CN115721710A - 一种肺炎球菌结合疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种糖缀合物，和将细菌荚膜多糖的伯羟基氧化，直接或经由间隔物基团偶联至载体蛋白与载体蛋白反应制备糖缀合物的具体制备方法及一种包含所述糖缀合物的免疫原性组合物。本发明还公开了所述糖缀合物、免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。本发明所述的糖缀合物具有免疫原性更高、杀菌作用更强的特点。

Description

一种肺炎球菌结合疫苗组合物

技术领域

本发明涉及疫苗研制技术领域，具体涉及一种血清型肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白反应制备获得的糖缀合物，一种包含所述糖缀合物的免疫原性组合物，以及所述的糖缀合物、免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。

背景技术

本发明涉及医药生物技术开发领域，具体涉及一种多价肺炎球菌疫苗组合物的制备，本组合物由24种血清型组成，分别含肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F，用于预防由所包含血清型的肺炎球菌所引起的感染。

肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)为革兰氏阳性菌，细胞壁外的荚膜多糖有较厚的荚膜，肺炎球菌是引发儿童及老人罹患肺炎、菌血症、脑膜炎等的主要病原菌，在世界各地均有较高的发病率和死亡率。细菌的病原性和血清型常与荚膜多糖成分与结构有关，目前发现的肺炎链球菌荚膜多糖超过90种不同的血清型，其中，20多种已用于制备由肺炎链球菌感染所导致疾病的疫苗。肺炎链球菌缀合物疫苗(PCV)是用于预防肺炎链球菌所致疾病的肺炎球菌疫苗，目前在全球上可以获得辉瑞公司的十三价疫苗Prevenar 13。

本发明人按照肺炎球菌在中国流行的清型的情况，开发了一款24价肺炎球菌结合疫苗，包含血清型为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F。

其中，多种血清型在研究过程中利用传统的高碘酸钠法或CDAP(1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸盐)法均可得到免疫原性较高的结合物。但12F血清型多糖利用高碘酸钠法或CDAP法所得活化多糖的稳定性较差，而且最终结合物免疫应答较弱。

专利CN104870463A公开了一种12F血清型荚膜多糖制备结合物的全新的方法，由辉瑞公司开发。具体的，通过使用稳定的硝酰基相关的试剂/氧化剂作为氧化物质来制备包含与载体蛋白缀合的糖的糖缀合物的方法、包含此类糖缀合物的免疫原性组合物以及使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。该方法利用TEMPO-NCS可选择性氧化伯羟基产生醛基，制备活化多糖。

非专利文献TEMPO-mediated glycoconjugation:a scheme for the controlledsynthesis of polysaccharide conjugates(Carbohydrate Research 346(2011)343–347)公开了一种方法：利用TEMPO-NaClO选择性氧化革兰阴性菌荚膜多糖结构上的伯羟基为羧酸，然后羧酸与载体蛋白结合，但该方法较难控制，NaClO氧化速度太快。

非专利文献Effect of temperature modulations on TEMPO-mediatedRegioselective oxidation of unprotected carbohydrates and nucleosides公开了一种方法：利用TEMPO-碘苯二乙酸选择性氧化伯羟基为羧酸，但在控制碘苯二乙酸用量以及无碱存在的条件下，伯羟基可只氧化到醛基，而不再继续氧化为羧酸。

专利CN111821432公开了一种方法，利用高碘酸钠氧化荚膜多糖得到活化多糖，然后通过间隔物衍生，最后与载体蛋白结合，但该方法所得活化多糖的稳定性较差，结合物免疫应答较弱，满足不了疫苗的需求。

发明内容

根据上述方法的技术缺陷或技术壁垒，本发明提供了多种制备12F型肺炎球菌荚膜多糖与蛋白缀合物的方法，利用多糖不同活化(反应)位点反应，获取12F型肺炎球菌荚膜多糖与蛋白载体偶联的糖缀合物，并且公开了12F型肺炎球菌荚膜多糖的活化位点，所述的活化位点分别为：乙酰氨基吡喃型半乳糖基伯羟基(β-D-GalpNAc)、吡喃型半乳糖基伯羟基(α-D-Galp)、或吡喃型葡萄糖基伯羟基(α-D-Glcp)。

本发明还提供了一种糖缀合物的制备方法，该方法适用于任何包含伯羟基的多糖，具有优于高碘酸钠或CDAP活化方法的明显优点，高碘酸钠氧化方法主要应用于活化有邻位羟基的糖环，糖环结构被破坏后，12F血清型多糖很不稳定。

本发明采用的氧化方法只要求荚膜多糖含有伯羟基。本发明进一步提供了一种包含所述糖缀合物的免疫原性组合物。本发明还提供了所述糖缀合物、所述免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。

本发明所述的缀合物与现有技术中用高碘酸盐活化、CDAP活化后与载体蛋白所得结合物以及TEMPO-NCS方法相比，稳定性高，免疫原性高，杀菌作用也显著增强。

具体地，本发明的第一方面，提供了一种糖缀合物，所述的糖缀合物为将细菌荚膜多糖的伯羟基氧化直接或经由间隔物基团偶联至载体蛋白上获得。

优选的，所述的细菌荚膜多糖选自肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F型荚膜多糖，进一步优选的，所述的细菌荚膜多糖为肺炎链球菌12F型荚膜多糖。

优选的，所述的细菌荚膜多糖活化位点包括β-D-GalpNAc、α-D-Galp或α-D-Glcp。

优选的，所述的肺炎链球菌12F型荚膜多糖可以为天然的或人工合成的。

优选的，以硝酰基化合物和碘氧化剂将细菌荚膜多糖中伯羟基氧化，进一步优选的，所述的硝酰基化合物为2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基或包含2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基结构的化合物，更优选的，所述的碘氧化剂为PIA。

优选的，包含2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基结构的化合物包括但不限于2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物、2,2,6,6-四甲基-4-(甲基磺酰氧基)-1-哌啶氧基、4-膦酰氧基-TEMPO、4-氧代-TEMPO、4-异硫氰酸基-TEMPO、4-(2-碘乙酰氨基)-TEMPO自由基、4-羟基-TEMPO、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基、4-氰基-TEMPO、4-甲氧基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO或4-氨基-TEMPO。

优选的，所述的载体蛋白含有一个或多个氨基或羧基。所述的载体蛋白可以是来自靶标病原体的增强对该病原体的特异性免疫应答的相关蛋白抗原，或是主要作为佐剂或一般免疫应答刺激剂的一般免疫原性蛋白。

进一步优选的，所述的载体蛋白选自白喉类毒素突变体(CRM197/CRM)、破伤风类毒素(TT)、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、流感嗜血杆菌表面脂蛋白、由流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因以1：1方式形成的融合蛋白、百日咳毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒VP7蛋白质或呼吸道合胞病毒F和G蛋白或其活性部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的载体蛋白为CRM197或TT。

优选的，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.3至3(例如，0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3)。

进一步优选的，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.8至2。

在本发明的一个具体实施方式，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为1.0至1.3。

在本发明的一个具体实施方式，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.8至1.2。

优选的，所述的细菌荚膜多糖的每10至30个糖重复单元，在所述载体蛋白与所述细菌荚膜多糖之间存在至少一个共价键。

本发明的第二方面，提供了一种糖缀合物的制备方法，包括：

以硝酰基化合物和碘氧化剂将细菌荚膜多糖的伯羟基选择性氧化为醛基，得到含有醛基的细菌荚膜多糖；

任选的，将含有醛基的细菌荚膜多糖与间隔物反应，得到含有醛基的细菌荚膜多糖衍生物；

将含有醛基的细菌荚膜多糖或含有醛基的细菌荚膜多糖衍生物与载体蛋白的氨基或羧基反应制备获得糖缀合物，优选的，含有醛基的细菌荚膜多糖衍生物与载体蛋白在EDAC存在下反应制备获得糖缀合物。

优选的，所述的细菌荚膜多糖选自肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型荚膜多糖，进一步优选的，所述的细菌荚膜多糖为肺炎链球菌12F型荚膜多糖。

优选的，所述的细菌荚膜多糖的活化位点为乙酰氨基吡喃型半乳糖基伯羟基(α-D-GalpNAc)、吡喃型半乳糖基伯羟基(α-D-Galp)或吡喃型葡萄糖基伯羟基(α-D-Glcp)。

优选的，所述的碘氧化剂为碘苯二乙酸(PIA)。

优选的，所述的硝酰基化合物为2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基或包含2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基结构的化合物。

优选的，所述的包含2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基结构的化合物包括但不限于：2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物、2,2,6,6-四甲基-4-(甲基磺酰氧基)-1-哌啶氧基、4-膦酰氧基-TEMPO、4-氧代-TEMPO、4-异硫氰酸基-TEMPO、4-(2-碘乙酰氨基)-TEMPO自由基、4-羟基-TEMPO、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基、4-氰基-TEMPO、4-甲氧基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO或4-氨基-TEMPO。

优选的，所述的间隔物包含通式Y₁-L-Y₂，其中Y₁包含可以与多糖中的羰基(或羧基)反应的第一伯胺基；Y₂包含可以与连接体中的一个酯基反应的伯胺基；并且L是其他连接体中的连接部分。一般的L基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀)，特别地-(CH₂)₄-。通式Y-L-Y的同型双功能连接体是特别合适作为间隔物的，其中两个Y基团是相同的，并且均能与羰基(或羧基)以及酯基反应；并且其中L是间隔物中的连接部分。一般Y基团是-NHNH2基团。L通常具有通式-L'-L²-L'-，其中L'是羰基。一般L²基团是具有1-10个碳原子的直链烷基(例如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀)，特别地-(CH₂)₄-。

优选的，所述的间隔物选自ADH(己二酸二酰肼)或CDH(羧二肼)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的间隔物为ADH。

优选的，所述的硝酰基化合物与荚膜多糖的摩尔比＝(0.03～0.1)：1(例如，0.03:1、0.04:1、0.05:1、0.06:1、0.07:1、0.08:1、0.09:1、0.1:1)。

进一步优选的，所述的硝酰基化合物与荚膜多糖的摩尔比＝(0.03～0.08)：1。

优选的，所述的碘氧化剂与荚膜多糖的摩尔比＝(0.5～5)：1(例如，0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1、5:1)。

进一步优选的，所述的碘氧化剂与荚膜多糖的摩尔比＝(0.8～3)：1。

优选的，所述的活化的ADH与荚膜多糖的摩尔比为3至96(例如3、5、7、9、10、15、20、24、25、30、35、40、45、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96)。

进一步优选的，所述的ADH与活化荚膜多糖的摩尔比为24至48。

优选的，未反应的醛基在直接或经由间隔物与载体蛋白缀合之后使用硼氢化钠在封闭反应中还原为羟基，由此使在涉及氧化及随后的缀合的修饰步骤中，糖表位修饰程度为最小化。

优选的，未反应的醛基，在与蛋白反应完之后使用0.1M氢氧化钠调节pH至7.0以封闭反应。

优选的，所述的硝酰基化合物为具有所述氧化剂的存在下选择性氧化伯羟基以产生醛基的能力。

优选的，所述的氧化剂为具有硝酰基化合物的存在下选择性氧化伯羟基以产生醛基的能力的带有高价碘的氧化剂。

优选的，所述的载体蛋白含有一个或多个氨基/羧基。所述的载体蛋白可以是来自靶标病原体的增强对该病原体的特异性免疫应答的相关蛋白抗原，或是主要作为佐剂或一般免疫应答刺激剂的一般免疫原性蛋白。

进一步优选的，所述的载体蛋白选自CRM197、破伤风类毒素、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、流感嗜血杆菌表面脂蛋白(HiD)、由流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因以1：1方式形成的融合蛋白、百日咳毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒VP7蛋白质或呼吸道合胞病毒F和G蛋白或其活性部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的载体蛋白为CRM197或TT。

优选的，所述的肺炎链球菌12F型荚膜多糖可以为天然的或人工合成的。

优选的，所述的TEMPO与荚膜多糖的摩尔比＝(0.03～0.1)：1(例如，0.03:1、0.04:1、0.05:1、0.06:1、0.07:1、0.08:1、0.09:1、0.1:1)。

进一步优选的，所述的TEMPO与荚膜多糖的摩尔比＝(0.03～0.085):1。

优选的，PIA与荚膜多糖的摩尔比＝(0.05～5)：1(例如，0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1、5:1)。

进一步优选的，所述的PIA与荚膜多糖的摩尔比＝(0.8～3)：1。

优选的，所述的伯羟基氧化为醛基的反应是在水性溶剂中进行。

优选的，所述的硝酰基化合物以催化量≤0.1摩尔当量使用，并且通过改变所用的氧化剂的量来实现期望的荚膜多糖的氧化度。

优选的，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.3至3(例如，0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3)。

进一步优选的，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.8至1.7。

在本发明的一个具体实施方式，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为1.0至1.5。

在本发明的一个具体实施方式，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.8至1.2。

优选的，所述的细菌荚膜多糖的每10至30个糖重复单元，在所述载体蛋白与所述细菌荚膜多糖之间存在至少一个共价键。

优选的，所述氧化(活化)的时间为3至24h。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的氧化时间为12至24h。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的糖缀合物的制备方法，包括：

1)将12F型肺炎链球菌荚膜多糖水解至50-500kDa的分子量，以TEMPO和PIA作为活化剂将糖环上的伯羟基氧化为醛基，获得活化的12F型肺炎链球菌荚膜多糖；优选的，所述的多糖的活化度为5至20，进一步优选的，所述的活化的肺炎链球菌12F型荚膜多糖的氧化度为5至15，更进一步优选的，活化度为6至12。优选的，所述的活化反应时间为2至24h。进一步优选的，所述的活化反应时间为16至20h。

2)将步骤1)活化的12F型肺炎链球菌荚膜多糖与TT或CRM197反应制备糖缀合物。其中，未反应的醛基在与载体蛋白缀合之后，使用硼氢化钠在封闭反应中还原为伯羟基。

3)纯化步骤2)获得的糖缀合物。

优选的，所述步骤1)中将12F型肺炎链球菌荚膜多糖水解至50-500kDa的分子量。

优选的，所述的步骤1)还包括纯化活化的肺炎链球菌12F型荚膜多糖的步骤。

优选的，所述步骤2)中封闭反应的温度为20至35℃。

优选的，所述步骤2)中封闭反应时间为2至6h。

优选的，所述的方法适用于任一含伯羟基的肺炎链球菌血清型荚膜多糖。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的糖缀合物的制备方法，包括：

1)将12F型肺炎链球菌荚膜多糖水解至50-500kDa的分子量，以TEMPO和PIA作为活化剂将糖环上的伯羟基氧化为醛基，获得活化的多糖；优选的，所述的多糖的活化度为5至20，进一步优选的，所述的活化的12F型荚膜多糖的氧化度为5至15，更进一步优选的，活化度为6至12。优选的，所述的活化反应时间为2至24h。进一步优选的，所述的活化反应时间为16至20h。

2)将步骤1)活化的12F型肺炎链球菌荚膜多糖与ADH反应制备12F衍生多糖。其中，未反应的ADH在反应结束之后，使用10mM的磷酸盐缓冲液超滤30次，然后用水超滤10次，可除尽。

3)糖缀合物的制备：将步骤2)所得衍生多糖与载体蛋白TT或CRM197反应，得缀合物，所得缀合物利用AKTA纯化，即得结合物原液；

优选的，所述步骤1)中将12F型肺炎链球菌荚膜多糖水解至50-500kDa的分子量。

优选的，所述的步骤1)还包括纯化活化的12F型肺炎链球菌荚膜多糖的步骤。

优选的，所述步骤2)中反应的温度为20至40℃。

优选的，所述步骤2)中封闭反应时间为2至6h。

本发明的第三方面，提供了一种上述的制备方法制备得到的糖缀合物。

本发明的第四方面，提供了免疫原性组合物，包含上述的糖缀合物或上述的制备方法制备的糖缀合物，以及药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。

优选的，所述的组合物中包括肺炎链球菌12F型荚膜多糖缀合物，所述肺炎链球菌12F型荚膜多糖缀合物以硝酰基化合物和碘氧化剂将12F型细菌荚膜多糖的伯羟基选择性氧化为醛基，得到含有醛基的12F型细菌荚膜多糖；

任选的，将12F型含有醛基的细菌荚膜多糖与间隔物反应，得到含有醛基的12F型细菌荚膜多糖衍生物；

将含有醛基的12F型细菌荚膜多糖或含有醛基的12F型细菌荚膜多糖衍生物与载体蛋白的氨基或羧基反应制备获得。

优选的，所述的免疫原性组合物还包含其他细菌荚膜多糖的糖缀合物，所述的其他细菌荚膜多糖选自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F荚膜多糖。

优选的，所述免疫原性组合物的剂型选自：片剂、胶囊、丸剂、注射剂、吸入剂、含片、栓剂、乳剂、微乳剂、亚微乳剂、纳米颗粒、凝胶剂、粉剂、悬乳液、乳膏剂、胶冻剂、喷雾剂等。

优选的，所述免疫原性组合物的给药方式选自：口服、肠给药、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、鼻腔给药、透皮给药、结膜下给药、眼球内给药、眼眶给药、眼球后给药、视网膜给药、脉络膜给药、鞘内注射等。

优选的，所述的免疫原性组合物还包括佐剂。更优选的，所述的佐剂为铝系佐剂。最优选的，所述铝系佐剂选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。

优选的，所述的免疫原性组合物还包含生理盐水和琥珀酸。

本发明的第五方面，提供了上述的糖缀合物、上述的制备方法制备的糖缀合物或上述的免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。本发明提供的糖缀合物、免疫原性组合物具有较高的免疫原性，并在个体中诱导治疗性免疫应答。

优选的，所述的与肺炎链球菌相关的疾病选自肺炎、脑膜炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、心内膜炎、败血性休克、发热性菌血症、中耳感染、鼻窦炎、复发型支气管炎及其他严重的侵袭性疾病。

本发明的第六方面，提供了一种预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物，所述的药物包括本发明所述的糖缀合物或免疫原性组合物。

本发明的第七方面，提供了一种预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的疫苗，所述的疫苗包括本发明所述的糖缀合物或免疫原性组合物。

优选的，所述的疫苗为液体注射剂。

优选的，所述的注射剂中还含有生理盐水、琥珀酸、磷酸铝佐剂等。

优选的，所述的疫苗至少包含肺炎链球菌的血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F荚膜多糖。

优选的，所述的疫苗每一次使用剂量，含有多糖1至5μg。

本发明的第八方面，提供了一种预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的方法，所述的方法包括向个体施用有效剂量的本发明所述的糖缀合物或免疫原性组合物。

本发明所述的“糖缀合物”是指与载体蛋白共价缀合的糖。其中，所述的糖缀合物中可以包含一定量的游离糖。

本发明所述的“活化度”是指每摩尔醛的糖重复单元摩尔比。

本发明所述的“衍生率”是指ADH浓度(μg/ml)与多糖浓度(mg/ml)的比值。

本发明所述的“结合比”是指结合物中多糖浓度(mg/ml)与蛋白浓度(mg/ml)的比值。

本发明所述的“药学上可接受的”是指既不显著刺激个体也不抑制所施用的产的活性物质的生物学活性及特性。

本发明所述的“预防”是指通过施用本发明所述的产品来抑制症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。

本发明所述的“治疗”是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“个体”包括哺乳动物和人。

本发明所述的“有效剂量”是指在以单个或多个剂量给予至个体或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明的组合物的量或剂量。

本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。

本发明所述的“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：图A、B分别表示肺炎链球菌血清型12F的荚膜多糖的结构式及表达式，其中，图A中椭圆圈位置表示通过TEMPO-PIA氧化荚膜多糖的氧化位点，分别为β-D-GalpNAc、α-D-Galp、α-D-Glcp，伯羟基；长方形框的位置表示高碘酸盐介导的氧化的位点，具体为α-D-Galp、α-D-Glcp，邻二羟基；

图2：肺炎链球菌血清型2的荚膜多糖的结构式及表达式；

图3：肺炎链球菌血清型6B的荚膜多糖的结构式及表达式；

图4：肺炎链球菌血清型8的荚膜多糖的结构式及表达式；

图5：肺炎链球菌血清型9N的荚膜多糖的结构式及表达式；

图6：肺炎链球菌血清型10A的荚膜多糖的结构式及表达式；

图7：肺炎链球菌血清型11A的荚膜多糖的结构式及表达式；

图8：肺炎链球菌血清型15B的荚膜多糖的结构式及表达式；

图9：肺炎链球菌血清型17A的荚膜多糖的结构式及表达式；

图10：肺炎链球菌血清型17F的荚膜多糖的结构式及表达式；

图11：肺炎链球菌血清型20的荚膜多糖的结构式及表达式；

图12：肺炎链球菌血清型22F的荚膜多糖的结构式及表达式；

图13：肺炎链球菌血清型33F的荚膜多糖的结构式及表达式；

图14：ELISA法检测12F多糖缀合物的免疫原性结果；

图15：MOPA法检测12F多糖缀合物的免疫原性结果；

图16：不同工艺方法制备的12F相关产物的核磁结构，其中NAME为12F相关产物名称编号，EXPNO为实验号，PROCNO为处理号，INSTRUM为机柜的名称，PROBHD为探头型号，PULPROG为脉冲序列，TD为采样点数，SOLVENT为溶剂，NS为扫描次数，DS为空扫次数，SWH为谱宽，FIDRES为自由感应衰减信号的分辨率，AQ为采样时间，RG为接收机增益，DW为采样间隔，DE为发射机关闭接收机打开的时间间隔，D1为循环延迟，TD0代表每隔多少次保存，SFO1为观测通道的基频+偏移，NUC1为观测通道的核，P1为脉宽，PLW1为功率，SI为傅里叶变换之后的点数，SF为基频，WDW为窗函数，EM指的是采用指数窗函数，SSB为正弦振铃型窗函数的参数，LB线性展宽因子，GB为高斯窗函数的参数，PC为检峰灵敏度；

图16A：TEMPO-PIA工艺制备的12F活化多糖(F12F-A-20210309)的核磁结构；

图16B：TEMPO-PIA工艺制备的12F衍生多糖(F12F-AA-20210312)的核磁结构；

图16C：TEMPO-NCS工艺制备的12F活化多糖(F12F-A-20210220)的核磁结构；

图16D：TEMPO-NCS工艺制备的12F衍生多糖(F12F-AA-20210122)的核磁结构；

图16E：TEMPO-NCS工艺制备的12F衍生多糖(F12F-AA-20210219-2)的核磁结构；

图16F：TEMPO-NCS工艺制备的12F衍生多糖(F12F-AA-20210222-2)的核磁结构；

图17：实施例1制备的12F糖缀合物的粒径；

图18：实施例2制备的12F糖缀合物的粒径；

图19：实施例4制备的12F糖缀合物的粒径；

图20：ADH亚甲基特征峰，核磁位移；

图21：TEMPO-PIA工艺相关图谱比较；

图22：TEMPO-NCS工艺相关图谱比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1使用TEMPO-PIA制备血清型12F-CRM197糖缀合物(一)

为了改善12F多糖疫苗工艺的稳定性以及结合物的免疫原性，发明人使用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基(TEMPO)和其共氧化剂碘苯二乙酯(碘苯二乙酸或PIA)将多糖伯羟基氧化成醛，然后与载体蛋白的氨基反应，制备获得12F-CRM197缀合物。

其中，主要氧化剂为PIA，副产物为碘苯；TEMPO为催化量，副产物为1-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶。经分析表明，本方法氧化(活化或反应)位点与高碘酸钠的氧化位点不同。TEMPO-PIA的氧化位点为α-D-GalpNAc、α-D-Galp、α-D-Glcp上的伯羟基(见图1)，高碘酸钠的氧化位点主要是α-D-Galp上的邻二羟基(见图1)。

本发明中，碘苯二乙酯(碘苯二乙酸)氧化伯羟基可能的反应机理如下：

制备血清型12F-CRM197糖缀合物的方法如下：

1)将12F荚膜多糖加入醋酸溶液，控制pH＝2，加热2小时,即得12F水解多糖；TSK测分子量，分子量应控制在50kDa至500kDa；

2)TEMPO-PIA活化多糖，具体操作为：冰浴下，将250mg的12F水解多糖溶于水中，至终浓度为2mg/ml，加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM，加入TEMPO(2.2mg，0.06eq)以及PIA(220mg，3eq)，避光，室温反应20小时。

超滤，30KD膜包超滤50次，得活化多糖205mg，收率82％。用蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构。糖含量与醛基含量的比值即为活化度(DO)。

3)将12F活化多糖与CRM197载体蛋白结合

-40℃冻干72h，得活化多糖固体。

将200mg的12F活化多糖溶于水中，至终浓度为10mg/ml，加入等质量的CRM197载体蛋白，混匀，加入氰基硼氢化钠(23mg，2eq)，避光，37℃反应72小时。反应结束后，加入硼氢化钠(14mg，2eq)封闭反应反应1-3h。

纯化：100KD膜包，10mM的磷酸盐缓冲液超滤50次，0.9％的氯化钠溶液超滤20次，得结合物原液。

上述结合物原液用0.2μm过滤器无菌过滤，将这种原液材料称为单价结合体。用类似的方法可以生成含伯羟基的血清型的所有单价的结合体。

福林酚法测蛋白含量，蒽酮法测多糖含量，DOC沉淀法测游离多糖含量，SDS-PAGE法测游离蛋白含量，CL-4B测分子量(K_D≤0.3)。

实验具体检测数据见表1。

同时还对最终产物利用动态光散射(Dynamic lightscattering，DLS)进行粒径检测，结果如图17所示。

实施例2使用TEMPO-PIA和ADH制备血清型12F-CRM197糖缀合物

制备血清型12F-CRM197糖缀合物的方法如下：

1)在酸性加热条件下将12F荚膜多糖水解,即得12F水解多糖，TSK测分子量，分子量应控制在50kDa至500kDa；

2)TEMPO-PIA活化多糖，具体操作为：冰浴下，将175mg的12F水解多糖溶于水中，至终浓度为4mg/ml，加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM，加入TEMPO(1mg，0.04eq)以及PIA(43.8mg，0.85eq)，避光室温反应20小时。

超滤，30KD膜包，纯水超滤30次，得活化多糖127mg，收率72.6％。蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构。糖含量与醛基含量的比值即为活化度(DO)。

3)制备12F衍生多糖

将250mg的12F活化多糖溶于水中，至终浓度为8mg/ml。加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM。加入ADH固体(1910mg，48eq)，搅拌溶解。加入氰基硼氢化钠(28.7mg，2eq)，避光，37℃恒温反应8～16h。反应结束后，加入硼氢化钠(17.3mg，2eq)封闭反应反应1～3h。

超滤：30KD膜包，10mM磷酸盐缓冲液超滤50次，纯水超滤20次，浓缩，得衍生多糖203mg，收率81.3％。蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构，药典方法测ADH含量(中国药典通则3118己二酰肼含量测定法)。ADH含量(单位μg/ml)与多糖含量(单位mg/ml)的比值即为ADH衍生率。

4)将12F衍生多糖与CRM197载体蛋白结合

将200mg的12F衍生多糖溶于水中，至终浓度为4mg/ml，冰浴控温2～8℃，加入等质量的CRM197载体蛋白，混匀，加入EDAC至终浓度为20mg/ml，盐酸调节pH＝5.3，反应3h，反应结束后，用氢氧化钠调节pH＝6.6～7.5，封闭反应1h。0.45μm过滤器过滤后，经AKTA纯化，得结合物原液。

福林酚法测蛋白含量，蒽酮法测荚膜多糖含量，DOC沉淀法测游离多糖含量，SDS-PAGE法测游离蛋白含量，CL-4B测分子量(K_D≤0.3)。

上述结合物原液用0.2μm过滤器无菌过滤，将这种原液材料称为单价结合体。用类似的方法可以生成含伯羟基的血清型的所有单价的结合体。

实验具体检测数据见表1。

同时还对最终产物利用动态光散射(Dynamic lightscattering，DLS)进行粒径检测，结果如图18所示。

实施例3使用TEMPO-PIA和ADH制备血清型12F-TT糖缀合物

制备血清型12F-TT缀合物的方法如下

本实施例的方法与实施例2相似，但载体蛋白为破伤风类毒素。

制备血清型12F-TT缀合物的方法如下：

1)在酸性加热条件下将12F荚膜多糖水解,即得12F水解多糖，TSK测分子量，分子量应控制在50kDa至500kDa；

2)TEMPO-PIA活化多糖，具体操作为：冰浴下，将350mg的12F水解多糖溶于水中，至终浓度为2mg/ml，加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM，加入TEMPO(2mg，0.04eq)以及PIA(87.6mg，0.85eq)，避光室温反应20小时。

超滤，30KD膜包，纯水超滤30次，得活化多糖254mg，收率72.6％。蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构。糖含量与醛基含量的比值即为活化度(DO)。

3)制备12F衍生多糖

将250mg的12F活化多糖溶于水中，至终浓度为5mg/ml。加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM。加入ADH固体(1910mg，48eq)，搅拌溶解。加入氰基硼氢化钠(28.7mg，2eq)，避光，37℃恒温反应8～16h。反应结束后，加入硼氢化钠(17.3mg，2eq)封闭反应反应1～3h。

超滤：30KD膜包，10mM磷酸盐缓冲液超滤50次，纯水超滤20次，浓缩，得衍生多糖209mg，收率83.6％。蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构，TNBS法测ADH含量(中国药典通则3118己二酰肼含量测定法)。ADH含量(单位μg/ml)与多糖含量(单位mg/ml)的比值即为ADH衍生率。

4)将12F衍生多糖与TT载体蛋白结合

将200mg的12F衍生多糖溶于水中，至终浓度为4mg/ml，冰浴控温2～8℃，加入1.1倍质量的TT载体蛋白，混匀，加入EDAC至终浓度为20mg/ml，盐酸调节pH＝5.3±0.2，反应1～3h，反应结束后，用氢氧化钠调节pH＝6.6～7.5，封闭反应1h。0.22μm过滤器过滤后，AKTA纯化，得结合物原液。

福林酚法测蛋白含量，蒽酮法测荚膜多糖含量，DOC沉淀法测游离多糖含量，SDS-PAGE法测游离蛋白含量，CL-4B测分子量(K_D≤0.3)。

上述结合物原液用0.2μm过滤器无菌过滤，将这种原液材料称为单价结合体。用类似的方法可以生成含伯羟基的血清型的所有单价的结合体。

实验具体检测数据见表1。

实施例4使用TEMPO-NCS和ADH制备血清型12F-CRM197糖缀合物

制备血清型12F-CRM197糖缀合物。

1)在酸性加热条件下将12F荚膜多糖水解,即得12F水解多糖，TSK测分子量，分子量应控制在50～500kDa；

2)TEMPO-NCS活化多糖，具体操作为：冰浴下，将300mg的12F水解多糖溶于水中至终浓度为2mg/ml，加入pH 8.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液至终浓度为10mM，加入TEMPO(3.6mg，0.085eq)以及NCS(73mg，2eq)，2-8℃避光反应3小时。

超滤，30KD膜包纯水超滤50次，浓缩得活化多糖235mg，收率78.3％。用蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构。糖含量与醛基含量的比值即为活化度(DO)。

3)制备12F衍生多糖

将250mg的12F活化多糖溶于水中，至终浓度为5mg/ml。加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM。加入ADH固体(1910mg，48eq)，搅拌溶解。加入氰基硼氢化钠(28.7mg，2eq)，避光，37℃恒温反应8～16h。反应结束后，加入硼氢化钠(17.3mg，2eq)封闭反应反应1～3h。

超滤：30KD膜包，10mM磷酸盐缓冲液超滤50次，纯水超滤20次，浓缩，得衍生多糖220mg，收率88.0％。蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构，药典法测ADH含量(中国药典通则3118己二酰肼含量测定法)。ADH含量(单位μg/ml)与多糖含量(单位mg/ml)的比值即为ADH衍生率。

将200mg的12F衍生多糖溶于水中，至终浓度为4mg/ml，冰浴控温2～8℃，加入等质量的CRM197载体蛋白，混匀，加入EDAC至终浓度为20mg/ml，盐酸调节pH＝5.4，反应3h，反应结束后，用氢氧化钠调节pH＝6.6～7.5，封闭反应1h。0.45μm过滤器过滤后，经AKTA纯化，得结合物原液。

福林酚法测蛋白含量，蒽酮法测荚膜多糖含量，DOC沉淀法测游离多糖含量，SDS-PAGE法测游离蛋白含量，CL-4B测分子量(K_D≤0.3)。

上述结合物原液用0.2μm过滤器无菌过滤，将这种原液材料称为单价结合体。用类似的方法可以生成含伯羟基的血清型的所有单价的结合体。

实验具体检测数据见表1。

同时还对最终产物利用动态光散射(Dynamic lightscattering，DLS)进行粒径检测，结果如图19所示。

实施例5使用TEMPO-NCS和ADH制备血清型12F-TT糖缀合物

制备血清型12F-TT糖缀合物。

1)在酸性加热条件下将12F荚膜多糖水解,即得12F水解多糖，TSK测分子量，分子量应控制在50～200KD；

2)TEMPO-NCS活化多糖，具体操作为：冰浴下，将300mg的12F水解多糖溶于水中至终浓度为2mg/ml，加入pH 8.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液至终浓度为10mM，加入TEMPO(3.6mg，0.085eq)以及NCS(73mg，3eq)，室温避光反应3小时。

超滤，30KD膜包纯水超滤50次，浓缩得活化多糖255mg，收率85.0％。用蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构。糖含量与醛基含量的比值即为活化度(DO)。

3)制备12F衍生多糖

将250mg的12F活化多糖溶于水中，至终浓度为5mg/ml。加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM。加入ADH固体(1910mg，48eq)，搅拌溶解。加入氰基硼氢化钠(28.7mg，2eq)，避光，37℃恒温反应8～16h。反应结束后，加入硼氢化钠(17.3mg，2eq)封闭反应反应1～3h。

超滤：30KD膜包，10mM磷酸盐缓冲液超滤50次，纯水超滤20次，浓缩，得衍生多糖217mg，收率86.8％。蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构，药典法测ADH含量(中国药典通则3118己二酰肼含量测定法)。ADH含量(单位μg/ml)与多糖含量(单位mg/ml)的比值即为ADH衍生率。

将200mg的12F衍生多糖溶于水中，至终浓度为4mg/ml，冰浴控温2～8℃，加入1.2倍质量的TT载体蛋白，混匀，加入EDAC至终浓度为20mg/ml，盐酸调节pH＝5.4，反应3h，反应结束后，用氢氧化钠调节pH＝6.6～7.5，封闭反应1h。0.45μm过滤器过滤后，用AKTA纯化，得结合物原液。

福林酚法测蛋白含量，蒽酮法测荚膜多糖含量，DOC沉淀法测游离多糖含量，SDS-PAGE法测游离蛋白含量，CL-4B测分子量(K_D≤0.3)。

上述结合物原液用0.2μm过滤器无菌过滤，将这种原液材料称为单价结合体。用类似的方法可以生成含伯羟基的血清型的所有单价的结合体。

实验具体检测数据见表1。

实施例6使用TEMPO-PIA制备血清型12F-CRM197糖缀合物(二)

制备血清型12F-CRM197糖缀合物的方法如下：

1)将12F荚膜多糖加入醋酸溶液，控制pH＝2，加热2小时,即得12F水解多糖；TSK测分子量，分子量应控制在50kDa至500kDa；

2)TEMPO-PIA活化多糖，具体操作为：冰浴下，将250mg的12F水解多糖溶于水中，至终浓度为2mg/ml，加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM，加入TEMPO(3.0mg，0.08eq)以及PIA(220mg，3eq)，室温避光反应16小时。

超滤，30KD膜包超滤50次，得活化多糖220mg，收率88.0％。蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构。糖含量与醛基含量的比值即为活化度(DO)。

3)将12F活化多糖与CRM197载体蛋白结合

将200mg的12F活化多糖与1.2倍质量的CRM197蛋白充分混合，置于-80℃的冰箱冰冻8h，然后将其-40℃真空冻干72h，得冻干粉。

将冻干粉溶于水中，至糖浓度为10mg/ml，加入氰基硼氢化钠(23mg，2eq)，避光，37℃反应72小时。反应结束后，加入硼氢化钠(14mg，2eq)封闭反应反应1-3h。

纯化：100KD膜包，10mM的磷酸盐缓冲液超滤50次，0.9％的氯化钠溶液超滤20次，得结合物原液。

上述结合物原液用0.2μm过滤器无菌过滤，将这种原液材料称为单价结合体。用类似的方法可以生成含伯羟基的血清型的所有单价的结合体。

福林酚法测蛋白含量，蒽酮法测荚膜多糖含量，DOC沉淀法测游离多糖含量，SDS-PAGE法测游离蛋白含量，CL-4B测分子量(K_D≤0.3)。

实验具体检测数据见表1。

实施例7使用TEMPO-PIA制备血清型12F-CRM197糖缀合物(三)

制备血清型12F-CRM197糖缀合物的方法如下：

1)将12F荚膜多糖加入醋酸溶液，控制pH＝2，加热2小时,即得12F水解多糖；TSK测分子量，分子量应控制在50kDa至500kDa；

2)TEMPO-PIA活化多糖，具体操作为：冰浴下，将250mg的12F水解多糖溶于水中，至终浓度为2mg/ml，加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM，加入TEMPO(2.2mg，0.06eq)以及PIA(220mg，3eq)，避光，2-8℃反应3小时。

超滤，30KD膜包超滤50次，得活化多糖213mg，收率85％。用蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构。糖含量与醛基含量的比值即为活化度(DO)。

3)将12F活化多糖与CRM197载体蛋白结合

将12F活化多糖与25倍质量的蔗糖混匀，置于-40℃真空冻干72h，得活化多糖固体。

将200mg的12F活化多糖溶于水中，至终浓度为10mg/ml，加入等质量的CRM197载体蛋白，混匀，加入氰基硼氢化钠(23mg，2eq)，避光，37℃反应72小时。反应结束后，加入硼氢化钠(14mg，2eq)封闭反应反应1-3h。

纯化：100KD膜包，10mM的磷酸盐缓冲液超滤50次，0.9％氯化钠溶液超滤20次，得结合物原液。

上述结合物原液用0.2μm过滤器无菌过滤，将这种原液材料称为单价结合体。用类似的方法可以生成含伯羟基的血清型的所有单价的结合体。

福林酚法测蛋白含量，蒽酮法测荚膜多糖含量，DOC沉淀法测游离多糖含量，SDS-PAGE法测游离蛋白含量，CL-4B测分子量(K_D≤0.3)。

实验具体检测数据见表1。

实施例8使用TEMPO-PIA制备血清型12F-CRM197糖缀合物(四)

制备血清型12F-CRM197糖缀合物的方法如下：

1)将12F荚膜多糖加入醋酸溶液，控制pH＝2，加热2小时,即得12F水解多糖；TSK测分子量，分子量应控制在50kDa至500kDa；

2)TEMPO-PIA活化多糖，具体操作为：冰浴下，将250mg的12F水解多糖溶于水中，至终浓度为2mg/ml，加入pH＝6.5的磷酸盐缓冲液至终浓度为10mM，加入TEMPO(1.5mg，0.04eq)以及PIA(75mg，1eq)，避光室温反应3小时。

超滤，30kd膜包超滤50次，得活化多糖200mg，收率80.0％。用蒽酮法测糖含量，MBTH法测醛基含量，TSK测分子量，核磁检测荚膜多糖结构。糖含量与醛基含量的比值即为活化度(DO)。

3)将12F活化多糖与CRM197载体蛋白结合

将12F活化多糖置于-40℃真空冻干72h，得活化多糖固体。

将200mg的12F活化多糖溶于水中，至终浓度为12mg/ml，加入1.2倍质量的CRM197载体蛋白，混匀，加入氰基硼氢化钠(23mg，2eq)，避光，37℃反应72小时。反应结束后，加入硼氢化钠(14mg，2eq)封闭反应反应1-3h。

纯化：100KD膜包，10mM的磷酸盐缓冲液超滤50次，0.9％的氯化钠溶液超滤20次，得结合物原液。

上述结合物原液用0.2μm过滤器无菌过滤，将这种原液材料称为单价结合体。用类似的方法可以生成含伯羟基的血清型的所有单价的结合体。

福林酚法测蛋白含量，蒽酮法测荚膜多糖含量，DOC沉淀法测游离多糖含量，SDS-PAGE法测游离蛋白含量，CL-4B测分子量(K_D≤0.3)。

实验具体检测数据见表1。

实施例9制备各种含有伯羟基的血清型的糖缀合物

制备各种含有伯羟基的血清型的糖缀合物的方法：

实验操作同实施例1～8。

含有伯羟基的血清型包括但不限于本文所述。

本方法可应用于其他血清型，其他血型结构与表达式如图2-13所示，均为伯羟基被选择性氧化：

2型反应位点D-Glcp，3型反应位点β-D-Glcp，4型反应位点β-D-ManpNAc等，5型反应位点D-Glcp，6A型反应位点D-Galp、D-Glcp，6B型反应位点D-Glcp、D-Glcp，7F型反应位点D-Galp等，8型反应位点β-D-Glcp等，9N型反应位点α-D-Glup等，9V型反应位点α-D-Galp等，10A型反应位点β-D-Galf等，11A型反应位点β-D-Galp等，14型反应位点D-Glcp等，15B型反应位点α-D-Galp等，17A型反应位点β-D-Glcp等，17F型反应位点β-D-Glcp等，18C型反应位点D-Glcp等，19A型反应位点β-D-ManpNAc等，19F型反应位点β-D-ManpNAc等，20型反应位点α-D-GlcpNAc等，22F型反应位点α-D-Glcp，23F型反应位点D-Glcp、L-Rhp，33F型反应位点β-D-Galp等。

表1：实施例1～8数据汇总表

实施例10制备肺炎球菌24价多糖结合疫苗

将多糖-CRM197结合物配制为疫苗

将24种肺炎球菌结合物原液(1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F)按一定比例加入到0.9％的生理盐水中，充分混合，加适量的50mM琥珀酸溶液以及磷酸铝佐剂，配制为肺炎球菌24价多糖结合疫苗。

其中，各型多糖含量为2.2μg/ml(6B 4.4μg/ml)，铝离子含量不高于0.2mg/ml，0.5ml/支分装，即得。

实施例11免疫原性研究

针对本研究，招募普通家兔，每只2.5kg左右，雌雄各半，实验共设10组：8组实验组、1组阳性对照疫苗(Prevenar13)、1组安慰剂。给予家兔0.5ml的剂量体积，相当于成人中的单剂量，皮下注射，分别于0、14、28天进行免疫，免疫后42天颈部静脉采集全血，分离血清。具体试验组别见表2。

表2：试验组别

组别	12F结合物原液结合工艺
		PCV-1	高碘酸钠工艺结合CRM197
PCV-2	CDAP工艺结合CRM197
		PCV-3	CDAP工艺结合TT
PCV-4	PIA还原胺法(实例1)
		PCV-5	PIA-ADH法(实例2)
PCV-6	PIA-ADH法(实例3)
		PCV-7	NCS还原胺法(辉瑞)
PCV-8	NCS-ADH法(实例4)

ELISA法检测IgG对各种肺炎球菌荚膜多糖的滴度，按照标准化的WHO ELISA流程操作。12F多糖缀合物的免疫原性见图14。

按照标准化的OPA流程操作，测定合并血清的OPA GMT，12F多糖缀合物的免疫原性见图15。

实施例12核磁结构比较

实施例1～8中各相关活化/衍生产物核磁结构的比较

由TEMPO-PIA氧化所得的活化多糖；

由TEMPO-NCS氧化所得的活化多糖；

由TEMPO-PIA氧化后以ADH衍生所得的衍生多糖；

由TEMPO-NCS氧化后以ADH衍生所得的衍生多糖；

由高碘酸钠氧化所得的活化多糖；

以上活化产物的核磁结构如图16所示，各工艺核磁结构的比较(参见图21～22，其中各多糖编号见表4)，表明由TEMPO-PIA氧化或TEMPO-NCS氧化生成的12F活化多糖与12F荚膜多糖结构类似，糖环质子区与指纹区信号基本一致，亦表明TEMPO-PIA或TEMPO-NCS氧化不会破坏具有邻羟基结构的糖环。而高碘酸钠氧化生成的活化多糖的核磁与12F荚膜多糖结构相比较，有较明显差异，表明此法对糖六元环结构(糖环邻羟基)有一定破坏，可能是因为这种结构的破坏，造成了高碘酸钠法所得活化多糖的稳定性较差。表3显示了不同方法获得的多糖缀合物稳定性的比较。

表3：不同工艺方法制备的12F缀合物的稳定性比较

以上ADH衍生产物与活化产物的核磁结构的比较(参见图16、21-22)，表明由TEMPO-PIA或TEMPO-NCS两种不同路径，在适宜的条件下均可得到ADH衍生产物。生成的12F活化荚膜多糖与12F荚膜多糖结构类似，具体数据参见下表，结果表明TEMPO-PIA氧化或TEMPO-NCS氧化生成的活化多糖使具有邻羟基结构的糖环的完整性得到了很好的保留。

实施例中，由TEMPO-PIA或TEMPO-NCS活化的多糖用ADH衍生后所得的衍生多糖，与12F荚膜多糖比较，其最大的不同点在两组位移，见图21或22中方框中的位移区间，此位移即为ADH两组亚甲基特征峰δ1.57、δ2.18(图20)。

理论上，ADH特征峰积分后，与多糖特征峰积分的比值，可计算多糖的衍生率，但核磁积分计算衍生率的方法准确性较差(若ADH两个氨基均与多糖羧基反应，其产物对本工艺无意义)，所以只能用核磁方法推算衍生趋势。根据中国药典2020版三部通则3118关于ADH的检测方法，得出衍生率，如表4所示。与核磁推算衍生率的变化趋势相同。

表4多糖衍生率

通过上述实施例中使用PIA和NCS的氧化最终获得的多糖蛋白缀合物的各性质的检测结果可以发现，通过PIA获得的产物相比于NCS获得产物，免疫原性相近，但PIA获得产物拥有更高的稳定性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (16)

1.一种糖缀合物，其特征在于，所述的糖缀合物为将细菌荚膜多糖中伯羟基氧化，直接或经由间隔物基团偶联至载体蛋白上获得，其中，所述的细菌荚膜多糖包括肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F型荚膜多糖，所述的荚膜多糖的反应位点包括β-D-GalpNAc、α-D-Galp或α-D-Glcp。

2.权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于，以硝酰基化合物和碘氧化剂将细菌荚膜多糖中伯羟基氧化，优选的，所述的硝酰基化合物为2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基或包含2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基结构的化合物，更优选的，所述的碘氧化剂为PIA。

3.权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于，所述的细菌荚膜多糖为12F型荚膜多糖。

4.根据权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于，所述的载体蛋白选自白喉类毒素突变体、破伤风类毒素、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、流感嗜血杆菌表面脂蛋白、由流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因形成的融合蛋白、百日咳毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒VP7蛋白质或呼吸道合胞病毒F和G蛋白或其活性部分。

5.根据权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.3至3。

6.根据权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于，所述的细菌荚膜多糖的每10至30个糖重复单元，在所述载体蛋白与所述细菌荚膜多糖之间存在至少一个共价键。

7.一种糖缀合物的制备方法，其特征在于，包括：

以硝酰基化合物和碘氧化剂将细菌荚膜多糖的伯羟基选择性氧化为醛基，得到含有醛基的细菌荚膜多糖；

任选的，将含有醛基的细菌荚膜多糖与间隔物反应，得到含有醛基的细菌荚膜多糖衍生物；

将含有醛基的细菌荚膜多糖或含有醛基的细菌荚膜多糖衍生物与载体蛋白的氨基或羧基反应制备获得糖缀合物，优选的，含有醛基的细菌荚膜多糖衍生物与载体蛋白在EDAC存在下反应制备获得糖缀合物；

其中，所述的细菌荚膜多糖还包括肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F型荚膜多糖。

8.根据权利要求7所述的一种糖缀合物的制备方法，其特征在于，所述的碘氧化剂为PIA。

9.根据权利要求7或8所述的一种糖缀合物的制备方法，其特征在于，所述的硝酰基化合物为2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基或包含2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基自由基结构的化合物。

10.根据权利要求7所述的一种糖缀合物的制备方法，其特征在于，所述的间隔物选自ADH或CDH。

11.根据权利要求7所述的一种糖缀合物的制备方法，其特征在于，所述的载体蛋白选自白喉类毒素突变体、破伤风类毒素、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、流感嗜血杆菌表面脂蛋白、由流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因形成的融合蛋白、百日咳毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒VP7蛋白质或呼吸道合胞病毒F和G蛋白或其活性部分。

12.根据权利要求7所述的一种糖缀合物的制备方法，其特征在于，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为0.3至3。

13.根据权利要求7-12任一所述的制备方法制备得到的糖缀合物。

14.免疫原性组合物，其特征在于，包含权利要求1-6任一所述的糖缀合物或权利要求13所述的糖缀合物，以及药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。

15.根据权利要求14所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的组合物中包括肺炎链球菌12F型荚膜多糖缀合物，所述肺炎链球菌12F型荚膜多糖缀合物以硝酰基化合物和碘氧化剂将12F型细菌荚膜多糖的伯羟基选择性氧化为醛基，得到含有醛基的12F型细菌荚膜多糖；

任选的，将12F型含有醛基的细菌荚膜多糖与间隔物反应，得到含有醛基的12F型细菌荚膜多糖衍生物；

将含有醛基的12F型细菌荚膜多糖或含有醛基的12F型细菌荚膜多糖衍生物与载体蛋白的氨基或羧基反应制备获得；

并且，所述的组合物中还包括肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型荚膜多糖缀合物。

16.权利要求1-6任一所述的糖缀合物、权利要求13所述的糖缀合物或权利要求14-15任一所述的免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。

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