CN115701991A - 吡唑基丙酰胺化合物及其用于治疗前列腺癌的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及吡唑基丙酰胺化合物及其用于治疗前列腺癌、晚期前列腺癌、难治性前列腺癌、过表达AR的前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、去势敏感性前列腺癌、表达AR‑V7的前列腺癌或表达d567ES的前列腺癌、达洛鲁胺抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌或阿比特龙抗性前列腺癌的用途。

Description

吡唑基丙酰胺化合物及其用于治疗前列腺癌的用途
发明领域
本发明涉及吡唑基丙酰胺化合物及其用于治疗前列腺癌、晚期前列腺癌、难治性前列腺癌、过表达AR的前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、去势敏感性前列腺癌、表达AR-V7的前列腺癌或表达d567ES的前列腺癌、达洛鲁胺抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌或阿比特龙抗性前列腺癌的用途。
发明背景
前列腺癌(PC)是美国男性中继肺癌之后的第二大癌症相关的死亡原因。前列腺癌的发展、进展、生长和存活取决于雄激素受体(AR)信号传导的活化。
大约20-40％接受放射和根治性前列腺切除术治疗的PC患者会经历肿瘤复发。一旦肿瘤复发，雄激素剔除疗法或雄激素剥夺疗法(ADT)就成为大多数患者的标准护理。ADT通过手术去势(睾丸切除术)或化学去势(注射促性腺激素释放激素激动剂或拮抗剂)来实现，这两者均致使睾丸的睾酮生物合成减少。除ADT之外，次级激素抑制由称作抗雄激素药的直接竞争性配体结合域(LBD)导向的AR拮抗剂如氟他胺(1)、比卡鲁胺(2)、尼鲁米特(3)、恩杂鲁胺(4)、阿帕鲁胺(5)或达洛鲁胺(6)，或雄激素合成抑制如醋酸阿比特龙(7)+泼尼松提供。次级激素抑制(即作为ADT的补充)已被批准用于治疗去势敏感性PC(CSPC)或去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，并且批准倾向于在疾病自然病程早期使用它们，以便更有效地延缓疾病进展。
ADT最初对晚期PC有效；然而，持续的ADT治疗联合抗雄激素药通常只能使疾病稳定2-3年，随后PC变得难治，从而导致其中肿瘤变得对(持续的ADT和)次级激素疗法有抗性的更具侵袭性的CRPC肿瘤表型。对比卡鲁胺(2)、恩杂鲁胺(4)、阿帕鲁胺(5)或醋酸阿比特龙(7)中任一者的抗性可能在开始后仅仅几个月就出现，并且研究表明，达洛鲁胺(6)可能在CPRC群体中表现得类似(经批准用于mCSPC的达洛鲁胺(6))。尽管在CRPC中对次级激素疗法有直接的(1-6)或是间接的(7)抗性，AR信号传导仍然是肿瘤生长和疾病进展的基础。相应地，在激素抗性PC中需要抑制AR轴的新机制。
虽然CRPC进展的确切机制在临床上并非总是为人所知，它们也不互相排斥，但是临床前和临床研究已经展示多个CRPC出现的促成因素，包括(i)瘤内雄激素(例如，由肾上腺前体合成的DHT)的补偿性产生，(ii)AR基因扩增和过表达，(iii)AR LBD点突变，(iv)辅调节蛋白表达的改变，(v)AR的配体非依赖性活化，(vi)组成性活性截短AR剪接变体(ARSV)，以及(vii)胞内分泌雄激素代谢酶的诱导。直接和间接抗雄激素疗法均靶向AR的LBD处，并最终由于以上所提及的抗性机制而失效。迫切需要开发出针对CRPC的AR拮抗剂，其具有新作用机制，能够持久性治疗对比卡鲁胺(2)、恩杂鲁胺(4)、阿帕鲁胺(5)以及醋酸阿比特龙(7)(7与4和5的交叉抗性较常见；氟他胺(1)和尼鲁米特(3)很少使用)或达洛鲁胺(6)(2019年批准；对6的抗性模式仍在出现)有抗性的患者。
为了提供针对CRPC的临床益处或者避免CRPC的出现，下一代AR靶向治疗剂理想地应当能够结合AR的新的和/或多个域，并且抑制在大量预治疗的CPRC群体中存在和出现的广泛AR序列中的广泛AR功能。这样的新型拮抗剂会理想地在野生型(wt)、点突变、AR SV和/或过表达AR的致病状态中维持活性，并且效力足以在PC逐步变得更难以治疗时维持对AR轴的抑制。
与非LBD位点结合和AR蛋白降解是合理靶向CRPC的具前景性的临床前方法。AR降解可通过基因敲低技术(如反义寡核苷酸、RNA干扰和DNA编辑)来实现。尽管遗传方法具有巨大的治疗潜能，但由于寡核苷酸(聚阴离子大分子)向前列腺和转移性肿瘤递送的技术困难，其在临床上仍然具有挑战性。此外，肿瘤细胞中的寡核苷酸摄取较差。或者，通过经由泛素蛋白酶体系统(UPS)降解AR的蛋白质敲低技术来靶向破坏AR仍然是有前景性的选项，但有待在临床环境中得到明确测试。
在最近的抗肿瘤研究中，已报道了选择性抑制肿瘤生长并降解这些肿瘤内的AR(全长)和AR SV(截短)的AR拮抗剂的发现和表征(Ponnusamy等人，CancerRes.2017，77，6282-6298)。一系列芳基吲哚-1-基丙酰胺和芳基和芳基二氢吲哚-1-基丙酰胺已被报道为选择性雄激素受体降解剂(SARD)(Hwang等人，J.Med.Chem.2019，62，491-511)。如由UPS抑制剂研究所确定，这些SARD活性通过UPS介导(Ponnusamy等人，Cancer Res.2017，77，6282-6298；Ponnusamy等人，Clin.Cancer Res.2019，25，6764-6780)。已发现SARD降解AR并抑制AR功能，并且在筛选测定(例如，LBD结合、转录抑制、AR降解和抗增殖测定)中表现出体外抑制效力，并且表现出比经批准的AR拮抗剂更大的体内效力(Hershberger测定和多种AR依赖性CPRC异种移植物)。
如本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物是选择性雄激素受体降解剂(SARD)和泛拮抗剂。这些化合物表现出有效的AR拮抗剂活性(包括具前景性的分布、代谢和药代动力学特性)以及广谱AR拮抗剂特性(包括有效的体内抗肿瘤活性)。
发明概述
在一个方面中，本发明提供治疗需要其的个体中的前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的由式I的结构表示的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合
Figure BDA0003971812710000021
其中
T为OH；
R1为CH3；
Y为H、CF3、F、I、Br、Cl或CN；
Z为H、NO2、CN、卤素、COOR、COR、NHCOR或CONHR；
或者Y和Z形成5-8元稠环；
X和D各自为CH或N；
B为键或CH，并且当B为键时，D＝B-X由D-X表示；
R为H、烷基、卤代烷基、烷基-OH、芳基、F、Cl、Br、I或OH；
A为具有至少一个氮原子和0、1或2个双键的五元不饱和环，其任选地被Q1、Q2、Q3和Q4中的至少一个取代，所述Q1、Q2、Q3和Q4各自独立地选自线性或支链烷基、卤代烷基、CF3、芳基、F、Cl、Br、I、CN、NO2、OR、苄基、炔基、SO2N(R)2、NHCOOR、N(R)2、NHCOR、CONHR、COOR或COR；其中所述烷基、炔基和芳基各自任选地被卤素、CN或OH取代。
在一些实施方案中，所述前列腺癌是晚期前列腺癌、难治性前列腺癌、过表达AR的前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、去势敏感性前列腺癌、表达AR-V7的前列腺癌或表达d567ES的前列腺癌。
在一些实施方案中，所述去势抵抗性前列腺癌(CRPC)是转移性CRPC(mCRPC)、非转移性CRPC (nmCRPC)或高风险nmCRPC。
在一些实施方案中，所述去势抵抗性前列腺癌是过表达AR的去势抵抗性前列腺癌、表达F876L突变的去势抵抗性前列腺癌、表达F876L_T877A双突变的去势抵抗性前列腺癌、表达AR-V7的去势抵抗性前列腺癌、表达d567ES的去势抵抗性前列腺癌和/或以瘤内雄激素合成为特征的去势抵抗性前列腺癌。
在一些实施方案中，所述去势敏感性前列腺癌是表达F876L突变的去势敏感性前列腺癌、F876L_T877A双突变去势敏感性前列腺癌和/或以瘤内雄激素合成为特征的去势敏感性前列腺癌。在一些实施方案中，所述去势敏感性前列腺癌的治疗在非去势情境下进行，或作为单一疗法进行，或当去势敏感性前列腺癌肿瘤对恩杂鲁胺、阿帕鲁胺和/或阿比特龙具有抗性时进行。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括施用雄激素剥夺疗法(ADT)。
在一些实施方案中，所述前列腺癌对用雄激素受体拮抗剂的治疗具有抗性。在一些实施方案中，所述雄激素受体拮抗剂是达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、比卡鲁胺、阿比特龙、EPI-001、EPI-506、AZD-3514、加来特龙(galeterone)、ASC-J9、氟他胺、羟基氟他胺、尼鲁米特(nilutamide)、醋酸环丙孕酮、酮康唑或螺内酯中的至少一种。
在一些实施方案中，所述前列腺癌是达洛鲁胺抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌或阿比特龙抗性前列腺癌。在一些实施方案中，所述前列腺癌是达洛鲁胺抗性前列腺癌。在一些实施方案中，所述前列腺癌是恩杂鲁胺抗性前列腺癌。在其他实施方案中，所述前列腺癌是阿帕鲁胺抗性前列腺癌。在一些实施方案中，所述前列腺癌是阿比特龙抗性前列腺癌。
会理解为了简单和清楚说明，图中所示的元件并非必需按比例绘制。例如，为了清楚起见，相对于其它元件，可放大一些元件的尺寸。另外，在认为适当时，参考数字可在各图之间重复以指示对应或类似元件。
附图简要说明
视为本发明的主题被特别地指出且在本说明书的结论部分中被清楚地要求保护。然而，当结合附图阅读时，通过参考以下详细描述，可以最好地理解本发明的组织和操作方法以及其目的、特征和优点。
图1示出了F876L突变体AR反式激活的拮抗作用。将苯丙氨酸876突变为亮氨酸的AR(F876L)、GRE-LUC和CMV-海肾LUC转染到COS细胞中。转染后24小时，用0.1nM R1881(激动剂)和剂量反应的拮抗剂处理细胞。转染后48小时进行荧光素酶测定。每种化合物的效应以拮抗模式(在0.1nM R1881的存在下)进行。
图2示出了wtPR反式激活的拮抗作用。将COS细胞用wtPR转染，并且如图1进行反式激活研究。
图3示出了SARD拮抗前列腺癌细胞LNCaP中的AR功能。使LNCaP细胞在活性炭处理的含血清培养基中维持2天。将细胞用如图中所指定的拮抗剂处理20-24小时，分离RNA，并测量AR靶基因FKBP5的表达，并使用实时PCR归一化至GAPDH。
图4示出了恩杂鲁胺抗性LNCaP(MR49F)细胞抗增殖。将恩杂鲁胺(4)抗性(Enz-R)LNCaP(MR49F)细胞铺板在1％活性炭处理的含血清培养基中，并用0.1nM R1881和滴定的拮抗剂处理，如图中所指定。在第一次处理后3天对细胞再处理，并且通过Cell-Titer Glo测定(Promega，Madison，Wi)测量活细胞的数目。N＝3。
图5示出了SARD降解赋予恩杂鲁胺抗性的逃逸突变体AR。使恩杂鲁胺(4)抗性(Enz-R)LNCaP(MR49F)(上图)或22RV1细胞(下图)维持在活性炭处理的含血清培养基中2天，并用0.1nM R1881(激动剂)和滴定的SARD或恩杂鲁胺处理，如图中所指定。处理后二十四小时，收获细胞，提取蛋白质，并用AR-N20抗体实施蛋白质印迹。将印迹剥离并用GAPDH抗体重新探测。AR与GAPDH或各泳道的比率在各印迹下给出。
图6示出了化合物26a在大鼠中的浓度-时间图。向十二周龄雄性Sprague Dawley大鼠给予所显示剂量，分五组，每组五只动物(N＝5)。在所显示时间点抽取血液样品并通过MS/MS测定分析物浓度。显示出所有剂量组在第1天(左)和第7天(右)的浓度-时间图。
图7A和7B示出了SARD和泛拮抗剂抑制大鼠中的雄激素依赖性器官。图7A和7B显示在用每天po 20mg/kg(mpk)的拮抗剂或媒介物处理完整大鼠14天后VP和SV重量的减小(n＝5/组)。在治疗期结束时处死大鼠，并且测量前列腺和SV的重量并归一化至体重。
图8A和8B示出了SARD和泛拮抗剂抑制恩杂鲁胺抗性前列腺癌的生长。将恩杂鲁胺抗性MDVR细胞(10×106个细胞/大鼠)经皮下植入雄性SRG(Sprague Dawley-Rag2：IL2rgKO)大鼠中。当肿瘤达到1000-3000mm3时，将动物随机分组并处理(完整)。一旦肿瘤达到2000-3000mm3，就用媒介物(DMSO/PEG-300 15∶85)或10mg/kg/天的26a口服处理动物。每周测量两次肿瘤体积(T.V.)，并表示为百分比变化(图9A)或处死时重量(图8B)。
图9示出了21a在大鼠中的PK结果。向Sprague Dawley大鼠给予30mg/kg 21a，并在给予后5分钟、30分钟、1小时、3小时、360小时、12小时和24小时从颈静脉收集血液。将血清分离并使用LC/MS-MS分析21a的量。
图10示出了除29q外的吡唑基丙酰胺化合物均是AR拮抗剂，并且它们均有效地拮抗由雄激素R1881诱导的AR活性。将COS-7细胞以30,000个细胞/孔铺板在24孔板中的DME+5％csFBS w/o中。在阳离子脂质体转染试剂中，用0.25μg GRE-LUC、10ng CMV-海肾-LUC和25ng人AR质粒转染细胞。在转染后24小时处理细胞，并且在处理后24小时进行荧光素酶测定。将萤火虫荧光素酶值归一化至海肾荧光素酶。
图11A和11B示出了化合物21c抑制AR和AR-V7阳性22RV1异种移植物63％，而恩杂鲁胺未能抑制生长。当媒介物处理的动物的肿瘤体积从315mm3增加至2300mm3时，21c处理的动物的体积从301mm3增加至1205mm3。505组的最大TV抑制为63％。未达到安乐死标准的媒介物组和505处理的组中的动物将继续直到它们达到安乐死。将22RV1细胞(2百万个/小鼠)经皮下植入NSG小鼠中。一旦肿瘤生长至100-400mm3体积(长度*宽度*宽度)，就基于肿瘤体积将动物随机分组并且口服处理。每周测量肿瘤体积两次。在研究结束时处死动物，并收集肿瘤用于进一步分析。
图12示出了对荷有22RV1肿瘤的动物绘制的卡普兰-梅尔图(在图11A和11B中显示)。安乐死标准是当肿瘤达到＞2cm或2000mm3的体积时。用媒介物和恩杂鲁胺处理的荷瘤动物比用21c处理的动物更早达到安乐死标准。安乐死标准(长度＞2cm或体积＞2000mm3)。创建安乐死标准的卡普兰-梅尔图，以显示存活差异。
图13A-13C示出了化合物21c和10显著地抑制生长三阴性乳癌(TNBC)患者来源的异种移植物(PDX)UT-1355。UT-1355表达AR和AR-V7两者。当媒介物处理的肿瘤从237生长至1355时，21c和10处理的肿瘤分别从227和427增加至331和1354。这些结果显示10和21c对PDX有效。将来自患者的TNBC乳腺癌标本植入小鼠中。一旦肿瘤生长，就将P-1肿瘤冷冻。将P1肿瘤于2020年8月植入60只雌性NSG小鼠中。一旦肿瘤生长至100-400mm3，就将动物随机分组并用媒介物(n＝12)、60mpk21c(n＝11)、10(n＝9；60mpk b.id)和恩杂鲁胺(n＝9；60mpk)组处理。在处理开始和研究结束当天测量体重。每周测量肿瘤体积两次。表征：评价PDX样本的AR表达。观察到处于110Kda的AR条带。然而，也观察到处于约70Kda的另一条带。AR-V7抗体的蛋白质印迹显示处于70Kda的条带。患者和肿瘤特征：非裔美国人，年龄65岁，收集日期01/02/2020，ki67 45-50％。
图14示出了来自图13A-13C的肿瘤体积的p值。
图15示出了对荷有UT-1355肿瘤的动物绘制的卡普兰-梅尔图(在图13A-13C中显示)。安乐死标准是当肿瘤达到＞2cm或2000mm3的体积时。用媒介物和恩杂鲁胺处理的荷瘤动物比用21c处理的动物更早达到安乐死标准。安乐死标准(长度＞2cm或体积＞2000mm3)。
本发明详述
在以下详细描述中，阐述许多具体细节以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域技术人员会理解，可在没有这些具体细节的情况下实施本发明。在其它情况下，未详细描述公知的方法、操作和组分，以免混淆本发明。
雄激素通过与AR结合而在细胞中起作用，AR是转录因子的类固醇受体超家族的成员。由于前列腺癌(PCa)的生长和维持在很大程度上通过循环雄激素来控制，PCa的治疗重度依赖于靶向AR的疗法。用如达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿比特龙(间接AR拮抗剂；其它为LBD结合直接AR拮抗剂)、阿帕鲁胺、比卡鲁胺或羟基氟他胺的AR拮抗剂治疗以破坏受体活化已在过去成功地用于减少PCa生长。所有当前可用的直接AR拮抗剂竞争性地结合AR且募集如NCoR和SMRT的辅阻遏物以抑制靶基因的转录。然而，改变的细胞内信号传导、AR突变和增加的共活化剂表达导致拮抗剂的功能障碍或甚至使拮抗剂转化为激动剂。
研究已表明AR内的W741和T877的突变将比卡鲁胺和羟基氟他胺分别转化为激动剂。类似地，增加的细胞内细胞因子将共活化剂而非辅阻遏物募集到AR反应性启动子，随后将比卡鲁胺转化为激动剂。与恩杂鲁胺、阿帕鲁胺和阿比特龙抗性相关的突变包括F876、H874、T877和二突变体T877/S888、T877/D890、F876/T877(即MR49细胞)和H874/T877(Genome Biol.(2016)17：10(doi：10.1186/s13059-015-0864-1))。
阿比特龙耐药突变包括L702H突变，其致使通过糖皮质激素(如泼尼松)活化AR，产生对阿比特龙的抗性，因为阿比特龙通常与泼尼松组合开处方。如果对恩杂鲁胺或阿帕鲁胺产生抗性，则患者通常也会对阿比特龙耐药，反之亦然；或者响应的持续时间极短。
达洛鲁胺在CRPC中也具有有限的功效和作用持续时间。这种情况突出了对确定的雄激素剔除疗法的需要，以防止晚期前列腺癌中的AR再活化。Arora等人在Cell 155，1309-1322中报道了作为来自前列腺癌细胞系(LNCaP/AR)和临床样品的耐药性肿瘤的共同特征的糖皮质激素受体(GR)表达的诱导。GR替代AR活化一组类似但可区分的靶基因，并且是维持抗性表型所必需的。GR激动剂地塞米松足以赋予恩杂鲁胺(或阿帕鲁胺)抗性，而GR拮抗剂恢复敏感性。急性AR抑制导致前列腺癌细胞亚群中的GR上调，这是由于AR介导的GR表达反馈阻遏的减轻。这些发现通过在药物暴露时经由替代核受体引发以驱动AR靶基因的细胞的扩增，建立了逃避AR阻断的机制。本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物可能是有效GR拮抗剂。因此，它们可能预防GR依赖性抗雄激素抗性的出现，或者治疗依赖于GR的抗雄激素抗性前列腺癌。虽然尚未报道赋予达洛鲁胺抗性的具体AR突变或AR旁路机制，但达洛鲁胺结合AR上的相同LBD靶点，并且可能发展出对本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物敏感的耐药突变。
本发明涉及吡唑基丙酰胺化合物，它们是选择性雄激素受体降解剂(SARD)和泛拮抗剂。本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物可用于治疗前列腺癌、晚期前列腺癌、难治性前列腺癌、过表达AR的前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、去势敏感性前列腺癌、表达AR-V7的前列腺癌或表达d567ES的前列腺癌、达洛鲁胺抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌或阿比特龙抗性前列腺癌的用途。
如本文所用，除非另有定义，否则“选择性雄激素受体降解剂”(SARD)化合物是雄激素受体拮抗剂，其能够抑制依赖于AR全长(AR-FL)和/或AR剪接变体(AR-SV)进行增殖的PCa细胞和肿瘤的生长。所述SARD化合物可不结合至配体结合域(LBD)。或者，“选择性雄激素受体降解剂”(SARD)化合物是雄激素受体拮抗剂，其能够引起多种致病性突变体变体AR和野生型AR的降解，并因此能够发挥抗雄激素作用，其为在本发明中具体说明的疾病状态中发现的多种致病性改变的细胞环境。在一个实施方案中，所述SARD是口服活性的。在另一个实施方案中，所述SARD局部应用于作用位点。
所述SARD化合物可与AR的N端域(NTD)结合；与AR的替代结合和降解域(BDD)结合；与AR配体结合域(LBD)以及替代结合和降解域(BDD)两者结合；或与AR的N端域(NTD)和配体结合域(LBD)两者结合。在一个实施方案中，所述BDD可以位于所述NTD中。在一个实施方案中，所述BDD位于所述NTD的AF-1区中。或者，所述SARD化合物能够：抑制由N端域(NTD)依赖性组成性活性AR-SV驱动的生长；或通过与不同于AR LBD的域结合来抑制AR。此外，所述SARD化合物可以是强(即，高度强效和高度有效)选择性雄激素受体拮抗剂，其比其它已知AR拮抗剂(例如达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、比卡鲁胺和阿比特龙)更强地拮抗AR。
所述SARD化合物可以是选择性雄激素受体拮抗剂，其靶向不能被常规拮抗剂抑制的AR-SV。所述SARD化合物可以表现出数种活性中的任一种，包括但不限于：AR-SV降解活性；AR-FL降解活性；AR-SV抑制活性(即，为AR-SV拮抗剂)；AR-FL抑制活性(即，为AR-FL拮抗剂)；AR-SV的组成性活化的抑制；或AR-FL的组成性活化的抑制。或者，所述SARD化合物可具有双重AR-SV降解和AR-SV抑制功能，和/或双重AR-FL降解和AR-FL抑制功能；或者具有所有这四种活性。
所述SARD化合物还可降解AR-FL和AR-SV。所述SARD化合物可通过与不同于AR LBD的域结合来降解AR。所述SARD化合物可具有双重降解和AR-SV抑制功能，其不同于任何可用的CRPC治疗剂。所述SARD化合物可通过替代机制抑制AR的再活化，例如：胞内分泌雄激素合成、缺乏配体结合域(LBD)的AR-SV表达和具有抵抗拮抗剂潜能的AR-LBD突变，或抑制存在于致病性改变的细胞环境中的再活化雄激素受体。
AR-剪接变体的实例包括但不限于AR-V7和ARv567es(也称为AR-V12；S.Sun等人，Castration resistance in human prostate cancer is conferred by a frequentlyoccurring androgen receptor splice variant.J Clin Invest.(2010)120(8)，2715-2730)。赋予抗雄激素抗性的AR突变的非限制性实例为：W741L、T877A和F876L(J.D.Joseph等人，A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance tosecond-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509[阿帕鲁胺].CancerDiscov.(2013)3(9)，1020-1029)突变。许多其它赋予LBD抗性的突变是本领域中已知的，并且会被继续发现。AR-V7是缺乏LBD的AR的剪接变体(A.H.Bryce&E.S.Antonarakis.Androgen receptor splice variant 7in castration-resistantprostate cancer：Clinical considerations.Int J Urol.(2016年6月3日)23(8)，646-53.doi：10.1111/iju.13134)。它具有组成性活性，且已展示造成侵袭性PCa和对内分泌疗法具有抗性。
如本文所用，在一些实施方案中，术语“泛拮抗剂”是指有效对抗野生型AR和所测试的所有AR突变体(包括但不限于F876L、T877A和W741L)的拮抗剂。
如本文所用，“UT-1355”是由本申请的发明人开发的三阴性乳腺癌(TNBC)患者来源的异种移植物(PDX)。它是在动物体内作为肿瘤生长的TNBC患者标本。
本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物是SARD和泛拮抗剂，其可用于治疗不能用任何其它拮抗剂治疗的CRPC。所述吡唑基丙酰胺化合物可通过降解AR-SV来治疗CRPC。所述吡唑基丙酰胺化合物可在通常使AR拮抗剂转化为激动剂的AR突变体中维持其拮抗活性。举例来说，所述吡唑基丙酰胺化合物维持其对AR突变体W741L、T877A和F876L的拮抗活性(J.D.Joseph等人，A clinically relevant androgen receptor mutation confersresistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509[阿帕鲁胺].Cancer Discov.(2013)3(9)，1020-1029)。或者，所述吡唑基丙酰胺化合物在改变的细胞环境内引发拮抗活性，其中LBD靶向药物无效或其中NTD依赖性AR活性是组成性活性的。或者，吡唑基丙酰胺化合物可为AR和GR的共拮抗剂，且由此克服或预防其中GR过表达和/或GR活化AR轴的抗雄激素抗性CRPC。或者，吡唑基丙酰胺化合物为AR和PR的共拮抗剂，且由此克服或预防其中PR过表达和/或PR活化AR轴的抗雄激素抗性CRPC。
本发明提供治疗需要其的个体中的前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的由式I的结构表示的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合
Figure BDA0003971812710000051
其中
T为OH；
R1为CH3；
Y为H、CF3、F、I、Br、Cl或CN；
Z为H、NO2、CN、卤素、COOR、COR、NHCOR或CONHR；
或者Y和Z形成5-8元稠环；
X和D各自为CH或N；
B为键或CH，并且当B为键时，D＝B-X由D-X表示；
R为H、烷基、卤代烷基、烷基-OH、芳基、F、Cl、Br、I或OH；
A为具有至少一个氮原子和0、1或2个双键的五元不饱和环，其任选地被Q1、Q2、Q3和Q4中的至少一个取代，所述Q1、Q2、Q3和Q4各自独立地选自线性或支链烷基、卤代烷基、CF3、芳基、F、Cl、Br、I、CN、NO2、OR、苄基、炔基、SO2N(R)2、NHCOOR、N(R)2、NHCOR、CONHR、COOR或COR；其中所述烷基、炔基和芳基各自任选地被卤素、CN或OH取代。
在一些实施方案中，所述化合物由式II的化合物表示
Figure BDA0003971812710000061
在一些实施方案中，所述化合物由式IIA或式IIB的化合物表示：
Figure BDA0003971812710000062
在一些实施方案中，所述化合物由式III的化合物表示：
Figure BDA0003971812710000063
其中
T为OH；
R1为CH3；
Y为H、CF3、F、I、Br、Cl或CN；
Z为H、NO2、CN、卤素、COOR、COR、NHCOR或CONHR；
或者Y和Z形成5-8元稠环；
x为CH或N；
R为H、烷基、卤代烷基、烷基-OH、CF3、CH2Cl、CH2CH2Cl、芳基、F、Cl、Br、I或OH；
A为吡咯、吡唑、三唑或咪唑，其各自任选地被Q1、Q2、Q3和Q4中的至少一个取代，所述Q1、Q2、Q3和Q4各自独立地选自线性或支链烷基、卤代烷基、CF3、芳基、F、Cl、Br、I、CN、NO2、OR、苄基、炔基、SO2N(R)2、NHCOOR、N(R)2、NHCOR、CONHR、COOR或COR；其中所述烷基、炔基和芳基各自任选地被卤素、CN或OH取代，
或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。
在一些实施方案中，所述化合物由式IIIA或式IIIB的结构表示：
Figure BDA0003971812710000071
在一些实施方案中，所述化合物由式IV的结构表示：
Figure BDA0003971812710000072
在一些实施方案中，所述化合物由式IVA或式IVB的结构表示：
Figure BDA0003971812710000073
在一些实施方案中，所述化合物由式V的结构表示：
Figure BDA0003971812710000074
其中
Q2、Q3和Q4各自独立地选自线性或支链烷基、卤代烷基、CF3、芳基、F、Cl、Br、I、CN、NO2、OR、苄基、炔基、SO2N(R)2、NHCOOR、N(R)2、NHCOR、CONHR、COOR或COR；其中所述烷基、炔基和芳基各自任选地被卤素、CN或OH取代，
或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。
在一些实施方案中，所述化合物由式VA或式VA的结构表示：
Figure BDA0003971812710000075
Figure BDA0003971812710000081
在一些实施方案中，Q1、Q2、Q3和Q4为CN、NO2、CF3、F、Cl、Br、I、炔基、SO2N(R)2、NHCOOR、N(R)2、NHCOR、COR或苯基，其中所述苯基任选地被卤素、CN或OH取代。
在一些实施方案中，所述化合物由以下化合物中的任一个表示：
Figure BDA0003971812710000082
Figure BDA0003971812710000091
Figure BDA0003971812710000101
Figure BDA0003971812710000111
在一些实施方案中，所述化合物由化合物26a表示：
Figure BDA0003971812710000112
在一些实施方案中，所述化合物由以下化合物中的任一个表示：
Figure BDA0003971812710000113
在一些实施方案中，所述化合物由化合物21a或21c表示。
Figure BDA0003971812710000121
在一些实施方案中，所述化合物由以下化合物中的任一个表示：
Figure BDA0003971812710000122
如本文所用，术语“烷基”是指直链或支链的饱和脂族烃。所述烷基可具有1-12个碳、1-7个碳、1-6个碳或1-4个碳原子。在一些实施方案中，所述烷基可以被卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、硝基、CN、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫基或硫烷基取代。
“芳烷基”是指与芳基结合的烷基，其中烷基和芳基如本文中所定义。芳烷基的实例是苄基。
“炔基”是指具有一个或多个三键的不饱和直链或支链烃。所述炔基可具有2-12个碳。在一些实施方案中，所述炔基具有2-6个碳或2-4个碳。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基或丁炔基等。所述炔基可被卤素、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫基或硫烷基取代。
如本文所用，术语“芳基”是指具有至少一个碳环芳族基团的芳族基团，其可以是未取代的或取代的。所述取代基包括但不限于卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫基或硫烷基。芳环的非限制性实例是苯基和萘基。所述芳基可以是6-12元环。在一些实施方案中，所述芳基可以是苯环。
术语“杂芳基”是指具有至少一个杂环芳环的芳族基团。在一个实施方案中，所述杂芳基包含至少一个杂原子(如硫、氧、氮、硅、磷或其任意组合)作为环的一部分。在另一个实施方案中，所述杂芳基可以是未被取代的或被选自以下的一个或多个基团取代：卤素、芳基、杂芳基、氰基、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰胺基、烷基酰胺基、二烷基酰胺基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫基或硫烷基。杂芳环的非限制性实例是吡喃基、吡咯基、吡嗪基、嘧啶基、吡唑基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、异噁唑基等。在一个实施方案中，所述杂芳基为5-12元环。在一个实施方案中，所述杂芳基为五元环。在一个实施方案中，所述杂芳基为六元环。在另一个实施方案中，所述杂芳基为5-8元环。在另一个实施方案中，所述杂芳基包含1-4个稠环。在一个实施方案中，所述杂芳基为1，2，3-三唑。在一个实施方案中，所述杂芳基为吡啶基。在一个实施方案中，所述杂芳基为联吡啶。在一个实施方案中，所述杂芳基为三联吡啶。
如本文所用，术语“卤代烷基”是指被一个或多个卤素原子(例如F、Cl、Br或I)取代的烷基。
“羟基”是指OH基团。
术语“卤素”或“卤代”或“卤化物”是指卤素，例如F、Cl、Br或I。
如本文所用，在一些实施方案中，术语“吡唑化合物”可指“吡唑基丙酰胺化合物”。在一些实施方案中，术语“吡唑丙酰胺”和“吡唑基丙酰胺”可以互换使用。
在一个实施方案中，本发明提供本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物或其衍生物、旋光异构体、异构体、代谢物、药学上可接受的盐、药物产物、水合物、N-氧化物、前药、多晶型物、晶体或其组合的用途。
在一个实施方案中，本发明的方法利用所述吡唑基丙酰胺化合物的“药学上可接受的盐”，其可通过化合物与酸或碱的反应来制备。
可将本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物转化为药学上可接受的盐。药学上可接受的盐可以通过化合物与酸或碱的反应来制备。
合适的胺的药学上可接受的盐可由无机酸或由有机酸制备。胺的无机盐的实例包括但不限于硫酸氢盐、硼酸盐、溴化物、氯化物、半硫酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、2-羟乙基磺酸盐(羟基乙烷磺酸盐)、碘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐(isethionate)、硝酸盐、过硫酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氨基磺酸盐、磺胺酸盐、磺酸(烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、卤素取代的烷基磺酸盐、卤素取代的芳基磺酸盐)、磺酸盐或硫氰酸盐。
胺的有机盐的实例可选自脂族、环脂族、芳族、芳脂族、杂环、羧酸和磺酸类有机酸，其实例为乙酸盐、精氨酸盐、天冬氨酸盐、抗坏血酸盐、己二酸盐、邻氨基苯甲酸盐、藻酸盐(algenate)、烷烃羧酸盐、取代的烷烃羧酸盐、海藻酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、羧酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环己基氨基磺酸盐、环戊烷丙酸盐、乙二胺四乙酸钙、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、克拉维酸盐、肉桂酸盐、二羧酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基磺酸盐、二盐酸盐、癸酸盐、庚酸盐(enanthuate)、乙烷磺酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、甲酸盐、氟化物、半乳糖醛酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、葡庚糖酸盐、羟乙酰氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate)、戊二酸盐、谷氨酸酯、庚酸盐、己酸盐、羟基马来酸盐、羟基羧酸、己基间苯二酚盐、羟基苯甲酸盐、羟基萘甲酸盐、氢氟酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、亚甲基双(β-氧基萘甲酸盐)、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基磺酸盐、马来酸单钾盐、粘酸盐、单羧酸盐、硝酸盐、萘磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、萘磺酸盐(napsylate)、N-甲基葡糖胺、草酸盐、辛酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、苯乙酸盐、苦味酸盐、苯基苯甲酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、邻苯二甲酸盐、果胶酸盐、苯基丙酸盐、棕榈酸盐、泛酸盐(pantothenate)、多聚半乳糖酸盐、丙酮酸盐、奎尼酸盐(quinate)、水杨酸盐、琥珀酸盐、硬脂酸盐、磺胺酸盐、次醋酸盐(subacetate)、酒石酸盐、茶碱乙酸盐(theophyllineacetate)、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)、三氟乙酸盐、对苯二甲酸盐、鞣酸盐(tannate)、8-氯茶碱盐(teoclate)、三卤乙酸盐、三乙碘化物、三羧酸盐、十一烷酸盐和戊酸盐(valerate)。羧酸或酚的无机盐的实例可选自铵盐、碱金属和碱土金属。碱金属包括但不限于锂、钠、钾或铯。碱土金属包括但不限于钙、镁、铝；锌、钡、胆碱或季铵。羧酸或酚的有机盐的实例可选自精氨酸、有机胺，包括脂族有机胺、脂环族有机胺、芳族有机胺、苄星青霉素(benzathine)、叔丁胺、苯乙苄胺(N-苄基苯乙胺)、二环己胺、二甲胺、二乙醇胺、乙醇胺、乙二胺、肼胺(hydrabamine)、咪唑、赖氨酸、甲胺、葡甲胺(meglamine)、N-甲基-D-葡糖胺、N，N’-二苄基乙二胺、烟酰胺、有机胺、鸟氨酸、吡啶、甲基吡啶、哌嗪、普鲁卡因、三(羟甲基)甲胺、三乙胺、三乙醇胺、三甲胺、氨丁三醇和脲。
在各种实施方案中，本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物的药学上可接受的盐包括但不限于：HCl盐、草酸盐、酒石酸盐、HBr盐和琥珀酸盐。每个都代表本发明的单独实施方案。
盐可以通过常规方式形成，如通过使产物的游离碱或游离酸形式与一个或多个当量的适当酸或碱在盐不溶的溶剂或介质中，或者在真空中或通过冷冻干燥移除的溶剂(如水)中反应来进行，或者通过使现有盐的离子与另一种离子或适合的离子交换树脂交换来进行。
本发明的方法可使用不带电的化合物或所述化合物的药学上可接受的盐。具体而言，所述方法使用式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的药学上可接受的盐。所述药学上可接受的盐可以是式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的胺盐或酚盐。
在一个实施方案中，本发明的方法利用游离碱、游离酸、不带电或不络合的式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物，和/或其异构体、旋光异构体、或旋光异构体的任意混合物、药物产物、水合物、多晶型物或其组合。
在一个实施方案中，本发明的方法利用式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、v、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的旋光异构体。在一个实施方案中，本发明的方法利用式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的异构体。在一个实施方案中，本发明的方法利用式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的药物产物。在一个实施方案中，本发明的方法利用式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的水合物。在一个实施方案中，本发明的方法利用式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的多晶型物。在一个实施方案中，本发明的方法利用式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的代谢物。在另一个实施方案中，本发明的方法利用包含式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的组合物，或在另一个实施方案中，式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的异构体、旋光异构体、药学上可接受的盐、代谢物、药物产物、水合物、多晶型物的组合。
如本文所用，术语“异构体”包括但不限于旋光异构体、结构异构体或构象异构体。
术语“异构体”意在涵盖本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物的旋光异构体。本领域技术人员会理解，本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物含有至少一个手性中心。因此，所述化合物能够以光学活性(如(R)异构体或(S)异构体)或外消旋形式存在。光学活性化合物可以对映异构体富集的混合物的形式存在。一些化合物还可表现出同质多晶。会理解，本发明涵盖任何外消旋、光学活性、多晶型或立体异构形式，或其混合物。因此，本发明可使用纯(R)-异构体或纯(S)-异构体形式的吡唑基丙酰胺化合物。本领域已知如何制备光学活性形式。例如，通过重结晶技术拆分外消旋形式，通过由光学活性原料合成，通过手性合成，或通过使用手性固定相的色谱分离。
本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物可为化合物的水合物。如本文所用，术语“水合物”包括但不限于半水合物、单水合物、二水合物或三水合物。本发明还包括本文所描述的化合物的氨基取代基的N-氧化物的用途。
本发明可使用本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物的代谢物。在一个实施方案中，“代谢物”意指由另一种物质通过代谢或代谢过程产生的任何物质。
在一些实施方案中，本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物可以通过本领域已知的任意方法制备。在其他实施方案中，本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物是基于实施例1中的合成方法制备的。
发现本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物具有有利的体外筛选特性、大鼠中有益的体内PK特性、改善的第二性器官如精囊(SV)和前列腺腹叶(VP)的体内药效学的效力和功效，以及抗雄激素抗性CRPC如恩杂鲁胺抗性(称作MDVR)VCaP异种移植物的体内模型中改善的效力。如本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物的体内抗雄激素性在临床前模型和下文的广泛范围中具有远超过前几代SARD的效力和功效。这些数据表明这些吡唑基丙酰胺化合物具有泛拮抗特性，并且具有高度有效力和有效的体内活性。
如本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物具有优于直接(氟他胺(1)、比卡鲁胺(2)、尼鲁米特(3)、恩杂鲁胺(4)、阿帕鲁胺(5)或达洛鲁胺(6))或间接(醋酸阿比特龙(7))LBD靶向AR拮抗剂的优点，因为它们抑制和降解迄今测试的所有形式的AR蛋白，从而与批准的药剂相比扩大了对抑制敏感的CRPC模型的范围。此外，如本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物在体内表现出优异的ADME和PK特性，从而允许完整动物中的抗雄激素抗性模型中前所未有的异种移植物功效，并且本文中报道用于类似的分子。临床前特性包括降解(在大多数情况下)和抑制wtAR、AR点突变、截短突变体、AR过表达(例如，AR基因扩增)以及它们的组合的能力，以及改善的体内PK和PD特性。
在一个方面中，本发明提供治疗需要其的个体中的前列腺癌(PCa)的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、WA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗或抑制前列腺癌(PCa)的进展或增加患有前列腺癌的个体的存活期的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
在一些实施方案中，所述前列腺癌可依赖于AR-FL和/或AR-SV进行增殖。所述前列腺癌可对用以下治疗具有抗性：达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、比卡鲁胺、阿比特龙、EPI-001、EPI-506、AZD-3514、加来特龙、ASC-J9、氟他胺、羟基氟他胺、尼鲁米特、醋酸环丙孕酮、酮康唑、螺内酯，或其任意组合。
本发明的方法还可以降低AR、AR-FL、具有赋予抗雄激素抗性的AR-LBD突变的AR-FL、AR-SV、基因扩增的AR或其任意组合的水平。
在本发明方法的一些实施方案中，所述前列腺癌为达洛鲁胺抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌或阿比特龙抗性前列腺癌.
在一个实施方案中，本发明提供治疗达洛鲁胺抗性前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗或抑制达洛鲁胺抗性前列腺癌(PCa)的进展或增加患有阿帕鲁胺抗性前列腺癌的个体的存活期的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
在一个实施方案中，本发明提供治疗恩杂鲁胺抗性前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗或抑制恩杂鲁胺抗性前列腺癌的进展或增加患有恩杂鲁胺抗性前列腺癌的个体的存活期的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
在一个实施方案中，本发明提供治疗阿帕鲁胺抗性前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、v、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗或抑制阿帕鲁胺抗性前列腺癌(PCa)的进展或增加患有阿帕鲁胺抗性前列腺癌的个体的存活期的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
在一个实施方案中，本发明提供治疗阿比特龙抗性前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗或抑制阿比特龙抗性前列腺癌的进展或增加患有阿比特龙抗性前列腺癌的个体的存活期的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
在本发明方法的一些实施方案中，所述前列腺癌是晚期前列腺癌、难治性前列腺癌或去势抵抗性前列腺癌或去势敏感性前列腺癌。在一些实施方案中，所述去势抵抗性前列腺癌(CRPC)是转移性CRPC(mCRPC)、非转移性CRPC(nmCRPC)或高风险nmCRPC。
本发明提供治疗需要其的个体中的晚期前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗或抑制晚期前列腺癌(PCa)的进展或增加患有晚期前列腺癌的个体的存活期的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明提供治疗需要其的个体中的难治性前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗或抑制难治性前列腺癌(PCa)的进展或增加患有难治性前列腺癌的个体的存活期的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明提供治疗需要其的个体中的去势抵抗性前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
在本发明方法的一些实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用雄激素剥夺疗法。
本发明涵盖治疗或抑制去势抵抗性前列腺癌的进展或增加患有去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的个体的存活期的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21i、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
在本发明方法的一些实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用雄激素剥夺疗法。
在一些实施方案中，所述方法还包括第二疗法，例如雄激素剥夺疗法(ADT)或LHRH激动剂或拮抗剂。LHRH激动剂包括但不限于醋酸亮丙瑞林。
如本文所用，术语“增加存活期”是指在描述个体的存活期时的时间延长。因此，在本文中，本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物可用于增加患有晚期前列腺癌、难治性前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)、转移性CRPC(mCRPC)、非转移性CRPC(nmCRPC)、高风险nmCRPC、或达洛鲁胺抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌或阿比特龙抗性前列腺癌的男性的存活期。
或者，如本文所用，术语“增加(increase，increasing，increased)”可互换使用，且指实体变得越来越大(如在尺寸、量、数目或强度中)，其中例如，所述实体为性激素结合球蛋白(SHBG)或前列腺特异性抗原(PSA)。
本文中描述的化合物可用于增加患有非转移性前列腺癌的个体的无转移存活期(MFS)。非转移性前列腺癌可以是非转移性晚期前列腺癌、非转移性CRPC(nmCRPC)或高风险nmCRPC。
本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物可用于提供双重作用。例如，所述吡唑基丙酰胺化合物可以治疗前列腺癌并预防转移。所述前列腺癌可以是难治性前列腺癌、晚期前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)、转移性CRPC(mCRPC)、非转移性CRPC(nmCRPC)或高风险nmCRPC。
处于进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的高风险的患有晚期前列腺癌的男性是血清总睾酮浓度大于20ng/dL的进行ADT的男性或患有晚期前列腺癌的男性，所述男性在开始ADT时具有以下中的任一者：(1)确认Gleason模式4或5前列腺癌，(2)转移性前列腺癌，(3)PSA倍增时间＜3个月，(4)PSA≥20ng/mL，或(5)确定的局部疗法(根治性前列腺切除术或放射治疗)后PSA复发＜3年。
前列腺特异性抗原(PSA)的正常水平取决于数个因素，如年龄和男性个体的前列腺的大小等。PSA水平在2.5-10ng/mL之间被认为是“临界高”，而高于10ng/mL的水平被认为是“高”。速率变化或“PSA速度”大于0.75/年被认为是高的。尽管持续ADT或ADT史、手术阉割或尽管用抗雄激素药和/或LHRH激动剂治疗，PSA水平仍可能增加。
具有高风险非转移性去势抵抗性前列腺癌(高风险nmCRPC)的男性可包括具有快速PSA倍增时间的那些男性，其具有约18个月或更短的预期无进展存活期(Miller K，MoulJW，Gleave M等人，2013.“Phase III，randomized，placebo-controlled study of once-daily oral zibotentan(ZD4054)in patients with non-metastatic castration-resistant prostate cancer，”Prostate Canc Prost Dis.二月；16：187-192)。其疾病的这种相对快速进展强调了用于这些个体的新型疗法的重要性。
本发明的方法可以治疗PSA水平大于8ng/mL的个体，其中所述个体患有高风险nmCRPC。患者群体包括患有nmCRPC的个体，其中PSA在小于8个月或小于10个月内翻倍。所述方法还可治疗其中患有高风险nmCRPC的个体中总血清睾酮水平大于20ng/mL的患者群体。在一种情况下，无血清睾酮水平大于患有高风险nmCRPC的睾丸切除的男性个体中观察到的无血清睾酮水平。
前列腺癌、晚期前列腺癌、CRPC、mCRPC、nmCRPC、达洛鲁胺抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌和/或阿比特龙抗性前列腺癌的治疗可导致前列腺癌相关症状、功能和/或存活期的临床上有意义的改善。如果癌症是转移性的，则可以通过放射无进展存活期(rPFS)的增加来确定临床上有意义的改善，或者如果癌症是非转移性的，则通过无转移存活期(MFS)的增加来确定；等等。
本发明涵盖降低患有前列腺癌、晚期前列腺癌、转移性前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌(CRPC)、达洛鲁胺抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌或阿比特龙抗性前列腺癌的男性个体的血清前列腺特异性抗原(PSA)水平的方法，其包括给药治疗有效量的化合物，其中所述化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的结构表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖降低患有去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的男性个体的血清PSA的次级激素疗法的方法，其包括给药治疗有效量的式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物，所述化合物降低患有去势抵抗性前列腺癌的男性个体的血清PSA。
本发明涵盖降低需要其的个体中的AR、AR-全长(AR-FL)、具有赋予抗雄激素抗性的AR-LBD突变的AR-FL、AR-剪接变体(AR-SV)的水平和/或肿瘤内AR基因的扩增的方法，其包括给药治疗有效量的式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物，以降低AR、AR-全长(AR-FL)、具有赋予抗雄激素抗性的AR-LBD或其它AR突变的AR-FL、AR-剪接变体(AR-SV)的水平和/或肿瘤内的AR基因的扩增。
所述方法可以增加放射无进展存活期(rPFS)或无转移存活期(MFS)。
个体可能患有非转移性癌症；失败的雄激素剥夺疗法(ADT)，接受睾丸切除术，或具有高或增加的前列腺特异性抗原(PSA)水平；个体可以是患有前列腺癌、晚期前列腺癌、难治性前列腺癌的患者、CRPC患者、转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者、非转移性去势抵抗性前列腺癌(nmCRPC)患者、达洛鲁胺抗性前列腺癌、或恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌或阿比特龙抗性前列腺癌。在这些个体中，nmCRPC可以是高风险nmCRPC。另外，所述个体可在具有或不具有总T的去势水平下进行雄激素剥夺疗法(ADT)。
如本文所用，短语“患有去势抵抗性前列腺癌的个体”是指具有以下特征中的至少一种的个体：先前已经用雄激素剥夺疗法(ADT)治疗；对ADT有响应且目前血清PSA＞2ng/mL或者＞2ng/mL且表现高于ADT实现的最低点的25％增加；尽管维持雄激素剥夺疗法，但仍被诊断为具有血清PSA进展的个体；血清总睾酮的去势水平(＜50ng/dL)或血清总睾酮的去势水平(＜20ng/dL)。所述个体可以在至少间隔2周的两次连续评估中具有升高的血清PSA；用ADT有效治疗；或在开始ADT后有血清PSA响应史。
如本文所使用，术语“血清PSA进展”是指血清PSA增加25％或更多，且从最低点绝对增加2ng/ml或更多；或开始雄激素剥夺疗法(ADT)后血清PSA＞2ng/mL，或＞2ng/mL和高于最低点的25％增加。术语“最低点”是指患者经历ADT时的最低PSA水平。
术语“血清PSA反应”是指以下中的至少一种：在开始ADT之前血清PSA值的至少90％降低；在任何时间<10ng/mL血清PSA的不可检测水平(＜0.2ng/mL)；血清PSA自基线的至少50％下降；血清PSA自基线的至少90％下降；血清PSA自基线的至少30％下降；或血清PSA自基线的至少10％下降。
本发明的方法包括给药ADT形式与本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的组合。ADT形式包括LHRH激动剂。LHRH激动剂包括但不限于醋酸亮丙瑞林
Figure BDA0003971812710000182
(US专利号5,480,656；5,575,987；5,631,020；5,643,607；5,716,640；5,814,342；和6,036,976，在此通过援引加入)或醋酸戈舍瑞林
Figure BDA0003971812710000183
(US专利号7,118,552；7,220,247；和7,500,964，在此通过援引加入)。ADT形式包括但不限于LHRH拮抗剂、可逆抗雄激素药或双侧睾丸切除术。LHRH拮抗剂包括但不限于地加瑞克和阿巴瑞克。抗雄激素药包括但不限于比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺、非那雄胺、度他雄胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、EPI-001、EPI-506、达洛鲁胺、尼鲁米特、氯地孕酮、阿比特龙，或其任意组合。在一些实施方案中，本发明的方法涵盖至少给药本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物(例如式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物)和裂解酶抑制剂(例如阿比特龙)。
术语“晚期前列腺癌”是指起源于前列腺，且已广泛转移至超出前列腺，如周围组织，包括精囊、骨盆淋巴结或骨骼，或身体的其它部分的转移性癌症。前列腺癌病变以增加的恶性通过1到5的Gleason分级来分级。具有显著的前列腺癌进展性疾病和/或死亡风险的患者应该包含在该定义中，且疾病阶段低至IIB的患有前列腺包膜外癌症的任何患者显然具有“晚期”疾病。“晚期前列腺癌”可以指局部晚期前列腺癌。
术语“难治性”可指对治疗无响应的癌症。例如，前列腺癌或乳腺癌可在治疗开始时具有抗性或者其可在治疗期间变得具有抗性。“难治性癌症”在本文中也可称为“抗性癌症”。
术语“去势抵抗性前列腺癌”(CRPC)是指在患者维持ADT或其它疗法以减少睾酮时正恶化或进展的晚期前列腺癌，或视为激素难治性、激素静息性
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雄激素非依赖性或化学或手术去势抵抗性的前列腺癌。CRPC可以是通过内分泌雄激素合成的AR活化的结果；缺乏配体结合域(LBD)的AR剪接变体(AR-SV)的表达；或具有抵抗拮抗剂潜能的AR-LBD或其它AR突变的表达。去势抵抗性前列腺癌(CRPC)是一种晚期前列腺癌，尽管正在进行ADT和/或手术去势，但仍在发展中。去势抵抗性前列腺癌被定义为不管先前的手术去势，用促性腺激素释放激素激动剂(例如，亮丙瑞林)或拮抗剂(例如，地加瑞克或阿巴瑞克)、抗雄激素药(例如，比卡鲁胺、氟他胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、达洛鲁胺、酮康唑、胺鲁米特)、化学治疗剂(例如，多西他赛、紫杉醇、卡巴他赛、阿霉素、米托蒽醌、雌莫司汀、环磷酰胺)、激酶抑制剂(伊马替
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或吉非替尼
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卡博替尼(CometriqTM，也称为XL184))或其它前列腺癌疗法(例如，疫苗(西普亮塞-T(sipuleucel-T)
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GVAX等)、草药(PC-SPES)和裂解酶抑制剂(阿比特龙))的持续治疗，而继续进展或恶化或不利地影响患者的健康的前列腺癌，如通过前列腺特异性抗原(PSA)的增加或更高的血清水平、癌转移、骨转移、疼痛、淋巴结牵连、肿瘤生长的增加的尺寸或血清标志物、恶化的预后诊断标志物或患者病况所证实。
去势抵抗性前列腺癌可定义为激素静息性前列腺癌。在患有去势抵抗性前列腺癌的男性中，肿瘤细胞可具有在不存在雄激素(促进雄性特征的发育和维持的激素)下生长的能力。
许多早期前列腺癌需要雄激素来生长，但晚期前列腺癌是雄激素非依赖性或激素静息性的。
术语“雄激素剥夺疗法”(ADT)可包括睾丸切除术；给药促黄体激素释放激素(LHRH)类似物；给药促黄体激素释放激素(LHRH)拮抗剂；给药5α-还原酶抑制剂；给药抗雄激素药；给药睾酮生物合成抑制剂；给药雌激素；或给药17a-羟化酶/C17,20裂解酶(CYP17A1)抑制剂。LHRH药物降低睾丸产生的睾酮量。在美国可用的LHRH类似物的实例包括亮丙瑞林
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戈舍瑞林
Figure BDA0003971812710000195
曲普瑞林
Figure BDA0003971812710000196
和组氨瑞林
Figure BDA0003971812710000197
抗雄激素药阻断身体使用任何雄激素的能力。抗雄激素药物的实例包括达洛鲁胺
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恩杂鲁胺
Figure BDA0003971812710000199
阿帕鲁胺
Figure BDA00039718127100001910
氟他胺
Figure BDA00039718127100001911
比卡鲁胺
Figure BDA00039718127100001912
和尼鲁米特
Figure BDA00039718127100001913
促黄体激素释放激素(LHRH)拮抗剂包括阿巴瑞克
Figure BDA00039718127100001914
或地加瑞克
Figure BDA00039718127100001915
(2008年由FDA批准用于治疗晚期前列腺癌)。5α-还原酶抑制剂阻断人体的睾酮转化为更具活性的雄激素、5α-双氢睾酮(DHT)的能力，并且包括如非那雄胺
Figure BDA00039718127100001916
和度他雄胺
Figure BDA00039718127100001917
的药物。睾酮生物合成抑制剂包括如酮康唑
Figure BDA00039718127100001918
的药物。雌激素包括己烯雌酚或17β-雌二醇。17α-羟化酶/C17,20裂解酶(CYP17A1)抑制剂包括阿比特龙
Figure BDA00039718127100001919
本发明涵盖治疗抗雄激素抗性前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。在一些实施方案中，所述抗雄激素药可包括但不限于比卡鲁胺、羟基氟他胺、氟他胺、达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺和/或阿比特龙。
本发明涵盖治疗需要其的个体中的前列腺癌的方法，其中所述个体具有重排AR、过表达AR的前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、去势敏感性前列腺癌、表达AR-V7的前列腺癌或表达d567ES的前列腺癌，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
在一个实施方案中，所述去势抵抗性前列腺癌是重排AR、过表达AR的去势抵抗性前列腺癌、表达F876L突变的去势抵抗性前列腺癌、表达F876L_T877A双重突变的去势抵抗性前列腺癌、表达AR-V7的去势抵抗性前列腺癌、表达d567ES的去势抵抗性前列腺癌和/或以瘤内雄激素合成为特征的去势抵抗性前列腺癌。
在一个实施方案中，所述去势敏感性前列腺癌是表达F876L突变的去势敏感性前列腺癌、F876L_T877A双重突变的去势敏感性前列腺癌和/或以瘤内雄激素合成为特征的去势敏感性前列腺癌。
在一个实施方案中，所述去势敏感性前列腺癌的治疗在非去势情境下，或作为单一疗法，或当去势敏感性前列腺癌肿瘤对达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺和/或阿比特龙有抗性时进行。
本发明涵盖治疗需要其的个体中的过表达AR的前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗需要其的个体中的去势抵抗性前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。在一个实施方案中，所述去势抵抗性前列腺癌是重排AR、过表达AR的去势抵抗性前列腺癌、表达F876L突变的去势抵抗性前列腺癌、表达F876L T877A双重突变的去势抵抗性前列腺癌、表达AR-V7的去势抵抗性前列腺癌、表达d567ES的去势抵抗性前列腺癌和/或以瘤内雄激素合成为特征的去势抵抗性前列腺癌。
本发明涵盖治疗需要其的个体中的去势敏感性前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。在一个实施方案中，所述去势敏感性前列腺癌是表达F876L突变的去势敏感性前列腺癌、F876L_T877A双重突变的去势敏感性前列腺癌和/或以瘤内雄激素合成为特征的去势敏感性前列腺癌。在一个实施方案中，去势敏感性前列腺癌的治疗在非去势情境下，或作为单一疗法，或当去势敏感性前列腺癌肿瘤对达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺和/或阿比特龙有抗性时进行。
本发明涵盖治疗需要其的个体中的表达AR-V7的前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗需要其的个体中的表达d567ES的前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
在另一方面，本发明提供治疗需要其的个体中的雄激素受体依赖性疾病或病况或者雄激素依赖性疾病或病况的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
如本文所用，术语“雄激素受体相关病况”或“雄激素敏感性疾病或病症”或“雄激素依赖性疾病或病症”是通过雄激素受体的活性调节的或者其发病机制依赖于雄激素受体的活性的病况、疾病或病症。雄激素受体在身体的大部分组织中表达，然而，其尤其在前列腺和皮肤中过表达。ADT多年来一直是前列腺癌治疗的支柱，且本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物也可适用于治疗多种前列腺癌、良性前列腺肥大、肢端肥大和其它前列腺疾病。在一个实施方案中，“雄激素受体依赖性疾病或病况”是部分或完全依赖于或对体内雄激素活性或AR轴激活敏感的医学病况。在一个实施方案中，雄激素依赖性疾病或病况可与雄激素受体依赖性疾病或病况互换使用。
本发明涵盖治疗良性前列腺肥大的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗肢端肥大的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗过度增殖前列腺病症和疾病的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
术语“减少发病机制”应理解为涵盖减少与特定疾病、病症或病况相关的组织损伤或器官损伤。该术语可包括降低与所讨论的相关的疾病、病症或病况的发生率或严重性，或减少与所指明的相关的疾病、病症或病况或与其相关的症状的数量。
三阴性乳腺癌(TNBC)是一种缺乏雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和HER2受体激酶表达的乳腺癌类型。TNBC缺乏用于治疗其它类型原发性乳腺癌的激素和激酶治疗靶点。化学疗法通常是TNBC的初始药物疗法。AR通常仍然在TNBC中表达，并可提供替代化学疗法的激素靶向治疗。在ER阳性乳腺癌中，AR是阳性预后指标，因为认为AR的活化限制和/或抵抗ER在乳房组织和肿瘤中的效应。在没有ER存在下，AR实际上可能支持乳腺癌肿瘤的生长。尽管尚未充分了解AR在TNBC中的作用，但某些TNBC可能受到缺乏LBD的AR-SV的雄激素非依赖性活化或全长AR的雄激素依赖性活化的支持。达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺和其它LBD导向的传统AR拮抗剂不能够拮抗这些TNBC中的AR-SV。本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物能够通过AR的NTD中的结合位点破坏AR-SV，其能够拮抗AR(包括在源自TNBC患者的异种移植物中观察到的AR-SV)，并提供抗肿瘤作用。
在一个实施方案中，本发明提供治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本发明涵盖治疗或抑制三阴性乳腺癌(TNBC)的进展或增加患有三阴性乳腺癌的个体的存活期的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、v、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物由式10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物表示。在一些实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物是化合物16b、16c、16g、16i、16j、21a、21c、26a、26c、26e、26f或26g。在其它实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物为化合物26a。
本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物可用于药物组合物中。如本文所用，“药物组合物”意指活性成分的化合物或药学上可接受的盐与药学上可接受的载体或稀释剂。如本文所用，“治疗有效量”是指为既定适应症和给药方案提供治疗效果的量。
包含本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物的药物组合物可进一步包含至少一种LHRH激动剂或拮抗剂、抗雄激素药、抗程序死亡受体1(抗PD-1)药物或抗PD-L1药物。LHRH激动剂包括但不限于醋酸亮丙瑞林
Figure BDA0003971812710000221
(US专利号5,480,656；5,575,987；5,631,020；5,643,607；5,716,640；5,814,342；和6,036,976，在此通过援引加入)或醋酸戈舍瑞林
Figure BDA0003971812710000222
(US专利号7,118,552；7,220,247；和7,500,964，在此通过援引加入)。LHRH拮抗剂包括但不限于地加瑞克或阿巴瑞克。抗雄激素药包括但不限于比卡鲁胺、氟他胺、非那雄胺、度他雄胺、达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、尼鲁米特、氯地孕酮、阿比特龙，或其任意组合。抗PD-1药物包括但不限于AMP-224、纳武单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗和AMP-554。抗PD-L1药物包括但不限于BMS-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗和MPDL3280A。抗-CTLA-4药物包括但不限于伊匹木单抗和曲美木单抗。
如本文所用，术语“给药”是指使个体与本发明化合物接触。如本文所用，给药可以在体外(即在试管中)，或在体内(即在活生物体(例如人))的细胞或组织中完成。所述个体可以是男性或女性个体或两者。
许多标准参考文献可用于描述制备适于给药本发明化合物的各种组合物或制剂的程序。制造制剂和制备物的方法的实例可见于Handbook of PharmaceuticalExcipients，American Pharmaceutical Association(现行版)；Pharmaceutical DosageForms：Tablets(Lieberman，Lachman和Schwartz编)现行版，Marcel Dekker，Inc.出版，以及Remington′s Pharmaceutical Sciences(Arthur Osol编)，1553-1593(现行版)。
给药方式和剂型与对于既定治疗应用所需和有效的化合物或组合物的治疗量紧密相关。
本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法向个体给药。这些方法包括但不限于口服、肠胃外、血管内、癌旁、经粘膜、透皮、肌内、鼻内、静脉内、皮内、皮下、舌下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内、吸入、直肠或瘤内。这些方法包括可将组合物递送至组织的任何方式(例如，针或导管)。或者，局部给药可为向真皮、眼部或粘膜表面施用所需的。另一种给药方法经由抽吸或气雾剂制剂。所述药物组合物可以局部给药于体表，且因此配制成适用于局部给药的形式。合适的局部制剂包括凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、滴剂等等。对于局部给药，制备组合物且将其以溶液剂、混悬剂或乳剂的形式在有或没有药物载体的生理学上可接受的稀释剂中进行施用。
合适的剂型包括但不限于口服、经直肠、舌下、经粘膜、经鼻、经眼、皮下、肌内、静脉内、透皮、脊髓、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴和子宫内给药，以及用于全身递送活性成分的其它剂型。取决于适应症，适于口服或局部给药的制剂是优选的。
局部给药：本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、1VA、IVB、v、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物可以局部给药。如本文所用，“局部给药”是指式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物(和任选存在的载体)直接施用于皮肤和/或毛发。局部用组合物可以是溶液剂、洗剂、油膏、乳膏剂、软膏剂、脂质体、喷雾剂、凝胶剂、泡沫剂、滚筒棒和皮肤病中常规使用的任何其它制剂的形式。
局部给药用于皮肤上发现的适应症，如多毛症、脱发、痤疮和皮脂过量。剂量会变化，但作为普通准则，化合物在皮肤病学可接受的载体中以约0.01至50w/w％，且更通常约0.1至10w/w％的量存在。通常，将皮肤病学制备物每天施用于患病区域1至4次。“皮肤病学可接受”是指可施用于皮肤或毛发，且允许药物扩散到作用部位的载体。更具体地，“作用部位”是指需要抑制雄激素受体或雄激素受体降解的部位。
本发明的组合物还可包括固体制备物，如清洁皂或皂条。这些组合物根据本领域已知的方法进行制备。
诸如水溶液剂、醇溶液剂或水-醇溶液剂、或乳膏剂、凝胶剂、乳剂或摩丝的制剂或者具有抛射剂的气雾剂组合物可用于治疗在存在毛发时出现的适应症。因此，所述组合物也可以是护发组合物。这种护发组合物包括但不限于洗发剂、毛发定型洗剂、护理洗剂、定型乳膏剂或凝胶剂、染料组合物或用于防止脱发的洗剂或凝胶剂。所述皮肤病学组合物中各种成分的量是在所考虑的领域中常规使用的量。
含有本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物，例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物的药物和美容剂通常被包装用于零售分销(即，制品)。这些制品会以指示患者如何使用产品的方式贴标和包装。这种说明书包括待治疗的病况、治疗持续时间、给药时间安排等。
为了制备这种药物剂型，可将活性成分根据常规药物混配技术与药物载体混合。取决于给药所需的制备物形式，载体可采用多种形式。
如本文所用，“药学上可接受的载体或稀释剂”是本领域技术人员公知的。所述载体或稀释剂可以是用于固体制剂的固体载体或稀释剂、用于液体制剂的液体载体或稀释剂，或其混合物。
固体载体/稀释剂包括但不限于树胶、淀粉(例如玉米淀粉、预胶凝化淀粉)、糖(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖、右旋糖)、纤维素材料(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石，或其混合物。
口服或肠胃外给药：在制备呈口服剂型的组合物中，可采用常用药物介质中的任一种。因此，对于液体口服制备物，如混悬剂、酏剂和溶液剂，合适的载体和添加剂包括水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等等。对于固体口服制备物，如散剂、胶囊剂和片剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。由于片剂和胶囊的给药简易性，其代表了最有利的口服单位剂型。如果需要，片剂可通过标准技术包糖衣或包肠溶衣。
对于肠胃外制剂，载体会通常包括无菌水，但也可包括其它成分，如有助于溶解度或用于防腐的成分。也可制备可注射溶液剂，在这种情况下，可采用适当的稳定剂。
在一些应用中，可能有利的是利用“载体化”形式的活性剂，如通过在脂质体或其它包封介质中包封活性剂，或通过固定活性剂，例如通过在适合的生物分子，如选自蛋白质、脂蛋白、糖蛋白和多糖的生物分子上的共价结合、螯合或缔合配位。
使用适于口服给药的制剂的治疗方法可以作为离散单位提供，如胶囊剂、扁囊剂、片剂或锭剂，它们各自含有预定量的活性成分。任选地，可采用水性液体或非水性液体中的混悬剂，如糖浆剂、酏剂、乳剂或顿服剂。
片剂可通过压缩或模制，或湿法制粒制得，其任选地具有一种或多种辅助成分。压制片剂可通过在合适机器中的压制进行制备，其中活性化合物呈自由流动形式，如粉末或颗粒，其任选地与例如粘合剂、崩解剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或拔染剂混合。由粉末状活性化合物与合适的载体的混合物构成的模制片剂可通过在合适机器中模制而制得。
糖浆剂可以通过将活性化合物添加到糖(例如蔗糖)的浓缩水溶液中来制备，也可以向其中添加任何辅助成分。这些辅助成分可包括调味剂、合适的防腐剂、延缓糖结晶的试剂以及增加任何其它成分(如多羟基醇，例如甘油或山梨糖醇)的溶解度的试剂。
适于肠胃外给药的制剂可包括活性化合物的无菌水性制备物，其优选地与接受者的血液等渗(例如，生理盐水溶液)。这些制剂可包含助悬剂和增稠剂以及脂质体或其它微粒系统，其被设计成将化合物靶向血液组分或者一种或多种器官。制剂能够以单位剂量或多剂量形式呈现。
肠胃外给药可包括任何适合的全身递送形式。给药可例如为静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮下、肌内、腹内(例如腹膜内)等，且可由输液泵(外部或可植入)或任何其它适于期望给药方式的合适的装置实现。
鼻用和其它粘膜喷雾制剂(例如可吸入形式)可包括活性化合物与防腐剂和等渗剂的纯化水溶液。这些制剂优选地调节至与鼻或其它粘膜相容的pH和等渗状态。或者，其可呈悬浮于气体载体中的细粒固体粉末形式。这些制剂可通过任何合适的方式或方法递送，例如通过喷雾器、雾化器、定量吸入器等。
用于直肠给药的制剂可呈现为具有合适载体(如可可脂、氢化脂肪或氢化脂肪羧酸)的栓剂。
透皮制剂可通过在触变性或凝胶状载体(如纤维素介质，例如甲基纤维素或羟乙基纤维素)中引入活性剂进行制备，其中所得的制剂随后装入透皮装置中，该透皮装置被适配为确保与穿戴者的皮肤进行皮肤接触。
除前述成分之外，本发明的制剂可进一步包含选自以下的一种或多种成分：稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等等。
所述制剂可以是立即释放、持续释放、延迟起释或本领域技术人员已知的任何其它释放特性。
对于向哺乳动物(特别是人类)给药，预期医师会确定治疗的实际剂量和持续时间，其会最适于个体且可随着特定个体的年龄、体重、遗传学和/或响应而变化。
本发明的方法包括以治疗有效量给药化合物。治疗有效量可包括各种剂量。
在一个实施方案中，本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物(例如式I、II、IIA、IIB、III、IIIA、IIIB、IV、IVA、IVB、V、VA、VB、10、16a-16x、21a-21j、26a-26h和29a-29r的化合物)以1-3000mg/天的剂量给药。在额外实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以1-10mg/天、3-26mg/天、3-60mg/天、3-16mg/天、3-30mg/天、10-26mg/天、15-60mg、50-100mg/天、50-200mg/天、100-250mg/天、125-300mg/天、20-50mg/天、5-50mg/天、200-500mg/天、125-500mg/天、500-1000mg/天、200-1000mg/天、1000-2000mg/天、1000-3000mg/天、125-3000mg/天、2000-3000mg/天、300-1500mg/天或100-1000mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以25mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以40mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以50mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以67.5mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以75mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以80mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以100mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以125mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以250mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以300mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以500mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以600mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以1000mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以1500mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以2000mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以2500mg/天的剂量给药。在一个实施方案中，所述吡唑基丙酰胺化合物以3000mg/天的剂量给药。
所述方法可包括以各种剂量给药化合物。例如，所述化合物能够以3mg、10mg、30mg、40mg、50mg、80mg、100mg、120mg、125mg、200mg、250mg、300mg、450mg、500mg、600mg、900mg、1000mg、1500mg、2000mg、2500mg或3000mg的剂量给药。
或者，所述化合物能够以0.1mg/kg/天的剂量给药。所述化合物能够以0.2至30mg/kg/天，或0.2mg/kg/天、0.3mg/kg/天、1mg/kg/天、3mg/kg/天、5mg/kg/天、10mg/kg/天、20mg/kg/天、30mg/kg/天、50mg/kg/天或100mg/kg/天的剂量给药。
所述药物组合物可以是固体剂型、溶液剂或透皮贴剂。固体剂型包括但不限于片剂和胶囊剂。
提供以下实施例以便更全面地说明本发明的优选实施方案。然而，其决不应被解释为限制本发明的广泛范围。
实施例
一般操作、材料和信息.
所有溶剂和化学品购买使用而无进一步纯化。所有反应的进展通过在硅胶60F254板(Merck)上的薄层色谱(TLC)分析进行监测。柱色谱法用硅胶柱[(Merck Kieselgel 60，70-230目，Merck)进行。
一般方法：所有非水性反应均在干燥氮气的惰性气氛下在烘箱干燥的玻璃器具中进行。所有试剂和溶剂均购自Aldrich(St.Louis，MO)、Alfa-Aesar(Ward Hill，MA)、Combi-Blocks(San Diego，CA)、Ark Pharm(Libertyville，IL)，并且无需进一步纯化即使用。分析薄层色谱法在硅胶GHLF 10×20cm Analtech TLC Uniplates(Analtech，Newark，DE)上进行，并且在UV光下通过荧光猝灭可视化。使用Biotage SP1快速色谱纯化系统(Charlotte，NC)(Biotage SNAP Cartridge，二氧化硅，50g&100g)来纯化化合物。1H NMR和13C NMR波谱在Bruker Ascend 400(400MHz)(Billerica，MA)波谱仪上记录。1H NMR的化学位移以从作为氘化溶剂中的内标的四甲基硅烷向低磁场以份每一百万份(ppm)报告(δ)，并且偶合常数(J)以赫兹(Hz)报告。以下缩写用于自旋多重性：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quin＝五重峰，dd＝双二重峰，dt＝双三重峰，qd＝四重双峰，dquin＝双五重峰，m＝多重峰，并且br s＝宽单峰。低分辨质谱(MS)使用Brucker ESQUIRE电喷雾/离子阱仪器以正和负模式获得。高分辨质谱仪(HRMS)数据在配备有Acquity I级UPLC系统的Waters Xevo G2-S QTOF(Milford，MA)系统上获得。
实施例1：吡唑基丙酰胺化合物的合成
合成了一系列吡唑-1-基-丙酰胺化合物，其具有吡唑B环的不同的单取代基(系列I)、不同的芳族A环(系列II)、吡唑B环的不同的二取代基(系列IID或连接部分的修饰(系列IV)，如表1所示。
表1.吡唑-1-基-丙酰胺AR拮抗剂的结构
Figure BDA0003971812710000241
Figure BDA0003971812710000251
Figure BDA0003971812710000261
Figure BDA0003971812710000271
路线1.吡唑-1-基-丙酰胺16a-16x的合成
Figure BDA0003971812710000272
试剂和条件：(a)1.含SOCl2的THF，-10℃至0℃.2.含Et3N的THF，-10℃至0℃，然后至50℃，2-3h；(b)2-丁酮，K2CO3，回流；(c)含NaH的THF，0℃至rt.
化合物13的合成
在EasyMax 100mL反应器中，将(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酸11(5.00g，27mmol)溶解于THF(27mL，5.4体积)中。将搅拌设定为400rpm，并使该溶液冷却至2.5℃。在30分钟内，将亚硫酰氯(2.39mL，1.20当量，0.48体积)缓慢添加到反应混合物中，同时维持反应温度低于12℃。将反应混合物搅拌1.5小时。使反应冷却至-5℃。将三乙胺(5.0mL，1.30当量，1体积)缓慢添加到反应混合物中，保持温度低于12℃。然后，将4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲腈12(4.85g，0.95当量，0.97重量)和THF(3.37mL，0.67体积)加入批料中。然后将批料加热至50±5℃，并搅拌两小时。然后使批料冷却至20±5℃，随后添加水(14.7mL，2.9体积)和甲苯(20.2mL，4.0体积)。在短暂搅拌后，分层。然后用水(14.7mL，2.9体积)洗涤有机层。然后使批料浓缩至5±0.5体积(4±0.5重量)，同时维持批料温度低于50℃，随后添加甲苯(30mL，6体积)。然后将批料蒸馏至5±0.5体积(4±0.5重量)，并使批料温度降低至2.5±2.5℃。然后将批料过滤，并将滤饼用甲苯洗涤两次(每次8.5mL，每次1.7体积)。然后将批料在25-30英寸真空下干燥，以提供(R)-3-溴-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺13。
化合物14的合成
向(R)-3-溴-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺13(5.00g，0.018504mol)的25mL的2-丁酮溶液中添加碳酸钾(3.836g，0.027756mol)。将所得反应混合物在氩气气氛下回流加热2小时。在通过TLC确定反应结束后，使反应物冷却至室温(rt)，通过硅藻土垫过滤，并用15mL的2-丁酮冲洗硅藻土垫。将滤液真空浓缩，并在25-30英寸真空下干燥，以提供(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺14。
一般操作A
16(a-y)、21(a-k)、26(a-h)以及29(a-p)的合成，使用10(UT-34)作为实例
向在冰水浴中冷却的氩气气氛下4-氟-吡唑(0.10g，0.00116mol)(或通式吡唑15)的无水THF(10mL)溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.12g，0.00291mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将(R)-3-溴-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺13(0.41g，0.00116mol)或(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺14(0.313g，0.00116mol)添加到上述溶液中，且使所得反应混合物在rt和氩气下搅拌过夜。反应物用水淬灭，并用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。产物使用乙酸乙酯和己烷(1∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.13g的呈白色固体状的10。
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基-3-(1H-吡唑-1-基)丙酰胺(16a)
根据一般操作A制备化合物16a。将粗品产物通过硅胶柱(使用乙酸乙酯和己烷(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.52g的白色固体状的标题化合物。收率＝52％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.39(s，1H，NH)，8.48(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.22(dd，J＝8.2Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.08(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.66-7.65(m，1H，吡唑-H)，7.39-7.38(m，1H，吡唑-H)，6.28(s，1H，OH)，6.25-6.23(m，1H，吡唑-H)，4.50(d，J＝13.6Hz，1H，CH)，4.29(d，J＝13.6Hz，1H，CH)，1.35(s，3H，CH3).HRMS[C15H14F3N4O2 +]：计算值339.1099，实测值339.1105[M+H]+.
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(10(UT-34)).
根据一般操作A的路线1制备化合物10。将粗品产物通过硅胶柱(使用乙酸乙酯和己烷(1∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.13g的白色固体状的标题化合物。收率＝32％.1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.39(s，1H，NH)，8.47(d，J＝1.6Hz，1H，ArH)，8.24(dd，J＝8.4Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，7.73(d，J＝4.4Hz，，1H，吡唑-H)，7.41(d，J＝4.4Hz，1H，吡唑-H)，6.31(s，1H，OH)，4.38(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.21(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.34(s，3H，CH3).HRMS[C15H13F4N4O2 +]：计算值357.0975，实测值357.0966[M+H]+.
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(3-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16b)
根据一般操作A的路线1制备化合物16b。将粗品产物通过硅胶柱(使用乙酸乙酯和己烷(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.36g的白色针状的标题化合物。收率＝44％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.39(s，1H，NH)，8.47(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.24(dd，J＝8.8Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.11(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.55(t，J＝3.0Hz，1H，吡唑-H)，6.29(s，1H，OH)，5.93-5.91(m，1H，吡唑-H)，4.34(d，J＝13.6Hz，1H，CH)，4.15(d，J＝13.6Hz，1H，CH)，1.36(s，3H，CH3).HRMS[C15H13F4N4O2 +]：计算值357.0975，实测值357.0985[M+H]+.
(S)-3-(4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16c)
根据一般操作A的路线1制备化合物16c。将粗品产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.30g的白色固体状的标题化合物。收率＝55％.1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.38(s，1H，NH)，8.46(s，1H，ArH)，8.23(d，J＝8.6Hz，J＝1.2Hz，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.6Hz，1H，ArH)，7.83(s，1H，吡唑，H)，7.47(s，1H，吡唑-H)，6.34(s，1H，OH)，4.45(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.27(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.36(s，3H，CH3).HRMS[C15H13ClF3N4O2 +]：计算值373.0679，实测值373.0678[M+H]+.纯度：97.69％(HPLC).
(S)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16d)
根据一般操作A的路线1制备化合物16d。将粗品产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.47g的白色形态的标题化合物。收率＝79.6％.1HNMR(400MHz，CDCl3)δ9.08(s，1H，NH)，8.00(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.87(dd，J＝8.4Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.79(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，7.49(s，1H，吡唑-H)，7.47(s，1H，吡唑-H)，5.92(s，1H，OH)，4.64(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.24(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.47(s，3H，CH3).HRMS[C15H13BrF3N4O2 +]：计算值417.0174，实测值417.0167[M+H]+.纯度：99.53％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-3-(4-碘-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺(16e)
根据一般操作A的路线1制备化合物16e。将粗品产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.25g的灰白色固体状的标题化合物。收率＝52％.1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.36(s，1H，NH)，8.45(s，1H，ArH)，8.23(d，J＝8.8Hz，J＝1.2Hz，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.78(s，1H，吡唑-H)，7.46(s，1H，吡唑-H)，6.31(s，1H，OH)，4.48(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.31(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.35(s，3H，CH3).HRMS[C15H13F3IN4O2 +]：计算值465.0035，实测值465.0045[M+H]+.
(S)-3-(4-乙酰基-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16f)
根据一般操作A的路线1制备化合物16f。
将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到70mg的淡黄色固体状的标题化合物。收率＝20％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.37(s，1H，NH)，8.45(d，J＝1.2Hz，1H，ArH)，8.25(s，1H，吡唑-H)，8.23(d，J＝8.2Hz，J＝1.2Hz，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.86(s，1H，吡唑-H)，6-37(s，1H，OH)，4.50(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4-33(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，2.34(s，3H，CH3)，1.39(s，3H，CH3).HRMS[C17H16F3N4O3 +]：计算值381.1175，实测值381.1178[M+H]+.纯度：95.66％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基-3-(4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)丙酰胺(16g)
根据一般操作A的路线1制备化合物16g。将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.30g的白色泡沫状的标题化合物。收率＝50％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.38(s，1H，NH)，8.45(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.25-8.22(m，2H，ArH&吡唑-H)，8.11(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.82(s，1H，吡唑-H)，6.39(s，1H，OH)，4.55(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.37(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.40(s，3H，CH3).HRMS[C16H13F6N4O2]+：计算值407.0943，实测值407.0945[M+H]+.
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基-3-(3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)丙酰胺(16h)
根据一般操作A的路线1制备化合物16h。将产物通过硅胶柱(使用乙酸乙酯和己烷(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0-31g的白色固体状的标题化合物。收率＝50％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10-31(s，1H，NH)，8.42(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.18(dd，J＝8.8Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.09(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.84-7.83(m，1H，吡唑-H)，6.67(d，J＝2.4Hz，1H，吡唑-H)，6.41(s，1H，OH)，4.56(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4-38(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.40(s，3H，CH3).HRMS[C16H13F6N4O2 +]：计算值407.0943，实测值407.0945[M+H]+.
(S)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16i)
根据一般操作A的路线1制备化合物16i。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(1∶1至1∶2)作为洗脱液)纯化，以得到0.18g的白色固体状的标题化合物。收率＝46％.1HNMR(400MHz，DMSO-d6)610.35(s，1H，NH)，8.45(d，J＝1.2Hz，1H，ArH)，8.43(s，1H，吡唑-H)，8.22(d，J＝8.8Hz，J＝1.2Hz，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.98(s，1H，吡唑-H)，6.41(s，1H，OH)，4.45(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.36(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.38(s，3H，CH3).HRMS[C16H13F3N5O2 +]：计算值364.1021，实测值364.1016[M+H]+.纯度：98.48％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基-3-(4-硝基-1H-吡唑-1-基)丙酰胺(16j)
根据一般操作A的路线1制备化合物16j。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(1∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.15g的灰白色固体状的标题化合物。收率＝44％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.36(s，lH，NH)，8.69(s，1H，吡唑-H)，8.45(d，J＝1.2Hz，1H，ArH)，8.23(d，J＝8.8Hz，J＝1.2Hz，1H，ArH)，8.19(s，1H，吡唑-H)，8.11(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，6.47(s，1H，OH)，4.56(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.38(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.41(s，3H，CH3).HRMS[C15H13F3N5O4 +]：计算值384.0920，实测值384.0932[M+H]+.纯度：99.58％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-3-(4-甲氧基-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺(16k)
根据一般操作A的路线1制备化合物16k。将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.30g的白色固体状的标题化合物。收率＝60％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.38(s，1H，NH)，8.46(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.24(dd，J＝8.2Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.35(d，J＝0.8Hz，1H，吡唑-H)，7.15(d，J＝0.8Hz，1H，吡唑-H)，6.25(s，1H，OH)，4.35(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.18(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，3.61(s，3H，CH3)，1.36(s，3H，CH3).HRMS[C16H16F3N4O3 +]：计算值369.1175，实测值369.1182[M+H]+纯度：99.28％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基-3-(4-甲基-1H-吡唑-1-基)丙酰胺(16l)
根据一般操作A的路线1制备化合物16l。将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.28g的白色固体状的标题化合物。收率＝66％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.38(s，1H，NH)，8.46(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.23(dd，J＝8.8Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.41(s，1H，吡唑-H)，7.17(s，1H，吡唑-H)，6.24(s，1H，OH)，4.40(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.22(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.97(s，3H，CH3)，1.36(s，3H，CH3).HRMS[C16H16F3N4O2 +]：计算值353.1225，实测值353.1232[M+H]+.纯度：99.75％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基-3-(4-苯基-1H-吡唑-1-基)丙酰胺(16m)
根据一般操作A的路线1制备化合物16m。将产物通过硅胶柱(使用乙酸乙酯和己烷(1∶2)作为洗脱液)纯化，以得到0.90g的白色针状的标题化合物。收率＝68.5％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.40(s，1H，NH)，8.46(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.24(dd，J＝8.4Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.09(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，8.05(s，1H，吡唑-H)，7.82(s，1H，吡唑-H)，7.52-7.45(m，2H，ArH)，7-35-7-31(m，2H，ArH)，7.20-7.16(m，1H，ArH)，6.33(s，1H，OH)，4.50(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4-30(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.40(s，3H，CH3).HRMS[C21H18F3N4O2]+：计算值415.1382，实测值415.1391[M+H]+.
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基-3-(3-苯基-1H-吡唑-1-基)丙酰胺(16n)
根据一般操作A的路线1制备化合物16n。将产物通过硅胶柱(使用乙酸乙酯和己烷(1∶3至1∶2)作为洗脱液)纯化，以得到0.60g的白色针状的标题化合物。收率＝41.7％.1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10-33(s，1H，NH)，8.48(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.22(dd，J＝8.2Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.05(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.69(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.60-7.57(m，2H，ArH)，7.28-7.21(m，3H，ArH)，6.66(d，J＝3.0Hz，1H，ArH)，6.31(s，1H，OH)，4.52(d，J＝14.6Hz，1H，CH)，4.32(d，J＝14.6Hz，1H，CH)，1.43(s，3H，CH3).质谱(ESI，正)：[C21H18F3N4O2 +]：计算值415.1382，实测值514.1423[M+H]+.
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4-氟苯基)-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16o)
根据一般操作A的路线1制备化合物16o。将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.33g的白色固体状的标题化合物。收率＝62％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.29(s，1H，NH)，8.41(s，1H，ArH)，8.21(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，8.05(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.68(s，1H，吡唑-H)，7.61(t，J＝6.4Hz，2H，ArH)，7.08(t，J＝8.4Hz，2H，ArH)，6.65(s，1H，吡唑-H)，6.30(s，1H，OH)，4.51(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.31(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.42(s，3H，CH3).HRMS[C21H17F4N4O2 +]：计算值433.1288，实测值433.1291[M+H]+.纯度：96.01％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(3-(4-氟苯基)-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16p)
根据一般操作A的路线1制备化合物16p。将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.27g的白色固体状的标题化合物。收率＝43％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.29(s，1H，NH)，8.41(s，1H，ArH)，8.21(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，8.05(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.69(s，1H，吡唑-H)，7.61(t，J＝6.4Hz，2H，ArH)，7.08(t，J＝8.4Hz，2H，ArH)，6.65(s，1H，吡唑-H)，6.30(s，1H，OH)，4.51(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.31(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.42(s，3H，CH3).质谱(ESI，负)：431.12[M-H]-.HRMS[C21H17F4N4O2 +]：计算值433.1288，实测值433.1290[M+H]+.
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-乙炔基-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16q)
根据一般操作A的路线1制备化合物16q。将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(95∶5)作为洗脱液)纯化，以得到0.37g的白色泡沫状的标题化合物。收率＝62.7％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.40(s，1H，NH)，8.47(s，1H，ArH)，8.24(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，8.11(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.91(s 1H，吡唑-H)，7.57(s 1H，吡唑-H)，6.35(s，1H，OH)，4.46(d，J＝14.4Hz，1H，CH)，4.29(d，J＝14.4Hz，1H，CH)，4.00(s，1H，CH)，1.35(s，3H，CH3).HRMS[C17H14F3N4O2 +]：计算值363.1069，实测值363.1026[M+H]+.纯度：99.55％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-3-(4-(4-羟基丁-1-炔-1-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺(16r)
根据一般操作A的路线1制备化合物16r。将产物通过硅胶柱(使用DCM和甲醇(95∶5)作为洗脱液)纯化，以得到0.477g的淡黄色固体状的标题化合物。收率＝20％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.99(brs，1H)，10.47(s，1H，NH)，8.55(s，1H，ArH)，8.29(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，8.08(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.87(s 1H，吡唑-H)，7.49(s 1H，吡唑-H)，6.00(s，1H，OH)，3.64(d，J＝8.2Hz，1H，CH)，4.50(d，J＝9.6Hz，1H，CH)，3.60-3.56(m，2H，CH2)，2.59-2.55(m，2H，CH2)，1.31(s，3H，CH3).HRMS[C19H18F3N4O3 +]：计算值407.1331，实测值407.1267[M+H]+；HRMS[C19H17F3N4NaO3 +]：计算值429.1150，实测值429.1099[M+Na]+.纯度：％(HPLC).
(S)-1-(3-((4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-羟基-2-甲基-3-氧代丙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(16s)
以两步制备化合物16s。在第一步中，根据下文详细描述的一般操作A的路线1合成(-(S)-(1-(3-((4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-羟基-2-甲基-3-氧代丙基)-1H-吡唑-4-基)氨基甲酸叔丁酯16u(用于16s的中间体化合物)。将化合物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到白色固体状的化合物。收率＝69％.1H NMR(CDCl3，400MHz)δ9.13(bs，1H，NH)，8.18(d，J＝10.8Hz，1H)，8.02(d，J＝1.2Hz，1H)，7.94(s，1H)，7.89(d，J＝8.4Hz，1H)，7.77(d，J＝8.4Hz，1H)，7.66(bs，C(O)NHC(O))，5.79(bs，1H，OH)，4.70(d，J＝13.8Hz，1H)，4.32(d，J＝13.8Hz，1H)，1.52(s，3H)，1.50(s，9H).19F NMR(CDCl3，400MHz)δ-62.20.MS(ESI)m/z 480.23[M-H]-；HRMS(ESI)m/z C21H22F3N5O5的计算值382.1127[(M-t-Boc)+H]+实测值382.1129[[(M-t-Boc)+H]+.
第二步：在0℃下，向16u(0.721g，2.05mmol)在EtOH(10mL)中的溶液滴加乙酰氯(3mL)，并进一步在rt下搅拌3h。在减压下移除溶剂后，将混合物用乙酸乙酯和己烷(2∶1)处理，以得到淡黄色固体状的期望化合物。收率＝95％.UV max 194.45，270.45.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.39(bs，1H，NHC(O))，8.46(d，J＝1.6Hz，1H)，8.20(dd，J＝8.6，1.6Hz，1H)，8.08(d，J＝8.6Hz，1H)，8.05(s，1H)，7.75(s，1H)，7.55(bs，2H，C(O)NH2)，6.99(bs，1H，OH)，4.45(d，J＝13.8Hz，1H)，4.28(d，J＝13.8Hz，1H)，1.34(s，3H).19F NMR(DMSO-d6，解耦)δ-61.13.MS(ESI)m/z 380.19[M-H]-；HRMS(ESI)m/z C16H14F3N5O3的计算值382.1127[M+H]+，实测值382.1282[M+H]+.HPLC纯度：98.75％.
(S)-3-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16t)
在0℃下，向16u(参见下文)(0.815g，0.0018mol)在无水EtOH(10mL)中的溶液加入乙酰氯(0.4mL，5.4mmol)，并在rt下搅拌3h。在真空移除溶剂后，将所得混合物通过快速柱色谱法(使用己烷和乙酸乙酯(1∶1，v/v))纯化，以得到褐色固体状的设计化合物。收率＝91％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.31(bs，1H，NH)，10.21(bs，2H，NH2)，8.20(s，1H)，7.98(d，J＝7.6Hz，1H)，7.77-7.73(m，2H)，7.62(bs，1H)，7.21(bs，1H)，6.28(bs，1H，OH)，4.23(d，J＝14.0Hz，1H)，4.04(d，J＝14.0Hz，1H)，1.04(s，3H)；19F NMR(丙酮-d6，解耦)δ114.77.MS(ESI)m/z 354.08[M+H]+；351.98[M-H]-.
(S)-(1-(3-((4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-羟基-2-甲基-3-氧代丙基)-1H-吡唑-4-基)氨基甲酸叔丁酯(16u)
根据一般操作A的路线1制备化合物16u。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到褐色固体状的设计化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.12(bs，1H，NH)，8.01(d，J＝1.6Hz，1H)，7.85(dd，J＝8.4，1.6Hz，1H)，7.76(d，J＝8.4Hz，1H)，7.63(bs，1H)，7.43(bs，1H)，6.21(bs，1H，HN)，6.17(bs，1H，OH)，4.54(d，J＝14.0Hz，1H)，4.17(d，J＝14.0Hz，1H)，1.47(s，9H)，1.45(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-62.21.MS(ESI)m/z 452.11[M-H]-；454.11[M+H]+；476.12[M+Na]+.
(S)-3-(4-乙酰氨基-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16v)
在氩气气氛下，在冰水浴下，向16t(0.17g，0.48mmol)和三乙胺(0.16mL，1.15mmol)在10mL无水DCM中的溶液中加入乙酰氯(0.04mL，0.58mmol)。搅拌30分钟后，将温度升至室温，并将混合物搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩，然后分散于10mL乙酸乙酯中，用水洗涤，蒸发，用无水MgSO4干燥，并蒸发至干燥。将混合物通过快速柱色谱法(使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(2/1，v/v))纯化，以得到呈黄色固体状的设计化合物。收率＝92％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.08(bs，1H，NH)，7.92(bs，1H，NH)，7.82-7.80(m，2H)，7.69(d，J＝8.4Hz，1H)，7.44(bs，1H)，7.15(bs，1H)，6.10(bs，1H，OH)，4.50(d，J＝14.0Hz，1H)，4.13(d，J＝14.0Hz，1H)，2.04(s，3H)，1.39(s，3H).19F NMR(CDCl3，解耦)δ-62.20.MS(ESI)m/z356.11[M+H]+；354.06[M-H]-.
(S)-3-(4-(2-氯乙酰氨基)-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(16w)
在氩气气氛下，在冰水浴下，向16t(0.17g，0.48mmol)和三乙胺(0.16mL，1.15mmol)在10mL无水DCM中的溶液中加入2-氯乙酰氯(0.04mL，0.58mmol)。搅拌30分钟后，将温度升至室温，并将混合物搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩，然后分散于10mL乙酸乙酯中，用水洗涤，蒸发，用无水MgSO4干燥，并蒸发至干燥。将混合物通过快速柱色谱法(使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(2/1，v/v))纯化，以得到呈黄色固体状的标题化合物。收率＝68％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.12(bs，1H，NH)，8.12(bs，1H，NH)，7.99(d，J＝1.6Hz，1H)，7.92(bs，1H)，7.88(dd，J＝8.6，1.6Hz，1H)，7.78(d，J＝8.6Hz，1H)，7.61(bs，1H)，6.11(bs，1H，OH)，4.60(d，J＝13.8Hz，1H)，4.23(d，J＝13.8Hz，1H)，4.17(s，2H)，1.47(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-62.19.MS(ESI)m/z 452.01[M+Na]+；428.00[M-H]-.
(S)-(1-(3-((4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-羟基-2-甲基-3-氧代丙基)-1H-吡唑-4-基)氨基甲酸甲酯(16x)
在氩气气氛下，在冰水浴下，向16t(0.17g，0.48mmol)和三乙胺(0.16mL，1.15mmol)在10mL无水DCM中的溶液中加入氯甲酸甲酯(0.04mL，0.58mmol)。搅拌30分钟后，将温度升至室温，并将混合物搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩，然后分散于10mL乙酸乙酯中，用水洗涤，蒸发，用无水MgSO4干燥，并蒸发至干燥。将混合物通过快速柱色谱法(使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱液(2/1，v/v))纯化，以得到呈白色固体状的标题化合物。收率＝71％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.07(bs，1H，C(O)NH)，7.91(s，1H，ArH)，7.79(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.69(d，J＝7.2Hz，1H，ArH)，7.57(s，1H，ArH)，7.40(s，1H，ArH)，6.33(bs，1H，NH)，6.08(bs，1H，OH)，4.50(d，J＝13.6Hz，1H，CH2)，4.12(d，J＝13.6Hz，1H，CH2)，3.67(s，3H，NH(CO)OCH3)，1.39(s，3H，CH3)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-62.21.MS(ESI)m/z 410.30[M-H]-；413.21[M+H]+.
路线2.吡唑-1-基-丙酰胺21a-21j的合成
Figure BDA0003971812710000311
试剂和条件：(a)1.含SOCl2的THF，-10℃至0℃.2.含Et3N的THF，-10℃至0℃，然后加热至50℃，2-3h；(b)2-丁酮，K2CO3，回流；(c)含NaH的THF，0℃至rt。
(S)-N-(6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(21a)
根据一般操作A的路线2制备化合物21a，其中17为5-氨基-3-(三氟甲基)吡啶腈。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(1∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.50g的白色固体状的标题化合物。收率＝60.2％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.64(s，1H，NH)，9.32(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.82(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.75(d，J＝4.8Hz，1H，吡唑-H)，7.40(d，J＝4.0Hz，1H，吡唑-H)，6.41(s，1H，OH)，4.39(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.22(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.36(s，3H，CH3).HRMS[C14H12F4N5O2 +]：计算值358.0927，实测值358.0932.
(S)-N-(6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-2-羟基-2-甲基-3-(4-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)丙酰胺(21b)
根据一般操作A的路线2制备化合物21b，其中17为5-氨基-3-(三氟甲基)吡啶腈。将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.18g的白色固体状的标题化合物。收率＝60％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.63(s，1H，NH)，9.31(s，1H，ArH)，8.80(s，1H，ArH)，8.32(s，1H，吡唑-H)，7.81(s，1H，吡唑-H)，6.48(s，1H，OH)，4.55(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.37(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.42(s，3H，CH3).HRMS[C15H12F6N5O2 +]：计算值408.0892，实测值408.0890[M+H]+.纯度：96.81％(HPLC).
(S)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-N-(6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(21c)
根据一般操作A的路线2制备化合物21c，其中17为5-氨基-3-(三氟甲基)吡啶腈。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到灰白色固体状的标题化合物。收率＝52％.MP169.7-169.9℃；UV max 195.45，274.45；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.17(bs，1H，NH)，8.83(s，1H)，8.67(d，J＝1.6Hz，1H)，7.92(s，1H)，7.85(s，1H)，5.58(s，OH)，4.73(d，J＝14.0Hz，1H)，4.34(d，J＝14.0Hz，1H)，1.53(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-62.11.MS(ESI)m/z 363.1[M-H]-；365.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z C15H11F3N6O2的计算值365.0974[M+H]+实测值365.0931[M+H]+；387.0754[M+Na]+.
(S)-(1-(3-((6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)氨基)-2-羟基-2-甲基-3-氧代丙基)-1H-吡唑-4-基)氨基甲酸叔丁酯(21d)
根据一般操作A的路线2制备化合物21d，其中17为5-氨基-3-(三氟甲基)吡啶腈。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到褐色固体状的设计化合物。收率＝60％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.28(bs，1H，NH)，8.80(s，1H)，7.63(bs，1H)，7.43(bs，1H)，6.29(bs，1H，NH)，6.21(bs，1H，OH)，4.55(d，J＝14.0Hz，1H)，4.17(d，J＝14.0Hz，1H)，1.47(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-62.11.MS(ESI)m/z 453.16[M-H]-；477.16[M+Na]+.
(S)-N-(3-氯-4-氰基苯基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(21e)
根据一般操作A的路线2制备化合物21e，其中17为4-氨基-2-氯苯甲腈。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到白色固体形式的设计化合物。收率＝71％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.97(bs，1H，NH)，7.87(d，J＝2.0Hz，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，1H)，7.45(dd，J＝8.4，2.0Hz，1H)，7.36(dd，J＝8.8，J＝4.0Hz，1H)，5.86(bs，1H，OH)，4.55(d，J＝14.0Hz，1H)，4.16(d，J＝14.0Hz，1H)，1.46(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-176.47.HRMS(ESI)m/z C14H12FN4O2的计算值323.0711[M+H]+实测值323.0710[M+H]+.
(S)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基-N-(4-硝基-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺(21f)
根据一般操作A的路线2制备化合物21f，其中17为4-硝基-3-(三氟甲基)苯胺。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到淡黄色固体状的设计化合物。收率＝67％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.14(bs，1H，NH)，8.01(s，1H)，7.97-7.91(m，2H)，7.38(d，J＝3.6Hz，1H)，7.35(d，J＝4.4Hz，1H)，5.95(s，1H，OH)，4.56(d，J＝14.0Hz，1H)，4.17(d，J＝14.0Hz，1H)，1.48(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-60.13，-176.47.MS(ESI)m/z 375.08[M-H]-；377.22[M+H]+；399.04[M+Na]+.
(S)-5-(3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺基)吡啶甲酰胺(21g)
根据一般操作A的路线2制备化合物21g，其中步骤a的17为5-氰基-6-(三氟甲基)吡啶甲酰胺。在步骤c中，向在氩气气氛下在冰水浴中冷却的4-氟-吡唑(20；0.20g，0.0023237mol)在无水THF(5mL)中的溶液中加入氢化钠(油中的60％分散液，0.28g，0.0069711mol)。添加后，将所得混合物搅拌三小时。将(R)-3-溴-N-(6-氰基吡啶-3-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺18(0.66g，0.0023237mol)添加到上述溶液中，并将所得的反应混合物在室温下在氩气下搅拌过夜。将反应用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将产物通过硅胶柱(使用DCM和甲醇(9∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.10g白色固体状的标题化合物。收率＝14.1％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.08(s，1H，NH)，8.89(d，J＝2.4Hz，1H，ArH)，8.30(dd，J＝8.2Hz，J＝2.4Hz，1H，ArH)，8.01(s，1H，NH)，7.98(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.73(d，J＝4.4Hz，1H，吡唑-H)，7.51(s，1H，NH)，7.42(d，J＝4.0Hz，lH，吡唑-H)，6.24(s，1H，OH)，4.38(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.42(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.34(s，3H，CH3).HRMS[C13H15FN5O3 +]：计算值308.1159，实测值308.1177[M+H]+；HRMS[C13H14FN5NaO3 +]计算值330.0978，实测值330.0987[M+Na]+.
(S)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基-N-(喹唑啉-6-基)丙酰胺(21h)
根据一般操作A的路线2制备化合物21h，其中步骤a的17为喹唑啉-6-胺。在步骤c中，向在氩气气氛下在冰水浴中冷却的4-氟-吡唑(20；0.20g，0.0023237mol)在无水THF(5mL)中的溶液中加入氢化钠(油中的60％分散液，0.28g，0.0069711mol)。添加后，将所得混合物搅拌三小时。将(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基-N-(喹唑啉-6-基)丙酰胺(18；0.72g，0.0023237mol)添加到上述溶液中，并将所得的反应混合物在室温下在氩气下搅拌过夜。将反应用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将产物通过硅胶柱(使用DCM和甲醇(9∶1)作为洗脱液)纯化，以得到50mg黄色固体状的标题化合物。收率＝13.7％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.10(s，1H，NH)，9.54(s，1H，ArH)，9.21(s，1H，ArH)，8.64(d，J＝2.4Hz，1H，ArH)，8.22(dd，J＝8.6Hz，J＝2.4Hz，1H，ArH)，7.97(d，J＝8.6Hz，1H，ArH)，7.75(d，J＝4.8Hz，1H，吡唑-H)，7.43(d，J＝4.0Hz，1H，吡唑-H)，6.26(s，1H，OH)，4.42(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.25(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.36(s，3H，CH3).质谱(ESI，负)：314.05[M-H]+.
(S)-N-(2-氯吡啶-4-基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(21i)
分两步制备化合物21i。在第一步中，根据路线2合成作为中间体化合物的(R)-3-溴-N-(2-氯吡啶-4-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺，其中17是2-氯吡啶-4-胺。在氩气气氛下，将亚硫酰氯(11.2mL，0.154mol)滴加到11(18.3g，0.100mol)在100mL的THF的冷却溶液(小于4℃)中。将所得混合物在相同条件下搅拌3小时。向其中添加Et3N(25.7mL，0.185mol)，并在相同条件下搅拌20分钟。在20分钟后，添加2-氯吡啶-4-胺(17；9.89g，0.077mol)、100mL的THF，然后将混合物在室温下搅拌过夜。减压移除溶剂，以得到固体，将该固体用100m的H2O处理，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaHCO3溶液(2×100mL)和盐水(100mL)洗涤。将有机层经MgSO4干燥，并减压浓缩，以得到固体，将该固体由柱色谱法(使用乙酸乙酯和DCM(80∶20))进行纯化，以得到固体。将该固体从DCM和己烷中重结晶，以得到12.6g呈淡黄色固体状的中间体化合物。收率＝43％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.06(bs，1H，NH)，8.31(d，J＝5.6Hz，1H)，7.77(d，J＝0.8Hz，lH)，7.45(dd，J＝5.6，0.8Hz，1H)，4.81(bs，1H，OH)，3.97(d，J＝10.6Hz，1H)，3.60(d，J＝10.6Hz，1H)，1.64(s，3H).MS(ESI)m/z295.28[M+H]+.
第二步：根据一般操作A的路线2制备21i，其中18为(R)-3-溴-N-(2-氯吡啶-4-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到白色固体状的期望化合物。收率＝55％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.90(bs，1H，NH)，8.26(d，J＝5.6Hz，1H)，7.63(s，1H)，7.75(d，J＝4.2Hz，1H)，7.33(d，J＝4.2Hz，1H)，7.31(dd，J＝5.6，1.2Hz，1H)，5.88(s，1H，OH)，4.53(d，J＝13.6Hz，1H)，4.14(d，J＝13.6Hz，1H)，1.45(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-176.47.MS(ESI)m/z 298.98[M+H]+；296.96[M-H]-.
(S)-N-(4-氰基-2-碘-5-(三氟甲基)苯基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(21j)
根据一般操作A的路线2制备化合物21j，其中步骤a的17为4-氰基-2-碘苯胺。在步骤c中，20为4-氟-1H-吡唑(0.09g，0.001048mol)。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1至1∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.32g的白色固体状的标题化合物。收率＝64％.1HNMR(400MHz，CDCl3)δ9.60(s，1H，NH)，8.76(s，1H，ArH)，8.69(s，1H，ArH)，7.76(d，J＝4.8Hz，1H，吡唑-H)，7.36(d，J＝4.4Hz，1H，吡唑-H)，6.85(s，1H，OH)，4.39(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.20(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.41(s，3H，CH3).质谱(ESI，负)：481.00[M-H]-.
路线3.吡唑-1-基-丙酰胺26a-26h的合成
Figure BDA0003971812710000341
试剂和条件：(a)1.含SOCl2的THF，-10℃至0℃.2.含Et3N的THF，-10℃至0℃，然后加热至50℃，2-3h；(b)2-丁酮，K2CO3，回流；(c)含NaH的THF，0℃至rt.
(S)-3-(4-溴-3-氟-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(26a)
根据一般操作A的路线3制备化合物26a。向在氩气气氛下冰水浴中冷却的4-溴-3-氟-吡唑(25；0.30g，0.001819mol)在无水THF(10mL)中的溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.26g，0.006365mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将23(其中X是CH；0.64g，0.001819mol)添加到以上溶液中，并将所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。将反应用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。将产物通过硅胶柱(使用乙酸乙酯和己烷(2∶1)作为洗脱液)纯化，以获得0.34g呈淡粉色固体状的标题化合物。收率＝34％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.38(s，1H，NH)，8.45(d，J＝2.0-1.6Hz，1H，ArH)，8.23(dd，J＝8.2Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.11(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.82(d，J＝2.0Hz，1H，吡唑-H)，6.35(s，1H，OH)，4.35(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.04(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.37(s，3H，CH3).m.p 110-112℃.HRMS[C15H12BrF4N4O2 +]：计算值435.0080，实测值435.0080[M+H]+.纯度：96.98％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(3-氟-4-(4-氟苯基)-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(26b)
将26a(0.20g，0.4596mmol)、4-氟硼酸(77mg，0.5515mmol)、Pd(II)(OAc)2(2-3mg，0.009192mmol)、PPh3(7-8mg，0.02758mmol)和K2CO3(0.13g，0.965mmol)混合到CAN(4-5mL)和H2O(2-3mL)中，以通过Suzuki反应来制备化合物26b。使混合物脱气并用氩气再填充三次。将所得反应混合物在氩气下回流加热3小时。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1至1∶1)作为洗脱液)纯化，以获得51mg呈淡黄色固体状的标题化合物。收率＝25％.1HNMR(400MHz，CDCl6)δ9.12(s，1H，NH)，8.06(d，J＝1.6Hz，1H，ArH)，7.85(dd，J＝8.2Hz，J＝1.6Hz，1H，ArH)，7.77(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.51(d，J＝3.0Hz，1H，吡唑-H)，7.43-7.40(m，2H，ArH)，7.08-7.04(m，2H，ArH)，4.57(d，J＝10.5Hz，1H，CH)，4.17(d，J＝10.5Hz，1H，CH)，1.26(s，3H，CH3).HRMS[C21H16F5N4O2 +]：计算值451.1193，实测值451.1196[M+H]+.纯度：％(HPLC).
(S)-3-(3-溴-4-氰基-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(26c)
根据一般操作A的路线3制备化合物26c，其中22的X(步骤a)为CH，并且步骤c的25为3-溴-4-氰基-吡唑。将产物通过硅胶柱(使用乙酸乙酯和己烷(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.10g的灰白色固体状的标题化合物。收率＝20％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.32(s，1H，NH)，8.50(s 1H，吡唑-H)，8.41(s，1H，ArH)，8.20(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，8.11(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，6.47(s，1H，OH)，4.52(d，J＝13.6Hz，1H，CH)，4.33(d，J＝13.6Hz，1H，CH)，1.41(s，3H，CH3).HRMS[C16H12BrF3N5O2 +]：计算值442.0126，实测值442.0109[M+H]+.纯度：98.84％(HPLC).
(S)-3-(3-氯-4-甲基-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(26d)
根据一般操作A的路线3制备化合物26d，其中22的X(步骤a)为CH，并且步骤c的25为3-氯-4-甲基-吡唑。将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(98∶2至95∶5)作为洗脱液)纯化，以得到0.27g的白色固体状的标题化合物。收率＝54％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.33(s，1H，NH)，8.42(d，J＝0.8Hz，1H，ArH)，8.21(dd，J＝8.4Hz，J＝0.8HZ，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.50(s 1H，吡唑-H)，6.29(s，1H，OH)，4.36(d，J＝14.4Hz，1H，CH)，4.18(d，J＝14.4Hz，1H，CH)，1.91(s，3H，CH3)，1.35(s，3H，CH3).HRMS[C16H15ClF3N4O2 +]：计算值387.0836，实测值387.0839[M+H]+.纯度：97.07％(HPLC).
(S)-3-(3-溴4-氯-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(26e)
根据一般操作A的路线3制备化合物26e，其中22的X(步骤a)为CH，并且步骤c的25为3-溴-4-氯-吡唑。将产物通过硅胶柱(使用DCM和乙酸乙酯(95∶5)作为洗脱液)纯化，以得到0.25g的白色固体状的标题化合物。收率＝50％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.34(s，1H，NH)，8.41(s，1H，ArH)，8.20(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，8.11(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.93(s 1H，吡唑-H)，6.39(s，1H，OH)，4.43(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.25(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.38(s，3H，CH3).HRMS[C15H12BrClF3N4O2 +]：计算值450.9784，实测值450.9807[M+H]+.纯度：96.55％(HPLC).
(S)-3-(4-溴-3-氟-1H-吡唑-1-基)-N-(6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(26f)
根据一般操作A的路线3制备化合物26f，其中22的X(步骤a)为N，并且步骤c的25为4-溴-3-氟-吡唑。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1至1∶1)作为洗脱液)纯化，以得到0.28g的白色固体状的标题化合物。收率＝54％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.67(s，1H，NH)，9.32(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.82(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.85(d，J＝2.0Hz 1H，吡唑-H)，6.47(s，1H，OH)，4.35(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.17(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.39(s，3H，CH3).HRMS[C15H12BrClF3N4O2 +]：计算值434.9954，实测值435.9997[M+H]+.纯度：93.41％(HPLC).
(S)-3-(3-溴-4-氰基-1H-吡唑-1-基)-N-(6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(26g)
根据一般操作A的路线3制备化合物26g，其中22的X(步骤a)为N，并且步骤c的25为3-溴-4-氰基-吡唑。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱液)纯化，以得到白色固体状的标题化合物。收率＝81％.MP 172.5-173.6℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.60(bs，1H，NH)，9.29(s，1H)，8.79(s，1H)，8.53(s，1H)，6.59(s，OH)，4.50(d，J＝14.0Hz，1H)，4.32(d，J＝14.0Hz，1H)，1.43(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-61.25.MS(ESI)m/z442.1[M-H]-；HRMS(ESI)m/z C15H10BrF3N6O2的计算值443.0079[M+H]+实测值443.0083[M+H]+；464.9903[M+Na]+.
(S)-3-(4-氰基-3-苯基-1H-吡唑-1-基)-N-(6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(26h)
向配备有回流冷凝器、隔膜入口和磁力搅拌棒的烧瓶中装入在THF/甲醇(5mL/1mL)中的26g(0.053g，0.23mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(9mg，0.07mmol)和苯基硼酸(35mg，0.28mmol)以及在脱氧水(1mL)中的碳酸钠(50mg，0.48mmol)，搅拌并加热回流2小时，直到在TLC上检测不到原料。将混合物冷却至室温，并真空移除溶剂，然后倾注到乙酸乙酯(10mL)中，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用饱和NH4Cl、水洗涤，并经MgSO4干燥。真空移除溶剂，然后通过硅胶上的快速柱色谱法(使用己烷和乙酸乙酯(1∶1)作为洗脱液)纯化，以得到36mg呈微黄色固体状的目标化合物。收率＝69％.MP 112.3-124.4℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.17(bs，1H，NH)，8.76(s，1H)，8.60(s，1H)，7.77(s，1H)，7.57-7.52(m，3H)，7.18(d，J＝8.8Hz，2H)，5.32(s，OH)，4.60(d，J＝14.0Hz，1H)，4.23(d，J＝14.0Hz，1H)，1.47(s，3H).19F NMR(CDCl3，解耦)δ-62.09.MS(ESI)m/z 439.2[M-H]-；HRMS(ESI)m/zC21H15F3N6O2的计算值441.1287[M+H]+实测值441.1291[M+H]+；463.1111[M+Na]+.
路线4.吡唑-1-基-丙酰胺29a-29f的合成
Figure BDA0003971812710000351
试剂和条件：(a)1.含SOCl2的THF，-10℃至0℃.2.含Et3N的THF，-10℃至0℃，然后加热至50℃，2-3h；(b)含NaH的THF，0℃至rt.
(R)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(29a)
根据如上文对于10所例示的一般操作A的路线1制备化合物29a，除了使用相反的异构体[(S)-11或(S)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酸]，而非11。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(1∶1)作为洗脱液)纯化，以得到淡黄色固体状的标题化合物。收率＝64％.[α]D 24+126.7°(c＝1.0，MeOH)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.07(bs，1H，NH)，8.01(d，J＝2.0Hz，1H)，7.95(dd，J＝8.4，J＝2.0Hz，1H)，7.78(d，J＝8.4Hz，1H)，7.38(d，J＝4.0Hz，1H)，7.34(d，J＝4.4Hz，1H)，5.92(s，OH)，4.54(d，J＝14.0Hz，1H)，4.16(d，J＝14.4Hz，1H)，1.47(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-62.23，-176.47.HRMS(ESI)m/z C15H12F4N4O2的计算值：357.0975[M+H]+.实测值：357.0984[M+H]+.
N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺(29b)
如同所有之前化合物，根据一般程序A的路线4制备化合物29b，其中27中的Y是叔碳[CH(CH3)]而非季碳[C(OH)(CH3)]。向在氩气气氛下冰水浴中冷却的4-氟-吡唑(20；0.20g，0.0023237mol)在无水THF(5mL)中的溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.28g，0.0069711mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将3-溴-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-甲基丙酰胺(28；0.78g，0.0023237mol)添加到以上溶液中，并将所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。将反应用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(1∶1)作为洗脱液)纯化，以获得0.050g呈淡黄色固体状的标题化合物。收率＝6.3％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.77(s，1H，NH)，8.25(s，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.96(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.85(d，J＝4.4Hz，1H，吡唑-H)，7.47(d，J＝4.4Hz，1H，吡唑-H)，4.35-4.30(m，1H，CH)，4.12-4.07(m，1H，CH)，3.12-3.10(m，1H，CH)，1.22(d，J＝6.8Hz，3H，CH3).质谱(ESI，正)：341.14[M+H]+.
N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)丙酰胺(29c)
根据一般程序A的路线4制备化合物29c，其中27中的Y是仲碳[CH2]]而非季碳[C(OH)(CH3)]。向在氩气气氛下冰水浴中冷却的4-氟-吡唑(20；0.20g，0.0023237mol)在无水THF(5mL)中的溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.28g，0.0069711mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将3-溴-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺(28；0.75g，0.0023237mol)添加到以上溶液中，并将所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。将反应用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。将产物通过硅胶柱(使用DCM和甲醇(19∶1)作为洗脱液)纯化，以获得0.75mg呈白色固体状的标题化合物。收率＝10％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.81(s，1H，NH)，8.25(d，J＝2.4Hz，1H，ArH)，8.10(dd，J＝8.8Hz，J＝2.4Hz，1H，ArH)，7.95(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.88(s，1H，吡唑-H)，7.46(s，1H，吡唑-H)，4.35(t，J＝6.0Hz，2H，CH2)，2.79(t，J＝6.0Hz，2H，CH2).质谱(ESI，负)：325.03[M-H]-；(ESI，正)：[M+H]+.
(S)-4-(5-((4-氟-1H-吡唑-1-基)甲基)-5-甲基-2，4-二氧代噁唑烷-3-基)-2-(三氟甲基)苯甲腈(29d)
通过使10的2-甲基-2-羟基-丙酰胺连接基环化形成噁唑烷二酮环系来进行29d的制备。向10(0.234g，0.0006568mol)在无水吡啶(8mL)中的溶液中添加1，1′-羰基二咪唑(CDI)(0.16g，0.0009825mol)。在添加后，使所得混合物在室温和氩气下搅拌过夜。将反应用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。将产物通过硅胶柱(使用己烷和乙酸乙酯(2∶1)作为洗脱液)纯化，以获得0.134g呈白色泡沫状的标题化合物。收率＝42％.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.41(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，7.98(s，1H，ArH)，7.94(d，J＝4.0Hz，1H，吡唑-H)，7.85(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.58(d，J＝4.4Hz，1H，吡唑-H)，4.78(d，J＝14.8Hz，1H，CH)，4.69(d，J＝14.8Hz，1H，CH)，1.71(s，3H，CH3).HRMS[C16H11F4N4O3 +]：计算值383.0767，实测值383.0726[M+H]+.纯度：97.64％(HPLC).
(S)-3-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)-1-((4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-甲基-1-氧代丙烷-2-基2-氯乙酸酯(29e)
在氩气气氛下，在冰水浴中向16t(0.17g，0.48mmol)和三乙胺(0.16mL，1.15mmol)在10mL无水DCM中的溶液中添加2-氯乙酰氯(0.04mL，0.58mmol)。在搅拌30分钟后，将温度升至室温，并将混合物搅拌2小时。将反应混合物在真空下浓缩，然后分散到10mL的EtOAc中，用水洗涤，蒸发，经无水MgSO4干燥，并蒸发至干。将混合物用快速柱色谱法(使用己烷和乙酸乙酯作为洗脱剂(2/1，v/v))纯化，以得到呈黄色固体状的标题化合物。收率＝19％.1HNMR(400MHz，CDCl3)δ9.22(bs，1H，NH)，8.10(bs，2H，NH2)，7.93(d，J＝1.6Hz，1H)，7.89-7.86(m，2H)，7.78(d，J＝8.4Hz，1H)，7.53(bs，1H)，5.16(d，J＝14.8Hz，1H)，4.61(d，J＝14.8Hz，1H)，4.15(s，2H)，1.78(s，3H)；19F NMR(CDCl3，解耦)δ-62.19.MS(ESI)m/z 452.01[M+Na]+；428.03[M-H]-.
(S)-N-(3-((4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-羟基-2-甲基-3-氧代丙基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(29f)
根据一般操作A的路线4制备化合物29f。将产物通过硅胶柱(使用DCM和甲醇(19∶1)作为洗脱液)纯化，以得到褐色固体状的标题化合物。收率＝43％.1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ9.92(bs，1H，NHCO)，8.44(d，J＝1.8Hz，1H)，8.24(dd，J＝8.8，J＝1.8Hz，1H)，8.12(s，1H)，8.03(d，J＝1.8Hz，1H)，7.84(s，1H)，7.11(bs，1H，NHCO)，6.38(bs，1H，NH)，5.74(s，OH)，4.67(d，J＝14.0Hz，1H)，4.39(d，J＝14.0Hz，1H)，1.50(s，3H).19F NMR(丙酮-d6，解耦)δ114.69.MS(ESI)m/z 380.1[M-H]-；382.1[M+H]+.HRMS(ESI)m/z C16H14F3N5O3的计算值382.1127[M+H]+实测值382.1051[M+H]+；404.0882[M+Na]+.
化合物29g的合成
Figure BDA0003971812710000371
(R)-3-溴-N-(2-氰基嘧啶-5-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C9H9BrN4O2)
Figure BDA0003971812710000372
使(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酸(3.00g，0.0163934mol)与亚硫酰氯(2.34g，0.01967211mol)、三甲胺(2.16g，0.0213115mol)和5-氨基嘧啶-2-甲腈(1.97g，0.0163934mol)反应，以获得标题化合物。产物使用己烷和乙酸乙酯(1∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得3.44g(73.3％)呈微黄色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.71(s，1H，NH)，9.40-9.37(m，2H，ArH)，6.51(s，1H，OH)，3.84(d，J＝10.4Hz，1H，CH)，3.59(d，J＝10.4Hz，1H，CH)，1.50(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C9H10BrN4O2 +]：计算值284.9987，实测值284.9985[M+H]+.纯度：97.09％(HPLC).
(S)-N-(2-氰基嘧啶-5-基)-2-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺(C9H8N4O2)
Figure BDA0003971812710000373
向(R)-3-溴-N-(2-氰基嘧啶-5-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(5.00g，0.01754mol)的25mL的2-丁酮溶液中添加碳酸钾(6.06g，0.04384mol)。将所得反应混合物在氩气气氛下回流加热2小时。在通过TLC确定反应结束后，使反应物冷却至室温(rt)，通过硅藻土垫过滤，并用15mL的2-丁酮冲洗硅藻土垫。将滤液真空浓缩，并在25-30英寸真空下干燥，以提供(S)-N-(2-氰基嘧啶-5-基)-2-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.38(s，1H，NH)，9.27(br.s，2H，ArH)，3.11(d，J＝5.2Hz，1H，CH)，3.07(d，J＝8.8Hz，1H，CH)，1.56(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C9H9N4O2 +]：计算值205.0726，实测值205.0721[M+H]+.纯度：98.93％(HPLC).
(S)-N-(2-氰基嘧啶-5-基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C12H11FN6O2)(29g)
Figure BDA0003971812710000374
向在冰水浴中氩气气氛下冷却的4-氟-1H-吡唑(0.121g，0.001403mol)的无水THF(10mL)溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.20g，0.0049101mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将(R)-3-溴-N-(2-氰基嘧啶-5-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(0.40g，0.001403mol)添加到上述溶液中，且使所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，且在真空下浓缩。产物使用己烷和乙酸乙酯(1∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.12g(33.0％)呈灰白色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.53(s，1H，NH)，9.30(br s，2H，ArH)，7.75(d，J＝4.4Hz，1H，吡唑-H)，7.42(d，J＝4.0Hz，1H，吡唑-H)，6.41(s，1H，OH)，4.38(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.19(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.35(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C12H12FN6O2 +]：计算值291.1006，实测值291.1003[M+H]+.纯度：98.66％(HPLC).
(S)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-N-(2-氰基嘧啶-5-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C13H11N7O2)(29h)
Figure BDA0003971812710000381
向在冰水浴中氩气气氛下冷却的4-氰基-1H-吡唑(0.131g，0.001403mol)的无水THF(10mL)溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.20g，0.0049101mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将(R)-3-溴-N-(2-氰基嘧啶-5-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(0.40g，0.001403mol)添加到上述溶液中，且使所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，且在真空下浓缩。产物使用DCM和甲醇(9∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.115g(27.6％)呈微黄色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.50(s，1H，NH)，9.29(br s，2H，ArH)，8.46(s，1H，吡唑-H)，8.00(s，1H，吡唑-H)，6.52(s，1H，OH)，4.55(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.37(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.48(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C13H12N7O2 +]：计算值298.1052，实测值298.1055[M+H]+.纯度：99.26％(HPLC).
化合物29i的合成
Figure BDA0003971812710000382
(R)-3-溴-N-(2-氯-4-氰基苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C11H10BrClN2O2)
Figure BDA0003971812710000383
使(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酸(3.33g，0.018182mol)与亚硫酰氯(2.60g，0.02182mol)、三甲胺(2.16g，0.0213115mol)和5-氨基嘧啶-2-甲腈(2.39g，0.023638mol)反应，以获得标题化合物。产物使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得4.02g(69.5％)呈黄色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.78(s，1H，NH)，8.49(dd，J＝8.8Hz，J＝4.4Hz，1H，ArH)，8.19(d，J＝1.6Hz，1H，ArH)，7.88(dd，J＝8.8Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，6.84(s，1H，OH)，3.84(d，J＝10.4Hz，1H，CH)，3.59(d，J＝10.4Hz，1H，CH)，1.56(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C11H11BrClN2O2 +]：计算值316.9690，实测值316.9684[M+H]+.纯度：98.38％(HPLC).
(S)-N-(2-氯-4-氰基苯基)-2-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺(C11H9ClN2O2)
Figure BDA0003971812710000391
向(R)-3-溴-N-(2-氯-4-氰基苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(5.00g，0.01575mol)的25mL的2-丁酮溶液中添加碳酸钾(3.26g，0.02362mol)。将所得反应混合物在氩气气氛下回流加热2小时。在通过TLC确定反应结束后，使反应物冷却至室温(rt)，通过硅藻土垫过滤，并用15mL的2-丁酮冲洗硅藻土垫。将滤液真空浓缩，并在25-30英寸真空下干燥，以提供(S)-N-(2-氯-4-氰基苯基)-2-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.17(s，1H，NH)，8.19-8.15(m，2H，ArH)，7.87-7.84(m，1H，ArH)，3.17(d，J＝5.2Hz，1H，CH)，3.08(d，J＝5.2Hz，1H，CH)，1.56(s，3H，CH3).
质谱(EsI，正)：[M+H]+.
HRMS[C11H8ClN2O2-]：计算值235.0274，实测值235.0265[M+H]+.纯度：67.48％(HPLC).
(S)-N-(2-氯-4-氰基苯基)-3-(4-氟-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C14H12ClFN4O2)(29i)
Figure BDA0003971812710000392
向在冰水浴中氩气气氛下冷却的4-氟-1H-吡唑(0.108g，0.0012595mol)的无水THF(10mL)溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.176g，0.0044082mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将(R)-3-溴-N-(2-氯-4-氰基苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(0.40g，0.0012595mol)添加到上述溶液中，且使所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，且在真空下浓缩。产物使用DCM和甲醇(19∶1至9∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.15g(31.6％)呈灰白色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.50(br s，1H，NH)，8.44(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，8.15(d，J＝1.6Hz，1H，ArH)，7.86(dd，J＝8.8Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.75(d，J＝4.8Hz，1H，吡唑-H)，7.38(d，J＝4.2Hz，1H，吡唑-H)，6.76(br s，1H，OH)，4.39(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.12(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.39(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C14H13ClFN4O2 +]：计算值323.0711，实测值323.0723[M+H]+.纯度：98.81％(HPLC).
(S)-N-(2-氯-4-氰基苯基)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C15H12ClN5O2)(29j)
Figure BDA0003971812710000393
向在冰水浴中氩气气氛下冷却的4-氰基-1H-吡唑(0.117g，0.0012595mol)的无水THF(10mL)溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.176g，0.0044082mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将(R)-3-溴N-(2-氯-4-氰基苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(0.40g，0.0012595mol)添加到上述溶液中，且使所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，且在真空下浓缩。产物使用DCM和甲醇(19∶1至9∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.15g(31.6％)呈灰白色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.47(br s，1H，NH)，8.46(s，1H，吡唑-H)，8.42(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，8.15(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.97(s，1H，吡唑-H)，7.88(dd，J＝8.2Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，6.88(br s，1H，OH)，4.56(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.36(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.43(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C15H13ClN5O2 +]：计算值330.0758，实测值330.0753[M+H]+.纯度：95.75％(HPLC).
化合物29k的合成
Figure BDA0003971812710000401
(R)-3-溴-N-(3-氯-4-氰基-2-甲基苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C12H12BrClN2O2)
Figure BDA0003971812710000402
使(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酸(1.21g，0.006602mol)与亚硫酰氯(0.86g，0.007202mol)、三甲胺(0.79g，0.007802mol)和4-氨基-2-氯-3-甲基苯甲腈(1.00g，0.006002mol)反应，以获得标题化合物。产物使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得1.60g(80.4％)呈黄色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.70(s，1H，NH)，7.84(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，7.76(d，J＝8.4Hz，1H，ArH)，6.50(s，1H，OH)，3.84(d，J＝9.2Hz，1H，CH)，3.59(d，J＝9.2Hz，1H，CH)，2.32(s，3H，CH3)，1.50(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C12H13BrClN2O2 +]：计算值330.9849，实测值330.9843[M+H]+.纯度：98.80％(HPLC).
(S)-N-(3-氯-4-氰基-2-甲基苯基)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C16H14CIN5O2)(29k)
Figure BDA0003971812710000403
向在冰水浴中氩气气氛下冷却的4-氰基-1H-吡唑(0.112g，0.0012063mol)的无水THF(10mL)溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.169g，0.0042217mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将(R)-3-溴-N-(3-氯-4-氰基-2-甲基苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(0.40g，0.0012063mol)添加到上述溶液中，且使所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，且在真空下浓缩。产物使用DCM和甲醇(9∶1至5∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.31g(74.7％)呈灰白色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.52(br s，1H，NH)，8.46(s，1H，吡唑-H)，8.04(s，1H，吡唑-H)，7.83(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，7.78(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，6.51(br s，1H，OH)，4.56(d，J＝14.4Hz，1H，CH)，4.34(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，2.18(s，3H，CH3)，1.40(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C16H15ClN5O2 +]：计算值344.0914，实测值344.0910[M+H]+.纯度：99.59％(HPLC).
化合物291和29m的制备
Figure BDA0003971812710000411
(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基-N-(4-硝基-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺(C11H10BrF3N2O4)
Figure BDA0003971812710000412
使(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酸(1.95g，0.0106734mol)与亚硫酰氯(0.385g，0.0116437mol)、三甲胺(1.276g，0.012614mol)和4-硝基-3-(三氟甲基)苯胺(2.00g，0.0097031mol)反应，以获得标题化合物。产物使用DCM和乙酸乙酯(19∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得2.70g(75.0％)呈黄色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.61(s，1H，NH)，8.58(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.38(dd，J＝8.8Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.22(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，6.45(br s，1H，OH)，3.85(d，J＝10.4Hz，1H，CH)，3.61(d，J＝10.4Hz，1H，CH)，1.50(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C11H11BrF3N2O4 +]：计算值370.9854，实测值370.9854[M+H]+.纯度：95.23％(HPLC).
(S)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基-N-(4-硝基-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺(C15H12F3N5O4)(29l)
Figure BDA0003971812710000413
向在冰水浴中氩气气氛下冷却的4-氰基-1H-吡唑(0.376g，0.0040419mol)的无水THF(20mL)溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.566g，0.0141466mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌三小时。将(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基N-(4-硝基-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺(1.50g，0.0040419mol)添加到上述溶液中，且使所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，且在真空下浓缩。产物使用DCM和甲醇(9∶1至5∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.52g(33.5％)呈黄色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.42(br s，1H，NH)，8.47(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.46(s，1H，吡唑-H)，8.30(dd，J＝8.8Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.20(d，J＝8.8Hz，1H，ArH)，8.00(s，1H，吡唑-H)，6.44(br s，1H，OH)，4.55(d，J＝＝14.4Hz，1H，CH)，4.36(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.39(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C15H13F3N5O4 +]：计算值384.0920，实测值384.0914[M+H]+.纯度：100.00％(HPLC).
(S)-N-(4-氨基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C15H14F3N5O2)
Figure BDA0003971812710000421
将(S)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基N-(4-硝基-3-(三氟甲基)苯基)丙烯酰胺(0.30g，0.0007827mol)在10％钯碳于25psi下在室温下氢化2-3小时。通过TLC确认反应结束后，将反应混合物通过硅藻土过滤，真空浓缩，干燥，并在未进一步纯化下进行下一步。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C15H13F3N5O2 -]：计算值352.1021，实测值352.1030[M+H]+.纯度：％(HPLC).
(S)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-N-(4-异硫氰酸基-3-(三氟甲基)苯基)-2-甲基丙酰胺(C16H12F3N5O2S)(29m)
Figure BDA0003971812710000422
在氩气下，向冰水浴中冷却的(S)N-(4-氨基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(0.135g，0.0003821mol)的5mL的无水THF溶液中添加硫光气(88mg，0.0007642mol)和三乙胺(0.193g，0.0019105mol)。所得的反应混合物在室温和氩气下保持4-5小时。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，且在真空下浓缩。产物使用DCM和甲醇(9∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得20mg(13.3％)呈浅褐色固体状的标题化合物(不是非常稳定)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.13(s，1H，NH)，8.30(d，J＝2.0Hz，1H，ArH)，8.13(s，1H，吡唑-H)，8.04(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，7.64(dd，J＝8.2Hz，J＝2.0Hz，1H，ArH)，7.45(s，1H，吡唑-H)，6.19(s，1H，OH)，4.39(m，1H，CH)，4.21(m，1H，CH)，1.32(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C16H11F3N5O2S-]：计算值394.0586，实测值396.0613[M+H]+.纯度：％(HPLC).
化合物29q的合成
Figure BDA0003971812710000423
1-氨基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-甲腈(C5H3F3N4)
Figure BDA0003971812710000424
向3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-甲腈(0.5g，0.0031041mol)的10mL水溶液中添加粉碎的NaOH(0.5g，0.012416mol)。将溶液在55-60℃下搅拌20分钟。将羟胺-O-磺酸(1.05g，0.009312mol)小心地分批添加到上述溶液中。将所得的反应混合物在65℃下加热2小时，并在室温下搅拌2小时。反应物用DCM萃取三次。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，干燥，并进行下一步骤而无需进一步纯化。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ
HRMS[C5H2F3N4-]：计算值175.0232，实测值175.0317[M-H]-纯度：％(HPLC).
(R)-3-溴-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C9H8BrF3N4O2)
Figure BDA0003971812710000431
使(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酸(0.864g，0.0047223mol)与亚硫酰氯(0.613g，0.0051516mol)、三甲胺(0.565g，0.0055809mol)和1-氨基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-甲腈(0.756g，0.004293mol)反应，以获得标题化合物。产物使用DCM和乙酸乙酯(9∶1至4∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.46g(31.5％)呈黄色固体状的标题化合物。
(S)-3-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C13H10F3N7O2)(29q)
Figure BDA0003971812710000432
向在冰水浴中氩气气氛下冷却的4-氰基-1H-吡唑(0.15g，0.0016183mol)的无水THF(10mL)溶液中添加氢化钠(60％分散液于油中，0.19g，0.0047201mol)。在添加后，将所得的混合物搅拌两小时。将(R)-3-溴N-(4-氰基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(0.46g，0.0013486mol)添加到上述溶液中，且使所得反应混合物在室温和氩气下搅拌过夜。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，且在真空下浓缩。产物使用DCM和乙酸乙酯(4∶1至2∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.115g(50.4％)呈黄色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.27(s，1H，NH)，8.83(s，1H，吡唑-H)，8.46(s，1H，吡唑-H)，8.15(s，1H，吡唑-H)，6.49(s，1H，OH)，4.51(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.35(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.40(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C13H9F3N7O2-]：计算值352.0770，实测值352.0761[M-H]-纯度：99.00％(HPLC).
化合物29o的合成
Figure BDA0003971812710000433
(S)-3-叠氮基-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C12H10F3N5O2)
Figure BDA0003971812710000434
向(R)-3-溴-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(2.00g，0.005696mol)的无水DMF(10mL)溶液中添加叠氮化钠(0.74g，0.011392mol)。将所得的混合物在80℃下加热3-4小时。在通过TLC确定反应结束后，将反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在真空下减少体积。产物使用DCM和乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.93g(52.4％)呈微黄色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.58(s，1H，NH)，8.54(s，1H，ArH)，8.31(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，8.11(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，6.43(s，1H，OH)，4.02(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，3.39(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.37(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C12H11F3N5O2 +]：计算值314.0865，实测值314.0865[M+H]+.纯度：99.00％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4-氰基苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(C21H15F3N6O2)(29o)
Figure BDA0003971812710000441
向(S)-3-叠氮基N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(0.50g，0.0015692mol)在CAN和水(8mL+2mL)的混合物中的溶液中添加4-乙炔基苯甲腈(0.30g，0.0023943mol)和作为催化剂的CuI(30mg，0.0001596mol)。将所得的混合物在室温下搅拌3天(叠氮化物-炔烃Huisgen环加成，也称为点击反应)。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在真空下减少体积。产物使用DCM和甲醇(19∶1)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.22g(31％)呈白色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.44(s，1H，NH)，8.63(s，1H，吡唑-H)，8.42(s，1H，ArH)，8.23(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，8.09(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，8.03(d，J＝8.0Hz，2H，ArH)，7.91(d，J＝8.0Hz，2H，ArH)，6.56(s，1H，OH)，4.79(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.61(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.43(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMs[C21H16F3N6O2 +]：计算值441.1287实测值441.1287[M+H]+.纯度：％(HPLC).
化合物29p的合成
Figure BDA0003971812710000442
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基-3-(4-(4-(三氟甲基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙烯酰胺(C21H15F6N5O2)(29p)
Figure BDA0003971812710000443
向(S)-3-叠氮基N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(0.50g，0.0015692mol)在CAN和水(8mL+2mL)的混合物中的溶液中添加1-乙炔基-4-(三氟甲基)苯(0.41g，0.0023943mol)和作为催化剂的CuI(30mg，0.0001596mol)。将所得的混合物在室温下搅拌3天(叠氮化物-炔烃Huisgen环加成，也称为点击反应)。反应物用水淬灭，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在真空下减少体积。产物使用己烷和乙酸乙酯(1∶1至1∶1.5)作为洗脱液通过硅胶柱纯化，以获得0.538g(70％)呈白色固体状的标题化合物。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.45(s，1H，NH)，8.59(s，1H，吡唑-H)，8.42(s，1H，ArH)，8.24(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，8.10(d，J＝8.2Hz，1H，ArH)，8.05(d，J＝8.0Hz，2H，ArH)，7.80(d，J＝8.0Hz，2H，ArH)，6.56(s，1H，OH)，4.80(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，4.61(d，J＝14.0Hz，1H，CH)，1.44(s，3H，CH3).
质谱(ESI，正)：[M+H]+.
HRMS[C21H16F3N6O2 +]：计算值441.1287实测值441.1287[M+H]+.纯度：％(HPLC).
(S)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基-3-(4-氨磺酰基-1H-吡唑-1-基)丙烯酰胺(29n)
Figure BDA0003971812710000451
在冰水浴和氩气气氛下，向配备有滴液漏斗的干燥的氮气吹扫的100mL圆底烧瓶中，将NaH于矿物油中的60％分散液(240mg，6mmol)添加到烧瓶中的10mL无水THF溶剂中，并在冰水浴下添加1H-吡唑-4-磺酰胺(295mg，2mmol)的5mL THF溶液，并搅拌30分钟。在氩气气氛和冰水浴下，通过滴液漏斗向烧瓶中添加5mL的无水THF中的(R)-3-溴-N-(4-氰基，3-(三氟甲基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺(702mg，2mmol)，并在室温下搅拌过夜。在添加1mL的H2O之后，将反应混合物减压浓缩，然后分散到50mL的EtOAc中，用50mL(×2)水洗涤，蒸发，经无水MgSO4干燥，并蒸发至干。将混合物用丙酮/己烷结晶，以得到白色固体状的目标化合物。
收率：48％；纯度：98.18％；UV max：270.45；MS(ESI)m/z 416.20[M-H]-；LCMS(ESI)m/z C15H14F3N5O4S的计算值416.0640[M-H]-；实测值：416.0679[M-H]-418.0789[M+H]+，440.0613[M+Na]+；
1HNMR(丙酮-d6，400MHz)δ9.76(bs，1H，NH)，8.32(d，J＝1.6Hz，1H)，8.11(dd，J＝8.4，1.6Hz，1H)，7.94(s，1H)，7.88(d，J＝8.4Hz，1H)，6.39(bs，2H，SO2NH2)，5.53(bs，OH)，4.54(d，J＝14.4Hz，1H)，4.30(d，J＝14.4Hz，1H)，1.38(s，3H)；
19FNMR(CDCl3，400MHz)δ-62.80.
实施例2
SARD的雄激素受体结合、反式激活、降解和代谢
配体结合测定(Ki值)
将hAR-LBD(633-919)克隆到pGex4t.1中。使用GST柱制备且纯化大规模GST标记的AR-LBD。使重组AR-LBD与[3H]米勃酮(PerkinElmer，Waltham，MA)在缓冲液A(10mM Tris，pH7.4，1.5mM乙二胺四乙酸二钠，0.25M蔗糖，10mM钼酸钠，1mM PMSF)中混合，以测定[3H]米勃酮的平衡解离常数(Kd)。在具有或不具有高浓度的未标记米勃酮的情况下，使蛋白质与增加浓度的[3H]米勃酮一起在4℃下孵育18小时，以便测定总结合和非特异性结合。随后从总结合减去非特异性结合以测定具有一个位点饱和的配体结合曲线的特异性结合和非线性回归以测定米勃酮的Kd。
增加浓度的SARD或DHT(范围：10-12至10-2M)使用上文所描述的条件与[3H]米勃酮和AR-LBD一起孵育。在孵育后，将配体结合的AR-LBD复合物使用Bio Gel
Figure BDA0003971812710000452
羟磷灰石分离，洗涤且在添加闪烁混合液之后在闪烁计数器中计数。值表示为Ki。
wt AR的反式激活测定(IC50值)：
将HEK-293细胞以24孔板的125,000个细胞/孔铺板在无酚红的DME+5％csFBS中。在optiMEM培养基中，使用阳离子脂质体(Lipofectamine)转染试剂用0.25μg GRE-LUC、10ng CMV-海肾LUC和50ng CMV-hAR(wt)转染细胞。在转染后24小时，将培养基更换为无酚红的DME+5％csFBS，并用剂量响应的各种药物(1pM至10μM)处理。SARD和拮抗剂与0.1nMR1881组合处理。在处理后24小时，在Biotek synergy 4读板器上进行荧光素酶分析。将萤火虫荧光素酶值归一化为海肾荧光素酶值。
质粒构建体和瞬时转染
克隆到CMV载体骨架中的人AR用于反式激活研究。将HEK-293细胞以24孔板的120,000个细胞/孔铺板在DME+5％csFBS中。采用0.25μg GRE-LUC、0.01μg CMV-LUC(海肾荧光素酶)和25ng的AR，使用阳离子脂质体(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染细胞。如图所指示，在转染后24小时处理细胞，转染后48小时进行荧光素酶分析。数据表示为从四参数逻辑曲线获得的IC50。
LNCaP基因表达测定
将LNCaP细胞以96孔板的15,000个细胞/孔铺板在无酚红的RPMI+1％csFBS中。在铺板后四十八小时，用剂量响应的SARD处理细胞。在处理后二十四小时，使用cells-to-ct试剂分离RNA，合成cDNA，并使用taqman引物和探针通过实时rtPCR(ABI 7900)测量各种基因的表达。基因表达结果归一化为GAPDH。
LNCaP生长测定
将LNCaP细胞以96孔板的10,000个细胞/孔铺板在无酚红的RPMI+1％csFBS中。用剂量响应的SARD处理细胞。在处理后三天，再次处理细胞。在处理后六天，固定细胞并通过SRB测定测量细胞活力。
LNCaP或AD1降解(ARFL)
将表达全长AR的LNCaP或AD1细胞以6孔板的750,000-1,000,000个细胞/孔铺板在生长培养基(RPMI+10％FBS)中。在铺板后二十四小时，将培养基更换为无酚红的RPMI+1％csFBS并在该培养基中维持2天。将培养基再次更换为无酚红的RPMI+1％csFBS，并将细胞用SARD(1nM至10μM)与0.1nM R1881组合处理。在处理24小时后，将细胞用冷PBS洗涤并收获。蛋白质使用含盐裂解缓冲液，通过三个冻融循环提取。估计蛋白质浓度，并使五微克的总蛋白质负载于SDS-PAGE上，分级分离，并转移到PVDF膜。用AR N-20抗体(得自SantaCruz)和肌动蛋白抗体(得自Sigma)探测膜。
22RV1和D567es降解(AR SV).
将表达AR剪接变体的22RV1或D567es细胞以6孔板的750,000-1,000,000个细胞/孔铺板在生长培养基(RPMI+10％FBS)中。在铺板后二十四小时，更换培养基并进行处理。在处理24-30小时后，将细胞用冷PBS洗涤并收获。蛋白质使用含盐裂解缓冲液，通过三个冻融循环提取。估计蛋白质浓度，并使五微克的总蛋白质负载于SDS-PAGE上，分级分离，并转移到PVDF膜。用ARN-20抗体(得自SantaCruz)和肌动蛋白抗体(得自Sigma)探测膜。
22RV1生长和基因表达.
如前所述通过SRB测定评价细胞生长。将细胞铺板于96孔板的全血清中，并在3天后更换培养基处理6天。对在RPMI+10％FBS中以10,000细胞/孔铺板于96孔板中的22RV1细胞中执行基因表达研究。在铺板后二十四小时，将细胞处理3天，并如前所述进行基因表达研究。
反式激活(IC50)
表A中所示化合物的体外AR拮抗作用。在optiMEM培养基中使用阳离子脂质体用0.25ug GRE-LUC、0.01ug CMV-海肾LUC和25ng CMV-hAR转染COS7细胞。转染后24小时在0.1nM R1881存在下处理细胞，并在转染后48小时进行荧光素酶测定。萤火虫萤光素酶值归一化为海肾萤光素酶值。
降解
表A列出了指定化合物的FL和SV AR降解活性。每列下的数字代表媒介物的％变化。使用图像软件对条带进行定量。对于每个值，AR条带除以GAPDH条带，计算并表示与媒介物的％差异。显示的数字为0(无降解)或表示为针对GAPDH水平标准化的AR水平的降低。对于FL AR降解，将LNCaP细胞在含有木炭处理的FBS培养基中维持2天。在存在0.1nM R1881的情况下，在该培养基中处理细胞。处理后24小时收获细胞，提取蛋白质，并进行AR和GAPDH的蛋白质印迹。对于SVAR降解，如LNCaP所示处理22RV1细胞。
受试化合物的代谢稳定性(体外CLint)的测定
I期代谢
测定以0.5mL的最终体积一式两份进行(n＝2)。将受试化合物(1μM)在37℃下在含有0.5mg/mL肝微粒体蛋白质的100mM Tris-HCl(pH 7.5)中预孵育10分钟。在预孵育后，通过添加1mM NADPH(在37℃下预孵育)开始反应。孵育一式三份且在不同时间点处(0、5、10、15、30和60分钟)进行。取出100μL等分试样且用100μL含有内标的乙腈淬灭。将样本涡旋混合且以4000rpm离心10分钟。将上清液转移到96孔板并提交进行LC-MS/MS分析。作为对照，在不存在NADPH的情况下进行的样品孵育包括在内。由PCR％(剩余的母体化合物％)确定化合物消失率(斜率)并计算体外CLint(μl/min/mg蛋白质)。
I期和II期途径的代谢稳定性
在该测定中，将受试化合物与肝微粒体一起孵育并且使用发现级LC-MS/MS来测定药物消失。为了模拟II期代谢途径(葡萄糖醛酸反应)，UDPGA和丙甲甘肽包括在本测定中。
LC-MS/MS分析
使用由Agilent 1100HPLC与MDS/Sciex 4000Q-TrapTM质谱仪组成的LC-MS/MS系统进行所研究化合物的分析。使用由C18保护筒系统(用于4.6mm ID柱的SecurityGuardTMULTRA Cartridges UHPLC，Phenomenex)保护的C18分析柱(AlltimaTM，2.1×100mm，3μm)实现分离。流动相由通道A(95％乙腈+5％水+0.1％甲酸)和通道C(95％水+5％乙腈+0.1％甲酸)组成，并且以0.4mL/分钟的流速递送。针对每种分析物优化乙腈和水的体积比。使用针对每种化合物优化的气帘气、碰撞气体、雾化气体和辅助气体和550℃的源温度进行多反应监测(MRM)扫描。使用-4200V(负模式)的离子喷雾电压形成分子离子。针对每种化合物优化去簇(declustering)电位、入口电位、碰撞能量、产物离子质量和细胞退出电位。
用于测定大鼠血清浓度的LC-MS/MS分析
在最后一次给药后24-30小时收集血清。将100μL血清与200μL乙腈/内标混合。通过用100μL大鼠血清连续稀释标准物(以nM计)来制作标准曲线，浓度为1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9、1.9、0.97和0。用200μL乙腈/内标萃取标准物。这些实验的内标是(S)-3-(4-氰基苯氧基)-N-(3-(氯)-4-氰基苯基)-2-羟基-2-甲基丙酰胺。
使用由Agilent 1100HPLC与MDS/Sciex 4000Q-TrapTM质谱仪组成的LC-MS/MS系统进行分析物SARD的仪器分析。使用由C18保护筒(PhenomenexTM 4.6mm ID柱，具有支架)保护的C18分析柱(AlltimaTM，2.1×100mm，3μm)实现分离。流动相由通道A(95％乙腈+5％水+0.1％甲酸)和通道C(95％水+5％乙腈+0.1％甲酸)组成，并且在70％A和30％B下以0.4mL/分钟的流速等度递送。分析物SARD的总运行时间是最优的，但通常为2-4分钟，并且进样体积为10μL。用10下的气帘气；介质下的碰撞气；60.0下的雾化气体，和60.0下的辅助气体以及550℃的源温度进行多反应监测(MRM)扫描。使用4200(负模式)的离子喷雾电压(IS)形成分子离子。对所观察的质量对的每种分析物SARD优化去簇电位(DP)、入口电位(EP)、碰撞能量(CE)、产物离子质量和细胞退出电位(CXP)。
Log P：辛醇-水分配系数(Log P)
Log P是辛醇-水分配系数的对数，通常在药物发现工作的早期使用，作为特定分子是否可能穿过生物膜的粗略估计。计算Log P使用的ChemDraw Ultra版本是12.0.2.1016(Perkin-Elmer，Waltham，Massachusetts 02451)。计算的Log P值在表1中标记为“Log P(-0.4至+5.6)”的列中报告。Lipinski的五法则是一套旨在预测口服生物利用度的标准。这些用于口服生物利用度的标准之一是Log P在列标题中所示的值之间(-0.4(相对亲水性)至+5.6(相对亲脂性)范围)，或更通常地表述为<5。SARD设计的目标之一是提高水溶性。本发明的单环模板如吡唑、吡咯等比早期的类似物更易溶于水。
表A：LBD结合(Ki)、AR拮抗(IC50)、SARD活性和代谢稳定性的体外筛选
Figure BDA0003971812710000471
Figure BDA0003971812710000481
实施例3：吡唑部分的单取代(B环，系列I)
生物学方法
竞争性配体结合测定
如前所述使用从大鼠前列腺克隆的纯化AR-LBD进行AR配体结合测定(Cancer Res2017，77，6282-6298；JMed Chem 2019，62，491-511)。
AR反式激活测定
使用阳离子脂质体转染试剂(Life Technologies，Carlsbad，CA)转染以70,000个细胞/孔铺板在24孔板中的HEK-293细胞。将细胞用0.25μgGRE-LUC、25ng CMV-hAR和10ngCMV-LUC转染。在转染后24小时处理细胞，并且在转染后48小时进行荧光素酶分析。将萤火虫荧光素酶测定值归一化至海肾荧光素酶测定数值。
突变体AR(F876L)和wt PR反式激活测定
将COS细胞以24孔板的70,000个细胞/孔铺板在无酚红的DME+5％csFBS中。在optiMEM培养基中，使用阳离子脂质体转染试剂用0.25μgGRE-LUC、10ng CMV-海肾LUC和50ng pCR3.1-hPR(wt)或F876L AR转染细胞。在转染后24小时，将培养基更换为无酚红的DME+5％csFBS，并在存在或不存在0.1nM孕酮(PR)或R1881(F876L AR)的情况下用剂量反应的各种药物(1pM至10μM)处理。在处理后24小时，在Biotek synergy 4读板器上进行荧光素酶测定。将萤火虫荧光素酶值归一化至海肾荧光素酶值。
LNCaP细胞中的雄激素受体依赖性基因表达(图3)
将LNCaP细胞铺板到96孔板的无酚红的RPMI+1％csFBS中。将细胞在该培养基中维持两天，并在存在0.1nM R1881的情况下处理。处理后二十四小时，收获细胞，分离RNA，并使用cells-to-ct试剂盒(Life Technologies)制备cDNA。使用TaqMan引物和探针(LifeTechnologies)，使用实时PCR测量基因的表达。
MR49F LNCaP细胞中的细胞增殖测定(图4)
将MR49F细胞铺板到96孔板的无酚红的RPMI+1％csFBS中。将细胞在存在0.1nMR1881的情况下在该培养基中处理六天，更换培养基并在三天后再处理。使用cell-titer-glo(Promega)测量活细胞的数目。
蛋白质印记
将指定的细胞系处理24小时。收获细胞，提取蛋白质，并使用结合AR的N末端的ARPG-21兔多克隆抗体对AR、AR-SV和GAPDH进行蛋白质印迹1，12。
体外代谢测定
如前所述进行DMPK测定1，12。如上所述在小鼠、大鼠和人肝微粒体中进行代谢测定。
大鼠体内药代动力学
在Covance，使用如以下简要讨论的标准方法进行PK研究。
畜牧业和实验设计
使雄性Sprague Dawley大鼠(得自Envigo RMS，Inc.)适应研究条件5天，然后给药初始剂量。在初始给药时，动物为12周龄。将动物分组圈养(多至三只动物/笼/组)在具有硬木屑垫料的聚碳酸酯笼中。提供合乎标准的啮齿动物饲料#2016C(Envigo RMS，Inc.)，自由采食。每天新鲜提供水，自由饮用。将动物室的环境控制设定成维持20至26℃的温度、50±20％的相对湿度和12小时光/12小时暗循环。根据需要，中断12小时暗循环以适应研究程序。供试品由Covance在15％二甲基亚砜(DMSO)/85％聚乙二醇(PEG)300中制备。基于在剂量给药的第1天和第7天记录的体重，计算个体剂量。连续七天经由管饲针给药单次口服日剂量，并如下所述取血液样品。在第1天，经由尾静脉给药单次静脉内剂量并取血液样品。
26a实验的额外详细信息(包括组、每组动物数量、剂量(口服5、10、20和30mg/kg/天，持续七天；第1天iv 10mg/kg)以及途径)在以下实验设计表B中给出。每天两次(上午和下午)观察动物的死亡率以及疼痛和痛苦迹象，并且每天进行笼侧的一般健康状态和外观观察一次。在动物选择时以及在剂量给药的第1天和第7天对动物称重。
表B.七天大鼠药代动力学实验的实验设计
Figure BDA0003971812710000491
样品收集
在第1天和第7天，在给药前(仅第7天)和给药后大约0.083、0.25、0.5、1、3、6、12和24小时，从三只动物/组经由注射器和针经颈静脉收集血液(大约0.5mL)，并转移到含有K3EDTA的管中。对于i.v组，在给药后大约0.083、0.25、0.5、1、3、6、12和24小时，经颈静脉收集血液(大约0.5mL)。在离心以获得血浆之前，将血液维持在冷冻冰袋中。在收集1小时内开始离心。将血浆置入带有条形码标签的96孔管中。使血浆维持在干冰上，然后储存于大约-70℃。药物浓度通过建立的色谱/质谱(LC-MS/MS)方法进行测量。
Hershberger测定
将雄性大鼠(6-8周龄)基于体重随机分组。如图中所指示，用药物通过口服给药处理动物，持续14天。处死动物，对前列腺和精囊称重，并将器官重量规一化至体重。雄性大鼠(n＝5/组)保持完整13天。用指定化合物以指定剂量每天经口处理完整大鼠，持续13天。在处理的第14天处死大鼠，并移除前列腺和精囊器官并称重。将器官重量规一化至体重。对10、21a、16i(呈毒性，因此无数据)和26a进行该20mg/kg固定剂量筛选Hershberger。实验的目的是发现体内抗雄激素功效大于10的化合物。
异种移植物研究
在Hera Biolabs(Lexington，KY)进行异种移植物研究。将恩杂鲁胺抗性VCaP(MDVR VCaP；Dr.Donald McDonnell，Duke University，Durham，NC授权)细胞经皮下植入SRG大鼠(n＝5-7只/组)(Hera Biolabs)中。一旦肿瘤生长至1000-2000mm3，就将动物随机分组并用指定药物处理。每周测量肿瘤体积三次。处理后三十天，处死动物，将肿瘤称重，并储存用于进一步分析。
16a-16x的合成根据路线1进行。将市售可得的(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酸(11)用SOCl2处理以使酸11转化为酰氯(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酰氯(未显示)，其与苯胺(12)反应，以获得溴化物化合物(13)。在碱性条件(例如，K2CO3)下，将13转化为关键的环氧乙烷中间体(14)。市售可得的吡唑(15)通过与14反应而烷基化，得到吡唑-1-基-丙酰胺16a-16x。针对前列腺癌细胞系中的AR LBD结合(Ki)、反式激活抑制(IC50)、全长(LNCaP细胞中的AR FL)和剪接变体(22RV1细胞中的AR SV)雄激素受体的AR降解(％降解)，以及LNCaP细胞中的降解效力(DC50值)，在体外筛选系列I和本文测试的所有其它化合物(表2)。最佳SARD和泛拮抗剂是有效抑制AR反式激活(IC50)且任选地降解AR FL或AR SV且在抗雄激素抗性CRPC模型中具有大于10的效力的体内功效的化合物。
在吡唑环上不具有取代的化合物16a具有较弱的AR抑制活性，IC50值为1.442μM。体外AR抑制定义为抑制R1881诱导的wtAR转录活性的能力，如通过荧光素酶测定所测量[参见表2的反式激活(IC50)列中的值]，在本文称为体外AR抑制。除了4-碘化合物16e之外，在吡唑上引入卤素均显著地增加AR抑制活性。在卤素取代的情况下AR抑制效力的次序为：16c(4-Cl，0.136μM)＞10(4-F，0.199μM)>16b(3-F，0.220μM)＞16d(4-Br，0.427μM)＞16a(4-H，1.442μM)>16e(4-I，2.038μM)。具有4-取代的化合物表现出比它们的3-取代对应物更有效的AR抑制活性，例如，分别比较了10(4-F)与16b(3-F)、16g(4-CF3)与16h(3-CF3)、16m(4-苯基)与16n(3-苯基)以及16o[4-(4-氟苯基)]与16p[3-(4-氟苯基)]。
在吡唑环上的吸电子基团(EWG)越强，AR抑制活性就越有效，其中效力次序为16j(4-NO2，0.036μM)＞16i(4-CN，0.045μM)＞16g(4-CF3，0.071 μM)>16h(3-CF3，0.205μM)>16q(4-乙炔基，0.276μM)＞16f(4-COCH3，0.758μM)。在吡唑环上带有给电子基团的化合物显示出低效力的AR抑制活性(16l、16u和16x)、无AR抑制活性(16k、16s、16v和16w)、或甚至AR激动剂活性(16t，其为4-NH2)。例如，在吡唑环上带有[4-(4-OH-丁-1-炔-1-基)]的16r未表现出AR抑制活性，但显示出51％的AR全长蛋白质降解活性。
就SARD活性而言，吡唑环的取代似乎有必要(16a；0％/0％，以％降解计)，但是一些给电子基团如16k的4-OCH3以及16m和16n中的4-苯基或3-苯基是无活性的。与AR抑制效力类似，吸电子基团(EWG)的强度和4-取代似乎作出有利贡献，如在10(4-F；对于AR FL和ARSV功效100％/100％)、16g(4-CF3；80％/100％功效)、16i(4-CN；90％/100％功效)中所见；而3-取代的EWG具有略微较低的SARD活性，如可在16b(3-F；82％/73％功效)和16h(3-CF3；67％/54％功效)中所见。然而，16p(3-(4-氟苯基))优于其4-位异构体16o(4-(4-氟苯基))，其中降解功效为54％/81％vs 72％/0％。
抑制效力(IC50)不总是与％降解相关。例如，最有效的抑制剂16i(4-NO2；0.036μM)是较差降解剂，并且最有效的系列I卤素16c(4-Cl；0.136μM)仅展示出中等SARD活性(71％/34％)。此外，LBD结合(Ki)与AR抑制效力(IC50)或SARD活性不相关。例如，非结合剂10和16c(Ki值＞10μM)抑制和降解，而非结合剂16r降解但不是抑制剂。
SARD活性的％功效的构效关系(SAR)(考虑AR FL SARD和AR SV SARD总体活性，由于其限制而为半定量值)似乎在一定程度上与AR抑制效力相关且在[更]小程度上与LBD Ki相关。筛选特征旨在使得FL和SV SARD功效和AR抑制效力能够最大化，以提供用于在抗雄激素抗性CRPC模型中测试的最有效和广泛的拮抗剂。在一些情况下，如16g、16i和26a，高功效SARD(＞70％，对于AR FL和AR SV两者)是有效的AR抑制剂(＜0.100μM IC50)；并且中等功效SARD是中等效力的抑制剂，如16b、16c、16h和26c。然而，％SARD功效并不总是与体外抑制效力或LBD结合良好地相关。例如，16j是较差降解剂，仅具有20％AR FL功效(对于SV而言N.A.)，但与LBD结合(2.225μM)相比非常有效地抑制(0.036μM)，并且26f在1和10μM下仅具有8％、15％AR FL功效，但却非常有效的抑制(0.035μM)，比LBD结合(0.567μM)强＞10倍。因此，已认为主要强调这些分子作为AR降解剂(即SARD)，而非强调其抑制(且在大多数情况下降解)迄今测试的所有AR形式的能力。在致力于确定AR SARD活性对所观察到的AR拮抗作用作出的贡献中，此处首次提供了LNCaP细胞中的降解效力值(DC50值)。这些值比IC50值高大约4至10倍(表2-5)，表明单独的SARD活性可能无法解释这些化合物的有效AR泛拮抗作用。因此，这些宽范围和有效的非经典AR拮抗剂在本文中称为SARD和泛拮抗剂。
表2. 16a-16x(系列I)和批准的抗雄激素要的体外AR活性
Figure BDA0003971812710000511
Figure BDA0003971812710000512
aAR结合通过1nM[3H]MIB与野生型AR(wtAR)的重组LBD的竞争性结合来测定。在各实验中使用DHT作为标准试剂，并将值归一化至DHT，DHT的IC50取为1nM。b通过用全长wtAR、GRE-LUC，以及用于转染对照的CMV-海肾荧光素酶转染HEK-293细胞来测定反式激活抑制。在转染后24小时，在存在0.1nM R1881(拮抗剂模式)或在不存在R1881(激动剂模式)的情况下，用剂量反应的化合物(1pM至10μM)处理细胞24h。在处理后24小时，使用双荧光素酶(萤火虫和海肾)测定试剂盒(Promega，Madison，WI)进行荧光素酶测定。
cSARD活性的测定是通过处理LNCaP或22RV1细胞，以分别测定FL AR(在1μM的拮抗剂下)或SV AR(在10μM的拮抗剂下)蛋白质水平。使细胞在活性炭处理的含血清培养基中维持48小时，并在0.1nM R1881(激动剂)存在下用指定剂量的拮抗剂处理24小时。收获细胞，并使用针对AR的NTD和肌动蛋白(用于蛋白质上样的内部对照)的AR-N20或PG-21抗体来进行AR的蛋白质印迹。将AR FL和ARSV条带定量并归一化至肌动蛋白条带，并且以来自媒介物处理的细胞的抑制百分比表示。
d结果在文献中与此处所述的相同测定中有报道。
eN.A.意指数据不可得。
f两个值指示用1和10μM的拮抗剂运行的SARD进行。g在相同测定中以拮抗剂模式进行转录激活，并报道IC50值。h在文献中报道了达洛鲁胺的非对映体混合物的结合亲和力和反式激活的wtAR抑制。
实施例4：芳族A环的修饰(系列II)
化合物21a-21j通过路线2中所显示的途径进行制备。用SOCl2处理酸11，提供酰氯(R)-3-溴-2-羟基-2-甲基丙酰氯(未显示)，其与各种胺(17)在碱性Et3N条件下反应，以供应具有不同A环的溴酰胺18。碱性条件(例如K2CO3)将溴酰胺18转化为环氧乙烷中间体19，随后在氢化钠碱性条件下与各种吡唑20偶联，以制备目标化合物21a-21j。在体外测试化合物的AR活性(表3)。
对于4-F吡唑，在A环的3’-位用氮(N)替换碳(CH)(即10的3’-吡啶并衍生物)与其对应物10(IC50＝0.199μM)相比递送了更有效的化合物(21a)(AR抑制IC50值为0.062μM)。然而，在其它情况下，3’-吡啶并衍生物与其苯基A环类似物等效力或效力较低。3’-吡啶并21c(4-CN；0.059μM)与其A环苯基类似物16i(IC50＝0.045μM)相比显示出几乎同等有效的AR抑制活性。然而，3’-吡啶并化合物21b(4-CF3)和21d(4-NHCOOtBu)显示出比它们的苯基A环对应物16g和16u更低的活性(IC50值分别为0.208μM和6.108μM)。当与10(0.199μM；100％/100％)相比时，10的其它A环修饰减小AR抑制活性和％降解，包括用3’-Cl替换3’-CF3(21e；0.427μM；42％/0％降解)、用4’-NO2替换4’-CN(21f；部分激动剂；N.A.％降解)以及如21g-21k中的其它修饰。与显示出低或无AR LBD结合亲和力(Ki)的其它吡唑丙酰胺不同，发现对于21c所见，吡唑中的4-CN取代基与3’-吡啶并A环的组合促进了紧密的LBD结合(Ki＝0.089μM)，但SARD活性相对较差(15％/N.A.)。
表3. 21a-21j(系列II)的体外AR活性
Figure BDA0003971812710000521
Figure BDA0003971812710000522
Figure BDA0003971812710000531
a进行AR结合、反式激活和降解测定，并且所报告的值如表2中所述。
bN.A.意指数据不可得。
实施例5：吡唑B环的二取代(系列III)
利用与路线1和2中类似的合成方法来合成化合物26a-26h，如路线3中所示，并测试AR活性(表4)。
化合物26a在吡唑环上具有两个吸电子基团(3-F和4-Br)，并且表现出有效的抑制活性(IC50值为0.084μM)以及中等至高功效AR FL和AR SV降解(70-80％降解)。相对于3-F(16b；0.220μM；82％/73％)和4-Br(16d；0.427μM；42％/0％)单取代的类似物，化合物26a化合物使AR抑制效力提高3-4倍，并且在降解特性上保留或改善，支持二取代的进一步探索。在26a的A环中用氮(N)替换碳(CH)递送了3’-吡啶并26f，其是非常有效的AR抑制剂(IC50值为0.035μM)，但SARD活性较差(8％，对于FL/SV15％/N.A.)(表4)。在吡唑上具有二取代基的化合物26b-26e显示出与10(0.199μM)相当的抑制活性，其中AR抑制IC50值按次序为26e(3-Br，4-Cl；0.138μM)＞26c(3-Br，4-CN；0.202μM)>26b(3-Br，4-(4-氟苯基)；0.285μM)>26d(3-Cl，4-甲基)；0.332μM)。
化合物26e(0.138μM)和26c(0.202μM)相对其单取代的类似物16c(4-Cl；0.136μM)和16i(4-CN；0.045μM)未有改善。卤素加成到4-EDG吡唑上至少部分地拯救活性，例如，与26b(3-Br，4-(4-氟苯基)；0.285μM)和16o(4-(4-氟苯基)；0.969μM)和26d(3-Cl，4-甲基；0.332μM)以及16l(4-甲基；8.087μM)相比。另外，这些结果表明吡唑取代基的EWG强度有利地促进抑制活性。26c的3’-吡啶并A环形式得到效力低>10倍的抑制剂26g(AR抑制IC50值为5.481μM)，尽管在AR FL中的SARD功效为80％(但在AR SV中没有功效)。与21c(4-CN；0.059μM)相比，在吡唑的3位引入额外的溴(26g)或苯基(26h)使抑制活性分别大大地降低至5.481或0.579μM。发现对于26c，吡唑上的3-Br和4-CN取代基促进了更紧密的LBD结合(Ki＝0.202μM)，并且吡唑上的3-F、4-Br取代基(26a)递送有效的抑制剂(IC50＝0.084μM)，同时在AR FL和AR SV中保持SARD活性(70％/80％)。
表4. 26a-26h(系列III)的体外AR活性
Figure BDA0003971812710000532
Figure BDA0003971812710000533
Figure BDA0003971812710000541
a进行AR结合、反式激活和降解测定，并且所报告的值如表2中所述。
b两个值表示用1和10μM的拮抗剂运行的SARD测定。cN.A.意指数据不可得。
实施例6：连接部分的修饰(系列IV)
利用与路线1-3中类似的合成方法来合成化合物29a-29f，如路线4中所示，并测试29a-29f的AR活性(表5和表1)。
转换10(S-异构体)的手性得到几乎等效的29a(R-异构体，AR抑制IC50值为0.192μM)，并且与10(100％)相比略微降低至84％的降解。从10的2-羟基-2-甲基丙酰胺连接基中移除2-羟基部分得到26b，且与10(0.199μM；100％/100％)相比具有减小的AR抑制活性(0.462μM)和60％/70％FL/SV SARD活性。从10的键中移除2-甲基和2-羟基部分以得到线性丙酰胺29c，其进一步降低了AR抑制和SARD活性。
作为10的噁唑烷-2，4-二酮连接基变体，化合物29d具有类似于连接基的酰胺和羟基(如氨基甲酸酯中的氧)的基团。与10(0.199μM；100％/100％)相比，29d仍然显示活性，但具有显著减小的AR抑制(1.131μM)和SARD(18％，50％/N.A.)活性。2-羟基AR激动剂16t(4-NH2)的酰化得到29e，其恢复一些拮抗剂活性，且AR抑制IC50值为0.901μM，而将第二酰胺引入连接基中并如29f中改变吡唑连接位置得到激动剂。尽管连接基元件在系列IV的该初始SAR中没有最优化，但是同样观察到对手性中心反转的耐受性，并且确立对于抑制和SARD活性，对2-羟基-2-甲基丙酰胺连接基没有绝对要求。
表5. 29a-29f(系列IV)的体外AR活性
Figure BDA0003971812710000542
Figure BDA0003971812710000543
Figure BDA0003971812710000551
a进行AR结合、反式激活和降解测定，并且所报告的值如表2中所述。
bN.A.意指数据不可得。
c两个值表示用1和10μM的拮抗剂运行的SARD测定。
相对于目前临床上用于治疗PC的已知标准AR拮抗剂而言，系列I-III的AR LBD亲和力(对于一些化合物)和体外拮抗剂特性在相当到有利的范围内。例如，2、4、5和6具有0.509、3.641、1.452和0.011μM的LBD结合亲和力(3-5的值是内部测定的，而6的值则来自文献)，以及0.248、0.216、0.160和0.065μM的体外抑制(3-5的值是内部测定的，而6的值则来自文献)；与＞10μM的10结合和0.199μM的拮抗作用相比。发现来自系列I的化合物16b、16e、16g、16h、16i和16m，来自系列II的21a，来自系列III的26a和26c，以及来自系列IV的29a表现出在0.041至0.220μM范围内的相对有效的AR抑制IC50值，但与2和4-6不同，其为降解活性值在100％至45％范围内的SARD。这些化合物(16m除外)与相对于已知LBD靶向抗雄激素药改善的抑制剂是相当的，但具有新型泛拮抗作用和SARD活性。
实施例7：小鼠、大鼠和人肝微粒体中的体外代谢稳定性
选择各系列的具有有效抑制活性的化合物，以在具有I相和II相代谢二者的酶的辅因子的小鼠肝微粒体(MLM)中进一步评价体外代谢稳定性。计算半衰期(T1/2)和内在清除率(CLint)值作为这些化合物的分布、代谢和药代动力学(DMPK)特性的预测指标(表6)。这些化合物的CLint比前代的SARD慢，这些吡唑-1-基-丙酰胺(16b、16g、16h、16i、16m、21a、26a和29a)产生48.45分钟至>360分钟的相对稳定的T1/2值，其中九种测试的吡唑中有六种在MLM中＞360分钟是稳定的。这是巨大的改善当与先前的SARD模板相比时，如对于叔胺8为1.15分钟，对于吲哚9为12.11分钟(Ponnusamy等人，CancerRes.2017，77，6282-6298)以及对于先前在相同的体外测定中公开的多种吲哚和二氢吲哚B环化合物为9-36分钟(Dellis等人，Expet.Opin.Invest.Drugs 2018，27，553-559)，并且相对于10改善(T1/2为77.96分钟)。
Figure BDA0003971812710000552
表6.所选择化合物在小鼠肝微粒体(MLM)中的体外代谢稳定性
Figure BDA0003971812710000553
Figure BDA0003971812710000561
a如实验部分中所述，将化合物与所提供的具有I相和II相辅因子的小鼠肝微粒体(MLM)一起孵育。
b先前在使用与实验部分中相同的方法中报道。
c人口服给药后的T1/2(h)，如先前在参考文献中所报道58。
d如先前报道的人口服给药后的CL(mL/h/kg)58。
芳基双环如吲哚和二氢吲哚中可能的代谢倾向可以是B环的芳基羟基化。A环和丙酰胺部分引入许多生物可利用的化合物中，如2(N-[4-氰基-3-(三氟甲基)苯基]-3-(4-氟苯基)磺酰基-2-羟基-2-甲基丙酰胺)和恩博萨莫类(enobosarm)((2S)-3-(4-氰基苯氧基)N-[4-氰基-3-(三氟甲基)苯基]-2-羟基-2-甲基丙酰胺)，使B环成为可能的代谢不稳定位点。用吡唑改善PK特性的可能原理是消除了B环上的一些可能的芳基羟基化位点。在吡唑的2-位氮原子上增加的正电荷也有可能使化合物成为代谢酶的较差底物和/或改善了生物分配。
还在大鼠肝微粒体(RLM)和人肝微粒体(HLM)中表征了四种另外的化合物，因为这些读数与表明化合物在PD模型的体内测试(如大鼠Hershberger测定和SRG大鼠中的异种移植物(参见下文))以及最终在临床中的稳定性有关(表7)。系列I化合物16c和16g在RLM中是稳定的(T1/2＞120分钟)，但16c在HLM中不太稳定(T1/2为102分钟)。21a(3-吡啶并，4-F)和26a(3-F，4-Br)在RLM和HLM两者中均是稳定的(T1/2＞120分钟)，这与先前公开的10在RLM(181分钟)和HLM(274分钟)中的数据类似(Ponnusamy等人，Clin.Cancer Res.2019，25，6764-6780)。RLM和HLM中的稳定性与这些吡唑的口服生物利用度的可能性一致，如先前10中所见。然而，21a和26a相对于16c和10具有改善的体外功效。
相应地，如果获得足够高的21a和26a的血液水平并且化合物分布到作用部位(即遍及身体的肿瘤)，则与10相比改善治疗抗雄激素抗性CRPC的功效成为可能。因此，具有多种活性特性的吡唑化合物(16i、21a和26a)进入到CRPC模型中的测试，包括对4(具有F876LAR点突变体的MR49F细胞)和1(具有T877A的LNCaP细胞)的抗性。
表7.所选择化合物在RLM和HLM中的体外代谢稳定性
Figure BDA0003971812710000562
a如实验部分中所述，将化合物与所提供的具有I期和II期辅因子的RLM一起温育。b如实验部分中所述，将化合物与所提供的具有I期和II期辅因子的HLM一起温育。
实施例8：去势抵抗性前列腺癌模型中的体外药效学
在竞争性LBD结合测定(Ki)、抑制性AR反式激活测定(IC50)，以及AR FL(在LNCaP细胞中)和AR SV(在22RV1细胞中)降解测定(％降解)中体外筛选化合物(上表2-5)。一旦单个分子实现较强体外筛选特性，就将体外代谢稳定性标准也纳入待进一步体外测试的所选择化合物的考虑(上表6和7)。为了改善体内测试中的功效，寻求与10相比具有优异的体外筛选特性的化合物，并进一步测试AR与PR之间的反式激活选择性、LNCaP细胞中的AR靶基因表达以及Enz-R PC细胞(MR49F LNCaP细胞)中的增殖研究。
突变体AR和wtPR拮抗剂效应
测试所选择的化合物16i(4-CN)、21a(3-吡啶并，4-F)、26a(3-F，4-Br)和10(4-F)拮抗LBD点突变AR(其赋予PC细胞恩杂鲁胺(4)抗性(Enz-R)表型)的能力。将这种F876L突变体AR或野生型PR(wtPR)转染到COS细胞(非PC细胞系)中，并通过荧光素酶测定定量(图1)。化合物16i、21a、26a和10以0.043、0.063、0.084和0.219μM的IC50值强烈抑制F876L突变体AR(图1)，与0.045、0.062、0.084和0.199μM的wtAR IC50值相当(表2-4)。等效地抑制F876L和wtAR的能力表明这些SARD在Enz-R模型中表现出泛拮抗作用。另外，该泛拮抗作用不能由1.499、＞10、0.607和＞10μM的16i、21a、26a和10的AR LBD Ki值加以解释。此外，将16i、21a和26a相对于10而言在wtAR抑制效力中增加的效力转换到该Enz-R模型中。
这些分子也抑制wtPR活性，其中对于wtAR抑制，16i、21a、26a和10的IC50值为3.540、0.235、1.101和0.403μM(图2)vs.0.045、0.062、0.084和0.199μM(表2-5)。尽管保留了wtPR抑制，但选择性比率([PR IC50]/[AR IC50])变化，其中对选择用于测试的化合物值为79倍、3.8倍、13.1倍和2.0倍，表明AR选择性也可通过进一步测试来最优化。重要地，这些分子中没有一种对GR、MR或ER反式激活有任何影响(数据未显示)。
CRPC细胞中的AR靶基因表达.
进行AR靶基因抑制实验，以确定先导吡唑26a对LNCaP细胞中R1881诱导的AR靶基因表达的效应(图3)。LNCaP细胞系是表达赋予1抗性的AR的T877A点突变的CRPC的非常良好的表征模型。化合物26a被选择为先导吡唑，因为26a具有高效力抑制(0.084μM)和高功效降解(对于AR FL和AR Sv两者为70-80％)的平衡，其中3，4-二取代相对于10而言阻断代谢(MLM中T1/2>360分钟vs.77.96分钟(表6))，并且26a在RLM和HLM中也是稳定的(>120分钟)。与wtAR(0.084μM；表4)和F876L AR(0.084μM；图1)反式激活的nM抑制一致，LNCaP细胞中的FKBP5基因表达被26a在低至0.1μM的浓度下强烈抑制，表明抗雄激素效应包括在抗雄激素抗性CRPC的另一模型中抑制内源性基因表达(图3)而不丧失效力。如所预期，抗雄激素药4也抑制FKBP5的表达，但效力略微较低。其它AR靶基因如PSA和TMPRSS2观察到相同的结果(数据未显示)。综上所述，上述数据支持26a在至少wtAR(表4)、F876L(图1)、T877A(图3)和AR SV(表4)中具有泛拮抗剂效应。
恩杂鲁胺抗性LNCaP细胞中的增殖研究.
用26a进行增殖研究，以证实在具有T877A抗雄激素抗性突变的CRPC模型(即，LNCaP细胞)中AR依赖性基因表达的有效抑制转换为甚至更难治的CRPC模型(即，具有AR的F876L和T877A点突变的MR49F LNCaP细胞)中的抗增殖。如上所提及，F876L突变赋予对MR49F细胞的恩杂鲁胺(4)抗性(Enz-R)；然而，MR49F细胞仍然依赖于AR进行生长。如图4所显示，在存在滴定剂量的26a或4的情况下测试MR49F细胞。化合物26a展示出剂量响应性抗增殖，其在低至0.1μM的剂量下显示出有效但部分的功效(自媒介物下降约50-60％)。展示MR49F模型的Enz-R，因为4的抗增殖效力低约100倍。例如，10μM的4产生与0.1μM的26a相当的效应，其较弱地为约20％功效并且与媒介物没有显著差异。假定26a可到达肿瘤，这种有效的抗增殖表明26a可在Enz-R CRPC的体内模型中表现良好。
CRPC模型中的AR FL(F876L)和AR SV(AR-V7)降解
在MR49F细胞中进行FL AR降解研究，以证实16i(0.045μM，90％、100％wtAR抑制，AR FL和AR SV降解测定)和26a(0.084μM，70％、80％)的稳健体外AR拮抗作用特性预测该高度难治性CRPC模型中的SARD活性。如上所述，化合物26a具有抑制LNCaP细胞中的AR依赖性基因表达和抑制MR49F细胞中的增殖的能力，并且还能够在Enz-RCRPC环境中降解FLAR(图5上图)。蛋白质印迹不是定量方法，并且可能难以基于相对带密度比较化合物之间的AR水平。因此，每个泳道中还包含GAPDH作为蛋白质上样对照。将AR水平标准化至该泳道中的GADPH水平。用密度测定法对蛋白质印迹进行定量，并将AR/GADPH值以相对于媒介物处理的细胞的倍数变化(图5中的印迹下方)或百分比变化(表2-5)表示。
观察到26a在3μM下的高功效SARD活性且在10μM下完全降解(图5，上图)，表明赋予MR49F LNCaP细胞Enz-R的该突变体AR FL易被26a破坏。16i也展示SARD活性但非完全功效，而4在MR49F细胞中不产生AR降解。下图展示不仅对于在LBD中具有点突变的T877A(LNCaP；表2-5)和F876L/T877A(MR49F LNCaP细胞；图5上图)AR FL呈现SARD活性，而且也可降解ARSV，如缺乏LBD表达的AR-V7(22RV1细胞；图5的下图)。如表4和2中所显示(参见AR SV降解列)，26a和16i能够在10μM下降低22RV1细胞中的AR-V7水平。图5证实了在3和10μM下的AR-V7SARD活性，但在该特定实验中任一SARD的降解％不完全。AR SV比AR FL更低的降解％与较早的报告和表2-5一致，其揭示AR SV降解可以是完全的，但通常在比对于ARFL(在1μM下筛选)更高的处理浓度(在10μM下筛选)下。表达AR SV的PC不具有传统的(或典型的)抗雄激素结合AR的结合位点，与不良预后相关联，并且认为对包括1-7在内的批准疗法具有泛抗性66。因此，这些吡唑SARD和泛拮抗剂(如10、21a和26a)具有与低剂量下口服给药相容的PK特性，至少在以下各项得到了非常广泛的AR拮抗能力：
1)wtAR(表2-5中的IC50值)，
2)T877A(表2-5中的LNCaPAR FL降解和图3中的AR依赖性基因表达的抑制)，
3)F876L(图1中COS细胞中的抑制)，
4)F876L/T877A共突变体(图4中MR49F细胞中的增殖)，
5)AR-V7(表2-5和图5中22RV1细胞中AR SV的降解)，和
6)AR扩增/过表达(参见下文报道的VCaP数据)。
跨越各种赋予抗性的AR突变体的广泛AR拮抗作用有助于确保正在演变成含有这些和/或其它AR突变的经处理肿瘤会保持对如本文所述的SARD和泛拮抗剂敏感。另外，这些SARD和泛拮抗剂在AR过表达和/或AR基因重组(如存在于VCaP细胞中)的模型中表现良好，表明这些PC将不能抵抗住这种治疗。鉴于SARD活性对于这些活性可能并非必须的事实，这些化合物充当AR泛拮抗剂。将化合物26a在体外作为先导SARD和泛拮抗剂之一进行测试，并经受一系列体内测试，以描述其在健康大鼠和大鼠中抗雄激素药抗性PC模型中的药代动力学和药效学特性。
实施例9：体内大鼠药代动力学
进行大鼠PK研究，以证实与前几代SARD相比，吡唑26a具有改善的PK特性。吡唑模板内的最优化PK特性提供了最佳的机会来揭示对于在晚期PC的体内模型中具有其独特AR作用机制的分子而言最优化的体内PD特性。
向雄性Sprague Dawley大鼠给予单一口服(po)日剂量连续七天，或在第1天给予单次静脉内(iv)剂量，且在给予后0.083、0.25、0.5、1、3、6、12及24小时定期取血液样品。5、10、20和30mg/kg po(第1-4组)以及10mg/kg iv(第5组)的剂量基于在一系列预实验中所见的体内功效进行选择，这与本节中详细讨论的Hershberger研究类似。由该数据绘制26a的浓度-时间曲线(图6)，并从该数据计算26a的PK参数(表8)。
表8. 26a药物代谢动力学参数的总结
Figure BDA0003971812710000581
像10一样，化合物26a在大鼠中展现出稳健的PK特性，其特性在于微摩尔血液水平以及与每日口服给予一致的长终末消除半衰期(t1/2)(表8)。26a相对于10的优点是其相对长的t1/2(超过24相对于2.6小时)(基于Ponnusamy的论文中对10报道的7天大鼠PK数据计算)(Ponnusamy等人，Clin.Cancer Res.2019，25，6764-6780)。26a的确切t1/2值不能计算，因为t1/2比24小时给药间隔要长(图6)。26a在较高剂量下具有逐渐减小的口服生物利用度，如通过减小的剂量标准化的从0至24小时的浓度-时间曲线下面积(DN AUC0-24)值以及对于组1-4随着增大的26a剂量而增大的最大浓度时间(Tmax)值所揭示(表8)。对于5、10、20和30mg/kg剂量的26a，计算的口服生物利用度为1.18、0.982、0.705和0.524。26a相对于10的较长t1/2至少部分抵消了高剂量下口服生物利用度的减小，并且26a与10相比获得了略微增加的绝对暴露。例如，30mg/kg po 26a和10的AUC0-24值分别为71,500和62,000h*ng/mL。后一值同样由Ponnusamy的论文中呈现的7天大鼠PK数据计算(Ponnusamy等人，Clin.CancerRes.2019，25，6764-6780)。
化合物26a表现出强健到足以在大鼠中经由每日口服给药来维持体内高血液水平的PK特征。还显示了30mg po 21a的初步大鼠PK数据(图9)。浓度与时间图展示出降低的体内稳定性，大部分21a到24小时消除，这与24小时的血液水平几乎未从其Cmax降低的30mg po26a形成鲜明对照(图6)。30mg po的化合物21a展示出足够低的CL以允许在大鼠中观察其PD特征。尽管一系列有效的体外活性，16i在5mg/kg下在体内展示出致死性。在大鼠Hershberger测定中研究化合物21a和26a，并且26a被选择为异种移植研究的先导物之一。
所观察到的26a的微摩尔Cmax血液水平和长t1/2表明，大鼠中的PK特性与揭示实施例2-8中的数据产生的26a在体内的任何高功效AR拮抗作用一致。这些实施例表明，26a与10相比以增加的效力在体外抑制广谱抗雄激素活性，包括在抗雄激素抗性CRPC模型中。用26a在大鼠中每日口服给药应当能够维持血液水平高于AR拮抗作用(表4)以及对AR依赖性转录(图3)和增殖(图4)的抑制效应的IC50值，如抑制AR依赖性异种移植物中的AR轴所必需。另外，对于21a(图9)、26a(图6和表8)和102所见的低微摩尔药物水平超过21a(880nM)、26a(860nM)和10(740nM)的DC50值(参见表2-4)，表明SARD活性可有助于体内AR拮抗作用，如先前对于10所见，其中观察到瘤内降解。
实施例10：体内雄激素受体拮抗剂活性
Hershberger测定.为了发现这些具有强健PK特性的吡唑基丙酰胺化合物在体内是否具有临床意义的SARD和泛拮抗剂活性，针对已在大鼠中展示口服生物利用度的21a和26a在完整大鼠中进行Hershberger测定(图9和7)。Hershberger测定数十年来被用于表明雄激素的合成代谢选择性。大鼠前列腺腹叶(VP)、精囊(SV)和肛提肌(LA)肌肉是AR依赖性组织，其尺寸(由其重量反映)对去势反应迅速。
去势后，这些器官在3-7天内萎缩至与其完整器官重量相比减少大约85％(VP)、90％(SV)和50％(LA)的器官重量。传统上，给药激动剂以防止(由此在去势后给予激动剂)或恢复(组织萎缩后给予激动剂)合成代谢组织重量[LA或其它骨骼肌和骨(后者需要数月而非数天萎缩和恢复)]到完整水平或更高，而无需增加雄激素组织(SV或VP)重量回到完整水平。如本文所采用，即拮抗剂模式，使用幼年完整动物，其中内源性雄激素环境为VP、SV和LA重量提供AR介导的支持，如图7A和7B中媒介物柱的0％变化所反映。
给予具有有效体外抑制[0.062和0.084μM(表3和4)]的外源性拮抗剂21a和26a，以观察其体内AR拮抗作用。对于10的衍生物(其中(1)如在21a中，3′-吡啶并N加入至10，或者(2)在26a中吡唑上额外的卤素如3-F或4-Br)，观察到体内AR拮抗作用的改善的效力。在20mg/kg的21a和26a下(即，以上所提及的10的剂量的三分之一)，VP重量减小大约35和30％(图7A)，表明可在相对于10的较低剂量下观察到21a和26a固有的体内PD特性。在该剂量下SV中，21a和26a提供大约45-50％的降低。与实施例9一致，这些结果证实，口服给药的26a吸收并分布到AR靶器官中的作用部位，并且表明这些化合物还应当分布到异种移植物模型中的肿瘤并且在敏感模型中发挥抗肿瘤效应。
大鼠中的Enz-R(MDVR)VCaP异种移植物.VCaP细胞系源于激素难治性PC患者的脊椎骨转移(https：//atcc.org/Products/all/CRL-2876.aspx；2020年1月20日访问)55。VCaP通常用作CRPC模型，其表达AR SV(AR-V7)和AR FL(TMPRSS2-ERG基因融合)的过表达。VCaP(即以下实验中使用的MDVR VCaP的亲本细胞系)是高度晚期PC模型，其中在单个AR轴驱动的细胞系中响应于雄激素剔除而出现多种激素抗性机制。亲本VCaP细胞仍然对恩杂鲁胺(4)敏感；然而，除了亲本细胞系中的抗性机制之外，MDVR VCaP细胞还具有获得性Enz-R。此前，观察到VCaP对4部分敏感，而MDVR VCaP不敏感(Ponnusamy等人，Clin.CancerRes.2019，25，6764-6780)。
在采用优于10的体外筛选组中的26a展示MR49F(Enz-R LNCaP细胞系)中的体外活性和Hershberger测定中的体内拮抗作用之后，在Enz-R MDVR VCaP异种移植物中显示出26a的活性。为了使26a与10能够直接比较，MDVRVCaP异种移植物如对10所公开进行(Ponnusamy等人，Clin.Cancer Res.2019，25，6764-6780)。对于10，不需要去势来显示在该模型中的功效(与我们所知的所有先前的AR拮抗剂不同)；然而，10在小鼠中不稳定；因此，将完整SRG大鼠用作MDVR VCaP异种移植物实验的宿主。
用每天po 10mg/kg的26a处理完整SRG大鼠(在HERA Biolabs，Lexington KY进行的研究)产生了多达83％TGI的可比功效(图8A)，相比之下10需要20-30mg/kg来实现类似的结果，而4无法持久地实现任何效果(未显示；先前公开)(图5)(Ponnusamy等人，Clin.Cancer Res.2019，25，6764-6780)。在研究结束时测量的肿瘤重量也展示出显著的抑制(图8B)。与所表现出的高效力抗肿瘤活性一致，在该研究中观察到肿瘤内26a的平均浓度为881nM，这比其在wtAR或F876L中的IC50值(均为84nM)高10倍。另外，瘤内水平仅从这些动物血液中26a的1319nM平均浓度略微下降(表9)。这支持除了VP和SV之外，26a还有效地分布到肿瘤中，并且支持其在晚期PC中的使用。
表9. 26a的血清和肿瘤药物浓度
Figure BDA0003971812710000591
a最后一次给药(第28天)后20至24小时，处死动物，并收集血液和肿瘤用于进一步分析。从血液中分离血清，并使用LC-MS/MS方法测量血清和肿瘤中的药物浓度(n＝4)。
表3和4中报告的21a(880nM)和26a(860nM)在LNCaP细胞中的体外DC50值(第50百分位降解功效的浓度)与MDVRVCaP异种移植物中获得的瘤内水平相当。尽管在体外和体内研究之间的细胞类型不同，但数据表明了本实验的肿瘤中完全功效SARD活性的次最优暴露的可能性。这种假定的半功效瘤内SARD活性可能有助于TGI。有可能通过增加的瘤内水平(即在增加的26a剂量下)，或者采用改善的降解效力的类似物来改善抗肿瘤活性。
结果清楚地表明，26a在大鼠中是稳定的，并且在Enz-R CRPC的这种AR过表达和AR-V7表达模型中极其有效和高效。结果进一步表明，26a的改善的PK和PD转换成与10相比更有效的体内功效，如果到目前为止未观察到毒性变为剂量限制性，则提供了节省剂量的SARD和泛拮抗剂。另外，改善的PK可以转换成遍及癌症患者全身的改善的渗透，从而允许更好地抑制远端转移性生长。当在表达广谱CRPC抗性机制的人群(表7中的HLM研究)中试验时，所有上述项提高了观察到疾病负担的临床显著降低的机会。即使表达AR SV(如AR-V7)、AR基因扩增以过度表达AR(如TMPRSS2-ERG)或LBD导向的抗雄激素抗性(如在MR49F或MDVVCaP细胞中观察到的Enz-R和/或达洛鲁胺抗性)或它们的组合(如在MDVR VCaP中)，该群体仍是敏感的。
这些结果证实，对于26a，体外筛选范例成功地从SARD和泛拮抗剂中鉴定出在体内CRPC模型中高度有效的改善的先导化合物。虽然如对10所公开的全功效体外SARD活性是独特的且应当有益于AR依赖性疾病，但其可能在临床中不一定有功效。这受到26a在体内更有效和可比功效的抗肿瘤活性的支持，其在体外不是完全功效SARD(70％/80％；表4)，不同于10(100％/100％；表2)。尽管不能对26a的高功效有准确且无可争议的机理解释，但其有效的体内功效也是无可争议的。吡唑模板代表目前提出的最佳B环模板，并且26a是来自该模板的最佳先导物之一。认为10或26a拥有克服临床中存在的多种CPRC机制的巨大潜能。
来自系列I的化合物16c、16g、16i和16j；来自系列II的21a和21c；以及来自系列III的26a、26c、26e和26f在体外表现出有效的抑制活性，而来自系列I的化合物16b、16c、16g和16i；来自系列II的21a；以及来自系列III的26a和26g在体外具有有效的SARD活性(表2-4)。与先前的SARD模板相比(如对于叔胺8为1.15分钟，且对于先导吲哚9为12.11分钟(Ponnusamy等人，CancerRes.2017，77，6282-6298))，这些吡唑基丙酰胺化合物，如16g、16i、21a和26a显著地改善其在MLM中的体外稳定性(表6)，并且21a和26a在RLM和HLM中是稳定的(表7)。化合物16i、21a和26a稳健地抑制F876L突变体AR，其中IC50值为0.043、0.063和0.084μM图1)；以及抑制wt PR活性，其中IC50值为3.540、0.235和1.101μM(图2)。化合物26a在低至0.1μM的浓度下有效地抑制LNCaP细胞中FKBP5的表达，表明抗雄激素效应包括抑制内源性基因表达(图3)，以及在低至0.1μM的剂量下展示出剂量响应性抗增殖(图4)。与10和21a相比，化合物26a还产生了优异的体内大鼠PK和PD特性，具有大大超过24小时的相对长t1/2值(图6)，以及大鼠Hershberger测定中的AR拮抗作用，与其完整器官重量相比具有大约30％(VP)和50％(SV)(图7)的降低，这与21a相当。
在完整大鼠模型中采用每天pO10mg/kg的26a的Enz-R(MDVR)VCaP异种移植物实验表明瘤内高药物水平(881nM)并且产生了83％TGI的功效(图8A)，这与20-30mg/kg po的10相当。结果清楚地表明，26a在Enz-R CRPC的这种AR过表达和AR-V7表达模型中非常有效和高效，并且共同满足用于Enz-R前列腺癌的下一代AR拮抗剂的所有标准。
如本文中描述的吡唑基丙酰胺化合物是选择性雄激素受体(AR)降解剂(SARD)和发挥广泛AR拮抗作用的泛拮抗剂。药理学评价表明，这些小分子表现出独特的SARD和泛拮抗剂活性。这些化合物表现出有效和广谱的AR拮抗剂活性，包括有效的体内活性和具前景性的分布、代谢和药代动力学(DMPK)特性。
虽然本发明的某些特征已经说明且描述于本文中，但本领域的普通技术人员现会想到许多修改、取代、变化和等同物。因此，应理解，所附权利要求书旨在涵盖如落入本发明的真实精神内的所有这些修改和变化。

Claims (24)

1.治疗需要其的个体中的前列腺癌的方法，其包括向所述个体给药治疗有效量的由式I的结构表示的化合物或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合：
Figure FDA0003971812700000011
其中
T为OH；
R1为CH3；
Y为H、CF3、F、I、Br、Cl或CN；
Z为H、NO2、CN、卤素、COOR、COR、NHCOR或CONHR；
或者Y和Z形成5-8元稠环；
X和D各自为CH或N；
B为键或CH，并且当B为键时，D＝B-X由D-X表示；
R为H、烷基、卤代烷基、烷基-OH、芳基、F、Cl、Br、I或OH；
A为具有至少一个氮原子的五元不饱和杂芳基，其任选地被Q1、Q2、Q3和Q4中的至少一个取代，所述Q1、Q2、Q3和Q4各自独立地选自线性或支链烷基、卤代烷基、CF3、芳基、F、Cl、Br、I、CN、NO2、OR、苄基、炔基、SO2N(R)2、NHCOOR、N(R)2、NHCOR、CONHR、COOR或COR；其中所述烷基、炔基和芳基各自任选地被卤素、CN或OH取代。
2.权利要求1的方法，其中所述化合物由式IIA或式IIB的化合物表示：
Figure FDA0003971812700000012
3.权利要求1的方法，其中所述化合物由式III的化合物表示：
Figure FDA0003971812700000013
其中
T为OH；
R1为CH3；
Y为H、CF3、F、I、Br、Cl或CN；
Z为H、NO2、CN、卤素、COOR、COR、NHCOR或CONHR；
或者Y和Z形成5-8元稠环；
X为CH或N；
R为H、烷基、卤代烷基、烷基-OH、CF3、CH2Cl、CH2CH2Cl、芳基、F、Cl、Br、I或OH；
A为吡咯、吡唑、三唑或咪唑，其各自任选地被Q1、Q2、Q3和Q4中的至少一个取代，所述Q1、Q2、Q3和Q4各自独立地选自线性或支链烷基、卤代烷基、CF3、芳基、F、Cl、Br、I、CN、NO2、OR、苄基、炔基、SO2N(R)2、NHCOOR、N(R)2、NHCOR、CONHR、COOR或COR；其中所述烷基、炔基和芳基各自任选地被卤素、CN或OH取代，
或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。
4.权利要求3的方法，其中所述化合物由式IIIA或式IIIB的结构表示：
Figure FDA0003971812700000021
5.权利要求1的方法，其中所述化合物由式IVA或式IVB的结构表示：
Figure FDA0003971812700000022
6.权利要求1的方法，其中所述化合物由式V的结构表示：
Figure FDA0003971812700000023
其中
Q2、Q3和Q4各自独立地选自线性或支链烷基、卤代烷基、CF3、芳基、F、Cl、Br、I、CN、NO2、OR、苄基、炔基、SO2N(R)2、NHCOOR、N(R)2、NHCOR、CONHR、COOR或COR；其中所述烷基、炔基和芳基各自任选地被卤素、CN或OH取代，
或其旋光异构体、药学上可接受的盐、水合物或其任意组合。
7.权利要求6的方法，其中所述化合物由式VA或式VA的结构表示：
Figure FDA0003971812700000031
8.权利要求1的方法，其中Q1、Q2、Q3和Q4为CN、NO2、CF3、F、Cl、Br、I、炔基、SO2N(R)2、NHCOOR、N(R)2、NHCOR、COR或苯基，其中所述苯基任选地被卤素、CN或OH取代。
9.权利要求1的方法，其中所述化合物由以下化合物中的任一个表示：
Figure FDA0003971812700000032
Figure FDA0003971812700000041
Figure FDA0003971812700000051
Figure FDA0003971812700000061
10.权利要求1的方法，其中所述化合物由以下化合物中的任一个表示：
Figure FDA0003971812700000062
Figure FDA0003971812700000071
11.权利要求1的方法，其中所述化合物由化合物26a表示：
Figure FDA0003971812700000072
12.权利要求1的方法，其中所述前列腺癌为晚期前列腺癌、难治性前列腺癌、过表达AR的前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、去势敏感性前列腺癌、表达AR-V7的前列腺癌或表达d567ES的前列腺癌。
13.权利要求12的方法，其中所述去势抵抗性前列腺癌是过表达AR的去势抵抗性前列腺癌、表达F876L突变的去势抵抗性前列腺癌、表达F876L_T877A双突变的去势抵抗性前列腺癌、表达AR-V7的去势抵抗性前列腺癌、表达d567ES的去势抵抗性前列腺癌和/或以瘤内雄激素合成为特征的去势抵抗性前列腺癌。
14.权利要求12的方法，其中所述去势敏感性前列腺癌是表达F876L突变的去势敏感性前列腺癌、F876L_T877A双突变去势敏感性前列腺癌和/或以瘤内雄激素合成为特征的去势敏感性前列腺癌。
15.权利要求12的方法，其中所述去势敏感性前列腺癌的治疗在非去势情境下进行，或作为单一疗法进行，或当去势敏感性前列腺癌肿瘤对恩杂鲁胺、阿帕鲁胺和/或阿比特龙具有抗性时进行。
16.权利要求12的方法，其中所述去势抵抗性前列腺癌(CRPC)是转移性CRPC(mCRPC)、非转移性CRPC(nmCRPC)或高风险nmCRPC。
17.权利要求1的方法，其还包括施用雄激素剥夺疗法(ADT)。
18.权利要求1的方法，其中所述前列腺癌对用雄激素受体拮抗剂的治疗具有抗性。
19.权利要求18的方法，其中所述雄激素受体拮抗剂是达洛鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、比卡鲁胺、阿比特龙、EPI-001、EPI-506、AZD-3514、加来特龙、ASC-J9、氟他胺、羟基氟他胺、尼鲁米特、醋酸环丙孕酮、酮康唑或螺内酯中的至少一种。
20.权利要求1的方法，其中所述前列腺癌为达洛鲁胺抗性前列腺癌、恩杂鲁胺抗性前列腺癌、阿帕鲁胺抗性前列腺癌或阿比特龙抗性前列腺癌。
21.权利要求1的方法，其中所述前列腺癌为达洛鲁胺抗性前列腺癌。
22.权利要求1的方法，其中所述前列腺癌为恩杂鲁胺抗性前列腺癌。
23.权利要求1的方法，其中所述前列腺癌为阿帕鲁胺抗性前列腺癌。
24.权利要求1的方法，其中所述前列腺癌为阿比特龙抗性前列腺癌。
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