CN115737829A - 一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物,属于纳米药物载体领域,包括如下步骤:从BALB/c小鼠骨髓提取原代骨髓间充质干细胞;利用光学显微镜、流式细胞仪鉴定原代骨髓间充质干细胞;利用“经典的差速超速离心法”从细胞培养上清液中提取骨髓间充质干细胞分泌的细胞外小囊泡;利用电穿孔的方法将水溶液中的Ce6和GW4869同时载入细胞外小囊泡;穿孔后在冰上孵育15分钟,后将混合液放入细胞培养箱孵育1小时,以促进细胞外小囊泡膜修复;100000g超速离心除去游离的Ce6和GW4869,得到能够改善三阴性乳腺癌免疫微环境的光敏细胞外小囊泡。制得的复合细胞外小囊泡中Ce6和GW4869的载药量能满足体内治疗要求为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的工具。

Description

一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物
技术领域
本发明涉及纳米药物载体领域,具体涉及一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物。
背景技术
光动力治疗作为一种新型非侵入性的临床治疗手段,目前已有多款光敏剂被多国的FDA批准在临床上应用。Ce6(Chlorin e6,二氢卟吩e6)作为一种光动力治疗常用的光敏剂,在660nm波长的光照下具有较强的抗肿瘤作用。GW4869是中性鞘磷脂酶抑制剂(GW4869),体外实验发现,GW4869可以抑制三阴性乳腺癌细胞分泌细胞外小囊泡,而三阴性乳腺癌细胞分泌的细胞外小囊泡可以刺激免疫抑制性细胞如:Tregs和MDSCs的成熟,因此GW4869抑制三阴性乳腺癌细胞分泌细胞外小囊泡可以减少免疫抑制性细胞的成熟,故其具有改善三阴性乳腺癌免疫微环境的能力。
然而两种药物均有明显的缺陷,比如:在血液循环系统中溶解性、稳定性差,容易被单核巨噬细胞吞噬,往往较多地聚集在肝脾及淋巴组织,肿瘤部位的浓度较低,影响其抗肿瘤的效果。用合适的载体对药物进行包载,提高其在血循环中的溶解性、稳定性,避免/减少免疫清除。因此,为了能够更多的将目标药物递送至三阴性乳腺癌区域,并实现光动力治疗和GW4869改善三阴性乳腺癌的免疫微环境协同治疗,提出一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提出了一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
一种光敏细胞外小囊泡制备方法,所述的细胞外小囊泡内载有可用于光动力治疗的Ce6以及抑制三阴性乳腺癌细胞外小囊泡分泌的GW4869,其还具有改善三阴性乳腺癌免疫微环境的功能;其中Ce6为水溶液,GW4869为二甲基亚砜(DMSO)溶液,其具体制备步骤如下:
从BALB/c小鼠的股骨和胫骨中获取其骨髓,在DMEM/F12培养液中培养;其中,原代BALB/c小鼠细胞的骨髓间充质干细胞的培养液为含有无细胞外小囊泡的血清;
在原代BALB/c小鼠细胞的骨髓间充质干细胞被提取后的第十四天在光学显微镜下观察期形态;
用流式细胞仪检测原代BALB/c小鼠细胞的骨髓间充质干细胞稳定增殖的第三代细胞表面标志物Sca-1、CD44、CD45、CD11b和CD31;
收集稳定传代的原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞的上清液,采用“经典的差速超速离心法”,得到的细胞外小囊泡并重悬于PBS溶液中,-80℃保存备用;其中,每800-1000mL的上清液在经过“经典的差速超速离心法”处理后获得的细胞外小囊泡用800μL-1000μL的PBS重悬;
将Ce6水溶液、含有GW4869的DMSO溶液及4)中获取的细胞外小囊泡混悬液加入PBS溶液中,充分混匀后获得样品;其中,细胞外小囊泡以其蛋白含量计,每100μg的细胞外小囊泡的溶液中,Ce6的质量为80-120μg,GW4869的质量为100-150μg;
按电穿孔仪的规格选择合适的电穿孔皿,并加入相应体积的上述样品,放入电穿孔仪中,按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数,进行穿孔;其中,电穿孔条件为:电压400-800V,电容125-200μF,放电时间1-10ms,放电次数1次;
穿孔后在冰上孵育15-20分钟等待药物充分进入细胞外小囊泡中,随后立即将样品放入细胞培养箱中37℃孵育1小时,以促进细胞外小囊泡膜修复;
上述样品孵育1小时后,以100000-110000g离心力超速离心70-110分钟,将上清弃去,沉淀物即为能够改善三阴性乳腺癌免疫微环境的光敏细胞外小囊泡,称之为复合细胞外小囊泡;
上述复合细胞外小囊泡用PBS重悬,制备铜网样品并进行负染,于电镜下观察细胞外小囊泡的形态,用纳米颗粒跟踪分析检测(NTA)测定其平均粒径及粒径分布范围,用BCA法测细胞外小囊泡的蛋白含量,用Western Blotting检测细胞外小囊泡膜表面特征性蛋白表达,证明其为细胞外小囊泡;
将部分复合细胞外小囊泡用PBS重悬,用紫外-可见光分光光度计检测400nm及653nm处Ce6的特征性吸收峰以及350nm处GW4869的特征性吸收峰,证明Ce6和GW4869成功负载于细胞外小囊泡内,并根据OD值测定Ce6和GW4869在复合细胞外小囊泡中的含量。
第二方面,本发明还提供一种光敏细胞外小囊泡,通过上述所述的光敏细胞外小囊泡的制备方法制备得到。
第三方面,本发明还提供如上述所述的光敏细胞外小囊泡在制备抗三阴性乳腺癌药物、抗三阴性乳腺癌辅助药物或三阴性乳腺癌诊断药物中的应用。
第四方面,本发明还提供一种药物,包括如上所述的光敏细胞外小囊泡。
本发明的有益效果:
本发明用细胞外小囊泡同时负载Ce6和GW4869,制得的复合细胞外小囊泡一方面增加了两种药物的溶解性、稳定性,降低了药物在活体应用时的被免疫系统的吞噬和清除可能;另一方面,由于该复合细胞外小囊泡保持了其纳米级别的粒径,活体应用时可以对肿瘤进行靶向治疗,保证药物的体内给药效率,实现了对肿瘤的精准治疗并减少其副作用。同时,该发明具有明确的理论基础,成熟的实验方法和简便易行的操作流程。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本申请的原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞在第十四天的光学显微镜下的示意图;
图2为本申请的流式实验检测原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞增殖的第三代细胞表面标志物的表达情况图;
图3为本申请的电穿孔前、后透射电镜(TEM)观察细胞外小囊泡大小和形貌特征图;
图4为本申请的电穿孔前、后纳米颗粒跟踪分析(NTA)测量细胞外小囊泡粒径大小及分布图;
图5为本申请的电穿孔前、后细胞外小囊泡特征性蛋白表达情况(WesternBlotting)图;
图6为本申请的电穿孔前、后细胞外小囊泡紫外-可见光分光光谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
首先获得原代BALB/c小鼠的骨髓间充质干细胞及其来源的细胞外小囊泡:
1)取雌性4-5周龄的BALB/c小鼠,采用颈椎脱臼法将其处死后,立即将其浸泡在75%的酒精中5-10分钟,随后将BALB/c小鼠转移至超净台内。将BALB/c小鼠的四肢固定在无菌的塑料泡沫板上,使其后肢能够充分暴露在操作者视野内。用高压灭菌后的手术剪刀和镊子剪开BALB/c小鼠的后腿皮肤,小心地剥离出BALB/c小鼠完整的股骨和胫骨,并且将其周围的皮肤、肌肉及结缔组织分离,分离后的股骨和胫骨放在盛有DMEM/F12完全培养液的培养皿中备用。取股骨或胫骨,用剪刀剪开两端,并用1mL的一次性无菌注射器吸取DMEM/F12完全培养液,并且将骨髓从骨髓腔内冲洗出,反复冲洗骨髓腔直至股骨和胫骨透光变白。收集冲洗出来带有骨髓的DMEM/F12培养液,利用70μm的无菌滤器过滤两次除去大的组织块、碎骨等杂质,随后收集过滤后的液体进行300g,5分钟的离心。离心后去上清液,加入细胞沉淀体积3-5倍的红细胞裂解液,反复吹打后静置3分钟。裂解完成后加入5mL的DMEM/F12完全培养液,再次反复吹打后进行300g,5分钟的离心。离心后去上清液,观察沉淀是否还有红色,若还可见到红色的沉淀说明红细胞未完全裂解,可重复上述红细胞裂解步骤直至沉淀完全变成白色为止(注意:红细胞裂解液对正常细胞有损伤,务必保证裂解时间不能过长)。最后用5mL的DMEM/F12完全培养液将细胞重悬,接种至T25的培养瓶内,在37℃的培养箱内培养,第二天对其进行换液,将漂浮的细胞洗去,剩余贴壁的细胞即为骨髓间充质干细胞。本发明方法中所使用的原代BALB/c小鼠的骨髓间充质干细胞,亦可采纳其他提取方法获得,原代BALB/c小鼠的骨髓间充质干细胞在本发明方法中作为纳米载体的来源细胞,其提取方法和流程并不构成对本发明保护范围的限定。
2)原代BALB/c小鼠的骨髓间充质干细胞来源的细胞外小囊泡的提取、纯化:收集原代BALB/c小鼠的骨髓间充质干细胞的上清液800-1000mL,按如下步骤进行差速超速离心:用300g离心10分钟后去除沉淀,取上清;继续用2000g离心10分钟后去除沉淀,取上清;继续用10000g离心30分钟后去除沉淀,取上清;用110000g超离70分钟两次后去上清;终沉淀物用800μL-1000μL的PBS液重悬,取50μl样品BCA法测蛋白含量。本发明方法中所使用的细胞外小囊泡,亦可采纳其他提取获得,细胞外小囊泡在本发明方法中作为药物的载体载体,其提取方法和流程并不构成对本发明保护范围的限定。
然后制备负载药物的溶液:
3)Ce6溶液配制:称取10mgCe6粉末,溶解于50μLDMSO中,充分混匀,再用PBS补足10mL,得1mg/mL的溶液:
4)GW4869溶液配制:称取10mgGW4869粉末,溶解于17.32mLDMSO中,充分混匀,得1.732mg/mL的溶液;
最后再通过电穿孔将Ce6和GW4869载入细胞外小囊泡中:
5)在PBS溶液中按一定比例加入细胞外小囊泡、Ce6水溶液、含有GW4869的DMSO溶液;充分混匀后,将适量体积的混合液加入电穿孔皿中,放入电穿孔仪,按照一定的反应条件进行电穿孔,穿孔后在冰上孵育15-20分钟等待药物充分进入细胞外小囊泡中,随后立即将样品放入细胞培养箱中37℃孵育1小时,以促进细胞外小囊泡膜修复;
6)上述样品孵育1小时后,以100000-110000g离心力超速离心70-110分钟,将上清弃去,沉淀物即为能够改善三阴性乳腺癌免疫微环境的光敏细胞外小囊泡,称之为复合细胞外小囊泡
下面结合具体实施例,进一步阐明本发明,应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
在PBS溶液中加入细胞外小囊泡100μg、1mg/mLCe6水溶液100μl、1.732mg/mL含有GW4869的DMSO溶液100μl;混匀后,加入8mm(容积750μl)电穿孔皿中,放入电穿孔仪,按照如下反应条件:电压400V,电容150μF,放电时间1ms,放电次数:1次。穿孔后将混悬液置于冰上15分钟后放入细胞培养箱中孵育1小时,继之100000g超速离心一次,每次70分钟,弃上清,用PBS重悬沉淀即为同时负载Ce6和GW4869的复合外泌体,-80℃储存进行后续检测及实验;
实施例2
在PBS溶液中加入细胞外小囊泡100μg、1mg/mLCe6水溶液100μl、1.732mg/mL含有GW4869的DMSO溶液100μl;混匀后,加入8mm(容积750μl)电穿孔皿中,放入电穿孔仪,按照如下反应条件:电压500V,电容170μF,放电时间1ms,放电次数:1次。穿孔后将混悬液置于冰上15分钟后放入细胞培养箱中孵育1小时,继之100000g超速离心一次,每次70分钟,弃上清,用PBS重悬沉淀即为同时负载Ce6和GW4869的复合外泌体,-80℃储存进行后续检测及实验;
实施例3
在PBS溶液中加入细胞外小囊泡100μg、1mg/mLCe6水溶液100μl、1.732mg/mL含有GW4869的DMSO溶液100μl;混匀后,加入8mm(容积750μl)电穿孔皿中,放入电穿孔仪,按照如下反应条件:电压600V,电容150μF,放电时间1ms,放电次数:1次。穿孔后将混悬液置于冰上15分钟后放入细胞培养箱中孵育1小时,继之110000g超速离心一次,每次70分钟,弃上清,用PBS重悬沉淀即为同时负载Ce6和GW4869的复合外泌体,-80℃储存进行后续检测及实验;
实施例4
在PBS溶液中加入细胞外小囊泡100μg、1mg/mLCe6水溶液110μl、1.732mg/mL含有GW4869的DMSO溶液110μl;混匀后,加入8mm(容积750μl)电穿孔皿中,放入电穿孔仪,按照如下反应条件:电压450V,电容150μF,放电时间1ms,放电次数:1次。穿孔后将混悬液置于冰上15分钟后放入细胞培养箱中孵育1小时,继之110000g超速离心一次,每次70分钟,弃上清,用PBS重悬沉淀即为同时负载Ce6和GW4869的复合外泌体,-80℃储存进行后续检测及实验;
实施例5
在PBS溶液中加入细胞外小囊泡100μg、1mg/mLCe6水溶液120μl、1.732mg/mL含有GW4869的DMSO溶液100μl;混匀后,加入8mm(容积750μl)电穿孔皿中,放入电穿孔仪,按照如下反应条件:电压550V,电容150μF,放电时间10ms,放电次数:1次。穿孔后将混悬液置于冰上15分钟后放入细胞培养箱中孵育1小时,继之110000g超速离心一次,每次70分钟,弃上清,用PBS重悬沉淀即为同时负载Ce6和GW4869的复合外泌体,-80℃储存进行后续检测及实验;
实施例6
在PBS溶液中加入细胞外小囊泡100μg、1mg/mLCe6水溶液100μl、1.732mg/mL含有GW4869的DMSO溶液100μl;混匀后,加入8mm(容积750μl)电穿孔皿中,放入电穿孔仪,按照如下反应条件:电压800V,电容150μF,放电时间5ms,放电次数:1次。穿孔后将混悬液置于冰上15分钟后放入细胞培养箱中孵育1小时,继之110000g超速离心一次,每次70分钟,弃上清,用PBS重悬沉淀即为同时负载Ce6和GW4869的复合外泌体,-80℃储存进行后续检测及实验。
图1为原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞在第十四天的光学显微镜下所见,所有细胞均为长梭形呈规律的平行状、旋涡状排布,为小鼠BMSCs光镜下的典型形态,证明我们成功提取了原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞。
图2中流式细胞检测提示:祖细胞表面特异性表达抗原阳性表达:Sca-1(79.3%);干细胞表面特异性抗原高表达:CD44(99.55%),造血细胞特异性表面抗原低表达:CD45(8.04%),CD11 b(10.97%),内皮细胞特异性表面抗原低表达:CD31(4.06%)。以上结果均符合BMSCs的细胞表型,证明我们提取的是原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞。
图3在电穿孔载药前、后,电镜图可见多个双层膜囊泡,呈现出典型的茶托样结构或是一侧凹陷的半球状,粒径均在100nm左右,该结果也符合细胞外小囊泡的形态和粒径,且在电穿孔载药后,其表面形貌及粒径没有发生明显的改变,证明我们成功获取了细胞外小囊泡,且通过电穿孔载药后细胞外小囊泡的形态和粒径不会发生改变,为后期的应用提供了基础。
图4中NTA结果提示,在电穿孔载药前、后,细胞外小囊泡的粒径分别为124.5±86.3nm和132.1±115.9nm,符合电镜中所观察到的结果,也证实在电穿孔载药前、后细胞外小囊泡的粒径不会发生变化,为后期的应用提供了基础。
图5的结果显示,细胞外小囊泡电穿孔载药前、后CD9、CD81和TSG101蛋白为阳性表达,Calnexin蛋白为阴性表达。电穿孔载药并未影响细胞外小囊泡标志蛋白的表达。证明在细胞外小囊泡载药后,并未改变细胞外小囊泡的基本性质和特征。
图6中紫外-可见光分光光谱图可见,细胞外小囊泡电穿孔载药后在400nm和653nm处可见Ce6的特征性吸收峰,而在350nm处可见GW4869的特征性吸收峰,并且利用该光谱图可以得到Ce6的药物包封率约为46%,GW4869的包封率约为20%。
以上结果可以证明我们成功获取原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞,并提取了其来源的细胞外小囊泡。电穿孔载药后,细胞外小囊泡保留了其本身的性质和特征,且其药物包封率也可满足后期应用所需。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (8)

1.一种光敏细胞外小囊泡的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将细胞外小囊泡、Ce6水溶液和含有GW4869的DMSO溶液加入PBS溶液,混均后进行电穿孔;电穿孔后,在冰上孵育15-20分钟,然后将混合溶液在温度为37℃的条件下孵育1小时;孵育结束后提取混合溶液中的沉淀物,沉淀物即为细胞外小囊泡。
2.根据权利要求1所述的光敏细胞外小囊泡的制备方法,其特征在于,所述细胞外小囊泡以其蛋白含量计,每100μg的细胞外小囊泡的溶液中,Ce6的质量为80-120μg,GW4869的质量为100-150μg。
3.根据权利要求1所述的光敏细胞外小囊泡的制备方法,其特征在于,所述细胞外小囊泡从BALB/c小鼠细胞的骨髓间充质干细胞获取。
4.根据权利要求1所述的光敏细胞外小囊泡的制备方法,其特征在于,所述电穿孔条件为:电压400-800V,电容125-200μF,放电时间1-10ms,放电次数1次。
5.根据权利要求1所述的光敏细胞外小囊泡的制备方法,其特征在于,所述混合溶液在孵育结束后以100000-110000g离心力超速离心70-110分钟除去上清留下沉淀物。
6.一种光敏细胞外小囊泡,其特征在于,通过权利要求1-5任一项所述的光敏细胞外小囊泡的制备方法制备得到。
7.根据权利要求6所述的光敏细胞外小囊泡在制备抗三阴性乳腺癌药物、抗三阴性乳腺癌辅助药物或三阴性乳腺癌诊断药物中的应用。
8.一种药物,其特征在于,包括如权利要求6所述的光敏细胞外小囊泡。
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