CN115746159A - 羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺，取鸡骨草粗多糖溶于NaOH溶液中，搅拌下加入一氯乙酸，然后继续搅拌反应；用HCl调至中性，终止反应；将反应液置于透析袋中透析，离心后，采用乙醇体系醇沉，冻干，即得羧甲基化鸡骨草多糖(CM‑ACP)。实验结果显示，该工艺所得羧甲基化鸡骨草多糖产品溶解性极佳。经本发明CM‑ACP处理后的小鼠免疫抑制和肠道损伤症状得到明显改善，体重指数、胸腺指数和脾脏指数下降缓解，结肠组织学评分降低。因此，本发明羧甲基化鸡骨草多糖能有效的预防环磷酰胺引起的免疫抑制和肠道损伤，在鸡骨草多糖的免疫制剂研究方面具有广阔的应用前景，为该多糖的后续研发及优化创新提供了思路。

Description

羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺及其应用

技术领域

本发明属于鸡骨草多糖技术领域，尤其涉及一种羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺及其应用。

背景技术

在大规模养殖的今天，越来越多的畜禽疾病涌现在生产中，其中免疫抑制性疾病在临床上多与其他疾病混合感染，造成免疫失败，饲养管理难度加大，用药效果不明显，严重影响畜牧养殖业的发展。

目前，国内外应对免疫抑制性疾病主要以免疫预防为主。中药产品作为“减抗”、“替抗”的主力军，在绿色健康养殖中发挥重要作用。大量研究报道，中药多糖具有良好的免疫调节活性，能调节免疫器官，使免疫细胞处于活跃状态，促进免疫相关细胞因子释放，上调维持肠道粘膜完整性的紧密连接和黏蛋白的表达，抑制肠上皮细胞的病理性凋亡，增强肠道免疫屏障，维持肠道微环境稳定。

多糖的生物活性与其分子结构密切相关，用适当的方法对多糖结构进行分子修饰可能会一定程度上改善天然多糖的理化性质，增强生物活性。羧甲基化多糖指多糖链中单糖分子上的一个或几个羟基被羧甲基基团取代而形成的一类结构复杂、活性多样、具有良好溶解性的多聚电解质产物。

鸡骨草多糖(Polysaccharide from Abrus cantoniensis，ACP)免疫调节活性的研究已见报道，但由于其水溶性欠佳可能限制了其生物活性的进一步发挥，制约了其在临床上的应用推广。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺及其应用，该工艺所得羧甲基化鸡骨草多糖产品溶解性极佳，它可以增强机体免疫力，有效预防环磷酰胺诱导的免疫抑制和肠道损伤。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺，取鸡骨草粗多糖溶于NaOH溶液中，搅拌下加入一氯乙酸，然后继续搅拌反应；用HCl调至中性，终止反应；将反应液置于透析袋中透析，离心后，采用乙醇体系醇沉，冻干，即得羧甲基化鸡骨草多糖。

一氯乙酸的浓度为2.1mol/L；反应的温度为69℃、反应的时间为4h。

鸡骨草粗多糖的纯度为70％；NaOH溶液浓度为3mol/L，HCl浓度为2.0mol/L，乙醇体系为80％。

透析袋截留分子量为3500Da。

透析的时间为48h，离心的转速为4000r/min、时间为15min。

鸡骨草粗多糖、NaOH溶液、一氯乙酸的质量体积比为100mg：10ml：10ml。

上述制备工艺所得的羧甲基化鸡骨草多糖，羧甲基取代度为0.51。

上述羧甲基化鸡骨草多糖在制备增强机体免疫力(全身免疫和肠黏膜免疫)的药物中的应用。

上述羧甲基化鸡骨草多糖在制备缓解环磷酰胺诱导的免疫抑制和肠道损伤的药物中的应用。

药物为口服药物。

针对鸡骨草多糖(ACP)水溶性、活性欠佳的问题，发明人尝试对其进行羧甲基化修饰改性，改善ACP的理化性质，提高ACP的免疫调节活性，使其适用于临床生产。为此，发明人建立了一种羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺，取鸡骨草粗多糖溶于NaOH溶液中，搅拌下加入一氯乙酸，然后继续搅拌反应；用HCl调至中性，终止反应；将反应液置于透析袋中透析，离心后，采用乙醇体系醇沉，冻干，即得羧甲基化鸡骨草多糖(Carboxymethylatedderivative of ACP，CM-ACP)。为研究工艺影响因素及其作用，发明人采用响应面分析法优化，以氯乙酸浓度、制备温度和反应时间为自变量建立三因素三水平的响应面实验方案深入研究优化该工艺。实验结果显示，当氯乙酸浓度2.1mol/L，制备温度69℃，反应时间4h时，羧甲基化鸡骨草多糖有最高取代度0.51。

发明人以KM小鼠为实验对象，通过环磷酰胺(CTX)建立免疫抑制和肠道损伤模型，从小鼠一般情况，结肠组织病理学检测，血清、组织细胞因子检测，紧密连接蛋白表达，肠道菌群及肠道代谢角度进一步研究了本发明CM-ACP对CTX诱导的免疫抑制和肠道损伤的作用。实验结果显示，经本发明CM-ACP处理后的小鼠免疫抑制和肠道损伤症状得到明显改善，体重指数、胸腺指数和脾脏指数下降缓解，结肠组织学评分降低。分析表明，CM-ACP通过NF-KB和IL22/STAT3通路提高机体免疫相关细胞因子水平，维持免疫器官正常形态，降低肠上皮细胞凋亡，修复肠粘膜损伤，并通过调整肠道代谢，纠正菌群失调，增加机体短链脂肪酸(SCFAs)含量。因此，本发明羧甲基化鸡骨草多糖能有效的预防环磷酰胺引起的免疫抑制和肠道损伤，在鸡骨草多糖的免疫制剂研究方面具有广阔的应用前景，为该多糖的后续研发及优化创新提供了思路。

附图说明

图1是本发明羧甲基化鸡骨草多糖制备工艺研究中标准曲线图，图中：A苯酚-硫酸法的标准曲线，B铬变酸-硫酸法的标准曲线。

图2是响应面法优化羧甲基化鸡骨草多糖制备工艺3D直观图，图中：C温度和氯乙酸浓度相互作用，D时间和温度，E时间和氯乙酸。

图3是动物实验流程示意图。

图4是各组小鼠的体重变化图(第10天到14天)。

图5是各组小鼠结肠组织HE染色结果图，图中：a NC，b CTX，c AMP，d ACPL，eACPM，f ACPH，g CM-ACPL，h CM-ACPM，I CM-ACPH。

图6是各组小鼠结肠组织学评分图。

图7是动物实验免疫相关细胞因子分泌水平结果图一，图中：F血清中IL-2，G血清中IL-4，H血清中TNF-α，I血清中IFN-γ，J血清中IgG，K结肠组织中IL-2。

图8是动物实验免疫相关细胞因子分泌水平结果图二，图中：L结肠组织中IL-4，M结肠组织中TNF-α，N结肠组织中IFN-γ。

图9是NF-KB和IL-22/STAT3通路的相关指标结果图一，图中：A结肠组织中TLR2，B结肠组织中TLR4，C结肠组织中MyD88，D结肠组织中P65，E结肠组织中Occludin1，F结肠组织中Muc2。

图10是NF-KB和IL-22/STAT3通路的相关指标结果图二，图中：G血清中IL-1β，H血清中IL-17D，I血清中IL-22，J结肠组织中IL-1β，K结肠组织中IL-17D，L结肠组织中IL-22。

图11是NF-KB和IL-22/STAT3通路的相关指标结果图三，图中：M组织中STAT3，N组织中CD93。

图12是各组小鼠主要短链脂肪酸的水平结果图，图中：A.乙酸、B.丙酸、C.丁酸。

具体实施方式

1.材料与试剂

1.1药物：鸡骨草粗多糖、黄芪多糖均由广西大学中兽医实验室提取，纯度分别为70％、65％。

1.2实验材料：透析袋(3500Da，索莱宝生物科技有限公司)。

1.3主要试剂：氯乙酸(MCA)、羟基乙酸(GA)、铬变酸(CP)和乙酸铵(ACS)均够自上海麦克林生化科技有限公司(货号分别为C832199、G810373、C804988、A800996)；氢氧化钠(NaOH，成都金山化学试剂有限公司，20200308)；盐酸(HCl，公司，批号)；环磷酰胺(CTX，上海碧云天生物技术有限公司，042821220111)；H&E染料购自索莱宝生物科技有限公司；小鼠白介素-1β(IL-1β)、白介素-17D(IL-17D)、白介素-23(IL-23)、白介素-22(IL-22)、白介素-4(IL-4)、信号转导及转录激活蛋白-3(STAT3)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、免疫球蛋白-G(IgG)ELISA试剂盒均购自南京博研生物科技有限公司；总RNA提取试剂(TRIGene)、cDNA第一链合成预混试剂(StarScriptⅡFirst-strand cDNA Synthesis MixWith gDNA Remover)、实时荧光定量快速PCR反应体系(2×RealStar Green FastMixture)均购自北京康润诚业生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.4实验动物：实验动物为无特定病原体动物(Specific pathogen Free，SPF)级实验KM小鼠，90只，4周龄小鼠体重20±2g，雌雄各半，购自长沙天勤生物科技有限公司，许可证号SCXK(湘)2019-0014。

2.实验方法

2.1响应面法优化羧甲基化鸡骨草多糖制备工艺

葡萄糖标准曲线的绘制。精确称取葡萄糖10mg置于烧杯中，加入适量蒸馏水，充分溶解后转移至100mL容量瓶定容，得到浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。准确吸取葡萄糖标准溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于编号0至6号的具塞试管中，分别补充蒸馏水，使每只试管的溶液体积均达到2mL，用苯酚-硫酸比色法测吸光度，拟合线性回归方程如图1A；

羟基乙酸标准曲线的绘制。精确称取羟基乙酸400mg置于烧杯中，加入适量蒸馏水，充分溶解后转移至100mL容量瓶定容，得到浓度为4mg/mL的羟基乙酸标准溶液。准确吸取羟基乙酸标准溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL于编号0至6号的具塞试管中，分别补充蒸馏水，使每只试管的溶液体积达到1mL，用铬变酸-硫酸比色法测吸光度，拟合线性回归方程如图1B；

步骤一：羧甲基化鸡骨草多糖的制备，精确称取100mg鸡骨草粗多糖样品于250mL烧杯，溶于10mL 3mol/LNaOH溶液中，剧烈搅拌下缓慢加入一定浓度的一氯乙酸10mL，在设定温度继续搅拌反应一段时间后，用2.0mol/L的HCl调至中性，终止反应。将反应液置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析48h，4000r/min离心15min后，80％乙醇体系醇沉，冻干，即得羧甲基化鸡骨草多糖。

步骤二：糖含量及羧甲基取代度测定，按照苯酚-硫酸法和铬变酸-硫酸法的相关操作，根据标准曲线方程计算羧甲基化鸡骨草多糖的糖纯度和羧甲基取代度，相关计算参照如下公式：

羧甲基取代度

式(1)中：C1——羧甲基化鸡骨草多糖样品中多糖浓度，mg/mL；

C2——羧甲基化鸡骨草多糖样品浓度，mg/mL。

式(2)中：B——每克羧甲基化鸡骨草多糖样品相当于羟基乙酸的质量；

76——羟基乙酸摩尔质量，g/mol；

59——-CH₂COOH摩尔质量，g/mol。

采用box-behnken设计三因素三水平的响应面实验方案，以羧甲基取代度(DS)为响应值，探索氯乙酸浓度、制备温度和反应时间对羧甲基化鸡骨草多糖的最佳制备工艺。

表1box-behnken响应面实验的因素和水平

2.2羧甲基化鸡骨草多糖制剂的制备

取鸡骨草多糖(纯度70％)4g充分溶解于400ml 3mol/L氢氧化钠溶液中，根据最佳制备工艺制得羧甲基化鸡骨草多糖。将一定量的羧甲基化鸡骨草多糖溶于生理盐水，配成对应剂量的口服液。

2.3多糖溶解度测定

取2.5mLEP管9支，编号1、2、3，每个编号3个平行重复，称重后记为m1、m2、m3，准确称取TC-ACP、CM-ACP、D-ACP三种多糖50mg分别装于编号为1、2、3的EP管中，每支EP管加入1mL蒸馏水，60℃恒温振荡溶解6h后，4000r/min，2min离心，移去上层饱和溶液后，将沉淀连同EP管冷冻干燥至恒重，称重后记为M1、M2、M3。

多糖水溶液的最大溶解度参照如下公式：

多糖溶解度(mg/mL)＝50－(M－m)/1

式中：M——多糖溶液饱和后析出的沉淀和EP管的合质量，mg；

m——EP管的质量，mg；

50——EP管中多糖的质量，mg；

1——饱和溶液中溶剂蒸馏水的体积，mL。

2.4动物实验设计

适应饲养结束后，将小鼠随机分为9组(n＝10)：正常组(NC)、CTX模型组(MC)、低剂量鸡骨草多糖组(ACPL)、中剂量鸡骨草多糖组(ACPM)、高剂量鸡骨草多糖组(ACPH)、低剂量羧甲基多糖组(CM-ACPL)、中剂量羧甲基多糖组(CM-ACPM)、高剂量羧甲基多糖(CM-ACPH)和黄芪多糖阳性对照组(AMP)。在接下来14d内，正常组、模型组每天灌胃生理盐水0.1ml/10g.bw，同时低、中、高剂量组分别灌胃75、150、300mg/kg.bw鸡骨草多糖和羧甲基化鸡骨草多糖。AMP组给予150mg/kg.bw黄芪多糖。在第10、12、14d时，除正常组外，其余各组小鼠分别腹腔注射80mg/kg.bwCTX建立免疫抑制和肠道损伤，正常组注射等体积的生理盐水。每天观察小鼠精神状态并记录体重变化。最后一次给药后，所有小鼠禁食不禁水12h并称重，麻醉后用颈椎脱臼进行处死。迅速收集血液、胸腺、脾脏、空肠、结肠、盲肠内容物和结肠内容物作进一步分析。

2.4体重变化

每天记录小鼠体重。

2.5器官指数测定

小鼠颈椎脱臼处死后，迅速分离胸腺、脾脏，轻轻吸干水分并称重。器官指数按以下公式计算：

器官指数(mg/g)＝器官重量(mg)/体重(g)

2.6组织病理学观察及评分

将分离出的脾脏、结肠组织(1.5cm肠段)用10％中性福尔马林常温固定24h，酒精脱水，石蜡包埋后，置于石蜡切片机切成3～4μm的薄片。用苏木精-伊红(H&E)对结肠切片染色，制成H&E切片，观察组织变化，并评分。

2.7ELISA检测细胞因子含量

采集小鼠血样于无菌离心管中，离心(4℃，3000rpm，20min)后取上层血清分装暂存于-80℃中。按ELISA试剂盒使用说明书测定各组小鼠血清IL-1β、IL-17D、IL-23、IL-22、IL-4、TNF-α、IFN-γ、IgG水平。

精确称取100mg结肠组织，加入900μL预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)充分匀浆，离心(4℃，3000rpm，20min)，收集上清液进行分装保存于-80℃中。按照ELISA试剂盒使用说明书测定各组小鼠组织匀浆上清液L-1β、IL-17D、IL-23、IL-22、IL-4、STAT3、TNF-α、IFN-γ水平。

2.8RT-qPCR检测结肠组织mRNA表达水平

用TriZol法对各组小鼠结肠组织总RNA进行抽提，根据试剂盒操作要求进行后续荧光定量PCR测定，采用2^-ΔΔCt公式计算得到每个目的基因的相对表达量。

2.9肠道菌群的变化

根据粪便DNA提取试剂盒要求，按步骤提取结肠内容物的DNA后，通过1％琼脂凝胶电泳检测提取的基因组DNA的完整性，NanoDrop2000检测其浓度和纯度符合要求后送往上海美吉生物医药科技有限公司进行16S-rDNA高通量测序。引物对应区域16S V3-V4区，合成引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，PCR扩增体系20μL，扩增后进行产物的鉴定、纯化及定量。使用TruSeqTM DNA样品制备试剂盒构建PE文库，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序，通过收集荧光信号，得到模板DNA片段的序列。

2.10肠道短链脂肪酸的变化

通过靶向代谢组学GC-MS技术检测结肠内容物中短链脂肪酸(SCFAs)水平。

3.实验结果与分析

3.1响应面实验结果及数据分析

响应面实验设计方案和及实验结果如表2和表3所示。

表2box-behnken响应面实验设计及结果

回归方程拟合及方差分析：

羧甲基取代度回归方程拟合及方差分析：回归分析结果见表3，对各因素回归拟合后，以X1、X2、X3为自变量对羧甲基取代度Y进行数据拟合，建立如下多元二次回归方程：

Y＝－12.788+3.238X₁+0.274X₂+0.253X₃－0.015X₁X₂－0.036X₁X₃+1.050×10^-3X₂X₃

－0.499X₁ ²－1.807×10^-3X₂ ²－0.030X₃ ²

表3羧甲基取代度回归方程方差分析

注：*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异

通过方差分析可知，模型的显著水平P<0.0001，表明二次回归模型差异极显著，因变量与全体自变量之间的线性关系显著(r＝0.270/0.271＝0.996)。失拟项P＝0.1350﹥0.05，指示失拟项不显著，表明实验中其他因素对DS的干扰很小，羧甲基取代度(Y)的二次回归方程与实际情况相符，能较好的描述MCA浓度、反应温度、反应时间与DS的关系。影响DS大小的因素中MCA浓度与反应温度相当，皆大于反应时间对DS的影响。相互影响因素中，MCA浓度与反应温度的相互影响最为显著。

羧甲基取代度响应面图分析：各因素对DS的影响可以从图2三组交互影响直观图直观体现出来，响应面的坡度越陡峭，说明对应条件改变对响应值的影响越大，反之影响不大。由图可知，MCA浓度、反应温度对DS的影响最为显著，其对应的响应面坡度陡峭，等高线密度变化也较明显。而反应时间对取代度的影响相对较小，其对应曲线也较为平缓。通过响应面分析，DS达到最大值时的因素水平为：MCA浓度2.094mol/L、反应温度68.592℃、反应时间4.198h，预测DS为0.513，结合实验操作的可行性，确定鸡骨草羧甲基化多糖的制取工艺为：MCA浓度2.1mol/L、反应温度69℃、反应时间4h。

3.2鸡骨草羧甲基化多糖的溶解度

鸡骨草多糖修饰前后的最大溶解度见表4，ACP在水溶剂中的最大溶解度为24mg/mL，而修饰后的CM-ACP在水溶剂中的最大溶解度则为44mg/mL，较之ACP显著升高。表明对鸡骨草多糖进行羧甲基化修饰可显著提高多糖的溶解性，这将有可能提高多糖在小鼠肠道的吸收率。

表4溶解度测定结果

3.3预防性应用CM-ACP可减轻CTX诱导的免疫抑制和肠道损伤症状

为探究CM-ACP对CTX药物副作用的预防作用，各多糖组于1-14d灌胃不同剂量的多糖，除正常对照组外的所有组于第10、12、14d腹腔注射80mg/kg.bw的CTX(图3)。实验期间，小鼠在被注射CTX后逐渐出现食欲不振、精神萎靡和被毛凌乱等现象。与模型组相比，ACP、CM-ACP和AMP干预组的小鼠上述症状得到改善，显著缓解了CTX作用后的体重减轻(图4)，且缓解效果CM-ACPM组优于ACP。这说明在宏观水平上，CM-ACP能减轻CTX导致的副作用。

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，免疫器官指数被认为是反映机体免疫能力的原始指标。与正常对照组相比，模型组的胸腺指数和脾脏指数显著降低，表明造模成功。ACP和CM-ACP各剂量小鼠的胸腺指数和脾脏指数均高于MC组，表现出显著性(表5)。这表明ACP和CM-ACP可以有效的改善CTX所致的免疫器官指数降低，预防机体免疫器官萎缩，且预防效果CM-ACP较ACP更佳。

表5小鼠免疫器官指数

组织学分析进一步显示，在肠道保护方面，预防给药后，结肠粘膜损伤明显减轻，单位面积内的隐窝数量得到恢复(图5-图6)。

为了进一步评价ACP和CM-ACP对全身免疫和肠道免疫的影响，对血清和结肠组织中免疫相关细胞因子和免疫球蛋白含量进行测定。如图7和图8所示，与NC组相比，MC组血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ和IgG均显著降低(P＜0.001)，提示CTX具有抑制免疫活性的作用。而在ACP和CM-ACP不同剂量组，这种降低被不同程度的逆转。与MC组相比，CM-ACPM和CM-ACPH均能显著增加血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ和IgG水平(P＜0.01)，CM-ACPL组血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ和IgG水平显著高于MC组(P＜0.05)。ACP组与MC组相比，血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ和IgG水平虽然提高了，但仅有ACPM组血清中TNF-α和ACPH组血清中IL-4、TNF-α和IFN-γ有显著性差异(P＜0.01)。此外，与MC组相比，AMP组血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ和IgG分泌量显著增高(P＜0.01)。特别的，在3个剂量中，CM-ACP组与ACP组相比，IL-2、TNF-α、IFN-γ和IgG的分泌水平均显著提高(P＜0.05)，而IL-4在低、高剂量显著高于ACP组(P＜0.05)。

如图7和图8所示，在结肠组织中，与NC组相比，MC组IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ水平均显著降低(P＜0.001)。而在预防给药组，这种降低得到了不同程度的恢复。与MC组相比，CM-ACP的三个剂量组均能显著增加结肠组织中IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ的分泌量(P＜0.01)。ACP组较MC组，结肠中IL-4的水平在3个剂量中均显著提高(P＜0.05)，而TNF-α和IFN-γ仅在高剂量组显著高于MC组(P＜0.05)。此外，与MC组相比，AMP组结肠组织中IL-4、TNF-α和IFN-γ的水平显著上升(P＜0.001)。有趣的是，CM-ACP组与ACP组相比，IL-2在高剂量组(P＜0.001)，IL-4在中剂量(P＜0.05)，TNF-α和IFN-γ在低中高剂量(P＜0.05)的分泌水平显著提高。

总而言之，这些结果表明，预防性应用ACP和CM-ACP可以改善CTX诱导的免疫抑制和肠道损伤，且改善能力CM-ACP强于ACP。

3.3预防性应用CM-ACP通过NF-KB和IL-22/STAT3通路改善免疫抑制和肠道损伤

NF-KB是一种蛋白复合物，几乎存在于动物所有类型细胞中，通过控制转录的DNA，调节细胞因子产生和细胞存活，在触发机体免疫应答和维持肠道免疫稳态方面有重要作用。STAT3在多种组织的细胞因子信号转导中具有重要功能。在肠上皮细胞中，STAT3与肠道稳态相关联。STAT3基因的缺失会导致与凋亡相关的基因上调而与愈合相关的基因下调。研究认为，STAT3的活化受IL-22及其上游信号的调控。

之前的实验表明ACP和CM-ACP的高剂量组拥有更好的免疫调节效果，因此，为了探究本发明药物改善免疫抑制和肠道损伤的机制，发明人检测了NC组、MC组、AMP组、ACPH组(后文用ACP代替)和CM-ACPH组(后文用CM-ACP代替)中NF-KB和IL-22/STAT3通路相关因子的水平(如图9-11)。

与正常组不同，CTX作用后，MC组结肠组织中TLR2、TLR4、MyD88和P65的mRMA水平显著下降(P＜0.05)。预先灌胃ACP和CM-ACP能一定程度提高上述基因的表达。与MC组相比，ACP组和CM-ACP组TLR2、TLR4、MyD88和P65的mRNA水平均明显上升(P＜0.05)。此外，CM-ACP组上述基因的表达水平几乎都高于ACP组，但没有统计学意义(P＞0.05)。

在修复肠道损伤方面，CTX处理后，MC组较NC组Occludin1和Muc2的mRNA水平下降明显(P＜0.01)。ACP组和CM-ACP组与MC组相比，均能显著上调被CTX抑制的Occludin1和Muc2基因的表达(P＜0.01)，两者对于维持肠道粘膜完整十分重要。Occludin1和Muc2基因的表达受STAT3及其上游信号IL-1β、IL-17D、IL-22及其受体CD93影响。较之NC组，MC组血清和结肠组织中IL-1β、IL-17D和IL-22分泌水平被显著抑制(P＜0.001)，而这种抑制在ACP组和CM-ACP组得到缓解。与MC组相比，CM-ACP组小鼠血清和结肠组织中IL-1β、IL-17D和IL-22的水平增高显著(P＜0.01)，且高于ACP组(P＜0.05)。同时，与NC组相比，组织中STAT3分泌水平和CD93受体基因的表达水平在MC组中降低(P＜0.001)，但在灌胃ACP和CM-ACP后被逆转。ACP组和CM-ACP组STAT3的分泌水平和CD93受体mRNA水平显著高于MC组(P＜0.05)，且CM-ACP组STAT3的分泌水平明显高于ACP组(P＜0.01)。CM-ACP较ACP具有更强的生物活性。

总之，这些结果表明，CM-ACP较ACP有更强地缓解免疫抑制和修复肠道损伤的功能，且这些功能是通过NF-KB和IL22/STAT3通路实现的。

3.4预防性CM-ACP显著改变肠道微生物区系多样性和组成

为了进一步探究ACP和CM-ACP对CTX处理后小鼠肠道微生物的影响，发明人对实验小鼠的粪便进行了16SrRNA基因测序。发明人通过wilcoxon秩和检验，双尾检验进行两两比较，对比ACP和CM-ACP两种多糖组与MC组组间物种丰度的差异，进行组间差异显著性检验，采用fdr进行多重检验校正，bootstrap0.95置信区间进行计算。

结果显示，ACP能有效降低乳酸杆菌属(Lactobacillus)、肠杆菌属(Enterorhabdus)和疣微菌属(Ruminococcus_gnavus_group)的群落丰度(P＜0.05)，增加Muribaculaceae科所属的norank_f__Muribaculaceae、普雷沃氏菌(Prevotellaceae_UCG-001)和棒状杆菌属(Corynebacterium)的群落丰度(P＜0.05)。同时，CM-ACP能显著降低Lactobacillus、布劳特氏菌(Blautia)、瘤胃球菌(Ruminococcus_gnavus_group)和丹毒荚膜菌属(Erysipelatoclostridium)的群落丰度(P＜0.05)，增加norank_f__Muribaculaceae和Corynebacterium群落丰度(P＜0.05)。特别的，norank_f__Muribaculaceae和Corynebacterium在NC组中富集。

上述结果表明，预防性ACP和CM-ACP灌胃处理不但能将被CTX紊乱的肠道菌群调整至正常水平，还能增加益生菌norank_f__Muribaculaceae和Prevotellaceae_UCG-001的丰度，这对维持肠道微环境稳态是有利的。

3.5预防性CM-ACP对肠道短链脂肪酸代谢的影响

短链脂肪酸(SCFAs)是肠道微生物与不可消化碳水化合物共同发酵产生的一类挥发性脂肪酸，既为肠上皮细胞代谢提供能量，又作为信号分子参与调节肠黏膜屏障功能，在维持肠道黏膜免疫和微环境健康方面发挥重要作用。为了确定ACP和CM-ACP对肠道菌群产生SCFAs的影响，发明人检测了各组小鼠盲肠内容物中SCFAs的含量。较之空白对照组，模型组乙酸、丙酸和丁酸的浓度明显降低(P＜0.01)。与MC组相比，ACP组显著提高了乙酸和丙酸的水平(P＜0.05)，CM-ACP显著提高了丙酸和丁酸的含量(P＜0.05)。此外，CM-ACP组的丁酸含量明显高于ACP组(P＜0.01)(图12)。

总之，这些结果表明，CM-ACP和ACP能不同程度的提高肠道中SCFAs的含量，其中以丁酸含量的提高最为明显，推测其与免疫调节和肠道健康密切相关。

Claims (10)

1.一种羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺，其特征在于：取鸡骨草粗多糖溶于NaOH溶液中，搅拌下加入一氯乙酸，然后继续搅拌反应；用HCl调至中性，终止反应；将反应液置于透析袋中透析，离心后，采用乙醇体系醇沉，冻干，即得羧甲基化鸡骨草多糖。

2.根据权利要求1所述的羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺，其特征在于：所述一氯乙酸的浓度为2.1mol/L；所述反应的温度为69℃、反应的时间为4h。

3.根据权利要求1所述的羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺，其特征在于：所述鸡骨草粗多糖的纯度为70％；所述NaOH溶液浓度为3mol/L，HCl浓度为2.0mol/L，乙醇体系为80％。

4.根据权利要求1所述的羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺，其特征在于：所述透析袋截留分子量为3500Da。

5.根据权利要求4所述的羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺，其特征在于：所述透析的时间为48h，离心的转速为4000r/min、时间为15min。

6.根据权利要求1所述的羧甲基化鸡骨草多糖的制备工艺，其特征在于：所述鸡骨草粗多糖、NaOH溶液、一氯乙酸的质量体积比为100mg：10ml：10ml。

7.权利要求1制备工艺所得的羧甲基化鸡骨草多糖，其特征在于羧甲基取代度为0.51。

8.权利要求7所述羧甲基化鸡骨草多糖在制备增强机体免疫力的药物中的应用。

9.权利要求7所述羧甲基化鸡骨草多糖在制备缓解环磷酰胺诱导的免疫抑制和肠道损伤的药物中的应用。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述药物为口服药物。

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