CN115746008B - 一种同步光激活荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同步光激活荧光探针及其制备方法和用途，涉及荧光探针合成与成像应用技术领域，本发明合成的荧光探针可以被紫外光、可见光和近红外光等光源激活，激发光范围广且在最大吸收波长处激活效果最佳，并实现了荧光激活和成像的同步化，避免使用额外的激发光进行激活，还可有效延长细胞激光共聚焦成像的成像时程，同时具有极低的光毒性，几乎不影响细胞的生理学状态。
Description
技术领域：
本发明涉及荧光探针合成与成像应用技术领域，具体涉及一种同步光激活荧光探针及其制备方法和用途。
背景技术：
荧光成像是研究活细胞内分子细胞生物学的重要手段，但是荧光探针的光漂白和光毒性极大地限制了荧光成像的进一步应用。光漂白使荧光探针的成像时程难以达到数小时，无法实现长时程监测活细胞内生理学过程，尤其超分辨荧光显微技术甚至需要高达GW/cm2的激光。同时，光毒性会引起细胞本身产生过量的活性氧，导致细胞生理学发生变化甚至死亡。因此，目前荧光探针的光漂白和光毒性都限制了其在活细胞长时程和超分辨荧光成像中的应用。
发明内容：
为了解决现有荧光探针的光漂白和光毒性的问题，本发明旨在提供一种在荧光成像中抵抗光漂白和光毒性的同步光激活探针及其制备方法和用途。本发明的荧光探针是一类从不发荧光或弱荧光的“暗态”，通过吸收激发光，被激活为能发荧光的“荧光态”，最终转化成无荧光的“猝灭态”的激活型荧光探针。相对于目前初始态就全部为“亮态”的荧光探针，光照后就转换成“猝灭态”的单纯光漂白过程，本发明的荧光探针可以通过光照转化成“荧光态”，弥补光漂白引起的荧光降低，这种打开与淬灭共存的激活过程，使“荧光态”探针在长时间内维持在可满足成像要求的较低浓度，既实现长时程荧光成像，又减少了光毒性。在荧光成像过程中，成像激发光可以同时作为该探针的激活光源，实现成像过程中的同步光激活，避免使用额外的激发光，简化了成像仪器和步骤。目前，这种使用同一激发光源同步实现光激活和激发且同时克服光漂白和光毒性的荧光探针还未见报道。
本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
本发明的目的之一是提供一种同步光激活荧光探针，其结构式如式I所示：
其中，X为O或Si(CH3)2等；
R1、R2和R3为H、直链烷基、支链烷基、环烷基或芳香基等，R1、R2和R3可以相同也可以不同。
本发明的目的之二是提供一种所述同步光激活荧光探针的制备方法，将罗丹明类染料、二氨基胍衍生物和碱加入到有机溶剂中，搅拌反应，经纯化得到目标产物。
本发明的目的之三是提供所述同步光激活荧光探针在活细胞内的长时程和超分辨成像中的用途。
本发明的荧光探针在使用光照射后(包括紫外光、可见光、近红外光等，波长范围＞365nm)，都能发生脱氨基作用，脱氨基后探针荧光明显增强，并且在最大吸收波长处(±10nm)激活效果最佳。
本发明的有益效果是：
1、本发明合成的荧光探针是通过罗丹明类染料分子结构中的羧基或酯基与二氨基胍衍生物一步反应获得，反应步骤少，用料便宜，合成简单，反应条件温和。
2、本发明合成的荧光探针可以被紫外光、可见光和近红外光等光源激活，激发光范围广，并且在最大吸收波长处激活效果最佳。
3、本发明合成的荧光探针实现了荧光激活和成像的同步化，避免使用额外的激发光进行激活，简化设备和实验步骤。
4、本发明合成的荧光探针可以有效延长细胞激光共聚焦成像的成像时程，目前的试验结果证实该探针的激光共聚焦成像时程可长达16h，STED超分辨成像时程可长达3h。
5、本发明合成的荧光探针具有极低的光毒性，几乎不影响细胞的生理学状态。
附图说明：
图1A为本发明荧光探针RhB-AT-NH2在365nm紫外灯持续照射下荧光不断“打开”的过程；图1B为本发明荧光探针Rh6G-AT-NH2在365nm紫外灯持续照射下荧光不断“打开”的过程；
图2为本发明荧光探针RhB-AT-NH2和Rh6G-AT-NH2在470-680nm可见光照射下的荧光“打开”效果，辐照光功率密度为50W/cm2，辐照时长为5min，所有荧光强度在最佳激发光波长下测得；
图3A为本发明荧光探针Rh6G-AT-NH2在活细胞中持续的荧光成像和STED超分辨成像；图3B为本发明荧光探针RhB-AT-NH2在活细胞中持续的荧光成像和STED超分辨成像；图3C为图3A和图3B中共聚焦成像荧光强度随时间变化的统计图；图3D为图3A和图3B中STED超分辨成像荧光强度随时间变化的统计图；误差棒代表标准方差；
图4A为本发明荧光探针RhB-AT-NH2、Rh6G-AT-NH2及其母体分子罗丹明B和罗丹明6G在最佳激发光照射下的光毒性，所有细胞的细胞核被Hoechst33342染成较暗的颜色，死细胞的细胞核被SYTOX Deep Red染成很亮的颜色；图4B为图4A的统计图；误差棒代表标准方差。
具体实施方式：
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。
本发明的目的之一是提供一种同步光激活荧光探针，其结构式如式I所示：
其中，X为O或Si(CH3)2等；
R1、R2和R3为H、直链烷基、支链烷基、环烷基或芳香基等，R1、R2和R3可以相同也可以不同。
本发明的目的之二是提供一种所述同步光激活荧光探针的制备方法，将罗丹明类染料、二氨基胍衍生物和碱加入到有机溶剂中，搅拌反应，经纯化得到目标产物。
优选地，所述罗丹明类染料为罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明110、罗丹明123、硅基罗丹明等含有羧基或酯基的罗丹明类染料。
优选地，所述二氨基胍衍生物为1,3-二氨基胍、烷基单取代1,3-二氨基胍等。烷基单取代1,3-二氨基的结构式如式II所示：
其中，R为直链烷基、支链烷基、环烷基或芳香基等。
优选地，所述罗丹明类染料、二氨基胍衍生物和碱的摩尔比为1:1:1-1:10:10。
优选地，所述碱为甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、氢化钠等碱性大于氢氧化钠的碱。
优选地，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃等有机溶剂。
所述纯化是指通过洗涤、重结晶、柱色谱分离等方式纯化，洗脱剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及其混合物。
本发明的目的之三是提供所述同步光激活荧光探针在活细胞内的长时程和超分辨成像中的用途。
本发明所述同步光激活荧光探针在应用于荧光显微镜成像时，直接用成像激发光激活探针，无需额外的激发光。
将本发明所述同步光激活荧光探针加入到细胞中，使其最终浓度为0.1-10μM，在37℃、5％CO2条件下培养1-100min后进行激光共聚焦和STED超分辨成像。
实施例1
N-氨基-3-氨基-1,2,4-三唑-罗丹明B(RhB-AT-NH2)的合成：
在装有回流冷凝管的烧瓶中加入500mL甲醇，然后加入1.15g金属钠，待金属钠完全反应后，加入6.25g 1,3-二氨基胍盐酸盐和19.16g罗丹明B，回流搅拌2h后将反应液倾倒入水中，抽滤，滤饼用水洗涤2次，得到固体粗产品，粗产品经柱层析提纯(洗脱剂为体积比4:1的乙酸乙酯和甲醇)，得到15.26g目标产物RhB-AT-NH2。
1H-NMR(d6-DMSO,400MHz,δ):8.02-8.00(d,J＝8Hz,1H),7.46-7.42(t,1H),7.33-7.30(t,1H),6.93-6.91(d,J＝8Hz,1H),6.62-6.60(d,J＝8Hz,2H),6.39(s,1H),6.35-6.31(m,4H),5.64(s,2H),3.36-3,31(m,8H),1.12-1.08(t,12H).13C-NMR(d6-DMSO,100MHz,δ):153.03,151.74,148.16,143.74,138.51,129.63,128.88,128.47,127.63,124.52,121.68,109.11,106.95,97.38,59.25,43.63,12.40.HR-MS(m/z,ESI)计算值C29H33N7O m/z＝496.2825[M+H]+；实际值m/z＝496.2820.
实施例2
N-氨基-3-氨基-1,2,4-三唑-罗丹明6G(Rh6G-AT-NH2)的合成：
在装有回流冷凝管的烧瓶中加入500mL甲醇，然后加入1.15g金属钠，待金属钠完全反应后，加入6.25g 1,3-二氨基胍盐酸盐和17.70g罗丹明6G，回流搅拌2h后将反应液倾倒入水中，抽滤，滤饼用水洗涤2次，得到固体粗产品，粗产品经柱层析提纯(洗脱剂为体积比5:1的乙酸乙酯和甲醇)，得到12.70g目标产物Rh6G-AT-NH2。
1H-NMR(d6-DMSO,400MHz,δ):7.96-7.94(d,J＝8Hz,1H),7.42-7.38(t,1H),7.29-7.25(t,1H),6.85-6.83(d,J＝8Hz,1H),6.35-6.23(m,5H),5.56(s,2H),5.02-4.99(t,2H),3.16-3.11(m,4H),1.84(s,6H),1.21-1.18(t,6H).13C-NMR(d6-DMSO,100MHz,δ):153.52,150.50,147.90,144.23,139.52,129.91,129.41,129.19,128.11,124.90,122.17,117.31,109.51,96.21,59.88,37.97,17.85,14.75.HR-MS(m/z,ESI)计算值C27H29N7O m/z＝468.2512[M+H]+；实际值m/z＝468.2505.
实施例3
N-氨基-3-氨基-1,2,4-三唑-罗丹明110(R110-AT-NH2)的合成：
在装有回流冷凝管的烧瓶中加入500mL甲醇，然后加入1.15g金属钠，待金属钠完全反应后，加入6.25g 1,3-二氨基胍盐酸盐和13.47g罗丹明110，回流搅拌4h后将反应液倾倒入水中，抽滤，滤饼用水洗涤2次，得到固体粗产品，粗产品经柱层析提纯(洗脱剂为体积比3:1的乙酸乙酯和甲醇)，得到12.70g目标产物R110-AT-NH2。
1H-NMR(d6-DMSO,400MHz,δ):7.95-7.93(d,J＝8Hz,1H),7.42-7.40(t,1H),7.30-7.28(t,1H),6.88-6.87(d,J＝4Hz,1H),6.41-6.40(d,J＝4Hz,2H),6.31(s,2H),6.25(s,1H),6.16-6.15(d,J＝4Hz,2H),5.59(s,2H),5.32(s,4H).13C-NMR(d6-DMSO,100MHz,δ):165.98,158.69,152.86,152.02,133.09,129.80,128.89,128.45,123.95,122.84,112.46,110.39,102.77,65.07.HR-MS(m/z,ESI)计算值C21H17N7O m/z＝384.1573[M+H]+；实际值m/z＝384.1573.
式I中各个化合物的合成可按照上述探针RB-AT-NH2、Rh6G-AT-NH2和R110-AT-NH2的合成方法。
性能测试1
荧光探针在水溶液中的应用：
取上述实施例1制备的荧光探针RhB-AT-NH2和实施例2制备的荧光探针Rh6G-AT-NH2分别溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配置成浓度为1mmol/L的储备液。取储备液60μL加入到100mL锥形瓶中，用体积比为7:3的HEPES缓冲溶液(10mM,pH＝7.4)与DMSO的混合溶液稀释至60mL，使探针的最终浓度为1μM。
a、在365nm的紫外灯连续照射下，探针分子的荧光逐步打开。荧光光谱及荧光照片如图1A和1B所示。
b、在470-670nm的可见光照射下，探针分子的荧光也能逐步打开，并且在最大吸收波长处打开效率最高，如图2所示。
性能测试2
荧光探针在细胞长时程和超分辨成像中的应用：
配置含有1μM RhB-AT-NH2或Rh6G-AT-NH2的培养基，使用该培养基在37℃、5％CO2条件下培养人肝癌细胞30min后用培养基或PBS洗涤一次，然后进行激光共聚焦成像和STED超分辨成像(激发光为最佳激发波长，功率密度为2W/cm2；STED损耗光波长为592nm，功率密度为50W/cm2)。成像结果见图3，RhB-AT-NH2和Rh6G-AT-NH2在活细胞中的共聚焦成像时间分别长达12h和16h，STED超分辨时长分别为0.5h和3h，远远超过普通的荧光探针。
荧光探针的光毒性检测：
配置含有1μM RhB-AT-NH2或Rh6G-AT-NH2的培养基，使用该培养基在37℃、5％CO2条件下培养细胞30min后用培养基或PBS洗涤一次。然后在共聚焦显微镜下调节激发光为最佳激发波长，功率密度为2W/cm2，照射1h后，使用Hoechst 33342和SYTOX Deep Red分别对所有细胞和死细胞进行染色，统计细胞死亡率。成像和统计结果见图4，RhB-AT-NH2或Rh6G-AT-NH2在光照条件下，与空白对照组一样，几乎不会引起细胞死亡，而普通荧光探针会引起细胞大量死亡，死亡率超过20％。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种同步光激活荧光探针，其特征在于，所述同步光激活荧光探针的结构式如下所示：
2.权利要求1所述的同步光激活荧光探针的制备方法，其特征在于：将罗丹明类染料、二氨基胍衍生物和碱加入到有机溶剂中，搅拌反应，经纯化得到目标产物；所述罗丹明类染料为罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明110中的一种；所述二氨基胍衍生物为1,3-二氨基胍。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述罗丹明类染料、二氨基胍衍生物和碱的摩尔比为1:1:1-1:10:10。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述碱为甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、氢化钠中的至少一种。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃中的至少一种。
6.权利要求1所述的同步光激活荧光探针在制备活细胞内的长时程和超分辨成像检测试剂中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述同步光激活荧光探针在应用于荧光显微镜成像时，直接用成像激发光激活探针，无需额外的激发光。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于：将所述同步光激活荧光探针加入到细胞中，使其最终浓度为0.1-10μM，在37℃、5％CO2条件下培养1-100min后进行激光共聚焦和STED超分辨成像。
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| 氨基硫脲-罗丹明6G荧光探针的合成及对Hg2+的选择性识别;谢黎霞;安全与环境学报;第22卷(第5期);2865-2871 * |
| 细胞与活体内活性氧成像分析的有机荧光探针;刘光照;中国科学:化学;第52卷(第9期);1476-1491 * |
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