CN115720626A - 定位样品中染料的单个分子的方法和生成样品中结构的高分辨率图像的方法 - Google Patents

定位样品中染料的单个分子的方法和生成样品中结构的高分辨率图像的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于生成样品中结构的高分辨率图像或用于定位样品中荧光染料的单个分子的方法，以及荧光染料在这种方法中的用途。根据本发明的方法的特征在于，在用激发光和荧光阻抑光扫描荧光染料之前在光活化反应中首先由受保护的非荧光形式的染料形成荧光染料，该光活化反应包括至少两个反应步骤，并且该受保护的非荧光形式的染料对激发光和荧光阻抑光是惰性的。

Description

定位样品中染料的单个分子的方法和生成样品中结构的高分 辨率图像的方法
发明的技术领域
本发明涉及用于生成结构的高分辨率图像的方法和用于定位样品中荧光染料的单个分子的方法。为此，用激发光和荧光阻抑光的具有局部最小值的强度分布扫描样品或样品的片段，该荧光阻抑光阻止、减少或完全抑制荧光染料发射荧光。与现有技术中已知的相关方法相比，根据本发明的方法的特征在于，在用激发光和荧光阻抑光扫描荧光团之前，在包括至少两个反应步骤的光活化反应中，首先由染料的受保护的非荧光形式形成荧光团，并且染料的受保护的非荧光形式对于激发光和荧光阻抑光是惰性的。
现有技术
STED显微镜被理解为激光扫描显微镜的方法，该方法能够实现用荧光染料标记的样品的空间上高分辨率的成像。在此，用聚焦的激发光和刺激光扫描样品，其中，激发光和刺激光的强度分布基本上是互补的，并且刺激光的强度分布在激发光的强度最大值的位置处具有零点。在高强度位置，刺激光阻碍荧光染料发射荧光，从而将荧光发射限制在刺激光强度分布的零点周围的一个小范围内，并减小了有效点扩展函数的大小。
作为STED显微镜的改进方案，在DE 10 2013 100 172 A1中公开了一种用于STED显微镜的方法，其中在用激发光和刺激光照射之前，附加地(就像刺激光一样)用荧光阻抑光的具有局部最小值的强度分布照射测量区域中的样品，该荧光阻抑光使荧光团从荧光状态转变成保护状态，在该保护状态中荧光团被保护以防被激发光和刺激光电子激发。在此，该方法的目标主要不是通过叠加刺激光和荧光阻抑光的强度分布来改进显微镜的分辨率；而是通过激发光和刺激光，特别是在刺激光的高强度区域中，减少荧光团的光漂白，其方式是，使特别是在这些区域中的荧光团转变成不可激发的保护状态，从而得到保护免受激发光和刺激光的漂白作用。使用该方法的前提条件是要有合适的荧光团，该荧光团可以暂时转变成保护状态，即可光切换。在此例如，对切换对比度的要求不如RESOLFT显微镜那么严格，但保护状态对于激发光和刺激光必须(基本上)是惰性的—对于许多可光切换的荧光团来说，这一要求在实践中并没有得到满足或仅不充分地满足。
在定位显微镜的总称下，用于高分辨率荧光显微镜的其他相关的方法是已知的。这些方法基于单个荧光染料分子的高精度空间定位以及从这些单个分子定位重建高分辨率图像。使用这些方法的前提条件是，荧光染料分子在任何时间点都以单独的形式存在于样品中，即空间上彼此分离的形式存在，因此在相机上成像时在相机图像中显示为单独的对象。虽然例如可以通过在标记样品时使用相应高的染料稀释度来实现空间上分离的荧光染料分子；然而，为了能够生成结构的在空间上尽可能连续的高分辨率成像，需要用许多以高密度布置的荧光染料分子标记结构，并确定这些荧光染料分子的足够大的一部分(典型地数千个荧光染料分子)的位置。荧光染料分子的标记密度必然高，这意味着在定位染料分子期间，所有染料分子中始终仅允许一小部分以荧光状态存在，以便能够满足荧光分子单独且空间上孤立地存在的要求。因此，在定位显微镜中使用可光切换的荧光染料，该荧光染料具有荧光状态，在荧光状态中，染料可以用合适波长的激发光激发出荧光，并且还具有暗状态，在暗状态中，染料不能用激发光激发出荧光。在此，染料可以被光活化至少一次，即从暗状态转变成荧光状态。光活化通常以光诱导(lichtinduziert)的方式进行，即通过用合适波长(通常在蓝紫光谱范围内)的光活化光来照射，由此可以精确地调节和控制光活化的染料分子的比例。可替代地，染料分子也可以自发地转变成活化状态。根据荧光染料的类型，活化也可以是可逆的，即可以经历多个活化-去活化-切换周期，其中去活化或者向非荧光状态的转变也可以光诱导地或自发地进行。典型的切换机制是从荧光状态到瞬态暗状态(例如到三重态)的(可逆)转变。特别地，这些转变的切换动力学可以在样品中通过溶剂组成、添加氧化还原试剂和/或控制氧浓度来适应相应的要求。
在定位显微镜中可达到的定位精度取决于多个因素，并且例如由R.E.Thompson等人在Biophys.J.82,2775(2002)给出：
Figure BDA0004015216930000031
其中，s为显微镜的近似为高斯函数的PSF的宽度(标准偏差)，N为探测到的染料分子的荧光光子数，a为探测器像素的边缘长度以及b为由背景荧光和探测器噪声组成的背景信号。
只要定位精度不受探测器像素的大小a或者背景信号b的明显限制，等式(1)表明，在较小宽度s的(有效)PSF下，对于给定的光子数N，可以获得更高的定位精度或者较小的定位不确定性σ，或者用较低光子数N可以获得理想的定位精度。例如，更窄的有效PSF(具有更小的值s)可以通过以下方式生成：样品不是用均匀分布的激发光平面式地照射，而是类似于STED显微镜，用借助于扫描装置扫描图像场的聚焦的激发光和刺激光照射。在此，刺激光的具有局部强度最小值的强度分布被叠加在高斯形的激发焦点上，这抑制了在激发焦点的边缘区域中的荧光发射，从而减小了有效PSF的宽度s。由于整个图像场的扫描照射自然比平面式的宽视场照射慢，因此在某些情况下必须调整记录方案，使得不是将图像场作为整体进行扫描，而是片段地进行扫描，其中例如选择片段，使得该片段分别包含一个荧光染料分子。
首次由F.Balzarotti等人在arXiv1611.03401[physics.optics]中描述的较新的MINFLUX纳米镜结合了上述方法的特征。在此，用激发光的具有强度最小值的强度分布在一系列不同位置处照射空间上孤立的荧光分子。对于每个照射位置，记录由激发光激发的荧光发射，并从所记录的荧光的强度值的量推断出荧光分子的位置。当然，该位置确定具有不确定性，其中该位置确定的不确定性可以通过迭代地应用该方法来减小。为此，在每次迭代步骤之前调整照射位置，即更接近分子的相应假定的位置。同时增强激发光的强度，使强度梯度在强度最小值附近增大。可替代地，可以增加测量持续时间，这相当于以有效光量计算的激发光强度的增加。利用调整后的参数，在调整后的每个照射位置处依次照射分子，并记录对荧光发射的强度。根据荧光信号对强度最小值位置的依赖性，当前可以以比之前更低的不确定性确定分子的位置。这些方法步骤可以重复进行，直至位置确定收敛或直至达到另一中断标准，例如预先确定的最大可接受的不确定性。MINFLUX方法可实现的定位精度约为1nm，根据目前的技术水平，MINFLUX方法代表了最精确的商业化荧光分子定位方法。
文献WO 2015/097000 A1进一步公开了从各个分子的位置数据可以获得样品中分子分布的(高分辨率的)图像(“MINFLUX成像”)。该方法对应于通常从定位显微镜中已知的用于从单个荧光分子的多个位置测定中生成高分辨率图像的方法，但在MINFLUX纳米镜的情况下，图像的空间分辨率进一步提高至5nm或更高。
在DE 10 2017 104 736 B3中描述了MINFLUX方法的一种修改方案，其中对单独存在的荧光染料分子的扫描不是通过用激发光的具有局部强度最小值的强度分布照射来进行的，而是用激发光和荧光阻抑光的两个基本上互补的强度分布来进行。在此，激发光的强度分布具有局部强度最大值，而荧光阻抑光的强度分布在相同位置处具有局部强度最小值。具体地，荧光阻抑光可以是刺激光，其通过触发受激发射防止被激发的荧光染料分子在激发光的强度分布的边缘区域中发射荧光光子。因此，激发光和荧光阻抑光以这样的强度分布叠加，如在RESOLFT显微镜和STED显微镜中也是这样做的。利用针对相应的荧光染料分子记录的荧光的强度取决于其距荧光阻抑光的局部强度最小值的距离，并且可以从针对荧光阻抑光的强度最小值的多个位置记录的荧光的强度以高精度确定荧光染料分子的位置。在MINFLUX方法的这种修改方案中，局部强度最小值也可以定位在样品中的几个位置处，并且可以根据与在MINFLUX纳米镜中相同的原理评估所记录的荧光的强度。然而，区别在于，在MINFLUX纳米镜中，来自荧光标记物的荧光的强度随着其位置到局部强度最小值的位置的距离的增加而增加，而在另外的光是荧光阻抑光的该方法的修改方案中，荧光的强度随着距离的增加而减小。
总之，从现有技术中已知高分辨率荧光显微镜的多个变型方案，其中为了在成像中实现高的空间分辨率，除了激发光之外还使用刺激光。同时，这些方法都需要使用可光活化或可光切换的荧光染料来标记样品。在实践中，这些方法的适用性是有限的，因为通常使用的具有光敏保护基的可光活化的荧光染料不是惰性的或者不是充分惰性的，特别是对于用高强度的刺激光的照射而言。如果刺激光以具有非常高的峰值强度(如在STED显微镜中是优选的)的短激光脉冲的形式使用时尤其如此。然后，由于光敏保护基也增加了多光子吸收，其结果是荧光染料会以不期望的方式被光活化。
发明任务
因此，本发明的目的在于，提供用于高分辨率荧光显微镜的方法，其中，可光活化的荧光染料可以暴露于高强度的刺激光或其他荧光阻抑光下，而可光活化的荧光染料不会被刺激光或者荧光阻抑光以阻碍方法的方式活化，而是对刺激光或者荧光阻抑光表现为惰性的。
解决方案
本发明的目的通过根据独立权利要求1、14和20的方法来实现。从属权利要求2至13、15至19和21至33涉及该方法的优选实施方式。应用权利要求34涉及可光活化的荧光染料在根据本发明的方法中的用途。
根据本发明的方法基于从现有技术已知的高分辨率荧光显微镜的方法，其中为了在成像中实现高的空间分辨率，除了激发光之外，还使用荧光阻抑光或者刺激光。然而，它们以决定性的方式如下地改进了已知方法，即使用一种荧光染料的光活化，其能够大大地减少或完全抑制通过刺激光或荧光阻抑光而引起的无意的和干扰的光活化。由此，与已知的方法相比,大大扩展了应用范围，或者首先实现了该方法的应用。
本发明基于申请人的认识，即受保护的非荧光荧光染料在刺激光的波长下通常具有小的吸收横截面，但鉴于荧光阻抑光或者刺激光的强度有时非常高，该小的吸收横截面仍然足以导致不期望的光活化。此外，可能会出现荧光阻抑光或者刺激光的双光子或多光子吸收，这也可能导致光活化。用于制备可光活化的荧光染料的一些光不稳定保护基甚至针对多光子吸收进行了优化。
现在，可光活化的荧光染料相对于荧光阻抑光或者刺激光的稳定性可以通过以下方式显著改进，即将受保护的、非荧光染料的光活化设计成，使得活化不是在一个反应步骤中进行，而是在多个反应步骤中进行。在此，如果每个单独的反应步骤是光诱导的，并且荧光能力仅在最后一个反应步骤之后才生成，则光活化因此需要吸收两个(或更多个)光子，由此生成光活化速率对光强度非线性的(即，二次方的、三次方的、……)依赖性，类似于双/多光子荧光的。如从双光子荧光激发中已知的那样，双光子吸收现象在实践中仅在使用非常短的光脉冲时才是有意义的，这同样适用于从单光子吸收转变成双光子吸收时的光活化。因此，可以抑制不期望的光活化，顺便说一句，这也适用于多光子吸收的情况，多光子吸收成为(甚至)更高阶的吸收过程。
虽然使用专用的激活光也会降低光活化的概率，但通常有足够的强度可用，并且特别地可以与刺激光无关地进行定量供给。由于光活化过程的阶数较高，光活化保持被限制在较小的体积上，并且因此甚至允许在空间上更精确地控制光活化。
发明描述
本发明涉及由同一发明概念联系起来的三种方法，用于生成样品中结构的高分辨率图像，或者用于定位样品中荧光染料的单个分子以及荧光染料在这种方法中的用途。所有三种方法的共同之处在于，选择可光活化的荧光染料，其中光活化包括至少两个相应的光诱导的反应步骤。此外，根据本发明，在所有方法中荧光染料的光活化以包括至少两个光诱导的反应步骤的活化反应的形式进行，其中荧光团仅在最后的反应步骤之后形成，并且染料获得其荧光特性。最后，在所有根据本发明的方法中，用激发光和/或荧光阻抑光的具有强度最小值的强度分布扫描样品或样品的片段。
根据本发明的第一方法包括以下步骤：
1.选择荧光染料，获得的该荧光染料最初以受保护的非荧光形式存在，并且通过用活化光照射该荧光染料使其能够从受保护的非荧光形式转变成活化的荧光形式，即可被光活化。荧光在此理解为，染料可以被合适波长的光激发以发出荧光，而这在非荧光形式中是不可能的。根据本发明，选择荧光染料，使得光活化包括至少两个相应的光诱导的反应步骤。
2.用所选择的染料标记样品中的感兴趣结构，为此可以使用现有技术中已知的荧光标记方法，包括免疫荧光标记技术。
该方法的其他步骤可以执行一次或更多次，并且包括：
3.通过用活化光照射样品，使荧光染料的(小的)子集从受保护的非荧光形式光活化成活化的荧光形式。在此，该子集可以是空间上限定的并且例如包括在样品的片段或平面内的荧光染料的分子，但是该子集也可以是统计上限定的，并且包括所有分子的随机选择。特别地，子集可以包括在空间上彼此分离的单个分子。
根据本发明，光活化以包括至少两个光诱导的反应步骤的活化反应的形式进行，其中荧光团仅在最后反应步骤之后形成，并且染料获得其荧光性质。光活化大大增加了染料的荧光量子产率，即电子激发的染料分子以荧光光子的形式释放其激发能量的概率，而不是通过非辐射过程。然而，由于受保护形式的荧光量子产率通常非常小，但不完全等于零，因此用光活化获得的荧光对比度在实践中是有限的。因此，作为荧光对比度，通常寻求比例至少为1：10，优选至少为1：100以及理想地至少为1：1000。
在此，光活化过程在两个或更多个反应步骤中的设计方案可以通过不同的反应方案来实现。光活化过程的一个可能的实施方案是将多个光不稳定保护基与荧光染料的官能基团结合在一起，使得只有在所有保护基(平行或顺序)光解裂解之后才可以形成荧光团。潜在的结合位点特别是包含在荧光团中的羟基基团、氨基基团、羰基基团和羧基基团。对于这些官能团，已知有许多光不稳定保护基，例如邻硝基苄基基团、苯偶姻基团、苯甲酰甲基基团、香豆酸酰基基团和芳基甲基基团、苯偶姻基团、芳基磺酰胺以及这些基团的被取代的变体。有关全面概述，请参阅P.Klán等人在评论文章“Photoremovable Protecting Groupsin Chemistry and Biology:Reaction Mechanisms and Efficacy”in Chem.Rev.113,119(2013)中所提到的。所述类型的保护基也适用于制备可光活化的荧光染料。受保护的罗丹明和荧光素染料的示例是技术人员从现有技术中已知的【参见例如“Specific proteinlabeling with caged fluorophores for dual-color imaging and super-resolutionmicroscopy in living cells”，S.Hauke et al.，Chem.Sci.8，559(2017)】。
虽然大多数光不稳定保护基可以用紫外光裂解，但也有越来越多的保护基可以在可见光谱范围内裂解。这些特别包括可以用蓝光(400-500nm)裂解的香豆酸酰基保护基和可以用绿光(>500nm)裂解的由二吡咯亚甲基硼(BODIPY)衍生的保护基(例如参见“BODIPY-Derived Photoremovable Protecting Groups Unmasked with Green Light”)，P.P.Goswami等人，J.Am.Chem.Soc.137,3783(2015)。现在可用的保护基的宽光谱范围也允许从分子中选择性地裂解不同的保护基，参见“Wavelength-Selective Cleavage ofPhotoprotecting Groups:Strategies and Applications in Dynamic Systems”，M.J.Hansen等人，Chem.Soc.Rev.44，3358(2015)。
保护基的裂解可以用单色活化光进行。特别地，如果光不稳定保护基在化学上是相同的或者至少可以用相同波长的光裂解，则该方法可以仅用一个活化光源实施。该活化光源可以是连续光源或脉冲光源。在后一种情况下，特别是在使用超短脉冲激光作为活化光源的情况下，光活化也可以通过双光子或多光子吸收来启动。然而，可替代地，如果保护基不同并且具有不同的光谱吸收特性，则活化光也可以包括多个波长，特别是也包括来自多个光源的多个波长。
保护基的大的可变性允许可光活化的荧光染料的设计可以根据个别情况进行调整，其中，优化可以在荧光阻抑光或者刺激光的尽可能低的光活化方面进行优化，同时可以为活化光提供尽可能大的吸收横截面。在这方面，保护基在化学上和光谱吸收特性上彼此不同是有利的。在这种情况下，活化光也可以具有多个波长分量，使得可以将化学上不同的并且在不同光谱范围内吸收的保护基裂解。在此，可以同时或相继地辐射不同波长的活化光。
在所述变型方案中，多个保护基的裂解可以同时或在时间上并行地进行或者也可以相继地进行。两个光诱导的反应步骤的严格顺序系列也发生在该方法的另一有利的变型方案中，其中使用所谓的串联反应(该串联反应不一定导致保护基的裂解)。串联反应被理解为由依次进行的多个独立反应阶段(但不是机械步骤)组成的反应序列。虽然串联反应通常被理解为自发地一个接一个发生的反应，但在本文的上下文中，该术语也明确地包括这样的反应，其步骤单独地和相继地(特别是通过光的作用)启动。根据本发明，只有在串联反应的第二(或进一步)光诱导阶段之后才会生成荧光态。A.Paul等人在“o-Hydroxycinnamate for Sequential Photouncaging of Two Different FunctionalGroups and its Application in Releasing Cosmeceuticals”，Org.Biomol.Chem.33(2019)给出了这种串联反应的一个示例：
Figure BDA0004015216930000091
串联反应的各个阶段也可以是可逆的，使得如果不触发随后的反应阶段，则恢复光活化的的初始状态或中间状态。
4.在样品中形成激发光和荧光阻抑光的强度分布，其中荧光阻抑光的强度分布具有局部强度最小值。如在STED显微镜中常见的那样，在此优选地，激发光的强度分布以衍射受限聚焦的光斑的形式形成，其(中央)强度最大值在空间上与荧光阻抑光的强度最小值叠加。然而原则上，激发光的其他强度分布也是可以考虑的并且适用于实施该方法，例如激发光在样品中的均匀分布。
术语“荧光阻抑光”应理解为任何类型的光，其适合于在用激发光照射时阻止、降低或完全抑制活化的荧光染料分子的荧光。特别地，荧光阻抑光可以是从STED显微镜中已知的刺激光，其诱导电子激发的染料分子的受激发射，由此染料分子(返回)转变到电子基态并且阻止自发荧光发射。如从RESOLFT显微镜中已知的那样，荧光阻抑光也可以引发光诱导的化学反应，特别是异构化、循环化/循环逆转反应，所述化学反应伴随着荧光发射的调制。
激发光与荧光阻抑光的叠加导致用激发光照射的荧光染料分子可以发出荧光的区域变窄，并且因此导致有效PSF的尺寸减小。在此，根据通常的实践，分析能力Δ理解为两个相同的点对象之间的距离，对于该距离，两个点对象还能够被分离和成像为单独的对象。在扫描过程中获得的分析能力取决于荧光阻抑光的强度，并且如本领域技术人员从STED和RESOLFT显微镜中已知的那样，并有下式给出：
Figure BDA0004015216930000101
其中λ为荧光阻抑光的波长，n为形成所述荧光阻抑光的强度分布的光学材料的折射率，α为用于照射样品的光学组件的半张角，I为强度分布最大处的荧光阻抑光或者刺激光的强度，以及Is(λ)为染料特定的饱和强度。该饱和强度通常通过以下方式限定：用强度为I＝Is将由染料发射的荧光的光子数或强度降低2倍。
在此，强度分布的形成不应被理解为强度分布又被取消之后的完成步骤；相反，其应理解为，强度分布也在随后的扫描步骤期间保持形成。
5.利用荧光阻抑光的先前形成的、具有局部强度最小值的强度分布在一系列扫描位置处对所述样品或所述样品的片段进行扫描，其中，在每个扫描位置处探测荧光的强度或光子数并且与所述扫描位置相关联。在此，优选沿着规则的、特别是笛卡尔的或六边形的网格进行扫描；然而，这不是强制性的。特别地，也可以自适应地进行扫描，例如通过如下方式进行，即，沿着网格以相对大的步长对样品或样品的片段进行扫描，并且仅在其中探测到荧光发射的那些区域中以较小的、必要时匹配于结构的步长进行扫描。如果具有该结构的区域能够被预先识别(例如从样品的或样品的片段的荧光图像中识别)，那么也能够完全放弃在这些区域之外的扫描。
6.根据荧光的相互关联的光子数或强度以及扫描位置生成结构的高分辨率的网格图像(Rasterbild)，其中，将亮度值分配给栅格图像的每个图像像素。在最简单的情况下，一方面扫描位置和另一方面网格图像的图像像素之间存在直接的一对一关系，即，在扫描位置和网格图像的图像像素之间存在直接的一对一关系，即，将在对应的扫描位置处探测到的光子数或(数字化的)强度值作为亮度值直接分配给每个图像像素。然而，扫描位置的数量和图像像素的数量不必强制一致，将多个扫描位置的所探测的光子数或强度组合成一个像点与从相邻扫描位置的光子数或强度中插值图像像素一样是可能的。
为了提高网格图像的动态范围，为了突出弱荧光结构或为了使亮度值与显示设备的显示特性或人眼的感知特性相匹配，亮度值可选地可以是光子数或强度值的(单调)函数，例如以对数函数或伽马函数的形式。
在方法的一种优选的实施方式中，荧光阻抑光具体地具有环形的强度分布，环形的强度分布具有呈中心零点形式的局部强度最小值，而利用激发光形成典型地衍射受限的高斯形焦点，使得荧光阻抑光的最小值和激发光的最大值在空间上重合。用于形成这种环形强度分布的方法对于本领域技术人员从现有技术中已知，在此示例性地仅提及螺旋相位板(涡旋相位板)在荧光阻抑光的光束中的布置。在该实施方式中，激发光的强度分布和荧光阻抑光的强度分布基本上彼此互补，即，在激发光的高强度的位置处，荧光阻抑光的强度低，反之亦然。
在该实施方式的平行变型方案中，可替代地通过四个激发和荧光阻抑光束的成对干涉在形成每两个相互正交的驻波的情况下生成激发和荧光阻抑光的多个，必要时甚至非常多的相应的强度分布[参见"Nanoscopy with more 100，000'doughnuts"，A.Chmyrov等人在Nature Meth.10，737(2013)]。在此，激发光和荧光阻抑光的驻波彼此(相)偏移，从而在此也生成基本上互补的强度分布。
为了将激发光和荧光阻抑光的强度分布定位在扫描位置处，可以使用布置在光路中的射束偏转装置，射束偏转装置例如可以利用振镜实现。对于更高的扫描速度和特别是不规则布置的扫描位置，可替代地，电光或声光偏转器是合适的，电光或声光偏转器在没有运动部件的情况下工作并且允许光束的特别快速的偏转。
在此，荧光的探测可以根据激发光和荧光阻抑光的强度分布的类型借助于点探测器、探测器阵列或者相机。由于其灵敏度，在光子计数模式下运行的雪崩光电二极管或雪崩光电二极管阵列以及(混合)光电倍增管或积分探测器如CCD相机和sCMOS相机是特别合适的。在利用激发光进行点状照射和借助点探测器进行探测的情况下，为了抑制散射光和背景光，该点探测器优选布置在共焦针孔光阑后面。然而，在点状照射的情况下，也可以有利地利用探测器阵列来记录荧光。
如果需要，可以重复用激发光和荧光阻抑光照射样品并探测扫描位置处的荧光，例如以改进信噪比或记录时间序列。任选地，可以在重新扫描之前使另外的染料分子光活化，例如以替代在扫描期间褪色的染料。替代地，可能希望活化荧光染料的完全不同的子集。在这种情况下，(剩余的)荧光染料分子必须首先再次失活，这在最简单的情况下可以通过用强激发光褪色来实现。
本发明还涉及用于定位样品中荧光染料的单个分子的方法。该方法包括在包括两个反应步骤的活化反应中光活化荧光染料的单个分子，用激发光的强度分布和荧光阻抑光的强度分布扫描这些分子以及在每个扫描位置处探测荧光。在该扫描中，两个强度分布中的一个强度分布可以保持位置固定，两个强度分布中的至少一个强度分布顺序地定位在多个扫描位置处。从荧光强度和扫描位置计算出相对于先前的位置估计值的荧光分子的新的位置估计值。如果静止的荧光染料分子被定位，则新的位置估计值是改进的位置估计值，即那些以较低不确定性估计相关荧光染料分子的实际位置的位置估计值。如果观察到移动的荧光染料分子，则其可能是分别估计相关荧光染料分子的新的、改变的位置的值。该方法的步骤具体如下：
1.选择荧光染料，获得的该荧光染料最初以受保护的非荧光形式存在，并且通过用活化光照射该荧光染料使其能够从受保护的非荧光形式转变成活化的荧光形式，即可被光活化。根据本发明，选择荧光染料，使得光活化包括至少两个相应的光诱导的反应步骤。
该方法还包括第一组方法步骤：
2.通过用活化光照射样品，使荧光染料的彼此间隔开最小距离d的一个或更多个分子从受保护的非荧光形式光活化成活化的荧光形式。根据本发明，与根据本发明的第一种方法一样，光活化通过包括至少两个光诱导的反应步骤的活化反应进行，其中荧光团仅在最后的反应步骤之后形成，并且染料获得其荧光性质。对光活化过程的要求和设计与根据本发明的第一方法的说明书中所述的内容相同。
为了保证多个活化的染料分子之间的最小距离d，必须精确控制在用活化光照射时活化染料分子的空间密度。为此，活化光的照射参数(即，特别是照射持续时间和照射强度)可以通过试错一次性地确定，使得对于给定的样品和在给定的记录条件下确保存在空间上单独的染料分子的要求。如果在光活化过程中可以连续地观察样品，例如通过将样品暴露在激发光下，其中探测到荧光，那么光活化也可以在直接控制下执行，并且在达到分子密度的极限值时，停止用活化光照射。如果活化发生在局部狭窄的区域中，则在观察过程中如果荧光信号超过阈值(阈值也可以是0(零))，则活化可以停止。在数据记录的过程中，染料的总量由于光漂白而减少并且照射持续时间或强度必须增加，以便维持活化的染料分子的恒定密度或以便在局部受限的区域中活化染料分子，受控活化是特别有利的。可替代地或附加地，活化的染料分子之间的距离可以通过如下方式控制，即不是用活化光大面积地且均匀地照射样品，而是用例如呈网格上的照射点形式的照射模式来照射样品。
3.确定一个或更多个活化的染料分子的初始位置估计值，作为该方法的后续扫描和探测步骤的起始值。确定初始位置估计值，使得其不确定性至多为d/2，从而可以将该初始位置估计值明确地与彼此至少相隔距离为d的活化染料分子相关联。
初始位置估计值原则上可以以不同的方式来测定。特别地，可以通过定位活化的染料分子从样品或样品片段的荧光图像来确定位置估计值。用用相机或借助共焦激光扫描记录的荧光图像特别适合于此。在该方法的更具体的变型方案中，初始位置估计值也可以借助STED显微镜来确定，这必要时能够实现活化的染料分子的更高的空间密度。
借助共焦显微镜或STED显微镜确定初始位置估计值也可以改变，即不是扫描整个图像场以便(随后)在这些图像中识别和定位各个染料分子，而是扫描样品，直到探测到单个活化的染料分子，并且其位置可以从相应的扫描位置近似确定。然后，随后的扫描和探测步骤可以分别紧接着探测染料分子，因此这些方法步骤不一定要严格分开地执行，而是也可以交替地进行。同样地，光活化也可以与扫描结合起来。为此，可以用活化光和激发光(同时或作为快速序列)逐点和逐行地扫描样品，直到探测到单个活化的染料分子。扫描和探测步骤可以再次紧接着探测染料分子。
特别地，如果活化在局部狭窄的区域中借助衍射受限聚焦的活化光束进行，则初始位置估计值也可以直接从活化光束的已知焦点的位置确定；然后将该位置用作初始位置估计值。
4.在样品中形成激发光的强度分布和荧光阻抑光的强度分布。激发光根据其波长适于激发活化的荧光染料以发射荧光，而术语“荧光阻抑光”又应理解为适于在用激发光照射时阻止、减少或完全抑制活化的荧光染料分子的荧光的任何类型的光。具体地，荧光阻抑光可以是刺激光，其诱导电子激发染料分子的受激发射，从而使染料分子(返回)转变到电子基态并防止它们自发荧光发射。通常，两个强度分布(至少激发光的强度分布)也在随后的扫描步骤期间保持形成。
根据本发明，至少荧光阻抑光具有带有局部强度最小值的强度分布，并且防止或抑制在该局部强度最小值之外的区域中的荧光的发射。在此，重点不是像STED显微镜那样，在提高分辨率的意义上减小有效PSF的体积，而是抑制来自焦点边缘区域或样品的其他平面的染料分子的不期望的荧光。由此，荧光的探测可以被限制在位于局部强度最小值附近的荧光染料分子上，并且可以抑制来自其它荧光染料分子(特别是来自焦点边缘区域或样品的其它平面的)不期望的贡献。因此，与在STED显微镜中不同的是，鉴于随后的扫描和定位步骤的特定实施方式，甚至可以明确地期望，将强度最小值设计得尽可能宽，并且使强度最小值附近的强度增加尽可能平坦，以便在强度最小值移位时仅略微影响位于强度最小值附近的荧光染料分子的荧光发射。例如，可以通过用高阶涡旋相位板对荧光阻抑光束进行相位调制来生成这种具有宽零点的强度分布，该涡旋相位板的相位延迟不随着旋转角度从0变到2π(如STED显微镜中常见的那样)，而是从0变到4π或2π的更高倍数。然而，尽管有上述情况，在该方法的各个实施方式中，在STED显微镜的意义上通过荧光阻抑光提高分辨率也可以是有利的和期望的。
根据该方法的相应的实施方式，激发光的强度分布可以以不同的方式形成，但是特别地，激发光的强度分布也可以具有局部强度最小值。该方法的优选实施方式包括点状聚焦的激发光与荧光阻抑光的环形强度分布的结合，以及激发光和荧光阻抑光的两个环形强度分布的结合。
该方法最后包括第二组方法步骤：
5.用之前形成的、具有强度最小值的强度分布之一在一系列扫描位置处对样品或样品的片段进行扫描，其中，在每个扫描位置处探测光子数或荧光的强度并且将其分配给扫描位置。由光子数或荧光强度和扫描位置形成的这些值对形成用于随后的定位步骤的数据基础。选择扫描位置，使得每个待定位染料分子的位置估计值周围至少有两个距离小于d/2的扫描位置。在此，以强度分布进行扫描，所述强度分布具有局部的强度最小值--理想地是强度零点。这可以是激发光或荧光阻抑光的强度分布。在任何情况下，在每个扫描步骤中用激发光加载样品或样品的片段。如果用荧光阻抑光进行扫描，则激发光的强度分布可以是位置固定的。如果荧光阻抑光是刺激光，则在每个扫描步骤中以荧光阻抑光，即刺激光加载样品或样品的片段。如果荧光阻抑光是将荧光团切换到(间)稳定的非荧光状态的切换光，则在扫描开始时用荧光阻抑光加载样品一次就足够了。就此而言，方法步骤的第二组的第一步骤不与第一组的最后步骤严格分开。尤其在使用形成强度最小值的光的高强度的情况下，从强度最小值出发生成陡急的强度梯度，使得位于强度最小值附近的染料分子的荧光发射已经在扫描位置的小的移位的情况下强烈地改变。在这个过程中，荧光发射可以随着染料分子与强度最小值的距离的增加而增加(当用激发光进行扫描时)或减小(当用荧光阻抑光进行扫描时)。荧光发射对扫描位置的强依赖性，无论其方向如何，为改进定位步骤中的位置估计奠定了基础。
在一个优选的实施方式中，激发光和荧光阻抑光都具有具有空间上叠加的强度最小值的强度分布，例如呈环形(环圈形)强度分布的形式。在该实施方式中，进一步优选地利用激发光的强度分布进行扫描，而荧光阻抑光的强度分布的位置在扫描期间在分别与活化的荧光染料分子相关联的扫描位置处是位置固定的，并且因此对荧光信号在不同的扫描位置处的变化没有影响。然而，荧光阻抑光的强度分布也可以在扫描时在从一种染料分子到另一种染料分子的过渡中一起移位。特别地，强度分布适合于荧光阻抑光，强度分布在染料分子的扫描范围内仅具有小的强度变化并且例如可以利用高阶涡旋相位板生成(参见上文)。在该实施方式中，荧光阻抑光的目的仅在于抑制在强度最小值之外的染料分子的对所探测的荧光的贡献，并且因此能够实现所扫描的分子的定位，或者通过消除干扰使定位更加精确。原则上，利用两个强度分布的扫描也是可能的，但是在这种情况下要考虑的是，染料分子的荧光在扫描时受到两个强度分布的影响。特别地，当利用刺激光进行荧光激发、荧光抑制和利用时间门进行荧光探测时，特别是当荧光探测被限制在非常短的时间窗口内时，例如限制在从观察体积发射的荧光在激发脉冲的时间上最大值时在探测器上生成信号的时间点之后的荧光寿命的一半以下、优选四分之一以下、进一步优选十分之一以下时，可以得到优点。
在另一优选的实施方式中，使用由STED显微镜已知的激发光的高斯形聚焦光斑与荧光阻抑光的环形(环圈形)强度分布的组合。在此，现在仅荧光阻抑光具有具有强度最小值的强度分布，并且相应地利用荧光阻抑光进行扫描，而激发光的强度分布的位置在扫描期间在各自与活化的荧光染料分子相关联的扫描位置处优选是位置固定的，并且因此对荧光信号在不同的扫描位置处的变化没有影响。激发光的强度分布在扫描过程中仅在从一个染料分子到另一个染料分子的转变过程中或在跟踪样品中染料分子的运动过程中被带入。
每个待定位的染料分子的两个扫描位置的最小数量允许染料分子在一个维度上的高精度定位。相反，如果需要二维定位，则扫描位置的最小数量增加到每个染料分子三个。在这种情况下，扫描位置的布置是有利的，其中染料分子位于由三个扫描位置展开的三角形内；然而，这并不是严格必要的。对于三维定位，每个染料分子的最小数量增加到四个扫描位置。在此，扫描位置的布置也是有利的(但不是强制性的)，其中染料分子位于由四个扫描位置跨越的四面体内。在实践中，超过这些最小数量的扫描位置的数量的增加可能是有意义的，以便进一步改进定位精度。尤其可以有利的是，使用在相应执行第二组之前确定的位置估计值作为扫描位置。由此实现的是，从记录的荧光信号中明确地获得位置估计值，即，所测量的荧光信号不能是有歧义的。
6.在最后的定位步骤中，由相互关联的光子数或强度和扫描位置确定活化的染料分子的改进的位置估计值。在最简单的情况下，这是通过形成用光子数或者荧光强度加权的扫描位置的位置矢量和。其他常见的、更精确的方法使用例如最大似然估计器(MaximumLikelihood Estimators，MLE)和由用于MINFLUX纳米学的现有技术已知。
根据本发明，选择d值，使得初始位置估计值可以明确地与活化的荧光染料分子相关联，并且在每个扫描位置处，所探测的荧光仅分别来自唯一的荧光染料的活化分子。一方面，这意味着活化的染料分子之间的最小距离不得低于用于确定初始位置估计值的方法的光学分析能力，即由于光学衍射的限制，通常预先规定d≥250nm。仅在利用已经分辨率更高的方法(例如通过STED显微镜)确定初始位置估计值的情况下，选择d的值，必要时也可以选择更小的值。然而在此也应考虑的是，活化的染料分子之间的最小距离也被限制到小的值，即，在利用具有强度最小值的光分布对样品或样品的片段进行扫描时，分别仅允许荧光染料的唯一的活化的分子对所探测的荧光信号做出贡献。因此，只有在该方法的特殊变型中(例如，在利用激发光的高斯聚焦光斑和荧光阻抑光的环形(环圈形)强度分布的组合进行扫描时)才有可能获得将d值降低到250nm以下。
在实施根据本发明的方法时，一系列扫描位置不一定必须在扫描开始之前完全确定，而是也可以相继地补充。以特别有利的方式，在考虑之前的一个或更多个确定步骤的情况下，可以继续进行与染料分子相关联的扫描位置的顺序。因为位置估计中的不确定性通过定位步骤显著减小，所以扫描位置随后可以非常密集地围绕待定位的染料分子布置。在这些新确定的扫描点处的扫描连同用于进行扫描的光的强度的(进一步)提高导致在下一确定步骤中的位置估计的改进。重复应用这些步骤允许染料分子的定位到几纳米范围内。
在根据本发明的方法的一个改进方案中，多次进行单个活化染料分子的位置估计值的确定，例如以固定的间隔进行。如果执行所述方法以跟踪样品中的染料分子的运动，则根据前述确定步骤的位置估计值确定用于确定步骤的扫描位置，如在定位未运动的染料分子的情况下也可以是这种情况。在跟踪分子时，有利地使扫描位置的距离与染料分子的运动的速度和类型相匹配，特别是只要它们从前面的确定步骤中已知。如果运动是快速和随机的，则选择大的扫描位置距离，以便分子在每种情况下都可靠地位于由扫描位置确定的范围内，在该范围内可以估计分子的位置。相反，如果运动例如缓慢且定向，则扫描点的距离较小，但同样选择使分子分别可靠地位于通过扫描位置确定的区域内，在该区域中可以估计分子的位置。在这两种情况下，扫描位置的集合的中心被移动到在下一序列扫描步骤期间预期分子的位置。在随机移动的情况下，这是与最后确定的位置估计值相对应的位置。根据连续确定的位置估计值，可以重建、可视化和必要时进一步分析染料分子的轨迹。当使用染料作为生物分子(例如蛋白质或脂质)的标记物时，这种轨迹适合于研究标记的生物分子参与的动态细胞过程。除了高空间分辨率之外，本发明的方法还允许比现有技术中已知的方法更快地确定单个分子的位置，并且因此扩展了单个分子跟踪对快速动态过程的适用性。
跟踪单个染料分子的整个过程可以针对更多的染料分子重复。这样的重复可以从活化开始。如果在追踪一个分子之后，其他分子处于活化状态，那么只重复第二组方法步骤(现在是在另一个染料分子处)就足够了。最后，也可以从轨迹的集合中重建样品中的结构的高分辨率的图像。例如，可以局部分辨地确定扩散常数的值。然后，这些值的空间分布可以映射一个结构。
在根据本发明的方法的另一改进方案中，定位用于重建样品中的用荧光染料标记的结构的高分辨率的图像，例如以二维直方图的形式。这种类型的图像重建从STORM显微镜和PALM显微镜中已知。然而，为了能够生成高分辨率的、在空间上尽可能连续的结构成像，必须确定足够数量(通常是几千个)的荧光染料分子的位置。为此，多次使用从光活化到活化的染料分子的定位的方法步骤，以便定位荧光染料的期望的高数量的分子。在这种情况下，活性染料分子必须在重复序列之间转变成非荧光状态。在最简单的情况下，这可以通过用强激发光不可逆地漂白活性分子来实现。如果光活化是可逆的，则活化的分子也可以利用合适波的光恢复到非荧光状态。
最后，本发明涉及用于定位样品中荧光染料的单个分子的另一方法，其中该方法结合了根据本发明的前两种方法的特征。该方法的步骤具体如下：
1.选择荧光染料，获得的该荧光染料最初以受保护的非荧光形式存在，并且通过用活化光照射该荧光染料使其能够从受保护的非荧光形式转变成活化的荧光形式，即可被光活化。根据本发明，选择荧光染料，使得光活化包括至少两个相应的光诱导的反应步骤。
该方法还包括一组方法步骤：
2.通过用活化光照射样品，使荧光染料的彼此间隔开最小距离d的一个或更多个分子从受保护的非荧光形式光活化成活化的荧光形式，其中光活化通过包括至少两个光诱导的反应步骤的活化反应进行。
3.在样品中形成激发光的强度分布和荧光阻抑光的强度分布，其中荧光阻抑光的强度分布具有局部强度最小值。通常，两个强度分布(至少激发光的强度分布)在随后的扫描步骤期间也保持形成。
4.用荧光阻抑光的具有局部强度最小值的强度分布在一系列扫描位置处扫描样品或样品的片段，扫描位置彼此间隔开的距离不大于d/2，其中在每个扫描位置处，探测荧光的强度或光子数并且使荧光的强度或光子数与扫描位置相关联。在此，优选沿着规则的，特别是笛卡尔的或六边形的网格进行扫描；然而，这不是强制性的。特别地，也可以自适应地进行扫描，例如通过如下方式进行，即沿着网格以相对大的步长扫描样品或样品的片段，并且仅在其中探测到荧光发射的那些区域中以较小的、必要时匹配于结构的步长进行扫描。如果具有该结构的区域可以被预先识别(例如，从样品的或样品片段的荧光图像中识别)，那么也可以完全省去对这些区域之外的扫描。
5.根据荧光的相关联的光子数或强度以及扫描位置定位活化的染料分子，该定位在至少一个空间方向上的不确定性至多为d/10，
根据本发明，选择d的值，使得在每个扫描位置处所探测的荧光仅分别来自荧光染料的单个活化的分子。
本发明的进一步有利的改进方案从权利要求、说明书以及附图中可以获悉。说明书中所描述的本发明的特征和多个特征组合的优点仅为示例性的并且可以可替代地或累积地实施，而不一定要通过根据本发明的实施方式实现这些优点。在不改变所附权利要求的主题的情况下，以下内容适用于原始申请文件和专利的公开内容：从附图中可以找到进一步的特征。本发明不同实施方式的特征组合或不同权利要求的特征组合也有可能偏离权利要求选择的参考关系并特此提出。这也适用于那些在单独的图中示出或在其描述中提到的特征。这些特征也可以与不同的权利要求的特征组合起来。同样，权利要求中列出的本发明其它实施方式的特征也可以省略。
在权利要求和说明书中使用的特征的不定冠词“一”应理解为，就数量而言可以是该特征的恰好一个或更多个实例，而不需要明确使用副词“至少”。在权利要求中列出的特征必要时可以通过另外的特征来补充，或者也可以是各自方法所具有的唯一特征。
附图简述
图1以流程图的形式示出了根据本发明的方法的一部分。
图2示出了根据本发明的方法中的光活化步骤和扫描步骤。
图3示出了应用于根据本发明的方法中的荧光染料。
图4图示了方法的一实施方式，其中扫描位置沿着网格并且直接生成图像。
图5图示了方法的一实施方式，其中对单个荧光染料分子进行定位以生成图像。
图6示出了根据本发明的方法的各种实施方式的表格概览。
附图描述
在图1中，以流程图的形式示出了根据本发明的方法的一部分。首先，在光活化步骤S1中，通过用活化光照射使荧光染料(利用该荧光染料对样品中的结构进行染色)的一部分从受保护的、最初非荧光形式转变成活化的荧光形式。根据本发明，该光活化通过至少两个光诱导的反应步骤进行。在随后的扫描和探测步骤S2中，将激发荧光染料发出荧光的激发光和阻止、减少或完全抑制由荧光染料发出荧光的荧光阻抑光定位在样品中的一系列扫描位置处(定位子步骤S2.1)。在样品被照射的每个扫描位置处，探测荧光的光子数或强度(扫描和探测子步骤S2.2)。所探测的荧光的光子数或强度与相应的扫描位置一起存储在数据存储器1中，用于随后的处理。可选地，可以在所有或选定的扫描位置处重复扫描。同样可选地，重复所有方法步骤(即，光活化步骤S1以及扫描和探测步骤S2)，以便活化和扫描用于标记样品的荧光染料的另一部分或其他部分。
在图1中示出的实施方式中，最后从在扫描位置处探测到的荧光的光子数或强度生成高分辨率的图像2。图像2例如是网格图像，其图像像素再现了在每个扫描位置处探测到的荧光信号，因此代表用染料标记的结构的空间表示。如果将光活化控制成使得荧光染料的各个在空间上彼此分离的分子被活化，则现在与各个分子相关联的荧光的光子数或强度可替代地在(未示出的)中间步骤中用于定位荧光染料的这些分子，并且可以从定位的染料分子的位置重建图像2。
图2示出了包含结构4的样品的片段3。结构4用荧光染料5标记，该荧光染料5首先以受保护的非荧光形式6存在。在开始的光活化步骤S1中，用活化光7照射样品的片段3，该活化光使荧光染料5的一小部分转变成活化的荧光形式8。光活化9在两步反应10中进行，在此，通过以裂解12两个光不稳定保护基13和14形式的反应步骤11进行，由此形成活化的荧光染料5、8。在光活化9之后，用激发光16(在此是具有局部最大值的强度分布15形式的激发光)和荧光阻抑光18的具有局部最小值的强度分布17在一系列扫描位置19处对样品的片段3进行扫描，其中，在此示例性地仅示出前两个扫描位置。由于根据本发明将光活化9设计成两步反应10的形式，处于受保护形式6的荧光染料5对于激发光16和荧光阻抑光18是惰性的，因此在用激发光16和荧光阻抑光18进行扫描和探测步骤S2期间，受保护的非荧光形式6的荧光染料5被照射时不会被活化。
图3示出了从现有技术中已知的笼状Q-罗丹明(Caged Q-Rhodamin)衍生出来的荧光染料5，该荧光染料5具有所谓的Carbopyronin主链和在根据本发明的方法中使用的两个光不稳定保护基13和14。通过连接基L，可以使荧光染料结合到样品中的结构。保护基13、14阻止在分子24中的两个不同位置处形成荧光的Carbopyronin荧光团：当邻硝基藜芦氧基羰基基团(NVOC)13阻断了氨基中的一个，叠氮基(Az)14固定了分子24的(非荧光)螺旋形。因此，荧光染料5以受保护的非荧光形式6存在，直至两个保护基13、14被裂解。可以用波长在320nm至360nm范围内的UV光来裂解保护基，其中在反应步骤11中，NVOC基团14在脱羧作用(CO2的裂解12)下分解，而叠氮保护基14在进一步的反应步骤11中在氮分子N2的裂解12以及下游的沃尔夫重排作用下被去除，由此形成活化的荧光染料5、8。
图4示出了根据本发明的方法之一的优选实施方式，其中扫描位置19布置在规则的(这里是笛卡尔的)网格21的网格点20上。如在激光扫描显微镜中常见的那样，在扫描和探测步骤S2中用激发光和荧光阻抑光逐行地扫描样品，并且将在每个扫描位置19处探测到的荧光的光子数或强度作为亮度值23分配给图像2中对应于相应扫描位置19的图像像素22。在该实施方式中，扫描和探测步骤S2以及图像生成步骤S3不必在时间上分开；相反，在扫描样品期间已经生成图像2并且在显示设备上显示出来是有利的。
未活化的荧光染料5、6对于激发光和荧光阻抑光表现为惰性的，并且因此在扫描样品期间既不会发生光活化也不会褪色。通过重复地实施光活化步骤S1、扫描和探测步骤S2以及图像生成步骤S3，根据本发明的方法也能够实现对结构4的多次图像记录，即使经光活化的荧光染料5、8在用激发光和荧光阻抑光扫描期间褪色，因此利用传统的图像记录方法不可能重复记录图像。在重复中获得的图像可以被单独存储，例如为了测量样品随时间的变化，这些图像可以以累积的方式彼此组合，以便使用更大量的现有荧光团或基本上所有荧光团来对样品中的结构进行成像，并从而生成结构的最佳连续成像。也可以从连续记录的各个图像中确定结构彼此间的相对位移或漂移，对这些位移或漂移进行补偿，并且随后以累积方式确定结构的成像。此外，如果已经在样品中或在样品的部分区域中获得了质量足够好的结构图像，则可以完全结束该方法或者仅在图像质量还不令人满意的区域中继续该方法。
图5示出了根据本发明的方法的另一优选实施方式，其中荧光染料5的仅单个的、在空间上彼此分离的分子24从受保护的非荧光形式6转变成活化的荧光形式8。如此控制(在此未示出的)光活化步骤，使得荧光染料5的经活化的分子8、24彼此具有距离25，该距离不小于最小距离d。在此，根据用于预先定位活化的荧光染料分子5、8、24的方法的分辨率(见下文)或可替代地根据仅基于对活化位置的了解就知道活化的荧光染料分子的位置的程度和在用激发光16和荧光阻抑光18扫描时达到的分辨率来测量该最小距离d，并且该最小距离不得选择小于相关的两个值中的任何一个。
与图3中所示的方法变型不同，在扫描和探测步骤S2中获得的荧光的光子数或强度在这里不用于在所探测的亮度值的直接空间表示的意义上直接生成图像2，而是首先用于在定位子步骤S3.1中精确地定位荧光染料5的各个光活化的分子8、24。为此目的，扫描位置19不是全局性地被布置在规则的网格上，而是在每个光活化的荧光染料分子5、8、24周围，最初至少三个扫描位置19为一组来布置。为此，所需的光活化的荧光染料分子5、8、24的位置估计26可以从活化本身已知，或者通过技术人员已知的荧光显微镜方法获得，这里不详细说明。在最简单的情况下，这例如可以通过记录落射荧光图像来实现，可替代地，也可以用激发光16扫描样品，以便在样品中找到单个被活化的染料分子5、8、24，并且进行初步的位置估计26。
在随后的扫描和探测步骤S2中，从每个分子24各自的至少三个扫描位置19开始，用激发光和荧光阻抑光的强度分布照射活化的染料分子5、8、24，并且在每个扫描位置19处探测荧光的光子数或强度。从在至少三个扫描位置19的每个处探测到的荧光，现在根据三角测量的方式计算活化的染料分子5、8、24相对于初始位置估计26改进的位置估计值。为了清楚起见，没有示出在初始位置估计26的位置处的扫描位置。这样的扫描位置可以用于可靠地避免在改进的活化的染料分子5、8、24的位置估计中的模糊性。基于该改进的位置估计，现在可以为每个活化的染料分子5、8、24确定另外的扫描位置19，并且以在荧光阻抑光的最大强度增加的情况下继续扫描。由于扫描位置19越来越接近活化的染料分子5、8、23的实际位置，因此扫描位置近似地位于螺旋路径28上。在每个活化的染料分子5、8、24的预定数量的扫描点18之后或在低于位置估计的最大可接受误差时，结束扫描和探测步骤S2。
为了在图像生成步骤S3的范围内生成图像2，首先在定位子步骤S3.1中，从彼此相关联的荧光的光子数或强度以及扫描位置19测定活化的染料分子5、8、24的最终坐标29。然后，在显示子步骤S3.2中，例如以具有合适的网格宽度的二维直方图的形式显示所定位的分子24的坐标29。为了以这种方式获得样品中的结构的高分辨率图像，要重复(未示出)方法步骤(包括光活化)，直到直方图包括如此多定位的染料分子5、24的坐标28，使得用染料5标记的结构4在整个过程中由定位的染料分子5、24表示。
在图6中，根据本发明的方法的六个不同的实施方式A至F以表格形式列出。该列表是示例性的，并不代表根据本发明的方法的所有实施方式的最终列表。
所示的实施方式的共同之处在于，荧光染料最初以受保护的非荧光形式存在，并且荧光染料的一部分通过在包括至少两个光诱导的反应步骤的反应中用活化光照射而转变成活化的荧光形式。在该表格中，区别所示实施方式的特征以符号表示。在表格的第二列中指出，在相应的实施方式中，是提供单个分子24的光活化9还是分子集合体30(即，在以探测体积内的多个分子)的光活化9。在表格的第三列中指出扫描方案36，该扫描方案指出：在相应的实施方式中，是进行规则的扫描31，特别是沿着规则的网格21进行扫描，还是进行自适应的扫描32，在该自适应的扫描中，在考虑在先前的扫描步骤中探测到的荧光信号的情况下确定扫描位置。在第四列中，象征性地示出了激发光16的强度分布，其中，在具有中心强度最大值的强度分布15、均匀的强度分布33和具有中心强度最小值的强度分布17之间进行区分。在第五列中示出，是否用激发光16的强度分布进行扫描35，或者激发光16的强度分布是否占据固定的位置34。第六列和第七列显示了荧光阻抑光18的相应的特征。
在行A中示出的特别优选的实施方式对应于从STED显微镜已知的聚焦的激发光16与荧光阻抑光18或者激发光的环形强度分布17的组合。两个强度分布共同地并且同步地沿着规则的、通常是笛卡尔网格在样品或样品的片段上方扫描。为了生成网格图像，将在每个扫描点处探测到的荧光作为亮度值分配给对应的图像像素。在行B中示出的变型与实施方式A的不同之处在于，激发光16以在扫描区域中均匀的强度分布33的形式辐射。仅用荧光阻抑光18的具有强度最小值的强度分布17进行扫描35。由于用激发光16照射整个样品(或至少样品的感兴趣片段)，在实施方式B中来自当前扫描位置之外区域的荧光的贡献的增加，这是该实施方式不太优选的原因。在实施方式C至F中，以单独的、在空间上彼此分离的分子24的形式进行光活化9，使得在扫描样品或样品的片段时，每次只探测到一个活化的染料分子的荧光。在特别优选的实施方式C中，将激发光和荧光阻抑光的两个分别具有强度最小值的强度分布17叠加，其中，至少用激发光16扫描样品或样品的片段。在每次扫描活化的染料分子24时，如果荧光阻抑光18保持在固定的位置34处，则荧光阻抑光18主要完全地仅用于抑制来自强度最小值之外区域的荧光贡献；为此目的，具有尽可能宽的强度最小值的强度分布是特别有利的。根据在扫描位置处探测到的荧光信号，可以改进先前确定的活化的染料分子的位置估计，即可以更精确地定位活化的染料分子。在此优选地，扫描自适应地进行，即在考虑在先前的扫描位置处探测到的荧光信号的情况下确定扫描点，其中同时提高激发光16的总强度。通过这种方式，染料分子的定位可以在几纳米的不确定性下定位染料分子。在实施方式C中，可选地，也可以共同地进行激发光16和荧光阻抑光18的扫描；在这种情况下，激发光和荧光阻抑光的扫描位置处的荧光发射被调制，这会使对改进的位置估计值的计算变得困难。实施变型D和E与实施变型C的不同之处在于，荧光阻抑光18在此不仅用于抑制来自强度最小值之外区域的荧光贡献，而且荧光阻抑光18主要用于在扫描位置处扫描样品或样品的片段，并且对被扫描的染料分子24的荧光发射进行调制，以计算改进的位置估计值。在这些实施方式中，激发光可以均匀分布或是结构化的，例如以高斯形焦点的形式，并且可以是位置固定的或在扫描时与荧光阻抑光18一起移动。
最后，实施方式F一方面结合了实施方式A的特征，另一方面结合了实施方式C至E的特征。同样，活化单个的、空间上分离的染料分子，但对这些单个分子的扫描35与实施方式A一样，即用激发光16(具有强度最大值)和荧光预抑光18(具有强度最小值)的叠加强度分布进行扫描，其中，扫描35是沿规则的网格21进行的。由于分离的染料分子24的光活化9，可以从在沿着网格21的扫描位置处探测到的荧光的光子数或强度来进行单个分子24的位置估计，其不确定性远远低于扫描位置的距离。
参考标记列表
S1 光活化步骤
S1.1 预定位子步骤
S2 扫描和探测步骤
S2.1 定位子步骤
S2.2 照射和探测子步骤
S3 图像生成步骤
S3.1 定位子步骤
S3.2 显示子步骤
1 数据存储器
2 图片
3 片段
4 结构
5 荧光染料
6 受保护的非荧光形式
7 活化光
8 活化的荧光形式
9 光活化
10 两步反应
11 反应步骤
12 裂解
13 光不稳定保护基
14 光不稳定保护基
15 具有局部最大值的强度分布
16 激发光
17 具有局部最小值的强度分布
18 荧光阻抑光
19 扫描位置
20 网格点
21 网格
22 图像像素
23 亮度值
24 (单个)分子
25 距离
26 位置估计值
28 螺旋路径
29 坐标
30 分子集合体
31 规则的扫描
32 自适应扫描
33 均匀的强度分布
34 固定的位置
35 扫描
36 扫描方案。

Claims (34)

1.一种用于定位样品中荧光染料(5)的单个分子(24)的方法，包括以下方法步骤：
选择荧光染料(5)，通过用活化光(7)照射所述荧光染料(5)使所述荧光染料(5)能够从受保护的非荧光形式(6)转变成活化的荧光形式(8)，
第一组方法步骤包括以下步骤：
通过用活化光(7)照射，使所述荧光染料(5)的彼此间隔开最小距离d的一个或更多个分子(24)从所述受保护的非荧光形式(6)光活化成所述活化形式(8)，
确定一个或更多个活化的染料分子(5、8、24)的初始位置估计值(26)，所述初始位置估计值的不确定性不大于d/2，
在所述样品中形成激发光(16)的强度分布和荧光阻抑光(18)的强度分布，其中至少所述荧光阻抑光(18)的强度分布具有局部强度最小值，其中所述激发光(16)的强度分布也能够具有强度最小值；
以及第二组方法步骤包括以下步骤：
用具有强度最小值的强度分布(17)之一在一系列的扫描位置(19)处扫描所述样品或所述样品的片段(3)，所述一系列包含分别具有至少两个扫描位置(19)的子集，所述至少两个扫描位置在与所述子集相关联的活化的染料分子(5、8、24)的所述位置估计值(26)周围以小于d/2的距离(25)布置，
在所述一系列的每个扫描位置(19)处，探测荧光的光子数或强度，并且将所述光子数或所述强度与相应的扫描位置(19)相关联，
从所述荧光的相关联的光子数或强度以及所述扫描位置(19)确定与子集相关联的所述活化的染料分子(5、8、24)中每一个的新的位置估计值(26)，
其中，d的值是使得所述初始位置估计值(26)能够明确地与所述活化的荧光染料分子(5、8、24)相关联，并且在每个扫描位置(19)处所探测的荧光在每种情况下仅分别来自所述荧光染料(5)的单个活化的分子(8、24)，
其特征在于，
选择所述荧光染料(5)，使得所述光活化包括至少两个相应的光诱导的反应步骤(11)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，d≥250nm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述激发光(16)的强度分布具有局部强度最小值，并且用所述激发光(16)的强度分布(17)扫描所述样品或所述样品的片段(3)。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述激发光(16)的强度分布(15)具有局部强度最大值，其中所述荧光阻抑光(18)的强度分布和所述激发光(16)的强度分布基本上彼此互补。
5.根据权利要求1至4中的一项所述的方法，其特征在于，用两种强度分布进行所述扫描。
6.根据权利要求1至5中的一项所述的方法，其特征在于，所述一系列的扫描位置中的扫描位置(19)被布置在圆形路径、螺旋路径(28)或球壳上。
7.根据权利要求1至6中的一项所述的方法，其特征在于，重复地执行所述第二组方法步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述重复之间所述激发光(16)和/或所述荧光阻抑光(18)的具有局部强度最小值的强度分布(17)的总强度增加，并且所述子集的扫描位置(19)朝向相关联的活化的荧光分子(5、8、24)的相应的当前的位置估计值(26)移动。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，最后确定的位置估计值(26)在至少一个空间方向上的不确定性至多为d/10，并且优选地至多为d/30。
10.根据权利要求1至9中的一项所述的方法，其特征在于，跟踪所述荧光染料(5)的单个分子(24)在样品中的运动。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在两次重复之间所述激发光(16)和/或所述荧光阻抑光(18)的具有局部强度最小值的强度分布(17)的总强度减小，并且所述子集的扫描位置(19)朝向通过时间外推法确定的相关联的活化的荧光分子(5、8、24)的位置估计值(26)移动。
12.根据权利要求1至9中的一项所述的方法，其特征在于，整体上重复执行所述第一组方法步骤和所述第二组方法步骤，其中在所述重复之间使相应的活化的染料分子(5、8、24)转变成非荧光状态。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，从所述荧光染料(5)的单个分子(24)的定位，重建所述样品中结构(4)的空间上高分辨率图像。
14.一种用于定位样品中荧光染料(5)的单个分子(24)的方法，包括以下方法步骤：
选择荧光染料(5)，通过用活化光(7)照射所述荧光染料(5)使所述荧光染料(5)能够从受保护的非荧光形式(6)转变成活化的荧光形式(8)，
以及一组方法步骤，包括以下步骤：
通过用活化光(7)照射，使所述荧光染料(5)的彼此间隔开最小距离d的一个或更多个分子(24)从所述受保护的非荧光形式(6)光活化成所述活化形式(8)，
在所述样品中形成激发光(16)的强度分布和荧光阻抑光(18)的强度分布，其中所述荧光阻抑光(18)的强度分布(17)具有局部强度最小值，
用所述荧光阻抑光(18)的具有强度最小值的强度分布(17)在一系列扫描位置(19)处扫描所述样品或所述样品的片段(3)，所述扫描位置彼此间隔开的距离不大于d/2；
在所述一系列的每个扫描位置(19)处，探测荧光的光子数或强度，并且将所述光子数或所述强度与相应的扫描位置(19)相关联，
根据所述荧光的相关联的光子数或强度以及所述扫描位置(19)定位活化的染料分子(5、8、24)，该定位在至少一个空间方向上的不确定性至多为d/10。
其中，d的值是使得在每个扫描位置(19)处所探测的荧光仅来自所述荧光染料(5)的单个活化的分子(8、24)，
其特征在于，
选择所述荧光染料(5)，使得所述光活化包括至少两个相应的光诱导的反应步骤(11)。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于，d≥250nm。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述激发光(16)的强度分布(15)具有局部强度最大值，其中所述荧光阻抑光(18)的强度分布和所述激发光(16)的强度分布基本上彼此互补。
17.根据权利要求14至16中的一项所述的方法，其特征在于，将所述扫描位置(19)布置在规则网格(21)上。
18.根据权利要求14至17中的一项所述的方法，其特征在于，重复执行所述一组方法步骤，其中在所述重复之间使相应的活化的染料分子(5、8、24)转变成非荧光状态。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，从通过定位确定的所述活化的染料分子(5、8、24)的位置，重建所述样品中结构(4)的空间上高分辨率图像。
20.一种用于生成样品中结构(4)的空间上高分辨率图像的方法，包括以下方法步骤：
选择荧光染料(5)，通过用活化光(7)照射所述荧光染料(5)使所述荧光染料(5)能够从受保护的非荧光形式(6)转变成活化的荧光形式(8)，
用所述荧光染料(5)标记所述结构(4)，
以及一次性或重复执行的以下方法步骤：
通过用活化光(7)照射，使所述荧光染料(5)的子集从所述受保护的非荧光形式(6)光活化成所述活化形式(8)，
在所述样品中形成激发光(16)的强度分布和荧光阻抑光(18)的强度分布(17)，其中所述荧光阻抑光(18)的强度分布具有局部强度最小值，
用所述荧光阻抑光(18)的具有强度最小值的强度分布(17)在一系列扫描位置(19)处扫描所述样品或所述样品的片段(3)，
在每个扫描位置(19)处探测荧光的光子数或强度，并且将所述光子数或所述强度与相应的扫描位置(19)相关联，
通过将亮度值(23)与网格图像的每个图像像素(22)相关联，从所述荧光的相关联的光子数或强度以及所述扫描位置(19)生成所述结构(4)的高分辨率网格图像，所述亮度值是在相应的扫描位置(19)处或相应的扫描位置集合处探测到的所述荧光的光子数或强度的单调函数，
其特征在于，
选择所述荧光染料(5)，使得所述光活化包括至少两个相应的光诱导的反应步骤(11)。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，用所述激发光(16)形成具有局部强度最大值的、与所述荧光阻抑光(18)的强度分布(15)基本上互补的强度分布，并且所述扫描与所述激发光(16)和所述荧光阻抑光(18)一起进行。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其特征在于，将所述扫描位置(19)布置在规则网格(21)上。
23.根据权利要求1至22中的一项所述的方法，其特征在于，用所述活化光(7)在所述样品中形成多个照射点。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，将所述照射点布置在规则的网格(21)上。
25.根据权利要求1至24中的一项所述的方法，其特征在于，通过多光子吸收来诱导光诱导的反应步骤(11)。
26.根据权利要求1至25中的一项所述的方法，其特征在于，所有光诱导的反应步骤都是用相同波长的活化光(7)来诱导的。
27.根据权利要求1至25中的一项所述的方法，其特征在于，所述光诱导的反应步骤(11)之一用与另一光诱导的反应步骤(11)不同波长的活化光(7)来诱导。
28.根据权利要求1至27中的一项所述的方法，其特征在于，所述光诱导的反应步骤(11)中的至少一个光诱导的反应步骤是光不稳定保护基(13)的光解裂解(12)。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述光不稳定保护基(13)选自以下(各自未被取代的或被取代的)基团：硝基苄基、硝基苯乙基、硝基吲哚啉基、二硝基吲哚啉基、硝基藜芦基、芳基羰基甲基、烷基苯甲酰甲基、羟基苯甲酰甲基、苯偶姻、羟基肉桂酸酯、邻硝基-2-苯乙氧基羰基、硝基苯胺、香豆素基、氨基香豆素基、甲氧基香豆酸酰基甲基、蒽醌-2-基甲氧基羰基、(2-萘基)甲基、(蒽-9-基)甲基、(芘-1-基)甲基、(苝-3-基)甲基，(菲-9-基)甲基，邻羟基芳基甲基、叠氮化合物、二吡咯亚甲基硼。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其特征在于，所述光诱导的反应步骤(11)是相同的光不稳定保护基(13、14)的光解裂解反应(12)。
31.根据权利要求28或29所述的方法，其特征在于，所述光诱导的反应步骤(11)是不同的光不稳定保护基(13、14)的光解裂解反应(12)。
32.根据权利要求1至31中的一项所述的方法，其特征在于，所述光诱导的反应步骤(11)中的至少两个光诱导的反应步骤是串联反应的步骤。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述串联反应的步骤是可逆的。
34.一种荧光染料(5)在根据权利要求1至33中的一项所述的方法中的用途，其特征在于，通过用活化光(7)照射所述荧光染料(5)使所述荧光染料(5)能够从受保护的非荧光形式(6)转变成活化的荧光形式(8)，并且所述染料(5)转变成所述荧光形式(8)包括至少两个相应地光诱导的反应步骤(11)。
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