CN115716834A - 一种提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物及其制备方法和应用。所述的环烯醚萜化合物是从藏药喉毛花全株中分离得到，其分子式为C12H16O4，化合物命名为：(Z)‑6‑乙氧基‑5‑亚乙基‑4,5,6,8‑四氢‑1H,3H‑吡喃并[3,4‑c]吡喃‑1‑酮，英文名为：(Z)‑6‑ethoxy‑5‑ethylidene‑4,5,6,8‑tetrahydro‑1H,3H‑pyrano[3,4‑c]pyran‑1‑one。所述环烯醚萜化合物的制备方法，是以整株藏药喉毛花植物为原料，经粉碎、提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤。本发明所述化合物经生物活性测试表明，对大肠杆菌和表皮葡萄球菌具有较好的抑制作用。本发明化合物容易分离得到，化合物活性好，可作为抗菌药物的先导性化合物。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及一种提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物及其制备方法与应用。
背景技术
藏药喉毛花（Comastoma pulmonarium）是龙胆科（Gentianales）喉毛花属（Comastoma(Wettst.)Toyokuni）植物，别名喉花草，属于一年生草本，高5-30厘米，茎直立，单生，草黄色，近四棱形，具分枝，稀不分枝。藏药喉毛花生于生于海拔3000-4200米的草坡、林下、高山草地，主要分布于云南西北部、四川南部、西藏和青海等地。喉毛花属植物用于治疗某些疾病已有很长的历史，具有疏肝利胆、祛湿化痰、清热解毒等显著效果。对于该属植物的继续深入研究显得尤为重要。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物；第二目的在于提供所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，是以龙胆科喉毛花属植物藏药喉毛花(Cassia leschenaultiana DC.)整株植物为原料，将前处理、浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离制备得到，其分子式为C12H16O4，具体结构如下：
该化合物为浅黄色油状物，命名为：(Z)-6-乙氧基-5-亚乙基-4,5,6,8-四氢-1H,3H-吡喃并[3,4-c]吡喃-1-酮，英文名为：(Z)-6-ethoxy-5-ethylidene-4,5,6,8-tetrahydro-1H,3H-pyrano[3,4-c]pyran-1-one。
本发明的第二目的是这样实现的，是以龙胆科喉毛花属植物藏药喉毛花(Cassia leschenaultiana DC.)整株植物为原料，经前处理、浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离步骤制备得到，具体包括：
A、前处理：将原料龙胆科喉毛花属植物藏药喉毛花(Cassia leschenaultiana DC.)整株植物粉碎或切段得到物料a；
B、浸膏提取：将物料a中加入物料a质量2~4倍的提取溶剂，于常温下浸泡提取36~72h，提取3~5次，合并提取液，过滤浓缩得到浸膏b；
C、硅胶柱层析：将浸膏b中加入浸膏b重量2.5~5倍的100~200目硅胶干法装柱后，以体积配比为20:1~5:5的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，经TLC监测，合并相同的部分；
D、高压液相色谱分离：将以9:1配比的氯仿-丙酮溶液进行洗脱得到的洗脱液经高压液相色谱分离纯化得到目标物提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物。
所制备的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物结构是通过以下方法进行鉴定：
提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物为浅黄色油状物，HRESI-MS显示其准分子离子峰为m/z247.0944[M+Na]+（计算值247.0940），结合其1H和13C-NMR谱确定分子式为C12H16O4，不饱和度为5。
其红外光谱显示1710cm-1的吸收带证明存在酯羰基。从1H和13CNMR谱（如表1、图1和图2）数据中发现了一个明显的α，β不饱和δ-内酯片段，同时显示其含有12个碳信号和16个氢信号。包括1个6取代的裂环环烯醚萜母核（C-1~C-10;H-3,H-4,H-6,H-8,H-9,H-10），1个乙氧基（-OCH2CH3;C-11和C-12;H2-11,H3-12）。裂环环烯醚萜母核的存在可通过化合物二维谱图中H-3和C-1,C-4,C-4a;H-4和C-1,C-3,C-4a,C-8a;H-6和C-4a,C-5,C-8;H-8和C-6,C-8a,C-4a,H-9和C-5,C-10,C-6,C-4a;以及H-10和C-5,C-9的HMBC相关（图3）证实。
化合物的母核确定后，通过进一步分析其HMBC谱的相关性，可确定乙氧基的位置。通过乙氧基亚甲基氢H2-11（δ H3.63,3.90,m）和C-6（δ C94.37）以及H-6（δ H5.71,s）与C-11（δ C63.48）的HMBC相关性，可确定乙氧基位于C-6位。至此化合物的结构得到确认，该化合物命名为(Z)-6-乙氧基-5-亚乙基-4,5,6,8-四氢-1H,3H-吡喃并[3,4-c]吡喃-1-酮。
化合物的红外、紫外和质谱数据：紫外光谱(甲醇)，λ max(logε)279(3.94)，284(3.71)，297(3.82)，354(3.76)nm；红外光谱(溴化钾压片)：ν max2965，2881，1710，1633，1549,1451，1261，1098，1053，921，836cm-1；1H和13CNMR数据(500和125MHz，溶剂为C5D5N)，见表-1；正离子模式ESIMSm/z247[M+Na]+；正离子模式HRESIMSm/z247.0944[M+Na]+(计算值247.0940，C12H16NaO4)。
表-1化合物的1HNMR和13CNMR数据(C5D5N)
本发明的第三目的是这样实现的，所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物在制备抑菌药物中的应用。
本发明提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为环烯醚萜化合物，并表征了其具体结构。本发明还对对化合物进行了大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的抑菌活性筛选，发现其对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的抑制率较好（均达到了89%以上），对金黄色葡萄球菌的抑制率相对较弱（49%以上）。以上结果揭示了本发明的环烯醚萜化合物在抑菌药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性好，可作为抑菌药物的先导性化合物。
附图说明
图1为化合物的核磁共振碳谱；
图2为化合物的核磁共振氢谱；
图3为化合物的主要HMBC相关。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物，是以龙胆科喉毛花属植物藏药喉毛花(Cassia leschenaultiana DC.)整株植物为原料，将前处理、浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离制备得到，其分子式为C12H16O4，具体结构如下：
本发明所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物的制备方法，是以龙胆科喉毛花属植物藏药喉毛花(Cassia leschenaultiana DC.)整株植物为原料，经前处理、浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离步骤制备得到，具体包括：
A、前处理：将原料龙胆科喉毛花属植物藏药喉毛花(Cassia leschenaultiana DC.)整株植物粉碎或切段得到物料a；
B、浸膏提取：将物料a中加入物料a质量2~4倍的提取溶剂，于常温下浸泡提取36~72h，提取3~5次，合并提取液，过滤浓缩得到浸膏b；
C、硅胶柱层析：将浸膏b中加入浸膏b重量2.5~5倍的100~200目硅胶干法装柱后，以体积配比为20:1~5:5的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，经TLC监测，合并相同的部分；
D、高压液相色谱分离：将以9:1配比的氯仿-丙酮溶液进行洗脱得到的洗脱液经高压液相色谱分离纯化得到目标物提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物。
A步骤中所述的粉碎是粉碎过10目筛；所述的切段是切成0.5~1.5cm的小段。
B步骤中所述的提取溶剂为质量浓度80%~100%甲醇水溶液、质量浓度80%~100%的乙醇水溶液或质量浓度70%~100%的丙酮水溶液。
C步骤上柱前还包括用物料b重量1.2~3倍的有机溶剂溶解后加入物料b重量1~1.5倍的80~100目硅胶进行拌样步骤。
所述的有机溶剂为纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮。
C步骤中所述的氯仿-丙酮溶液体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5。
D步骤中高压液相色谱分离纯化是采用规格为21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为70%的甲醇水，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样160μL，收集26.1min的色谱峰，多次累加后蒸干得到目标物提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物。
D步骤中高压液相色谱分离纯化后还包括进一步纯化步骤，具体是将所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱进行层析分析得到目标物提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物。
本发明所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物的应用为所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物在制备抑菌药物中的应用。
本发明所用原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南和西藏各地的藏药喉毛花原料对本发明做进一步说明：
实施例1
藏药喉毛花样品来源于云南省丽江市玉龙县，将藏药喉毛花样品2.5kg粉碎过10目筛，以质量浓度90%的甲醇水溶液常温下浸泡提取4次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏122g。浸膏用重量2.0倍量的纯甲醇溶解后用180g的80目粗硅胶拌样，0.75kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到6个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分用安捷仑1200制备高效液相色谱分离，以70％的甲醇为流动相，ZorbaxSB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样160μL，收集26.1min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例2
藏药喉毛花样品来源于云南省迪庆州德钦县，将藏药喉毛花取样1.8kg切碎过10目筛，以质量浓度95%的乙醇水溶液常温浸泡提取5次，每次提取36h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏93g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用100g的100目粗硅胶拌样，0.5kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到6个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1200制备高效液相色谱分离，以70％的甲醇为流动相，ZorbaxSB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样150μL，收集26.1min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例3
藏药喉毛花样品来源于西藏昌都地区左贡县，将藏药喉毛花样品1.5kg切成0.5~1.5cm的小段，以质量浓度80%的丙酮水溶液常温浸泡提取4次，每次提取60h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏82g。浸膏用重量比1.6倍量的纯甲醇溶解后用120g的100目粗硅胶拌样，0.4kg的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到6个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1200制备高效液相色谱分离，以70％的甲醇为流动相，ZorbaxSB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样150μL，收集26.1min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例4
取实施例1制备的化合物，为浅黄色油状物。
化合物为浅黄色油状物，HRESI-MS显示其准分子离子峰为m/z247.0944[M+Na]+（计算值247.0940），结合其1H和13C-NMR谱确定分子式为C12H16O4，不饱和度为5。
其红外光谱显示1710cm-1的吸收带证明存在酯羰基。从1H和13CNMR谱（如表1、图1和图2）数据中发现了一个明显的α，β不饱和δ-内酯片段，同时显示其含有12个碳信号和16个氢信号。包括1个6取代的裂环环烯醚萜母核（C-1~C-10;H-3,H-4,H-6,H-8,H-9,H-10），1个乙氧基（-OCH2CH3;C-11和C-12;H2-11,H3-12）。裂环环烯醚萜母核的存在可通过化合物二维谱图中H-3和C-1,C-4,C-4a;H-4和C-1,C-3,C-4a,C-8a;H-6和C-4a,C-5,C-8;H-8和C-6,C-8a,C-4a,H-9和C-5,C-10,C-6,C-4a;以及H-10和C-5,C-9的HMBC相关（图3）证实。
化合物的母核确定后，通过进一步分析其HMBC谱的相关性，可确定乙氧基的位置。通过乙氧基亚甲基氢H2-11（δ H3.63,3.90,m）和C-6（δ C94.37）以及H-6（δ H5.71,s）与C-11（δ C63.48）的HMBC相关性，可确定乙氧基位于C-6位。至此化合物的结构得到确认，该化合物命名为(Z)-6-乙氧基-5-亚乙基-4,5,6,8-四氢-1H,3H-吡喃并[3,4-c]吡喃-1-酮。
实施例5
取实施例2制备的化合物，为浅黄色油状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例2制备的化合物为所述的环烯醚萜化合物：(Z)-6-乙氧基-5-亚乙基-4,5,6,8-四氢-1H,3H-吡喃并[3,4-c]吡喃-1-酮。
实施例6
取实施例3制备的化合物，为浅黄色油状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例3制备的化合物为所述的环烯醚萜化合物：(Z)-6-乙氧基-5-亚乙基-4,5,6,8-四氢-1H,3H-吡喃并[3,4-c]吡喃-1-酮。
实施例7
取实施例1制备的环烯醚萜化合物进行抑菌试验，试验情况如下：
采用二倍稀释法，以氨苄为阳性对照药，选用处于对数生长期的大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）实验菌种，细胞浓度为1×108CFU/mL，化合物用氘代试剂DMSO溶解，化合物1-3质量浓度分别为500μg·mL-1、250μg·mL-1、125μg·mL-1、62.5μg·mL-1、31.25μg·mL-1、15.625μg·mL-1，发现其对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的抑制率较好，为92.3%，对金黄色葡萄球菌的抑制率相对较弱，为51%。
实施例8
分别取实施例2和实施例3制备得到环烯醚萜化合物进行抑菌试验，方法同实施例7，结果均表明，本发明所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的抑制率较好（均达到了89%以上），对金黄色葡萄球菌的抑制率相对较弱（49%以上）。
Claims (10)
1.一种提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物，其特征在于，是以龙胆科喉毛花属植物藏药喉毛花(Cassia leschenaultiana DC.)整株植物为原料，将前处理、浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离制备得到，其分子式为C12H16O4，具体结构如下：
2.一种权利要求1所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物的制备方法，其特征在于，是以龙胆科喉毛花属植物藏药喉毛花(Cassia leschenaultiana DC.)整株植物为原料，经前处理、浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离步骤制备得到，具体包括：
A、前处理：将原料龙胆科喉毛花属植物藏药喉毛花(Cassia leschenaultiana DC.)整株植物粉碎或切段得到物料a；
B、浸膏提取：将物料a中加入物料a质量2~4倍的提取溶剂，于常温下浸泡提取36~72h，提取3~5次，合并提取液，过滤浓缩得到浸膏b；
C、硅胶柱层析：将浸膏b中加入浸膏b重量2.5~5倍的100~200目硅胶干法装柱后，以体积配比为20:1~5:5的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，经TLC监测，合并相同的部分；
D、高压液相色谱分离：将以9:1配比的氯仿-丙酮溶液进行洗脱得到的洗脱液经高压液相色谱分离纯化得到目标物提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，A步骤中所述的粉碎是粉碎过10目筛；所述的切段是切成0.5~1.5cm的小段。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，B步骤中所述的提取溶剂为质量浓度80%~100%甲醇水溶液、质量浓度80%~100%的乙醇水溶液或质量浓度70%~100%的丙酮水溶液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，C步骤上柱前还包括用物料b重量1.2~3倍的有机溶剂溶解后加入物料b重量1~1.5倍的80~100目硅胶进行拌样步骤。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，C步骤中所述的氯仿-丙酮溶液体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，D步骤中高压液相色谱分离纯化是采用规格为21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为70%的甲醇水，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样160μL，收集26.1min的色谱峰，多次累加后蒸干得到目标物提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，D步骤中高压液相色谱分离纯化后还包括进一步纯化步骤，具体是将所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱进行层析分析得到目标物提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物。
10.一种权利要求1所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物的应用，其特征在于所述的提取自藏药喉毛花中的环烯醚萜化合物在制备抑菌药物中的应用。
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| CN104262317A (zh) * | 2014-09-04 | 2015-01-07 | 玉溪师范学院 | 一种二聚单萜类化合物及其制备方法与应用 |
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| RONG HUANG等: "Chemical constituents from Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk", FITOTERAPIA, pages 104115 * |
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