CN1157403C - 冬虫夏草活性部分的分离方法和医疗用途 - Google Patents

Abstract

本发明是有关冬虫夏草的一种活性部份的分离方法，其经由将冬虫夏草的子实体部份烘干、研碎，萃取，浓缩，氧化硅凝胶管柱层析处理分离出活性部份，其特征为具有明显的对血小板活化因子诱发血小板凝集作用的抑制活性。将该活性部份用氧化硅凝胶管柱层析以具有不同溶剂组成的洗提剂分离并经重结晶纯化而得一活性化合物。本发明的医疗用途，是可抑制血小板活化因子诱发血小板凝集，改善气喘症后期反应的肺功能。

Description

冬虫夏草活性部分的分离方法和医疗用途

技术领域

本发明是有关一种药物组分的分离方法和医疗用途，尤其是一种冬虫夏草的活性部份及活性化合物的分离方法和医疗用途。

技术背景

近年来，药理学研究证实，一种寄生于鳞翅目昆虫的幼虫，而长出子座的麦角菌科冬虫夏草真菌，其活性与药理作用是多方面的，包括：

1.呼吸系统：冬虫夏草抽提物能明显扩张离体天竺鼠支气管平滑肌而有平喘作用，有提高小鼠常压下耐缺氧的能力，能直接作用松驰支气管壁，对氯化镉雾化吸入引起的肺气肿有防治效果；呈类似雄性激素作用，与保护气管上皮及增强呼吸道抗损伤能力有关。

2.肝脏：冬虫夏草提取物能提高巨噬细胞吞噬能力及肝脏血流量和提高肝组织胶原酶活性，在治疗肝炎后的肝硬化，有抗肝纤维化的作用。

3.免疫系统：冬虫夏草抽提液可提高正常人及白血病自然杀手细胞活性，促进淋巴球细胞表面CD16抗原的表现(提高与K562细胞的结合率)，促进细胞性免疫，提高Th/Ts比值，减少因使用类固醇及环磷酰胺造成的免疫抑制作用。

4.心血管系统：冬虫夏草抽提液可提高天竺鼠心脏对哇巴因中毒的耐受量及使麻醉的大鼠和天竺鼠心率减慢。且冬虫夏草也有抗缺氧、抑制脑单胺氧化酶的作用，松驰血管平滑肌及扩张血管的活性作用。

然而上述药理作用都未采用完全纯化的冬虫夏草活性成份进行，且有关改善肺功能及临床症状的研究，也未曾采用气喘症的动物模式进行。

气喘症临床上是以阵发性呼气性喘呜表现的慢性呼吸道阻塞疾病，患本症，不予以适当治疗会因其并发症而增加死亡率及发病率，世界各国气喘病的死亡率均有逐渐增加的趋势。迄今除了气管扩张剂及副肾皮质素可暂时改善支气管收缩外，尚无证实有任何结构的药剂可改善支气管及肺部慢性炎症变化及肺功能。

气喘症是多因子参与的一种疾病，患者本身具有过敏体质，当患者因吸入过敏原等因素被过敏原敏感化后，其体内的B细胞就被活化产生专一性免疫球蛋白E抗体，在呼吸道内的上皮细胞层及粘膜下层含有大量的肥胖细胞，肥胖细胞的细胞表面具有高亲和力的免疫球蛋白E受体，当与专一性免疫球蛋白E抗体结合即处可被敏感化状态；一旦过敏原再次侵入与两个连结于肥胖细胞表面所含免疫球蛋白E受体的免疫球蛋白E抗体交叉连结地结合后，信息即传入肥胖细胞，一方面细胞膜制造并释出血小板活化因子，白烯三素等，二方面释出细胞质内包括组织胺、蛋白酶及趋化因子的颗粒，因此一方面产生立即性的支气管收缩，二方面吸引来大量炎症细胞，前者可用支气管扩张剂对抗，但后者则造成大量的单核细胞，嗜酸性和嗜中性白血球浸润，并放出大量细胞激素、生长因子、蛋白酶等，使平滑肌收缩、血管渗透性增加、微血管血浆液渗出、呼吸道分泌物产生及表皮和基底膜细胞的损伤剥落，而造成支气管无法恢复的破坏，使肺功能逐渐降低。故后者的炎症反应是造成气喘症并发症及死亡的主要原因。而在后者中具有最强且最持久的嗜酸性及嗜中性白血球浸润的作用的是血小板活化因子，其作用时间可长达四周，且有自体增幅作用，即经由血小板活化因子吸引来的嗜酸性及嗜中性白血球，又再释出血小板活化因子而吸收更多的嗜酸性及嗜中性白血球来造成支气管的破坏，致使肺损伤。

过去已建立离体抑制血小板活化因子引起兔子血小板凝集的离体定模式，筛选可以抑制血小板活化因子活性的成份，并建立以血小板活化因子及卵白蛋白诱发气喘的棕色挪威鼠动物模式。利用抑制离体抑制血小板活化因子引起兔子血小板凝集的离体测定模式，急性毒性试验及气喘症状的棕色挪威鼠动物模式，从冬虫夏草找出可改善诱发气喘棕色挪威鼠动物模式的肺功能，强化Th1细胞反应，抑制氧化氮合合成酶基因表现，以应用于治疗气喘的活性部分及一活性化合物。

发明内容

综合所述，本发明的目的提供一种可抑制血小板活化因子诱发血小板凝集，改善肺功能及组织学和免疫学的变化的冬虫夏草的活性部分和活性化合物的分离方法和医疗用途。本发明的第一目的是提出一种从冬虫夏草分离出具有改善肺功能活性的活性部分的方法。

本发明的第二目的是提供一种从冬虫夏草分离出具有改善肺功能活性的活性化合物的方法。

本发明的第三目的是提出一种经由上述方法从冬虫夏草分离出的具有改善肺功能的活性部分。

本发明的第四目的是提供一种经由上述方法从冬虫夏草分离出的具有改善肺功能的活性化合物。

本发明的第五目的是提供上述活性部分和活性化合物的医疗用途。

本发明的目的是这样实现的：本发明的冬虫夏草活性部分和活性化合物的分离方法，主要包括烘干、研碎、抽提、浓缩、层析处理、鉴定等部分。其中包括将冬虫夏草的子实体部分烘干、研碎，以有机溶剂抽提，将抽提液浓缩，以及进行氧化硅凝胶管柱层析处理配合离体控制血小板活化因子诱发兔子血小板凝集活性鉴定出该活性部分；其中抽提剂为甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷；其中氧化硅凝胶管柱层是用正乙烷、乙酸乙酯、甲醇三种溶剂以不同比例成不同极性的冲提溶剂或者用二氯甲烷——甲醇(100∶1至1∶1的体积比)作为冲提溶剂进行，该种分离方法分离出的活性化合物是

(24R)--麦角甾--7，22--二烯--3β，5α，6β--三醇；该种分离方法出的活性部分和活性化合物的医疗用途是，可抑制血小板活化因子诱发兔子血小板凝结，并可预防性及治疗性改善气喘后期反应的阻塞性肺功能恶化，强化THL细胞激素表现，降低iNOS基因表现，改善肺组织学变化。

本说明的上述及其它目的，特征与优点可由下面的详细说明参照附图而明白，其中：

附图说明

图1是根据本发明自冬虫夏草子座抽取活性部分及活性化合物的方法流程图；

图2是本发明活性化合物F8的氢核磁共振(1H-NMR)光谱图；

图3是本发明活性化合物F8的乙酰化产物的1H-NMR光谱图；

图4是图3中所示1H-NMR光谱内δ0.4PPM至δ2.2PPM范围的扩大图；

图5是本发明活性化合物F8的13C-NMR光谱；

图6是本发明棕色挪威鼠肺组织丙种干扰素基因表现的图示，N：正常未处理的对照图；OA：以卵白蛋白诱发气喘；OA+F4：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F4(每组各6只)；

图7是本发明棕色挪威鼠肺组织Th2基因表现的图示；N：正常未处理的对照组；OA：以卵白蛋白诱发气喘；OA+F4：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F4(每组各6只)；

图8是本发明棕色挪威鼠肺组织丙种干扰素基因表现的图示；N：正常未处理的对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F4：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F4(每组各6只)；

图9是本发明棕色挪威鼠肺组织Th2基因表现的图示；N：正常未处理的对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F4：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F4(每组各6只)；

图10是本发明棕色挪威鼠肺组织丙种干扰素基因表现的图示；N：正常未处理的对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F8；在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F8(每组各6只)；

图11是本发明棕色挪威鼠肺组织Th2基因表现的图示；N：正常未处理的对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F8：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F8(每组各6只)；

图12是本发明棕色挪威鼠肺组织丙种干扰素基因表现的图示；N：正常未处理的对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F8：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F8(每组各6只)；

图13是本发明棕色挪威鼠肺组织Th2基因表现的图示；N：正常未处理的

对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F8：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F8(每组各6只)；

图14是本发明棕色挪威鼠肺组织氧化氮合成酶基因表现的图示：N：正常未处理的对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F4：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F4(每组各6只)；

图15是本发明棕色挪威鼠肺组织氧化氮合成酶基因表现的图示：N：正常未处理的对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F4：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F4(每组各6只)；

图16是本发明棕色挪威鼠肺组织氧化氮合成酶基因表现的图示：N：正常未处理的对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F4：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F4(每组各6只)；

图17是本发明棕色挪威鼠肺组织氧化氮合成酶基因表现的图示：N：正常未处理的对照组；OA以卵白蛋白诱发气喘；OA+F4：在卵白蛋白诱发气喘时并用预防性F4(每组各6只)；

图18是本发明预防性吸入投予活性部份对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气喘的肺功能明显改善50％全肺容积时用力吐气流速的图示(^*P值0.05)；

图19是本发明预防性吸入投予活悸部份对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气喘的肺功能明显改善25％全肺容积时用力吐气流速的图示(^*P值0.05)；

图20是本发明预防性吸入投予活性化合物对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气喘的肺功能明显改善50％全肺容积时用力吐气流速的图示(^*P值0.05)；

图21是本发明预防性吸入投予活性化合物对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气喘的肺功能明显改善25％全肺容积时用力吐气流速的图示(^*P值0.05)；

图22是本发明治疗性吸入投予活性化合物对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气的肺功能明显改善50％全肺容积时用力吐气流速的图示(^*P值0.05)；

图23是本发明治疗性吸入投予活性化合物对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气的肺功能明显改善25％全肺容积时用力吐气流速的图示(^*P值0.05)；

图24是本发明治疗性吸入投予活性化合物对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气的肺功能明显改善25％全肺容积时用力吐气流速的图示(^*P值0.05)；

图25是本发明治疗性吸入投予活性化合物对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气喘的肺功能明显改善50％全肺容积时用力吐气流速的图示(^*P值0.05)；

图26是本发明活性化合物对肺功能改善的剂量曲线的图示。

表1是预防性投予F4对以不同剂量乙酰胆碱激发试验后，最高峰呼气流速各呼吸分段流速百分比的变化；

表2是支气管肺泡灌洗液中的总细胞数及分类；

表3是预防性投予F8对以不同剂量乙酰胆碱激发试验后，最高峰呼气流速各呼吸分段流速百分比的变化。

表4支气管肺泡灌洗液中的细胞数及分类；

表5是预防性投予F4对以不同剂量乙酰胆碱激发试验后，最高峰呼气流速各呼吸分段流速百分比的变化。

表6是支气管肺泡灌洗液中的总细胞数及分类；

表7是ICR小白鼠喂食含2％F4喂料的急毒性试验；

表8是冬虫夏草中F4及F8对于血小板活化因子诱导的血小板凝集的抑制活性。

具体实施方式

参照附图和表，结合实施例，对本发明作进一步的详细描述。

如上所述，气喘症临床上的是以阵发性呼气性喘呜表现的慢性呼吸道阻塞疾病，患本症，如果不予以适当治疗，会因其并发症及肺伤害而增加发病率及死亡率，甚至突发死亡。世界各国气喘症病人均有逐年增加的趋势，因气喘症而需要住院治疗或死亡的病人，也有逐年增加的趋势。迄今除了气管扩张剂及副肾皮质素外，尚无任何结构的疗剂可改善气喘病的肺功能及组织病理学变化。为何气喘症会导致无法恢复的肺伤害？简单地说：患者本身具有过敏体质，当他因吸过过敏原等因素被过敏源敏感化后，其体内的B细胞就被活化产生专一性免疫球蛋白E抗体；在呼吸道内的上皮细胞层及粘膜下层含有大量的肥胖细胞，肥胖细胞的细胞表面具有高亲和力的免疫球蛋白E受体，当免疫球蛋白E受体与专一性免疫球蛋白E抗体结合即处于被敏感状态；一旦过敏源再次侵入与两个连结于肥胖细胞表面上免疫球蛋白E受体的免疫球蛋白E抗体交叉连结结合后，信息即传入肥胖细胞，一方面细胞膜制造并释出血小板活化因子、白烯三素等，而产生立即性地支气管收缩；二方面释出细胞质内的颗粒，包括组织胺、蛋白酶及趋化因子，而吸来大量炎症细胞；前者为可逆性的变化，可用气管扩张剂对抗，将收缩的支气管放松；但后者造成大量的单核细胞，嗜酸性及嗜中性白血球浸润，并放出大量细胞激素、生长因子、蛋白酶等，使支气管平滑肌收缩、血管渗透性增加，微血管血浆液渗出，呼吸道分泌物产生及表皮及基底膜细胞的损伤剥落，而造成支气管无法恢复的破坏，使肺功能逐渐降低。而故后者的炎症反应是造成气喘症并发症及死亡的主要原因。而在后者中具有最强且持久的嗜酸性和嗜中性白血球浸润的作用者为血小板活化因子，其作用时间可长达四周，且有自体增幅使用，经由血小板活化因子吸引来的嗜酸性和嗜中性白血球，又再释出血小板活化因子而吸引更多的嗜酸性和嗜中性白血球来造成支气管的破坏，至使肺损伤。

由以上所述可知，治疗上希望阻止气喘症的肺伤害则可由阻上血小板活化因子的作用，即可减少嗜酸性和嗜中性白血球对于肺的浸润，及后续它们所引起的肺伤害。于实验室中，可将兔子血小板加入血小板活化因子而造成兔子血小板凝集，以作为血小板活化因子作用的指标，并可测定血小板活化因子与血小板上血小板活化因子受体的结合比例，可作为与其受体结合的指标。故以上述方法，加入冬虫夏草的“活性成份”，降低血小板活化因子造成免子血小板凝集比例，作为离体筛选抑制血小板活化因子诱发兔子血小板凝集，作为离体的第一步筛选方法。当找到有效的〔活性成份〕，再以加入冬虫夏草的〔活性成份〕降低血小板活化因子与血小板上血小板活化因子受体的结合比例，作为离体的第二步筛选方法。

(a)抽取方法

到此请参看图1，是本发明自冬虫夏草子座抽取活性部份及活性化合物的方法的流程图；其是先将冬虫夏草成品用烘箱烘干(35～60度)或风干均可，由于冬虫夏草成吕含水量甚高，干燥处理可避免后续抽取时带出较多的极性物质，因而影响硅胶层析纯化的表现，且干品需用研磨机或粉碎机研碎，以提供抽取的效率。

由于冬虫夏草所含活性成份(指对本发明说明收所述的可抑制血小板活化因子诱发免子血小板凝集与预防及改善肺功能而言)，属较低极性的范围，用甲醇(或其他低碳数的醇类)、甲酮、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷抽取均可完全抽取。若将高活性成份尽量回收，及抽取到的非极性杂质较少等因素一并考虑，则以使用甲醇或乙酸乙酯最为适当，实施例中则使用甲醇，而其抽取的程序则如图中流程所述。

(b)层析法综述

取冬虫夏草的子实体部分，放入45～50度烘箱二日，将水份烘干，干燥子实体经研磨粉碎后，以10倍体积甲醇浸泡48小时，甲醇浸泡原液经过滤后，以旋转式真空浓缩机减压浓缩，将溶剂抽移，再将甲醇浸泡浓缩液用适当量的氧化硅凝胶将其吸附，然后进行第一氧化硅凝胶管柱层析处理，使用正乙烷、乙酸乙酯、甲醇三种溶剂以各种不同比例混合成不同极佳的冲提液，经氧化硅凝胶管柱层析，分离成6个冲提液份〔F1～F6〕，分离流程如图1所示。

分别测定其〔抑制血小板活化因子诱发兔子血小板凝集〕的生物活性，而分离出活性部份。要从活性部份中获取活性化合物时，可用氧化硅凝胶管柱层法分离，程序如下所述(参看图1)：

将活性部分以少量甲醇——氯仿溶解，以第二氧化硅凝胶(70～230筛目)管柱(5×40公分)层析分离，依序以二氯甲烷——甲醇(100∶l 1∶1)体积内，当冲提溶剂，收取比例为10∶1(v/v)的冲提液份，测定各冲提液份所具抑制血小板活化因子诱发兔子血小板凝集的功能，将活性冲提液份浓缩后，以甲醇——氯仿进行重结晶，可得活性化合物。

为了确认上述活性部份的应用潜力，避免其为一明显有毒或致突变物质，于第一层析分离阶段曾进行小白鼠急毒性试验及埃姆斯试验，以显示有无毒性及致突发性。

本申请案采用的检测方式有三种：离体一种，活体则有二种检测方式。

一为利用离体抑制血小板活化因子诱发兔子血小板凝集为模式，测定冬虫夏草活性部份或活性化合物处理下对诱发气喘的棕色挪威鼠的临床症状及肺功能改善的程度及强化Th1细胞反应，抑制iNOS基因表现。

二为急毒性测试。以含及不含2％活性部份的饲料喂食ICR鼷鼠各6只5天之后将其处理，其结果如附表所示，两组肝功能均在正常范围内(请通用附图7所示)。

三为活体动物模式。其采用〔卵自蛋白诱发气喘后期反应棕色挪威鼠模式〕。实验动物分成控制组及实验组两组，两组均经两次敏感化。其法为取2毫升的1％卵蛋白溶液放入雾化器容器内，以流速8公升/分的流速使之雾化，以此由动物吸入方式给药，七日后再进行第二次敏感化，步骤方法同上所述。进行完上述二次敏感化七日后，要进行肺功能检查。进行肺功能检查之前两日给予高剂量的卵白蛋白挑激(以3毫升4％卵白蛋白雾化)。动物进行挑激之前30分要先给予腹腔注射吡利纳明(10mg/kg)，避免急性反应而死亡。动物在实验鼠在进行挑激36小时之后进行乙酰胆碱激发试验，进行乙酰胆碱激发试验前后(5秒内)均要测定肺功能。

另，上述本发明分离自冬虫夏草的活性部份和活性化合物的医疗用途，其中包括：

(A)活性部份或活性化合物的预防处理

为了解冬虫夏草萃取物对气喘是否有保护预防作用，实验设计在以卵白蛋白(Ovalbumin；OA)敏感化及挑激时之前，OA组吸入投予生理食盐水对照，而预防则投入3毫克的活性化合物溶液。

(B)活性部分或活性化合物的治疗处理，治疗组实验动物在挑激后，由腹腔注射活性部份或活性化合物；OA组则注射生理食盐水作为对照，本发明要用下列诸实施例予以进一步阐明。

实施例1.菌丝体培养及活性指标成份鉴定，将冬虫夏草接种于含下列成份的液箱培养基中：葡萄糖2％

            (蛋白酶)0.5％

            麦牙抽出物2％

马玲薯——葡萄糖浸出物24克/各于26±1.0度下静置培养(培养期30天)，收集其菌丝体，于45～50度烘干，所获干重物研碎后以10倍体积的甲醇抽取48小时，粗抽出物减压浓缩，再采用逆相式高效液相层析分析，证实含有活性化合物的活性指标成份。

实施例2冬虫夏草成份的分划与生物活性分析筛选冬虫夏草子实体的甲醇萃取物经由硅胶管柱层析，依不同极性冲提溶液提取各冲提层(参图1)，由极性低至高细分成6个划分：CS-F1、CS-F2、CS-F3、CS-F4、CS-F5、CS-F6。以此六个部层进行生物活性分析，即抑制5nM活小板活化因子诱发洗涤避免血小板凝集反应的分析。

以药物最终浓度为500g/毫升时分析血小板凝集反应，CS-F1、CS-F2、CS-F3、CS-F4、CS-F5、CS-F6的血小板凝集百分比分别为87.5±1.2％、77.4±6.2％、41.8±1.2％、14.4±8.6％、58.6±13.0％、83.0±3.3％。由血小板凝集百分比计算其抑制作用百分比，此六个部分抑制百分比分别为：2.1±1.3％、13.4±6.9％、53.2±1.3％、83.9±9.6％、34.4±14.6％、7.1±3.7％。从最终浓度500ug/毫升分析，天然物能抑制血小板活化因子的活性主要出现于CS-F3、CS-F4、CS-F5。因此，进一步以62.5、125、250、500ug/毫升分别做其剂量反应曲线；CS-F3、CS-F4、CS-F5萃取物对于由血小板活化因子所诱发兔子血小板凝集的反应呈现剂量关系的抑制作用。而CS-F3、CS-F4、CS-F5各划分在50％抑制时的浓度(IC50)分别各为306.1±36.6ug/毫升，252.9±27.9ug/毫升，667.4±36.2ug/毫升.由IC50可以发现主要最大活性出现于CS-F4部分，故选择F4作为其后进一步动物体内试验的材料。

实施例3活性化合物的分离。将活性部份以少量甲醇——氯仿溶解。以第二氧化硅凝胶(70～230筛目)管柱(5×40公分)层析分离，依序以二氯甲烷——甲醇(100∶1→1∶1)当冲提溶剂，收取比例为10∶1(v/v)的冲提液份，测定各冲提液份所具抑制血小板活化因子诱发兔子血小板凝集的功能，将活性冲提液份浓缩后，以甲醇——氯仿进行再结晶，可得活性化合物。

实施例4毒性评估

用冬虫夏草对鼷鼠腹腔注射，其LD50值为21.7±2.6g/kg，静脉注射的LD50值为24.5±2.3克/公斤体重。口服最大耐受量为252.5～300克/公斤体重，说明无论采用静脉注射、腹腔注射或灌胃其毒性均非常低，而本发明案所作的急毒性测试，其方法为含2％的活性部份的饲料喂食ICR鼷鼠7天之后处理，以检视有无急毒性，其结果如表7所示，无急毒性。故冬虫夏草是一药理作用广泛，且毒性非常小的药物。

实施例5活性化合物的鉴定

本发明活性化合物经物理化学方法和光谱学分析例如质谱分析，氢核磁共振光谱分析和碳核磁共振光谱分析于以鉴定的结果如下所述：

其分子式为C₂₈H₄₆O₃，分子量为430克/摩尔；

其物理特征如下：溶点：243-245^》C

质谱(MS)(m/z)：430(M+)，412，394，379，287，269，251，227，225，197。

1H NMR(CDCl3，500MHz)d：5.33(1H，m，H-7)，5.14-5.20(2H，m，H-22，and H-23)，4.08(1H，m，H-3)，3.59(1H，m，H-6)，1.06(3H，s，H-19)，1.01(3H，d，J＝6.5Hz，H-21)，0.90(3H，d，J＝6.5Hz，H-28)，0.82(3H，d，J＝7.5Hz，H-26)，0.80(3H，d，J＝7.0Hz，H-27)，0.58(3H，s，H-18)。(图2)

1H NMR(CDCl3，200MHz)d：5.05-5.30(4H，m，H-3，H-7，H-22，和H-23)，4.80(1H，m，H-6)，2.06(3H，s，O＝C-CH3)，2.03(3H，s，O＝C-CH3)。(图3和图4)

13C-NMR(CDCl3，500MHz)d：144.0(C-8)，135.3(C-22)，132.1(C-23)，117.5(C-7)，76.7(C-5)，75.9(C-6)，67.7(C-3)，55.9(C-17)，54.7(C-14)，43.7(C-13)，43.4(C-9或C-24)，42.8(C-24或C-9)，40.4(C-4)，39.5(C-20)，39.2(C-12)，37.1(C-10)，33.1(C-2)，32.9(C-25)，30.8(C-1)，27.9(C-16)，22.9(C-15)，22.0(C-11)，21.1(C-21)，19.9(C-26或C-27)，19.6(C-27或C-26)，18.8(C-19)，17.5(C-28)，12.3(C-18).(图5)

上述图2为本发明活性化合物的氢核核磁共振光谱图，图3和图4是为本发明活性化合物的乙酰化产物的氢核磁共振光谱图。由上述两光谱图的分析，本发明活性化合物应属麦角  醇类化合物。由图3和图4可知本发明活性化合物乙酰化产物，含有两个乙酰基(d2.06和2.03)，充分显示本发明活性化合物会有两个或两个以上的羟基(-OH)。再由碳核磁共振光谱(图5)知本发明活性化合物又含有一接于四级碳(d76.7)的羟基，综上讨论，确定本发明活性化合物为

(24R)--麦角甾-7，22--二烯-3β，5α，6β--三醇。

其结构如下：

实施例6活性部份和活性化合物的预防与治疗结果的评估

(A)活性部份F4或活性化合物F8的预防处理，为了解冬虫夏草萃取物对气喘是否有保护预防作用，实验设计在以卵白蛋白敏感化及挑激时之前，OA组吸入性投入生理食盐水做对照，而预防组则投入3毫克的活性化合物F8溶液。

(B)性部份F4或活性化合物F8的治疗处理，治疗组实验动物在挑激后，由腹腔注射F4活性部份或F8活性化合物；OA组则注射生理食盐水作为对照。经过上述动物模式的处理后，将实验动物在挑激的两天后处理，并取其肺脏，置于冰中保持低温，进行去氧核糖核酸(RNA)及核蛋白质的抽取及反转录聚合连锁反应。

(C)对辅助型T淋巴球1(Th1)、抑制型T淋巴球2(Th2)细胞激素表现的影响由反转录聚合酶连锁反应的结果加以统计，分析比较每一种细胞激素的基因表现在未处理(N)，以卵白蛋白(OA)诱发气喘反应及给予活性部份(OA+活性部份)或活性化合物(OA+活性化合物)的三组实验动物间的差异每一组实验重复次数(n＝6)。

其结果为：

一、活性部份对Th1/Th2细胞激素的影响

(A)活性部份F4的预防效果(参图6和图7)

丙种干扰素(IFN-r)的表现在OA引起后期反应显著下降几乎是完全受到抑制。活性部份分别在致敏感前及刺激前先给予则避免了对IFN-r的抑制效果(参图6)。在Th2细胞激素表现方面IL-10、IL-4及IL-5在OA组都明显地增加表现，而活性部份的预防则完成抑制其增加，使这三种细胞激素的表现和未处理组相同。IL-6的表现则与其他Th2细胞激素不一致。未处理(N)组已有明显IL-6的表现，在OA组则没有显著的变化，但在活性部份预防则可以观察到有降低IL-6表现的情形(P(0.05)。

在OA引起气喘的模式中抑制型T淋巴球2(丙种干扰素)Th2(IFN-r)的表现下降，而Th2、IL-4、IL-5、IL-10的表现则增加；活性部份的预防性给予可以有效地使Th1/Th2的表现都近于未处理组时的表现状态(参图7)。

(B)活性部份的治疗效果(参图8及图9)

丙种干扰素(IFN-r)在OA组降低的表现，加入活性部份处理后可以恢复到与正常情形相同的表现(参图8)；对IL-4及IL-5的增加，活性部份也能降低其作用，在IL-6也有相同模式的变化，且本组中IL-6在OA组的表现比未处理(N)组显著增加；活性部份的处理对IL-10的表现有抑制的作用，但在本组中处理的老鼠确有IL-10的表现，活性部份的治疗也有效地使气喘的细胞激素表现型态由Th2转向Th1(参图9)。

二、活性化合物对Th1/Th2细胞激素的影响

(A)活性化合物的预防效果(参图10与图11)对IFN-r在气喘后期反应中下降的表现，活性化合物有明显的预防作用，给予活性化合物后IFN-r的表现为如OA组一样降低(参图10)；对Th2细胞激素的影响，活性化合物降低了OA引起的IL-4、IL-5、IL-6的上升；活性化合物的处理则使IL-10下降至OA组的1/4，故活性化合物的确可预防OA引发的Th2的反应(参图11)。

(B)活性化合物的治疗效果(参图12与图13)比起预防处理的结果，活性化合物在引起气喘反应性化合物使在OA(卵白蛋白)组中下降回复到略低于未处理组(参图12)。对IL-5、IL-6在OA引起的上升有抑制使其下降的作用，但降低的程度未能到与未处理组一样；在IL-4的情况则表现了显著的效果，抑制其IL-4在生产使其低于未处理组；IL-10在未处理组偏高，OA组略低，而活性化合物有明显抑制作用，故活性化合物的治疗效果会使气喘的Th2反应回趋Th1的方面(参图13)。

实施例7活性部份对氧化氮合成酶(iNOS)表现的影响(参图14与图15)使用相同的模式及反转录聚合酶连锁反应的方法，在此实验中，未处理的老鼠肺组织均有微量iNOS的表现，在OA引发气喘后期反应下可看到iNOS明显提高。活性部份在OA模式中作预防处理会使iNOS基因表现维持在与未处理组相同的低表现量的情况(参图14)，而活性部份的治疗效果也有降低OA引发的高iNOS经表现(参图15)，但其量略高于未处理组，故活性部份在预防及治疗两方面都能降低OA处理下iNOS的基因表现，但以预防效果较为安全。

实施例8活性化合物对iNOS基因表现的影响，不论是引发气喘前的预防处理，或之后的治疗对iNOS的表现均有明显的抑制，其中治疗效果更达到了安全抑制(参图16及图17)。

实施例9体内的筛选系统，活性部份F4和活性化合物F8对气喘动物模式肺功能的影响动物模式必须具备专一性，可造成肺功能阻塞性变化与支气管过度反应，呼吸道炎症反应，与相对应人类气喘症非常相似的特性。

基于上述的考虑，本发明实验是采用棕色挪威鼠卵白蛋白诱发气喘后期发炎反应，为体内动物模式，以肺功能及组织病理学变化作为〔活性成份〕疗效的指标。实验上是将棕色挪威鼠分成控制组和实验组两组，两组均先经两次卵白蛋白(OA)敏感化，敏感化方法是把动物放入密闭的体箱(长∶宽∶高＝30公分×28公分×15公分)，1％2毫升的卵白蛋白溶液放入雾化器容器内，以流速8公升/分的气流使卵白蛋白雾化后，使动物由吸入方式给药，待动物完全吸入至体箱内无气雾，取出动物，送回动物饲养，七日后进行第二次敏感化，步骤方法同上所述。两组实验动物，一组实验组，一组对照组，同时给予高测量4％，3毫升卵白掉白挑激，以吸入法诱发气喘，三十六小时后放气管插管，连结仪器测量肺功能。在进行最后一次给高剂量卵白蛋白挑激之前30分，先由腹腔注射利纳明(10mg/kg)，避免试验鼠因产生气喘急性反应而死亡。实验鼠在进行最后一次给高剂量卵白蛋白挑激之后起之36小时进行乙酰胆碱激发试验，以诱发后期反应。为了探讨由离体筛选找出的〔活性成份〕是否对气喘的后期反应具有预防或治疗效果，预防效果的探讨(参图12)是于实验组在以卵白蛋白敏感化之前吸入同离体筛选的冬虫夏草的活性部份或活性化合物；探制组则注射生理食盐水。治疗效果的探讨是实验组在以卵白蛋白诱发之后24小时再吸入再离体筛选的冬虫夏草的活性部份或活性化合物，接着测定肺功能以比较疗效。在肺功能可以发现主要最大活性出现于CS-F4活性部份，故选择该活性部份作为其后进一步动物体内试验的材料。

(a)肺功能检查

呼吸道开口接上戈尔特公司的压力转换器来测量开口压。实验鼠的呼吸流速是以DP-45-14压差转换器来测量。当自然呼吸时体箱壁是用6层325网沙状铁丝间隔板来测压力差，当用最大用力吐气时是用6层325网沙状铁丝间隔板来测压力差。

做最大用力吐气时小动物需先充气至全肺容积三次。当第三次充气至全肺容积时加用电磁阀将吸气阀关闭，并立刻自动转换至吐气阀。吐气阀与20公升的容器相接，以保持吐气时间固定在一30公分水柱的气压。另外用一30公分水柱的气压来产生最大吐气流速。流速、溶积及动脉氧分压(PaO₂)的变化由转送装置的7P1，7P10的前置转换器再由转送装置的多项记录器记录下来。最大吐气的流速——容积图用肺机械分析仪来检查并储存于有记忆功能的阴极射线示波器。

由记录下来的流速容积图来取尖峰流速值(即由记录下的流速容积图的最大流速)，75％全肺容积时用力吐气流速(MFEF75％)，50％全肺容积时用力吐气流速(MFEF50％)，25％全肺容积时用力吐气流速(MFEF25％)及肺活量。

(b)肺容积的测量

全肺容积被定义为呼吸道压力为35公分水柱时肺内的气体体积，残余容积被定义为呼吸道压力为一10公分水柱时肺内的气体体积。肺容积(TLC，肺机能储藏容积FRC)的测量是用气体稀释的原理与方法。氖床及一氧化碳的浓度是以气相分析仪来检查，肺容积需同时测量三次并取其平均值。

(c)支气管肺泡灌洗液

每双实验鼠于肺功能实验后，以10毫升生理食盐水经由气管插管予以灌洗两次(共20毫升)，回抽后再经纱布过滤，于转速2500rpm、4摄氏度冷冻离心5分钟，将上层液取出以备做进一步分析，而下层细胞则做为细胞计数用。

离心后的下层细胞以汉克平衡盐水充分洗净除去红血球后，加入磷酸盐平衡溶液调成细胞悬浮液，以锥虫蓝做细胞总数计算，离心除去磷酸盐平衡溶液，加入胎牛血清将调成细胞浓度为(1×106细胞/毫克)细胞悬浮液以细胞自旋转速1200ipm、5分钟将细胞打到玻片上(1×105片)，再作染色，进行细胞分类计数。

(d)组织病理学检查

将实验后的实验鼠进行开胸手术，取出肺脏，固定取其右下叶做组织病理学检查。将肺组织固定于10％中性福马林中，以渐增浓度的酒精脱水后，再以石腊包理，切成4uM厚切片，以苏木精及伊红染色在显微镜下观察。其结果如下所述：

(A)预防性吸入投入活性部份对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气喘的肺功能影响两组在未给予乙酰胆碱(Acetyl-choilne，简写Ach)前呼吸流速曲线的尖峰流速，75％全肺容积时用力吐气流速，50％全肺容积时用力吐气流速，25％全肺容积时用力吐气流速，平均基础值例于表1。由表1可发现两组的尖峰流速，75％全肺容积时用力吐气流速，全肺容积，呼吸道开口压及动态可张性并无统计学上显著的差别，但第一组的50％全肺容积时用力吐气流速及25％全肺容积时用力吐气流速则显著比第二组低(参图18、图19)。给予Ach后使各肺功能检查参数由基础值下降20％所需乙酰胆碱(Ach)的剂量，第一组各肺功能参数的PD20值；尖峰流速(47ugvs＞100ug)，75％全肺容积时用力吐气流速(52ugvs＞100g)，50全肺容积时用力吐气流速(27ugvs71ug)，25％全肺容积时用力吐气流速(12ugvs38ug)都显著比第2组低。

除了肺功能改变外，由支气管肺泡灌洗液的检查发现，投药组浸阔的炎症细胞显著比对照组为低(表2)；组织病理学检查也发现投药组明显减少炎症细胞浸润及支气管上皮细胞伤害。

(B)预防性吸入投入活性化合物对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气喘的肺功能影响两组在未给予乙酰胆碱(Ach)前呼吸流速曲线的尖峰流速，在75％全肺容积时用力吐气流速，50％全肺容积时用力吐气流速，25％全肺容积时用力吐气流速，平均基础值列于表3。由表3可发现两组的尖峰流速，75％全肺容积时用力吐气流速，全肺容积，呼吸道开口压及动态可张性并无统计学上显著的差别，但第一组的50％全肺容积时用力吐气流速及25％全肺容积时用力吐气流速则显著比第二组低(参图20、图21)。

(C)对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠预防性吸入投予活性化合物，给予Ach后各肺功能检查，第一组各肺功能参数的PD20值，尖峰流速(49ug vs＞100ug)，75％全肺容积时用力吐气流速(54ug vs＞100kug)，50％全肺容积时用力吐气流速(13ug vs＞51ug)，25％全肺容积时用力吐气流速(12ug vs＞30ug)都显著比第2组低。

除了肺功能改变外，由支气管肺泡灌洗液的检查发现，投药组浸润的炎症细胞显著比对照组为低(表4)；组织病理学检查也发现投药组明显减少炎症细胞浸润及支气管上皮细胞伤害。

(C)治疗效果吸入投入活性部份对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气喘的肺功能影响两组在未给予乙酰胆碱(Ach)前呼吸流曲线的尖峰流速，在75％全肺容积时用力吐气流速，50％全肺容积时用力吐气流速，25％全肺容积时用力吐气流速，平均基础值列于表5，由表5可发现两组的尖峰流速，75％全肺容积时用力吐气流速，全肺容积，呼吸道开口压及动态可张性并无统计学上显著的差别，但第一组的50％全肺容积时用力吐气流速及25％全肺容积时用力吐气流速则显著比第二组低(参图22、图23)。除了肺功能改变外，由支气管肺泡灌洗液的检查也发现投药组浸润的炎症细胞显著比对照组为低(表6)；组织病理学检查也发现投药组明显减少炎症细胞浸润及支气管上支细胞伤害。

对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠治疗性吸入活性部份，再给予Ach后各肺功能检查所需Ach的剂量，第一组肺功能参数的PD20值，尖峰流速(48ug vs＞100ug)，75％全肺容积时用力吐气流速(62ug vs＞100ug)，50％全肺容积时用力吐气流速(24ugvs＞46ug)，25％全肺容积时用力吐气流速(12ug vs＞48ug)都显著比第2组低。

(D)治疗效果吸入投稿活性化合物对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠气喘的肺功能影响两组在未给予乙酰胆碱(Ach)前呼吸流速曲线的尖峰流速，在75％全肺容积时用力吐气流速，50％全肺容积时用力吐气流速，25％全肺容积时用力吐气流速，平均基础值列于图24及图25。由图24及图25可发现两组尖峰流速，50％全肺容积时用力吐气流速及25％全肺容积时用力吐气流速有显著统计差异，对照组比活性化合物治疗组低(参图24、图25)。

除了肺功能改变外，由支气管肺泡灌洗液的检查也发现投药组浸润的炎症细胞显著比对照组为低(表6)；组织病理学检查也发现投药组明显减少炎症细胞浸润及支气管上皮细胞伤害。

对卵白蛋白诱发棕色挪威鼠治疗性吸入投入活性化合物，再给予Ach后各肺功能检查所需Ach后各肺功能检查所需Ach的剂量，第一组各肺功能参数的PD20值，在75％全肺容积时用力吐气流速，50％全肺容积时用力吐气流速都是对照组显著比活性化合物治疗组为低。

以上结果显示冬虫夏草活性组份或活性化合物不论以预防性给予(0.5毫克及3毫克)的活性部份或活性化合物溶液分别于第二次卵白蛋白敏感化及挑激时同时吸入给予或治疗性给予(在挑激后由腹腔注射活性部份或活性化合物)以测试其改善前述肺功能、病理表现及免疫变化表现的效果，也支持冬虫夏草有效活性部分及活性化合物确改进实验室〔气喘反应〕的效果。

有关附表陈列如下(共8张)：

表1：预防性投予F4对以齐量乙酰胆碱激发试验后，最高峰呼气流速各呼吸分段流速百分比的变化

                      尖峰流速                容积时用力吐气流速     全肺容积时用力吐气流速    全肺容积时用力吐气流速

                                                    (75％)               (50％)                      (25％)

                       对照组      试验组     对照组      试验组     对照组       试验组        对照组      试验组

基础值  ％             100±0      100±0     100±0      100±0     100±0       100±0        100±0      100±0

25μgAch/kg i.v..％    89.4±3.7^* 98.9±3.4  90.3±3.8^* 96.6±2.2  81±6.1^*   93.2±5.7     52.8±5.7^* 85.2±4.4

50μgAch/kg i.v..％    78.4±4.4^* 96.8±3.5  82.4±3.3^* 94.2±2.9  58.4±5.7^* 95.7±5.4     30.6±5.4^* 68.2±4.5

75μgAch/kg i.v..％    70.8±4.2^* 95.8±4.9  73.8±0.8^* 90.1±4.5  43.3±3.9^* 76.3±5.2     18.7±4.2^* 60.7±4.5

100μgAch/kg i.v..％   60.5±3.4^* 94.5±4.8  60.5±3.0^* 87.1±4.6  32.6±3.8^* 68.3±4.6     14.5±3.6^* 52.5±4.6

 表2：支气管肺泡灌洗液中的总细胞数及分类

                           对照组         试验组

总细胞数(×10⁴)/mL        12.4±3.4^*    7.8±2.3

吞噬细胞

    细胞数(×10⁴)/mL      5.9±0.71      6.86±0.53

    百分比(％)             47.6±5.7^*    88±3.8

淋巴球

      细胞数(×10⁴)/mL    2.77±0.56^*   0.51±0.12

      百分比(％)           22.3±4.5^*    6.5±1.6

嗜中性球

    细胞数(×10⁴)/mL      0.22±0.6      0.18±0.3

    百分比(％)             1.8±0.5       2.30±0.4

嗜酸性球

    细胞数(×10⁴)/mL      3.51±0.5^*    0.25±0.2

    百分比(％)             28.3±4.2^*    3.2±2.2

表3：预防性投予F8对以不同剂量乙酰胆碱激发试验后，最高峰呼气流速各呼吸分段流速百分比的变化

                      尖峰流速               全肺容积时用力吐气流速    全肺容积时用力吐气流速  全肺容积时用力吐气流速

                                                   (75％)                   (50％)                  (25％)

                      对照组      试验组     对照组      试验组       对照组       试验组       对照组      试验组

基础值  ％            100±0      100±0     100±0      100±0       100±0       100±0       100±0      100±0

25μgAch/kg i.v..％   90.7±3.6^* 97.1±3.6  89.8±3.5^* 96.5±3.2    78.6±4.8^* 90.8±4.5    59.8±5.3^* 83.6±4.3

50μgAch/kg i.v..&    80.6±4.2^* 93.8±3.4  82.3±3.2^* 91.4±2.7    54.4±4.3^* 80.7±4.7    43.9±4.9^* 70.6±4.4

75μgAch/kg i.v..％   75.6±3.9^* 91.2±4.3  74.1±3.4^* 87.3±4.5    43.7±3.8^* 68.3±4.4    28.6±4.1^* 55.8±4.1

100μgAch/kg i.v..％  60.5±3.3^* 88.6±3.5  64.5±3.2^* 82.9±4.6    36.8±3.6^* 60.4±4.7    18.7±3.5^* 46.2±4.2

表4：支气管肺泡灌洗液中的总细胞数及分类

                             对照组            试验组

总细胞数(×10⁴)/mL          14.8±3.2^*       6.7±2.2

吞噬细胞

    细胞数(×10⁴)/mL        6.85±0.64        5.78±0.55

    百分比(％)               46.3±5.5^*       86.3±3.9

淋巴球

    细胞数(×10⁴)/mL        3.37±0.51        0.46±0.09

    百分比(％)               22.8±4.5^*       6.9±1.6

嗜中性球

    细胞数(×10⁴)/mL        0.31±0.4         0.15±0.2

    百分比(％)               2.1±0.5          2.2±0.5

嗜酸性球

    细胞数(×10⁴)/mL        4.26±0.5^*       0.31±0.2

    百分比(％)               28.8±4.5^*       4.6±1.9

表5：治疗性投予F4对以不同剂量乙酰胆碱激发试验后，最高峰呼气流速各呼吸分段流速百分比的变化

                      尖峰流速            全肺容积时用力吐气流速    全肺容积时用力吐气流速  全肺容积时用力吐气流速

                                                (75％)                   (50％)                     (25％)

                      对照组      试验组     对照组      试验组     对照组       试验组       对照组      试验组

基础值  ％            100±0      100±0     100±0      100±0     100±0       100±0       100±0      100±0

25μgAch/kg i.v..％   93.2±3.3^* 96.4±3.8  90.3±3.8^* 96.5±3.5  79.5±4.6^* 89.6±3.9    65.9±4.8^* 80.4±4.4

50μgAch/kg i.v..&    78.9±3.9^* 95.2±3.6  84.2±3.1^* 91.4±3.4  56.7±4.1^* 75.1±3.8    58.3±4.4^* 67.8±4.1

75μgAch/kg i.v..％   72.2±3.7^* 90.6±4.1  75.4±3.5^* 86.3±4.1  44.8±3.9^* 64.8±4.2    45.4±3.2^* 54.2±3.9

100μgAch/kg i.v..％  64.6±3.5^* 86.3±3.6  64.5±3.3^* 81.8±4.2  38.2±3.4^* 59.8±4.3    34.2±2.7^* 47.6±3.8

表6：支气管肺泡灌洗液中的总细胞数及分类

                              对照组           试验组

总细胞数  (×10⁴)/ml         15.2±3.6^*      6.4±2.1

吞噬细胞

    细胞数(×10⁴)/ml         6.86±0.68       5.63±0.53

    百分比(％)                45.1±5.4^*      88±3.8

淋巴球

    细胞数(×10⁴)ml          3.69±0.51^*     0.42±0.12

    百分比(％)                24.3±4.2^*      6.5±1.6

嗜中性球

    细胞数(×10⁴)ml          0.22±0.5        0.15±0.3

    百分比(％)                1.5±0.4         2.30±0.4

嗜酸性球

    细胞数(×10⁴)ml          4.42±0.6^*      0.20±0.2

    百分比(％)                29.1±4.4^*      3.2±2.2

表7：ICR小白鼠喂食含2％F4喂料的急毒性试验

分析                                正常(n＝6)       2％F4(n＝6)

体重(克)                            21.58±0.56      22.01±0.66

肾重(克)                            1.23±0.07       1.30±0.05

肝重/体重(100克/克)                 5.72±0.30       5.92±0.15

肾重(克)                            0.20±0.01       0.20±0.01

胆固醇/肝重                         1.99±0.07       2.03±0.07

细胞色素P450含量(nmole/mg蛋白质)    0.82±0.04       0.92±0.05

表8：冬虫夏草中F4及F8对于血小板活化因子诱导的血小板凝集的抑制活性

              剂量               抑制活性(％)

F4            500μg/ml          83.8±9.1

F8            0.625mM            97.1±2.6

DMSO          0.1％(v/v)         12.1±0.7

综上所述，与现有技术相比，本发明从冬虫夏草中分离出的活性部份及活性化合物在体外可抑制血小板活化因子诱发兔子血小板凝集，在体内可预防性及治疗性改善气喘后期反应的阻塞性肺功能恶化，强化Th1细胞激素表现，降低iNOS基因表现，改善肺组织学变化，以阻断往后造成伤害。且活性部份并不会产生急毒性，计算活性部份及从活性部份中所纯化出来的活性化合物对于血小板活化因子诱导的血小板凝集的抑制活性如表8所示，对肺功能改善值为2毫克/公斤肌肉注射(如图26所示)，由此推算大约活性化合物3毫克/公斤，可见其在预防或治疗人类气喘症有疗效。

Claims (3)

1、一种冬虫夏草活性部分的分离方法，包括烘干、研碎、抽提、浓缩、层析处理、鉴定部分；其特征在于：先将冬虫夏草的子实体部分烘干，研碎，然后以有机溶剂丙酮、氯仿或二氯甲烷其中一种抽提，将抽提液浓缩，并用正乙烷、乙酸乙酯、甲醇三种溶液以不同比例混合成不同极性的冲提溶剂进行冲提，从活性部分获取活性化合物时，先将活性部分以甲醇——氯仿溶解，以氧化硅凝胶管柱层析分离，依序用二氯甲烷——甲醇100∶1→1∶1体积比当冲提溶剂，收取各冲提液份，测定各冲提液份所具抑制血小板活化因子诱发兔子血小板凝集的功能，将活性冲提液份浓缩后，以甲醇——氯仿进行重结晶，可得活性化合物，再进行氧化硅凝胶管柱层析处理，鉴定其活性部分和分离出活性部分。

2、如权利要求1所述的冬虫夏草活性部分的分离方法，其特征在于：其中收取的冲提液份是二氯甲烷——甲醇10∶1体积比的冲提液份。

3、如权利要求1所述的冬虫夏草活性部分的分离方法所获得的活性化合物，其特征在于：其中活性化合物是(24R)-麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β--三醇；其结构如下：

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