CN115724981A - 抗人cdk4重组抗体的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及抗人CDK4重组抗体的制备及应用。本发明提供的CDK4重组抗体，通过构建人源CDK4抗体表达载体，并采用CHO表达系统进行重组抗体的制备，同时通过蛋白印迹法及免疫组织化学法进行抗体的特异性验证，证明本发明提供的重组抗体特异性强，抗体性质稳定，满足了实验的可重复性，适用于工业化生产及应用。

Description

抗人CDK4重组抗体的制备及应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及抗人CDK4重组抗体的制备及应用。

背景技术

CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶4)是人体中由CDK4基因编码的一种酶，属于细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDKs家族的成员。该蛋白是由人的CDK4基因编码，CDK4基因定位于染色体12q13～14，mRNA序列全长为2.14kb，cDNA全长为912bp，编码303个氨基酸，分子量约为34kb，与CDK2非常接近。因为CDK4缺乏典型的PSTAIR序列，故其活性依赖与细胞周期蛋白(Cyclin D)的结合。

肿瘤细胞恶性增殖主要是由于细胞周期调控行为异常导致，而细胞调控机制的核心是CDKs时相性激活。CDK4与Cyclin D1结合形成复合物，调控细胞周期G1/S进程。研究表明，CDK4与细胞发生癌变的关系非常密切。CDK4可以启动DNA复制及有丝分裂，其表达的增加导致细胞DNA合成增加，进而使细胞分裂增殖失控，从而发生癌变。在多种肿瘤细胞和癌变组织中都发现伴随有CDK4的过度表达和过度活化现象，所以CDK4是目前肿瘤治疗的一个有效靶点。

据报道，CDK4在肿瘤组织如：粘液性/圆细胞脂肪瘤、横纹肌肉瘤中几乎全部阳性(≧95％的病例阳性)；在去分化脂肪肉瘤、非典型性脂肪肉瘤性肿瘤、低级别骨肉瘤中阳性表达率≧75％；在胰腺腺癌、低级别中央型骨肉瘤中、胰腺导管腺癌中阳性表达率≧55％；在子宫内膜腺癌、低级别纤维黏液肉瘤中也有阳性表达。同时研究发现，CDK4在口腔鳞状细胞癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌都有高表达，因此CDK4在肿瘤的诊断、治疗及预后判断等方面具有重要的意义。

目前，市面上传统的抗CDK4单克隆抗体，依然采用传统免疫动物的方法获得，无法克服由于动物个体差异导致的批次间差异，且产量低，抗体稳定性差，并无法避免杂交瘤细胞丢失的问题，限制了其进一步的工业化生产及应用。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗人CDK4重组抗体的制备及应用，本发明提供的抗人CDK4重组抗体特异性强，性质稳定，有助于提高实验的重复性。

本发明提供的CDK4重组抗体，包含如下氨基酸序列：

(1)、其重链的CDR区包含如SEQ ID NO:1、2或3所示的氨基酸序列中的至少一个，其轻链的CDR区包含如SEQ ID NO:4、5或6所示的氨基酸序列中的至少一个；或

(2)、与(1)所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个，但与Ⅰ所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列；或

(3)、与(1)或(2)所示的氨基酸序列具备至少80％同源性的氨基酸序列。

本发明中，所述CDK4重组抗体中：

I、其重链的四个FR区其中至少一个FR区具有如SEQ ID NO:7、8、9和10所示的氨基酸序列；其轻链的四个FR其中至少一个FR区具有如SEQ ID NO:11、12、13和14所示的氨基酸序列。

II、与I所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个，但与I所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列；或

III、与I或II所示的氨基酸序列具备至少80％同源性的氨基酸序列。

本发明中，所述具有至少80％同源性的序列为在原序列的基础上，经取代、添加或缺失一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个或38个。

一些实施例中，所述CDK4重组抗体重链的三个CDR区分别具有如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列；

一些实施例中，所述CDK4重组抗体轻链的三个CDR区分别具有如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列。

一些实施例中，所述CDK4重组抗体重链的四个FR区分别具有如SEQ ID NO:7、8、9和10所示的氨基酸序列；

一些实施例中，所述CDK4重组抗体轻链的四个FR分别具有如SEQ ID NO:11、12、13和14所示的氨基酸序列。

一些具体实施例中，所述CDK4重组抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:1、2或3所示的CDR区和SEQ ID NO:7、8、9和10所示的FR区。

本发明实施例中，所述单克隆抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:4、5或6所示的CDR区和SEQ ID NO:11、12、13和14所示的FR区。

在一些具体实施例中，所述CDK4重组抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；轻链可变区具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

本发明提供了生物材料，其包括以下至少一项：

1)、编码所述的CDK4重组抗体的核酸；

2)、包含所述核酸的表达载体；

3)、转化或转染所述表达载体的宿主细胞；

4)、所述的CDK4重组抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物；

5)、经化学标记或生物标记的所述的CDK4重组抗体；

6)、所述经化学标记或生物标记的CDK4重组抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

具体的，所述核酸包括：编码重链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；编码轻链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。

本发明所述的表达载体能够在宿主细胞体内表达产生所述CDK4重组抗体，所述的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、PAP、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。

所述固相介质或半固体介质是指本发明所述的重组抗体、经标记的重组抗体能够附着至其上的任何支持物，包括但不限于硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、iPDMS芯片、微孔板、聚苯乙烯平板、微粒、微载体、凝胶等。

本发明所述的CDK4重组抗体、生物材料、经宿主细胞表达的CDK4重组抗体在制备肿瘤检测试剂或试剂盒中的应用。

所述肿瘤细胞包括粘液性/圆细胞脂肪瘤、横纹肌肉瘤、分化脂肪肉瘤、非典型性脂肪肉瘤性肿瘤、低级别骨肉瘤、胰腺腺癌、低级别中央型骨肉瘤、胰腺导管腺癌、子宫内膜腺癌、低级别纤维黏液肉瘤、口腔鳞状细胞癌、肺癌、乳腺癌或结肠癌中的任意一种或多种。

本发明提供了检测试剂或检测试剂盒，其包括本发明所述的CDK4重组抗体、所述生物材料、所述宿主细胞表达的CDK4重组抗体。

所述检测试剂或检测试剂盒还包括可接受的助剂、缓冲液、辅料或载体。

本发明还提供了肿瘤相关疾病的诊断方法，包括：采用本发明的检测试剂或检测试剂盒对样本进行检测。

本发明提供了抗人CDK4重组抗体的制备及应用，通过构建人源CDK4抗体表达载体，并采用CHO表达系统进行重组抗体的制备。与现有技术相比，本发明提供的重组抗体特异性强，抗体性质稳定，满足了实验的可重复性，适用于工业化生产及应用。采用免疫组织化学法对比0.08μg/mL的CDK4重组抗体与0.4μg/mL的市售CDK4单克隆抗体对结肠癌组织的染色结果表明，CDK4重组抗体的染色效果更强。

附图说明

图1为CDK4单克隆抗体的蛋白印迹显色图(M：分子量Marker；1：sp2/0细胞裂解液；2：MAD109细胞裂解液)；

图2为CDK4重组抗体的蛋白印迹显色图(M：分子量Marker；1：小鼠肺癌组织裂解液；2：MAD109细胞裂解液)；

图3为CDK4重组抗体在结肠癌组织免疫组化结果；

图4为市售CDK4鼠单抗体在结肠癌组织免疫组化结果。

具体实施方式

本发明提供了抗人CDK4重组抗体的制备及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中涉及序列如下：

SEQ ID NO:1所示的序列为DFSLTRYA；

SEQ ID NO:2所示的序列为IWRGGNT；

SEQ ID NO:3所示的序列为AKDGYGTMDY；

SEQ ID NO:4所示的序列为SSVSY；

SEQ ID NO:5所示的序列为STS；

SEQ ID NO:6所示的序列为QQRSSYPPT。

SEQ ID NO:7所示的序列为QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVS；

SEQ ID NO:8所示的序列为IHWVRQSPGKGLEWLGV；

SEQ ID NO:9所示的序列为DYNAVFMSRLSITKDTSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYC；

SEQ ID NO:10所示的序列为WGQGTSVTVSS；

SEQ ID NO:11所示的序列为QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAS；

SEQ ID NO:12所示的序列为MHWFQQKPGTSPKLWIY；

SEQ ID NO:13所示的序列为NLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC；

SEQ ID NO:14所示的序列为FGGGTKLEIK。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：CDK4抗原的设计

根据Uniprot公布的CDK4蛋白序列和结构选择130-303aa，用于CDK4的重组蛋白的制备。CDK4的Uniprot的登录号是P11802，含有303个氨基酸，其中12-20aa为核酸结合位点，依据生信分析及文献调研，优选130-303aa作为CDK4的免疫原设计方案，其中，CDK4重组蛋白的核苷酸序列与氨基酸序列如下所示：

核苷酸序列：

TTCCTTCATGCCAATTGCATCGTTCACCGAGATCTGAAGCCAGAGAACATTCTGGTGACAAGTGGTGGAACAGTCAAGCTGGCTGACTTTGGCCTGGCCAGAATCTACAGCTACCAGATGGCACTTACACCCGTGGTTGTTACACTCTGGTACCGAGCTCCCGAAGTTCTTCTGCAGTCCACATATGCAACACCTGTGGACATGTGGAGTGTTGGCTGTATCTTTGCAGAGATGTTTCGTCGAAAGCCTCTCTTCTGTGGAAACTCTGAAGCCGACCAGTTGGGCAAAATCTTTGACCTGATTGGGCTGCCTCCAGAGGATGACTGGCCTCGAGATGTATCCCTGCCCCGTGGAGCCTTTCCCCCCAGAGGGCCCCGCCCAGTGCAGTCGGTGGTACCTGAGATGGAGGAGTCGGGAGCACAGCTGCTGCTGGAAATGCTGACTTTTAACCCACACAAGCGAATCTCTGCCTTTCGAGCTCTGCAGCACTCTTATCTACATAAGGATGAAGGTAATCCGGAG(SEQ ID NO:23)；

氨基酸序列：

FLHANCIVHRDLKPENILVTSGGTVKLADFGLARIYSYQMALTPVVVTLWYRAPEVLLQSTYATPVDMWSVGCIFAEMFRRKPLFCGNSEADQLGKIFDLIGLPPEDDWPRDVSLPRGAFPPRGPRPVQSVVPEMEESGAQLLLEMLTFNPHKRISAFRALQHSYLHKDEGNPE(SEQ ID NO:24)

实施例2：融合表达与纯化

1、在CDK4尾部核酸序列进行人工合成，并在序列两端引入酶切位点BamHI和XhoI，合成后克隆进入pET-32a表达载体中，构建pET-32a-CDK4表达载体。

2、将上述构建的重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态中，挑取单菌落在4mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中培养，加入终浓度1mM的IPTG进行表达分析，保存可以表达目的蛋白的菌株。

3、将上述可以表达目的蛋白的菌株接种于350mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养至OD600达到0.6，加入终浓度0.4mM的IPTG，37℃诱导表达4h。

4、离心收集上述诱导表达的菌体，用冰浴冷的10mM PBS进行重悬，超声破碎(350W，20min，工作3s，休息3s)，12000g离心10min，收集上清溶液用于下一步纯化。

5、将上述上清溶液进行0.45μm滤器过滤，过滤液进行镍琼脂糖凝胶纯化。滤液上样平衡过的凝胶中，控制流速为1mL/min。用10mM PBS进行洗涤除去未吸附的蛋白，用PBS和含0.5M咪唑的PBS进行线性洗脱，收集不同的洗脱峰进行SDS-PAGE鉴定蛋白，将纯度大于90％的样品进行超滤换液到10mM PBS中。

实施例3：CDK4杂交瘤细胞株筛选以及单克隆抗体制备

1、动物免疫：上述分别纯化得到CDK4蛋白，该蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合，采用皮下注射方法免疫6-8周龄BalB/c小鼠，免疫剂量为100μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，抗原采用弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量同第一次，采取腹腔注射方法。第二次免疫后取尾血以间接ELISA法梯度稀释测定血清效价，选取抗体效价最高的小鼠进行尾静脉冲击免疫，冲击剂量为100μg/只。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BalB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；无菌摘取冲击免疫后的小鼠脾脏，制成脾脏细胞单细胞悬液；小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞以1:5混合，滴加37℃的50％PEG(pH8.0)1mL，加入不完全培养基，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，定容到50mL，滴加到96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合后7-10天内挑选细胞克隆，进行筛选检测(ELISA、IHC、WB以及其他方法)。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD450阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆确定细胞株。

4、腹水单抗的制备与纯化：8-10周龄的BalB/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×106/只，每株细胞株打3只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，Protein A柱层析法进行腹水纯化，纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。

实施例4蛋白印迹(Western-Blot)检测CDK4单克隆抗体的特异性

1、样品制备：准备sp2/0细胞裂解液、MAD109细胞裂解液，用含1mM PMSF的RAPI裂解后，加入5×SDS-PAGE Loading buffer制样。

2、电泳以及转膜：每个样品上样30μg，按照80V 20min，然后120V电泳至溴酚蓝至凝胶底部。然后开始转膜，提前用转移缓冲液浸泡NC膜与滤纸，三明治形式置于湿转转膜仪，顺序为：电极(-)-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-电极(+)，恒压90V，90min。

3、封闭：用封闭液(含5％脱脂奶的TBST)浸没NC膜并置于37℃孵育2小时。

4、一抗孵育：将NC膜置于含抗CDK4单克隆抗体中(以封闭液将抗体按1:2000稀释)，37℃温箱孵育1h后，再用TBST洗膜3次，每次5min。

5、二抗孵育：将NC膜置于HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(以封闭液将抗体按1:5000稀释)中，37℃摇床孵育30min后，TBST洗膜3次，每次5min。

6、显色：ECL发光液中A与B组分按1：1混匀后加在NC膜上,在曝光仪中曝光。

显色结果如图1所示，CDK4单克隆抗体在MAD109细胞裂解液中有目的条带，约为34KD。

实施例5CDK4抗体基因调取

1、总RNA提取，复苏CDK4杂交瘤细胞，然后检测细胞株效价，收集细胞；加1mlTrizol，吹匀室温放置5-10min，至细胞完全裂解，12000rpm离心5min，弃沉淀，然后加入200μL氯仿，上下剧烈颠倒，静置15min，在12000rpm 4℃15min离心取上层水相；加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10min；然后12000rpm 4℃10min离心，弃上清；加1ml预冷75％乙醇，轻弹管底，12000rpm 4℃5min离心，弃上清，室温晾干数分钟，然后加30-50μL预冷的DEPC水至溶解即得到RNA产物，-80℃长期保存；整个提取过程必须带口罩与手套，防止RNase的污染。

2、5’RACE获取CDK4抗体基因

使用SMARTer RACE 5’/3’Kit(Clontech,Cat.No.634859)分离CDK4的抗体5’序列。分别以1μg总RNA为模板，采用试剂盒中提供的5’-CDS primer A，SMART II A oligo和3’-CDS primer A，根据说明书提供的方法进行first-strand cDNA synthesis，得到5’-RACE-Ready cDNA。以这些cDNA为模板进行PCR，即Rapid Amplification of cDNA Ends。5’-RACE PCR使用UPM(Universal Primer)引物，GSP(gene specific primer)引物根据基因特异序列设计。第一轮PCR的反应体系为50μL，组分如下：5’-RACE-Ready cDNA cDNA 2.5μL，10×UPM 5μL，10μM GSP 1μL，2×SeqAmp buffer 25μL，SeqAmp DNA polymerase 1μL，ddH2O 15.5μL。PCR反应程序为：5cycles，每个循环94℃30sec，72℃3min；5cycles，每个cycle 94℃30sec，70℃30sec，72℃3min；25cycles，每个cycle94℃30sec，68℃30sec，72℃3min；于4℃保存PCR产物。PCR产物取5μL用1.0％琼脂糖凝胶电泳，进行检测，如果条带单一，剩余切胶回收，构建至pRACE上后再挑选阳性克隆测序。如果条带不单一需要进行巢氏PCR进行下一步扩增后再构建至pRACE上后再挑选阳性克隆测序。

实施例6重组抗体的制备

1、根据测序结果和IMGT数据库，设计重链引物和轻链引物。其中，重链可变区基因扩增引物如下：

HF：TAAACGGATCTCTAGCGAATTCATGGCTGTCTTAGCGCTGCTC(SEQ ID NO:19)；

HR：CGAGCGGCCGCTAGCAAGCTTTCATTTACCAGGAGAGTGGGAG(SEQ ID NO:20)；

轻链可变区基因扩增引物如下：

LF：TAAACGGATCTCTAGCGAATTCATGGATTTACAGGTGCAGAT(SEQ ID NO:21)；

LR：CGAGCGGCCGCTAGCAAGCTTTTAACACTCATTCCTGTTGAAG(SEQ ID NO:22)；

以cDNA为模板，PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TAKARA Code No.R045Q)进行扩增，PCR其反应条件为：98℃3min；98℃10s，62℃10s，72℃10s，共32个循环；72℃5min。PCR扩增片段和pTT5载体经EcoRI/HindIII双酶切3h后，琼脂糖凝胶电泳切胶回收。而后通过重组的方式完成抗体表达载体的构建，并将测序正确的阳性克隆进行质粒提取，以备转染使用。

2、抗体重轻链基因信息确定和IMGT数据库分析

重链基因：

ATGGCTGTCTTAGCGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATAACCTGCACAGTCTCTGATTTCTCATTAACTAGATATGCTATACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGAGGTGGAAACACAGACTACAATGCAGTTTTCATGTCCAGACTGAGCATCACCAAGGACACCTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACTGCCATATACTACTGTGCCAAAGATGGTTACGGAACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA(SEQ ID NO:17)。

重链氨基酸序列：

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSDFSLTRYAIHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGNTDYNAVFMSRLSITKDTSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAKDGYGTMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ IDNO:15)。

IMGT分析：

CDR-H1：DFSLTRYA(SEQ ID NO:1)；CDR-H2：IWRGGNT(SEQ ID NO:2)；CDR-H3：AKDGYGTMDY(SEQ ID NO:3)。

FR-H1 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVS(SEQ ID NO:7)；

FR-H2 IHWVRQSPGKGLEWLGV(SEQ ID NO:8)；

FR-H3 DYNAVFMSRLSITKDTSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYC(SEQ ID NO:9)；

FR-H4 WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:10)。

轻链基因：

ATGGATTTACAGGTGCAGATTATCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCACTTCTCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT(SEQ ID NO:18)。

轻链氨基酸序列：

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNECC(SEQ IDNO:16)。

IMGT分析：

CDR-L1：SSVSY(SEQ ID NO:4)；CDR-L2：STS(SEQ ID NO:5)；CDR-L3：QQRSSYPPT(SEQ ID NO:6)。

FR-L1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSAS(SEQ ID NO:11)；

FR-L2 MHWFQQKPGTSPKLWIY(SEQ ID NO:12)；

FR-L3 NLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(SEQ ID NO:13)；

FR-L4 FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)。

3、抗CDK4重组抗体表达及纯化，包括转染前细胞培养、转染细胞的准备、瞬时转染和产物表达与检测；

(1)转染前细胞培养的方法为：将CHO细胞置于5％的CO₂恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养；传代时，需先做细胞计数，确认密度后无需离心细胞，可直接将细胞悬液依照所需比例兑入培养液中，若在培养过程中出现死细胞数过多的状况，应把细胞丢弃，使用新的细胞。

(2)转染细胞的准备的方法为：

在细胞瞬时转染前需确定其细胞密度及存活率；细胞无需离心，直接兑入CHO培养液，将细胞密度稀释成2×10⁶个/毫升；摇瓶置于5％的CO₂恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养10min后开始转染。瞬时转染的方法为：准备两支15ml的无菌离心管，在其中一支中加入5mL KPM和无菌质粒DNA按重链：轻链1：1比例加入，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5mL KPM和500μL TA-293转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置10分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO₂恒温摇床中震荡培养，3小时后可根据需要加入适量抗生素。

产物表达与检测的方法：转染24小时后可加入600μL 293细胞蛋白表达增强剂，以增加产物表达量；在转染24小时后添加瞬时转染营养添加剂。

(3)抗体的表达及纯化为：调整细胞生长状态至对数生长期，转染质粒并培养48～72h后，收集细胞。上清通过离心去细胞后，经过Protein G柱进行亲和层析纯化，对结合吸附获得的抗体通过pH3.0的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，利用pH8.8的Tris-HCl溶液迅速中和到pH7.2～7.4之间。纯化得到的抗体再经过透析处理浓缩至1mg/mL浓度以上。

实施例7蛋白印迹(Western-Blot)检测CDK4重组抗体特异性

具体实验步骤参考实施例4，具体样品采用了小鼠肺癌组织裂解液和MAD109细胞裂解液。

结果如图2所示，CDK4重组抗体在小鼠肺癌组织裂解液、MAD109细胞裂解液中均具有目的条带，约为34KD。

实施例8CDK4免疫组化检测试剂的制备

本实施例的免疫组化试剂为免疫组化检测试剂，在实施例6重组抗体的基础上构建CDK4重组抗体工作液。其中，试剂具体成分包括：重组抗体的浓度为0.08μg/mL，溶剂为TBS缓冲液，其中含有浓度为10mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)以及防腐剂Proclin 300与Proclin 950，防腐剂均按1:1000(V/V)的比例添加。

实施例9_免疫组织化学(IHC)检测CDK4重组抗体的特异性

将实施例8制备的抗人CDK4免疫组化试剂进行免疫组化染色应用，采用市售鼠单克隆抗体克隆号为EP180进行平行对比实验，CDK4重组抗体浓度为0.08μg/mL，具体的实验过程如下：

1、取结肠癌蜡块，使用Leica组织切片机进行切片，组织厚度为3μm，65℃干烤2h。

2、使用手工免疫组化方法对本发明抗体进行免疫组化染色测试，具体步骤为：采用DAKO HIGH pH修复液进行高温修复20min；待冷却后使用内源性过氧化物酶封闭液100μL室温孵育5min，清洗液浸泡2次，5min/次；一抗使用上述两种抗体工作液，加入体积为100μL，37℃孵育30min，清洗液浸泡2次，5min/次；使用酶标多聚物100μL，室温孵育20min，清洗液浸泡2次，5min/次；使用DAB显色液100μL，室温孵育5min，纯化水浸泡2次，5min/次；滴加100μL苏木素复染，室温孵育5min，自来水冲洗返蓝。

3、脱水、透明和封片：去离子水清洗3min；85％乙醇1min；95％乙醇1min；100％乙醇1min，2次；二甲苯1min，2次；中性树胶封片。

4、显微镜检测

CDK4重组抗体与CDK4鼠单抗在结肠癌组织中的定位结果分别如图3及图4所示，由图3及图4可知CDK4重组抗体和对照抗体在结肠癌组织都呈阳性；通过对比对照抗体(浓度为0.4μg/mL)，CDK4重组抗体的染色稍强，而CDK4重组抗体的浓度为0.08μg/mL，因此，该抗体具有好的亲和力及更强的染色效果。

在其他组织的免疫组化评价中，对比CDK4重组抗体与CDK4鼠单抗产品的染色结果如下：评价的蜡块组织采用组织蜡块有间叶源性肿瘤、正常结肠、结肠癌、肾脏去分化脂肪肉瘤、胰腺癌、卵巢浆液性癌、尿路上皮癌、滑膜肉瘤、乳腺脂肪源性肿瘤、孤立性纤维瘤、浆液性癌、盆腔粘液性纤维肉瘤、右股骨下段梭形细胞肿瘤、腹膜后肿肿瘤、宫颈鳞状细胞癌等共28个。

CDK4重组抗体与CDK4鼠单抗的组织评价结果如表1所示：

由表1的结果可以，CDK4重组抗体与CDK4鼠单抗在组织评价方面的阴阳性一致。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.CDK4重组抗体，其特征在于，包含如下氨基酸序列：

(1)其重链的CDR区包含如SEQ ID NO:1、2或3所示的氨基酸序列中的至少一个，其轻链的CDR区包含如SEQ ID NO:4、5或6所示的氨基酸序列中的至少一个；或

(2)与(1)所示的氨基酸序列中经过氨基酸的取代、添加或缺失一个或多个，但与(1)所示氨基酸功能相同或相似的氨基酸序列；或

(3)与(1)或(2)所示的氨基酸序列具备至少80％同源性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的CDK4重组抗体，其特征在于，

其重链的三个CDR区分别具有如SEQ ID NO:1、2和3所示的氨基酸序列；

其轻链的三个CDR区分别具有如SEQ ID NO:4、5和6所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的CDK4重组抗体，其特征在于，

其重链的四个FR区分别具有如SEQ ID NO:7、8、9和10所示的氨基酸序列；

其轻链的四个FR分别具有如SEQ ID NO:11、12、13和14所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1～3任一项所述的CDK4重组抗体，其特征在于，

其重链可变区具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；

其轻链可变区具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

5.生物材料，其特征在于，包括以下至少一项：

1)、编码如权利要求1～4任一项所述的CDK4重组抗体的核酸；

2)、包含所述核酸的表达载体；

3)、转化或转染所述表达载体的宿主细胞；

4)、权利要求1～4任一项所述的CDK4重组抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物；

5)、经化学标记或生物标记的权利要求1～4任一项所述的CDK4重组抗体；

6)、所述经化学标记或生物标记的权利要求1～4任一项所述的CDK4重组抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。

6.如权利要求5所述的生物材料，其特征在于，所述核酸包括：

编码重链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；

编码轻链可变区的核酸具有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。

7.权利要求1～4任一项所述的CDK4重组抗体的制备方法，其特征在于，包括：培养如权利要求5所述的宿主细胞，诱导所述CDK4重组抗体的表达。

8.如下ⅰ～ⅲ所示中至少一项在制备肿瘤检测试剂或试剂盒中的应用：

ⅰ、如权利要求1～4任一项所述的CDK4重组抗体；

ⅱ、如权利要求5所述的生物材料；

ⅲ、经权利要求7所述的制备方法制得CDK4重组抗体。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括粘液性/圆细胞脂肪瘤、横纹肌肉瘤、分化脂肪肉瘤、非典型性脂肪肉瘤性肿瘤、低级别骨肉瘤、胰腺腺癌、低级别中央型骨肉瘤、胰腺导管腺癌、子宫内膜腺癌、低级别纤维黏液肉瘤、口腔鳞状细胞癌、肺癌、乳腺癌或结肠癌中的任意一种或多种。

10.检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包括如下①～④中至少一项：

①、如权利要求1～4任一项所述的CDK4重组抗体；

②、如权利要求5或6所述的生物材料；

③、经权利要求7所述的制备方法制得CDK4重组抗体。

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