴定，结果显示培养的细胞主要为内皮细胞(vWF+、CD31+)；把实施例1的内皮细胞传至第14代后，免疫荧光进行表面标志物的鉴定，如图2所示，结果显示培养的细胞主要为内皮细胞(CD31+)，但与P5代比较，CD31+的细胞率显著降低。把实施例1的内皮细胞传至第14代后，实施对Dil-Ac-LDL的吸收试验，如图3所示，结果显示P14代的HUVEC细胞对Dil-Ac-LDL的吸收率>99%，第19代吸收率降低。

Claims (8)

1.一种人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，其特征在于，包括以下：

S1）取材：取健康新生儿的新鲜脐带，长15-20cm，离体时间<4小时，放入无菌含双抗的PBS溶液中于冰桶中冷藏储存；用一只灌胃针头扎入脐带静脉血管中，用血管钳夹住脐带，用无菌含双抗的PBS溶液冲洗至流出液体中无可见血液；

S2）一次消化：将冲洗后的脐带加入消化液A中，并置于二氧化碳培养箱内，在37℃温度下消化10-15分钟；将消化后的液体收集到一个50ml无菌离心管中，用DMEM培养基冲洗脐带1次，再用含5%FBS的DMEM培养基冲洗脐带1次并终止反应，获得收集液；

S3）一次离心：将收集液以2500转/分的转速离心10分钟；倒去上清，加入10ml ECM完全培养基中，用滴管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，即获得分离出的HUVEC细胞液；

S4）初次培养：将HUVEC细胞液，于二氧化碳培养箱内，在37℃下，培养24小时；

S5）二次培养：初次培养后，倒掉培养基，并用无菌含双抗的PBS溶液清洗2-3次，洗掉血细胞和死细胞；再次加入10ml新鲜的ECM完全培养基，每3天换一次培养基，直至细胞汇合至70%；之后，每2天换一次培养基，直到观察到内皮细胞长满，外观如同鹅卵石，获得原代内皮细胞。

2.如权利要求1所述的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，其特征在于，所述S5）之后，进行传代培养，步骤如下：

S6）二次消化：倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2ml消化液B消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，将消化液B从培养瓶转移到15ml离心管中，此时一小部分细胞可能已经脱落；并继续在37℃下孵育培养瓶一分钟，此时培养瓶中没有溶液，孵育结束时，轻轻敲击培养瓶的侧面以将细胞从表面脱落；在显微镜下观察，以确保所有细胞脱落下来；向培养瓶中加入2ml DMEM培养基，该DMEM培养基不含血清，并将脱落的细胞转移到15ml离心管中；用另外3毫升含5%FBS的DMEM培养基冲洗培养瓶终止消化并收集残留的细胞；

S7）离心：将所消化的细胞转移到一个15ml无菌离心管中，1000转/分，离心5分钟；

S8）传代培养：倒掉上清，加入6ml新鲜培基，分装到提前准备好完全培养基的新培养瓶中，一瓶细胞可传代3瓶；根据需求培养传代的HUVEC细胞。

3.如权利要求1所述的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，其特征在于，所述消化液A采用10-15ml的I型胶原酶，其浓度lmg/ml。

4.如权利要求1所述的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，其特征在于，所述原代内皮细胞培养3-4天，细胞可长满至90%单层，为合格品。

5.如权利要求2所述的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，其特征在于，所述消化液B采用含有0.02% EDTA的0.05%胰酶。

6.如权利要求2所述的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，其特征在于，所述HUVEC细胞选择3-14代用于实验。

7.如权利要求1或2所述的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，其特征在于，所述完全培养基采用sciencell品牌ECM培养基。

8.如权利要求1或2所述的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的分离培养方法，其特征在于，所述培养瓶采用T25透气培养瓶；使用1%明胶包被细胞培养瓶，将2毫升1%明胶加到T25透气培养瓶，37℃培养箱孵育培养瓶30分钟以上，弃去培养瓶中的液体，培养瓶晾干。

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