CN115725508A - 一种ghrh基因修饰的间充质干细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种GHRH基因修饰的间充质干细胞及其制备方法与应用。本发明公开了一种GHRH基因修饰的间充质干细胞，所述GHRH基因修饰的间充质干细胞为过表达GHRH基因的间充质干细胞。本发明首次通过对人脂肪间充质干细胞转入GHRH基因，使间充质干细胞过表达GHRH，进而间接促进间充质干细胞产生人生长激素，从而发挥其抗衰老和美容的功效。

Description

一种GHRH基因修饰的间充质干细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种GHRH基因修饰的间充质干细胞及其制备方法与应用。

背景技术

生长激素(Human Growth Hormone，hGH)是由人体脑垂体前叶分泌的一种肽类激素，由191个氨基酸组成，最主要的生理作用是通过刺激蛋白质和胶原的合成以及组织对循环系统中氨基酸的摄取和利用，促进骨、软骨和组织的生长。

生长激素在抗衰老方面有着十分显著的作用，对改善女性卵巢功能，提高男性精力活力和老年肌少症都有明显疗效。有事实表明，生长激素确实能够使体内脂肪重新分泌、皮下弹性组织中粘多糖增加，使皮肤变得坚实有弹性。不少成年人在补充生长激素后，会发生圆肚子消失、脸上皱纹减少等变化。

随着重组人生长激素(rhGH)在相关医学领域的广泛应用，研究发现高水平的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、生长激素和糖皮质激素会抑制生长激素的释放，因此其安全性问题也更加受到关注。经过近40年的临床观察，rhGH的安全性总体较好，但也有不少不良反应的出现，如水钠潴留、良性颅内高压、胰岛素敏感性下降、继发肿瘤发生的危险性升高、脊柱侧凸、股骨头滑脱等。

促生长激素释放激素(Growth Hormone Release Hormone,GHRH)是一种神经多肽，由下丘脑分泌，经垂体门脉系统进入后与垂体细胞表面促生长激素释放激素受体结合，促进生长激素释放。近年来，研究者发现该受体不仅仅表达于垂体，同时也表达在诸如心肌细胞、成纤维细胞、间充质干细胞表面。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem/Stroma Cells，MSCs)凭借其多向分化能力和免疫调节作用而受到广泛关注，也成为了众多难治性疾病的治疗新策略。间充质干细胞已从人类许多其他来源组织中分离和鉴定出来，广泛分布于几乎所有组织(包括胎儿和成人)，例如骨髓、血液、脐带、胎盘、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮肤、经血等等。诸多间充质干细胞临床试验已经证明了安全性和有效性，全球正在进行的间充质干细胞临床试验超过一千项，全球获批上市的干细胞药物中超过一半以上是间充质干细胞治疗产品.同时，间充质干细胞因取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，便于扩增和传代，同时又没有配型、排异等问题，极其适合于临床研究和应用。

发明内容

鉴于直接使用生长激素带来的诸多不良反应，本发明目的在于提供一种生长激素释放激素(GHRH)基因修饰的脐带间充质干细胞及其制备方法。利用间充质干细胞因取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，便于扩增和传代，同时又没有配型、排异等问题，极其适合于临床研究和应用的优点，将MSC作为递送GHRH基因的载体，提高机体GHRH的水平，进而间接提高机体生长激素的水平，规避直接使用重组人生长激素(rhGH)带来的副作用。

本发明提供的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种GHRH基因修饰的间充质干细胞。

所述GHRH基因修饰的间充质干细胞为过表达GHRH的间充质干细胞，所述GHRH基因的序列为为SEQ ID NO：1所示序列，或SEQ ID NO：1替换一个或多个核苷酸得到的核苷酸序列。

进一步地，所述间充质干细胞是脂肪组织、脐带组织、骨髓组织或牙髓组织来源的间充质干细胞；

更进一步地，所述间充质干细胞是脂肪组织来源的间充质干细胞。

进一步地，所述基因修饰采用的技术为电转移、病毒转染、脂质体转染、基因编辑或mRNA转染的技术。

本发明的第二方面，提供了一种GHRH基因修饰的间充质干细胞的制备方法。

所述GHRH基因修饰的间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：

(1)构建GHRH基因重组质粒载体；

(2)将所述GHRH基因重组质粒载体转染间充质干细胞，得到GHRH基因修饰的间充质干细胞。

进一步地，步骤(2)中所述转染的方式为电转染、病毒转染或脂质体转染；

更进一步地，步骤(2)中所述转染的方式为电转染。

本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的GHRH基因修饰的间充质干细胞或本发明第二方面所述的制备方法制得的GHRH基因修饰的间充质干细胞在制备抗衰老的药物或化妆品中的应用。

进一步地，所述抗衰老的药物包含所述GHRH基因修饰的间充质干细胞和药学上允许的载体。

进一步地，所述抗衰老的药物通常以注射剂等非口服制剂的形态使用。作为非口服制剂中能够使用的载体，可列举例如生理盐水、含有葡萄糖、D-山梨糖醇等的等渗液等水性载体。

具体地，本发明注射剂中包含注射液，如生理盐水、乳酸钠林格液、复方电解质注射液、5％葡萄糖注射液、20％HSA注射液、琥珀酰明胶注射液、琥珀酰明胶MIX注射液、MZJ注射液1、MZJ注射液2、MZJ注射液3、人血清蛋白注射液、勃脉力A、氯化钾注射液、硫酸镁注射液、碳酸氢钠注射液、葡萄糖氯化钠注射液、复方氯化钠注射液(林格氏液)、右旋糖酐20葡萄糖注射液(小分子)、氨基酸注射液、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、羟乙基淀粉40氯化钠注射液、注射用低分子量肝素钙、肝素钠注射液、注射用辅酶A、三磷酸胞苷二钠、注射用盐酸赖氨酸、维生素C注射液、胞磷胆碱氯化钠、注射用脂溶性维生素Ⅱ、注射用还原型谷胱甘肽、注射用脑蛋白水解物、脱氧核苷酸钠注射液、多种微量元素注射液Ⅱ、甘露醇注射液、盐酸精氨酸注射液、氯化钾注射液、注射用三磷酸胞苷二钠、注射用门冬氨酸鸟氨酸等。

所述注射剂中含有等渗或高渗溶液；优选地，所述溶液选自NaCl注射液(例如0.9％-2.7％NaCl注射液)、葡萄糖注射液(例如4％-5％葡萄糖注射液)、乳酸钠林格注射液、复方电解质注射液、HSA注射液(例如10％-20％HSA注射液)、琥珀酰明胶注射液(例如4％-5％琥珀酰明胶注射液)及其任意组合。

更进一步地，所述抗衰老的药物除了注射液之外还可以含有一种或多种注射剂附加剂，例如选自增溶剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、助悬剂、螯合剂、抗氧剂、抑菌剂、局麻剂、等渗调节剂、填充剂、保护剂及其任意组合。

进一步地，所述抗衰老的药物可以经由任何常规途径给药，只要它能够达到目标组织。在本发明抗衰老的药物为非口服制剂的情况下，可以列举例如血管内给药(优选静脉内给药)、腹腔内给药、肠道内给药、皮下给药、被膜下给药等局部给药(被膜的意思是被覆各种器官的膜组织)、鞘内给药。

更进一步地，所述抗衰老的药物通过肌肉注射或皮下注射的方式对生物体给药。

进一步地，所述抗衰老的药物可以以治疗有效量给药，“治疗有效量”是指足以以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平可能因多种因素而异，所述多种因素包括个体的类型、严重程度、年纪和性别，药物活性、药物敏感度、给药时间、给药途径、排放系数(discharge ratio)、治疗周期和共给药的药物以及医学领域周知的其他因素。

更进一步地，所述抗衰老的药物的给药剂量不少于1×10⁴个/mL(例如不少于1×10⁴个/ml，不少于3×10⁴个/ml，不少于5×10⁴个/ml，不少于7×10⁴个/ml，不少于1×10⁵个/ml，不少于3×10⁵个/ml，不少于5×10⁵个/ml，不少于7×10⁵个/ml，不少于1×10⁶个/ml，不少于3×10⁶个/ml，不少于5×10⁶个/ml，不少于7×10⁶个/ml，不少于1×10⁶个/ml，不少于3×10⁶个/ml，不少于5×10⁶个/ml，不少于7×10⁶个/ml，不少于1×10⁶个/ml，不少于3×10⁶个/ml，不少于5×10⁶个/ml，不少于7×10⁶个/ml，不少于1×10⁶个/ml，不少于3×10⁶个/ml，不少于5×10⁶个/ml，不少于7×10⁶个/ml，不少于1×10¹⁰个/ml，不少于3×10¹⁰个/ml，不少于5×10¹⁰个/ml或不少于7×10¹⁰个/ml，又例如1×10⁵-1×10⁸、7×10⁵-7×10⁶、1×10⁶-5×10⁶个/ml。

更进一步地，所述抗衰老的药物的给药剂量不少于1×10³个/kg(例如不少于1×10³个/kg，不少于3×10³个/kg，不少于5×10³个/kg，不少于7×10³个/kg，不少于1×10⁴个/kg，不少于3×10⁴个/kg，不少于5×10⁴个/kg，不少于7×10⁴个/kg，不少于1×10⁵个/kg，不少于3×10⁵个/kg，不少于5×10⁵个/kg，不少于7×10⁵个/kg，不少于1×10⁶个/kg，不少于3×10⁶个/kg，不少于5×10⁶个/kg，不少于7×10⁶个/kg，不少于1×10⁷个/kg，不少于3×10⁷个/kg，不少于5×10⁷个/kg，不少于7×10⁷个/kg，不少于1×10⁸个/kg，不少于3×10⁸个/kg，不少于5×10⁸个/kg，不少于7×10⁸个/kg，不少于1×10⁹个/kg，不少于3×10⁹个/kg，不少于5×10⁹个/kg，不少于7×10⁹个/kg，不少于1×10¹⁰个/kg，不少于3×10¹⁰个/kg，不少于5×10¹⁰个/kg或不少于7×10¹⁰个/kg，又例如1×10⁵-1×10⁸、7×10⁵-7×10⁶、1×10⁶-5×10⁶个/kg。

进一步地，所述抗衰老的药物可以单独给予或与其他疗法联合给予。所述抗衰老的药物与其他疗法的共给予可以同时地或者相继地进行。单个或者多个剂量均是可以的。重要的是，使用足以获得最大疗效而无副作用的最小可能量，在考虑所有因素的情况下。

进一步地，所述抗衰老的化妆品包含所述GHRH基因修饰的间充质干细胞、防腐剂、保湿剂、抗真菌剂。

进一步地，所述抗衰老的化妆品包括面膜、颈膜、乳剂、喷雾、精华液。

文中所述“间充质干细胞(MSC)”是指一类具有分化潜能的多能干细胞。其符合国际细胞治疗学会(ISCT)的如下定义：1)MSC可呈集落粘附生长；2)MSC细胞表面表达标记物CD105，CD73和CD90，且不表达内皮、造血或免疫细胞标记，例如CD45，CD34，CD14，CD11b，CD79α，CD19和HLA-DR。MSC细胞可在脂肪、骨髓、牙髓、脐带等不同组织中获得，也可由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)诱导分化而得。本发明实施例中的MSC来源于脂肪组织，也可以来源于骨髓、牙髓、脐带等组织，需要说明的是，MSC的来源并不会影响本发明的效果。

有益效果

本发明首次通过对人脂肪间充质干细胞转入GHRH基因，使间充质干细胞过表达GHRH，进而间接促进间充质干细胞产生人生长激素，从而发挥其抗衰老和美容的功效。本发明证实，转入GHRH基因的间充质干细胞衰老状态得到明显逆转，在制备抗衰老的药物和化妆品方面有巨大潜力。

附图说明

图1为实施例1构建的GHRH-pEGFP-N1载体的结构示意图。

图2为GHRH ELISA试剂盒的标准曲线和拟合方程。

图3为电转GHRH-pEGFP-N1质粒(实验组)和pEGFP-N1质粒(对照组)后MSC的β-半乳糖苷酶染色结果。

具体实施方式

除非本文另外定义，否则本公开内容中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在整个说明书中给出的每个数值范围包括其上限值和下限值，以及落入该范围内的每个较窄的数值范围，如同这些较窄的数值范围均在本文中明确写出。

对本发明所用间充质干细胞的来源进行说明：本发明所用的各类人体组织为临床废弃物或离体人体组织。例如，实施例中的脂肪取自整形手术后废弃的人体脂肪组织(已签署知情同意协议书)。本发明的技术方案不涉及获取人体组织过程的具体操作。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术方法为本领域技术人员所熟知的常规方法。

实施例1 GHRH基因重组质粒载体的构建

1、以pEGFP-N1质粒(Addgene，Plasmid#172281)为GHRH基因表达的骨架载体，酶切位点是EcoRI和Not1；

2、合成GHRH基因序列，合成公司为安徽通用生物科技有限公司，将GHRH基因序列插入骨架质粒的EcoRI和Not1之间，载体命名为GHRH-pEGFP-N1载体，其结构如图1所示。

3、GHRH基因序列信息如下

SEQ ID NO:1

ATGCCACTCTGGGTGTTCTTCTTTGTGATCCTCACCCTCAGCAACAGCTCCCACTGCTCCCCACCTCCCCCTTTGACCCTCAGGATGCGGCGGTATGCAGATGCCATCTTCACCAACAGCTACCGGAAGGTGCTGGGCCAGCTGTCCGCCCGCAAGCTGCTCCAGGACATCATGAGCAGGCAGCAGGGAGAGAGCAACCAAGAGCGAGGAGCAAGGGCACGGCTTGGTCGTCAGGTAGACAGCATGTGGGCAGAACAAAAGCAAATGGAATTGGAGAGCATCCTGGTGGCCCTGCTGCAGAAGCACAGCAGGAACTCCCAGGGATGA

实施例2 GHRH基因修饰的人脂肪间充质干细胞的制备

1、步骤

(1)取整形手术后废弃的脂肪组织，从中分离培养人脂肪间充质干细胞(MSC)，继代培养至P2代，然后从P2代传至P3代；

(2)取P2传至P3的细胞、即P3细胞，当其汇合度为65-70％时，收获待用；

(3)收集合度达到65-70％的P3代细胞，清洗一次，清洗前将细胞充分混匀并计数，并计算细胞活力，细胞活力高于98％时可用于电转；

(4)最后一次离心前准备neon电转仪、电转溶液和电转用专用管，测试电转仪，使其电路保持接通状态；

(5)离心结束时，吸弃上清，用1ml到200ul的微量移液枪尽可能将上清吸取干净。再用电转液R液(贴壁细胞专用)重悬细胞，调整细胞密度为5-6×10⁶cells/ml，使用10ul的电转枪头。将电转液与细胞沉淀充分混匀后每个电转反应加入0.5ug实施例1构建的GHRH-pEGFP-N1质粒，再度混匀，在两次混匀操作中严禁产生气泡；

(6)收集MSC细胞离心时准备细胞培养皿和培养基，按照每100万/150mm皿的比例接种电转后的细胞，接种的培养基数量为20ml；因此，100ul电转枪头内电转后的细胞注入至20ml MSC传代培养基中，混匀后接种；

电转参数为：990V、40ms、1pulse；GHRH-pEGFP-N1质粒用量为0.5ug；电转体积为10ul。

(7)电转后细胞直接接种在培养皿(直径150mm)内，培养皿不需包被，接种后常规培养，记为P4；

(8)每天观察MSC细胞生长状况，细胞汇合度达到70％左右时即行传代操作。

(9)上述P4代细胞汇合度达到70％后，使用人促生长激素释放激素(GHRH；GHRF)ELISA试剂盒(酶联生物，ml058198)，分别于24小时、48小时、72小时、96小时检测GHRH在蛋白水平的表达(每个时间点检测样品做3个重复，计为1号、2号、3号)。

2、结果

图2为GHRH ELISA试剂盒的标准曲线和拟合方程。其中r²＝0.99974,说明标准曲线满足要求。

如下表1所示，GHRH转染的MSC中GHRH蛋白的表达量明显高于未转染的MSC中的表达量，且电转GHRH-pEGFP-N1质粒的MSC在24小时内就开始表达分泌GHRH，同时分泌量在24-96小时基本可以维持不变。表明转染的GHRH基因在MSC细胞中成功表达。

表1电转GHRH-pEGFP-N1质粒后不同时间点MSC的GHRH分泌量

实施例3 GHRH基因修饰的人脂肪间充质干细胞肌肉注射吸收、分布、代谢特征

1、步骤

(1)购买6-8周龄C57BL小鼠(维通利华，#213)6只，设置为2个组别，分别为实验组(3只)，对照组(3只)；

(2)收获实施案例2中的P4代MSC细胞，将细胞密度调整为1×10⁵细胞/150ul。

(3)实验组小鼠大腿肌肉注射100ul上述步骤(2)中所述MSC细胞，小腿注射50ul细胞上述步骤(2)中所述MSC细胞；对照组小鼠大腿肌肉注射100ul生理盐水，小腿注射50ul生理盐水；

(4)注射7天后，分别提取小鼠的大腿、小腿、心脏、肺、大脑、肝脏、肾脏以及脾脏的组织DNA；以上述步骤(4)中的各组织DNA为模板，检测人的ALU基因序列，引物如下：

hALU forward：CGCCTGTAATCCAGCTACTC

hALU reverse:ATCTCGGCTCACTGCAAC

(5)注射7天后，分别眼眶采血，获取小鼠血清，使用人促生长激素释放激素(GHRH；GHRF)ELISA试剂盒，检测小鼠血清中GHRH含量。

2、结果

由表2所知，GHRH基因修饰的人脂肪MSC在小鼠大腿、小腿肌肉注射7天后，提取各个组织的DNA，通过QPCR检测小鼠不同组织器官人源保守基因ALU，可以看出，大腿，小腿肌肉可以检测到人源基因ALU，说明小鼠大腿小腿肌肉存在人MSC细胞；其他部位均未能检测到人源基因ALU，说明对应部位没有人的MSC细胞分布；表明MSC注射后没有迁移，定位在肌肉区域。说明肌肉可以作为基因修饰MSC的给药部位，由此也可以推测皮下也可以作为基因修饰MSC的给药部位。

表2 GHRH基因修饰人脂肪间充质干细胞在小鼠各个组织器官中的分布

注：ND代表未检测到人ALU基因的DNA序列

表3为注射GHRH基因修饰的MSC 7天后，用ELISA试剂盒检测的小鼠血清中GHRH含量。在小鼠大腿和小腿肌肉注射GHRH基因修饰的MSC 7天后，可以在血清中检测到人GHRH，说明肌肉可以作为基因编辑MSC给药部位。

表3注射GHRH基因修饰的MSC后小鼠血清中GHRH含量

实施例3 GHRH基因修饰对人脂肪间充质干细胞衰老抑制作用

1、步骤

(1)使用P5代次的经GHRH基因修饰的间充质干细胞，调整细胞密度为5-6×10⁶cells/ml，使用10ul的电转枪头。将电转液与细胞沉淀充分混匀后每个电转反应加入0.5ug实施例1构建的GHRH-pEGFP-N1质粒(实验组)或者pEGFP-N1质粒(Clontech，6085-1)(对照组)，再度混匀，在两次混匀操作中严禁产生气泡；

电转参数为：990V、40ms、1pulse；GHRH-pEGFP-N1质粒用量为0.5ug；电转体积为10ul。

(2)电转后细胞按照5万细胞/孔接种至24孔板，电转后2天一换液，3天后进行衰老细胞染色。

(3)衰老细胞染色方法：使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒(BeyotimeBiotechnology，C0602)，按照供应商说明书对间充质干细胞染色，显微镜下观察。

2、结果

如图3所示，深色的点代表死亡细胞，可以看出GHRH-pEGFP-N1质粒转染后的脂肪间充质干细胞死亡细胞更少，而对照质粒pEGFP-N1转染后的脂肪间充质干细胞死亡细胞更多，说明GHRH基因具有抗细胞衰老的作用。

综上所述，本发明通过电转的方式将GHRH导入人脂肪间充质干细胞，成功制备GHRH基因修饰的人脂肪间充质干细胞。细胞经过一代的培养，通过肌肉注射的方式注射到大腿和小腿的肌肉部位，发现GHRH基因修饰的人脂肪间充质干细胞能够定位在肌肉区域不发生迁移，且在血清中能够检测到较大量的GHRH，表明本发明制备的GHRH基因修饰的人脂肪间充质干细胞适用于肌肉注射和皮下注射的给药方式，且能够在体内过表达GHRH，进而发挥抗衰老和美容方面的作用。

尽管已经通过具体实施例描述了本发明，但是常规修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且这样的修改旨在落入本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种GHRH基因修饰的间充质干细胞，其特征在于，所述GHRH基因修饰的间充质干细胞为过表达GHRH的间充质干细胞，所述GHRH基因的序列为SEQ ID NO：1所示序列。

2.根据权利要求1所述的GHRH基因修饰的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞是脂肪组织、脐带组织、骨髓组织或牙髓组织来源的间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的GHRH基因修饰的间充质干细胞，其特征在于，所述基因修饰采用的技术为电转移、病毒转染、脂质体转染、基因编辑或mRNA转染的技术。

4.权利要求1-3任一项所述GHRH基因修饰的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建GHRH基因重组质粒载体；

(2)将所述GHRH基因重组质粒载体转染间充质干细胞，得到GHRH基因修饰的间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述转染的方式为电转染、病毒转染或脂质体转染。

6.权利要求1-3任一项所述的GHRH基因修饰的间充质干细胞、权利要求4-5任一项所述的制备方法制得的GHRH基因修饰的间充质干细胞在制备抗衰老的药物或化妆品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗衰老的药物包含所述GHRH基因修饰的间充质干细胞和药学上允许的载体。

8.根据权利要求6-7任一项所述的应用，其特征在于，所述抗衰老的药物通过肌肉注射或皮下注射的方式给药。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗衰老的化妆品包含所述GHRH基因修饰的间充质干细胞、防腐剂、保湿剂、抗真菌剂。

10.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述抗衰老的化妆品包括面膜、颈膜、乳剂、喷雾、精华液。

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