CN115700117A - 一种改善脱发的干细胞复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及改善脱发的干细胞复合物及其用途。本发明提供干细胞组合物，其包含间充质干细胞和富血小板血浆。本发明的干细胞组合物可以高效预防和治疗脱发。
Description
技术领域
本发明属于再生医学领域，具体涉及一种改善脱发复合物及应用。
背景技术
在日常生活中，皮肤和毛囊会不断被各种环境因素损害，比如紫外线辐射。据估计，一个成年人平均每天脱落5亿个细胞和100根头发。与此同时，受损的皮肤和毛囊会不断地被移除和更新，而毛囊干细胞则在这一过程中发挥重要作用。
根据国家卫健委发布的脱发人群调查数据，中国已经有超过2.5亿人正饱受脱发的摧残。也就是说，平均每6人里就有1人头秃。研究表明，基因不是唯一原因，长期压力释放刺激毛囊的信号，也会迫使毛囊进入提前休止期。产后妇女出现脱发也是这个原因。另外毛囊可能失去能力，无法进入初期，如化疗患者暂时经历。不过脱发不是永久，毛囊储蓄休闭状态，但仍有活性。
毛发生长遵循周期，主要包括四个时期。毛发生长初期：90％毛囊处于初期，每月1cm，把头发往上推。生长期维持2-7年。皮肤信号让毛囊进入毛发生长中期，即倒退期：发囊缩小至原来一小段，持续2-3周，切断毛帮供血，变成杵状毛club hair，准备好脱落。随后进入休止期：持续10-12周，影响5％-15％毛囊。200根杵状毛在一天脱落。毛囊干细胞调控生长周期重新开始。改善脱发主要是依靠缩短毛囊休止期，迫使其进入生长期。
病理性脱发是指头发异常或过度的脱落，毛囊决定着头发的生长，毛囊可以从毛细血管中吸收营养然后将多余的营养暂时存在毛基质中，供后续生长头发的消耗；毛囊还可以从血液和毛基质中提取养分，从头发下端生产出发干，不断地将头发顶出；毛囊组织的上皮细胞能分裂、繁殖，使毛发不断更换和增长。各种因素导致毛囊的萎缩、闭合，使毛囊作用逐渐减弱，头发没有营养供给，脱发现象也就随之发生。干细胞除了在体外具有分化功能外，其强大的旁分泌功能也备受关注；干细胞可以分泌趋化因子RANTES、SDF-1a、fractalkine、MIP-1a、MCP-1和MCP-2，这些趋化因子可以将干细胞归巢到受损细胞部位；此外分泌的细胞因子IL-6、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB和EGF能支持祖细胞的生长，这些因子能够刺激毛囊祖细胞向毛囊细胞分化；分泌VEGF165、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB和EGF支持毛囊周围的血管生成；此外分泌的细胞因子还能够抗瘢痕、抗纤维化和抗凋亡。
目前，绝大部分的男性女性脱发人群是雄性激素脱发。国内采用的大多为雄性激素抑制剂非那雄胺以及米诺地尔等药物进行联合使用，内服，外部涂抹等方案。而药物治疗存在疗效不一致，副作用大，患者需要每天服药及涂抹，给日常生活带来诸多不便等弊端。植发手术需要采集患者后枕部毛囊，进行分离，种植在脱发部位，因此，患者首先需要有充足的后枕部有活力的毛囊供采集，其次患者的待移植的脱发部位，头部皮肤需要仍处于供血及代谢正常水平，毛囊尚未完全闭合，不然容易导致种植存活率低，手术失败等问题。总的来说，目前改善脱发的手段有限，而且不具备普遍适用性。
发明内容
本发明提供改善脱发组合物及其应用，所述改善脱发组合物单独使用或与回输组合物联用可显著改善脱发。
本发明第一方面提供一种干细胞组合物，其包含间充质干细胞和富血小板血浆。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞组合物中间充质干细胞与富血小板血浆的比例为(1-10)×107个间充质干细胞：5ml富血小板血浆。优选为：(2-5)×107个间充质干细胞：5ml富血小板血浆。
在一个或多个实施方案中，所述间充质干细胞的浓度为：(0.2-2)×107个间充质干细胞/mL富血小板血浆。优选地，所述间充质干细胞的浓度为：(0.4-1)×107个间充质干细胞/mL富血小板血浆。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞组合物用于头部注射，例如头皮注射。
在一个或多个实施方案中，所述间充质干细胞高表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。优选地，所述间充质干细胞的培养上清中VEGF表达量在2000pg/ml以上(更优选2100pg/ml以上、2200pg/ml以上、或2300pg/ml以上)，从而能够强力支持毛囊周围的血管新生，改善脱发。
在一个或多个实施方案中，间充质干细胞是源于脂肪组织的间充质干细胞。优选的，间充质干细胞来自自体的脂肪组织。
本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述的干细胞组合物和药学上可接受的辅料。
在一个或多个实施方案中，所述药学上可接受的辅料是适合头部给予所述药物组合物的辅料，例如生理盐水。
在一个或多个实施方案中，所述头部给予是注射，例如微针注射。
本发明还提供一种药盒，包含本文任一实施方案所述的干细胞组合物或药物组合物和干细胞输注组合物。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物含有间充质干细胞和药学上可接受的辅料，任选还含有人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，间充质干细胞是源于脂肪组织的间充质干细胞。优选的，间充质干细胞来自自体的脂肪组织。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物中，间充质干细胞与人血白蛋白的比例为(0.5-5)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白；优选为(1-2)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述间充质干细胞输注组合物中的药学上可接受的辅料是生理盐水；优选地，所述干细胞输注组合物中每100mL生理盐水含有1g人血白蛋白。
本发明还提供本文任一实施方案所述的干细胞组合物或药物组合物在制备提高毛囊营养供给、预防和治疗脱发的药物或药盒中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述脱发是雄性激素脱发。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞组合物或所述药物组合物用于头部给予，例如头部注射，优选微针注射。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞组合物的用量为0.5-10mL/次，优选为1-5mL/次。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞组合物或药物组合物与干细胞输注组合物联用。所述干细胞输注组合物通过全身给予，优选通过输注给予，例如静脉输注。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物含有间充质干细胞和药学上可接受的辅料，任选还含有人血白蛋白。间充质干细胞是源于脂肪组织的间充质干细胞。优选的，间充质干细胞来自自体的脂肪组织。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物中，间充质干细胞与人血白蛋白的比例为(0.5-5)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白，优选为(1-2)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，干细胞输注组合物中所述药学上可接受的辅料为生理盐水；优选地，干细胞输注组合物中每100mL生理盐水含有1g人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述间充质干细胞输注组合物中的药学上可接受的辅料是生理盐水。
本发明还提供一种提高毛囊营养供给、预防或治疗脱发的方法，包括向有需要的对象：
(1)头部给予有效量的本文任一实施方案所述的干细胞组合物或药物组合物，和
任选地，(2)给予有效量的干细胞输注组合物。
在一个或多个实施方案中，所述脱发是雄性激素脱发。
在一个或多个实施方案中，干细胞组合物中间充质干细胞与富血小板血浆的比例为(1-10)×107个间充质干细胞：5ml富血小板血浆，优选为：(1-3)×107个间充质干细胞：5ml富血小板血浆。
在一个或多个实施方案中，干细胞组合物中间充质干细胞的浓度为：(0.2-2)×107个间充质干细胞/mL富血小板血浆。优选地，所述间充质干细胞的浓度为：(0.4-1)×107个间充质干细胞/mL富血小板血浆。
在一个或多个实施方案中，所述头部给予是头部注射，例如头皮注射。更优选的，采用微针注射。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物通过全身给予，优选通过输注给予，例如静脉输注。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物含有间充质干细胞和药学上可接受的辅料，任选还含有人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物中，间充质干细胞与人血白蛋白的比例为：(0.5-5)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物中，间充质干细胞、人血白蛋白的比例为：(1-2)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述间充质干细胞输注组合物中的药学上可接受的辅料是生理盐水。
在一个或多个实施方案中，间充质干细胞是源于脂肪组织的间充质干细胞。优选的，间充质干细胞来自自体的脂肪组织。
在一个或多个实施方案中，每次注射干细胞组合物的一周内注射干细胞输注组合物进行联合治疗；最佳的，两者间隔3天内进行联合治疗。
本发明还提供一种干细胞输注组合物，包括间充质干细胞、和药学上可接受的辅料。
在一个或多个实施方案中，所述辅料为生理盐水。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物还包括人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物中，间充质干细胞、人血白蛋白的比例为：(0.5-5)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞输注组合物中，间充质干细胞、人血白蛋白的比例为：(1-2)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白。
在一个或多个实施方案中，间充质干细胞是源于脂肪组织的间充质干细胞。优选的，间充质干细胞来自自体的脂肪组织。
本发明还提供一种干细胞复合物，其特征在于，所述干细胞复合物包括本文任一实施方案所述的干细胞组合物和干细胞输注组合物。
本发明还提供所述干细胞复合物在制备治疗提高毛囊营养供给、预防和治疗脱发药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的产品和方法具有如下优势：
(1)本发明采用间充质干细胞联合富血小板血浆，注射到头皮的真皮层，供给毛囊营养，间充质干细胞分泌的诸如IL-6，FGF-2，PDGF-AA，PDGF-BB，EGF等细胞因子能够刺激毛囊干细胞向毛囊细胞分化：VEGF165，FGF-2等支持毛囊周围的血管新生；干细胞的旁分泌效应能够改善毛囊微环境，减少毛囊干细胞消耗；调节毛发周期主要依赖WNTs、PDGF、BMPs、FGFs等信号通路。另外，富血小板血浆PRP也具有各种细胞因子，包括血小板衍生生长因子，乙型转化生长因子，成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子1，胰岛素样生长因子2，血管内皮生长因子，表皮生长因子，白血球介素-8，角质细胞生长因子，结缔组织生长因子等，这些因子也同样支持毛囊活性恢复，从而改善脱发。本发明能够从根源上解决脱发问题，使头发从无到有；
(2)间充质干细胞的头皮及回输注入期间，安全无痛，处理的时间短；
(3)间充质干细胞回输从健康管理的角度出发，除了能够改善脱发，还能进行全身的健康调理，包括局部炎症及体内代谢平衡；
(4)将间充质干细胞与富血小板血浆联合使用，多途径多通道，改善毛囊微环境，从而达到改善脱发的效果。
附图说明
图1为志愿者01治疗三个月后效果图。
图2为志愿者02治疗两个月后效果图。
图3为志愿者03治疗三个月后效果图。
图4为志愿者04治疗一个月后效果图。
图5为志愿者05治疗三个月后效果图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Methods in Enzymology(AcademicPress，Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987版及其定期更新版本)；A Practical Guide to Molecular Cloning(Perbal Bernard V.，1988)。
发明人发现，头部给予含间充质干细胞和富血小板血浆(PRP)可以显著改善脱发。而联合干细胞输注可以进一步提升改善效果。
干细胞组合物和干细胞输注组合物
本发明首先提供一种干细胞组合物，其包含间充质干细胞和富血小板血浆。
间充质干细胞旁分泌作用可以改善体内代谢平衡，清除炎症及免疫调节。IL-6，HGF，IDO，TGF-b等细胞因子发挥免疫调节。间充质干细胞分泌的诸如IL-6，FGF-2，PDGF-AA，PDGF-BB，EGF等细胞因子能够刺激毛囊干细胞向毛囊细胞分化：VEGF，FGF-2等支持毛囊周围的血管新生；从而改善脱发。富血小板血浆PRP也具有各种细胞因子，包括血小板衍生生长因子，乙型转化生长因子，成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子1，胰岛素样生长因子2，血管内皮生长因子，表皮生长因子，白血球介素-8，角质细胞生长因子，结缔组织生长因子等，这些因子也同样支持毛囊活性恢复，从而改善脱发。
本发明采用的间充质干细胞可以来自任何组织，优选脂肪组织。脂肪间充质干细胞高表达VEGF，其他来源的间充质干细胞不表达或低表达。具体地，从自体采集脂肪组织，然后对提取的脂肪组织进行分离、纯化、培养、扩增，制备间充质干细胞工作细胞；工作细胞与自体PRP混合制成细胞注射液，多次(例如一个周期三次)注射到头皮的真皮层，供给毛囊营养；改善雄性激素脱发，内分泌脱发，营养性脱发等。应当理解，本发明的间充质干细胞并不限于脂肪组织，本领域技术人员可以根据需要使用其他来源的间充质干细胞来完成本发明，且均在本发明的保护范围之内。
间充质干细胞的制备方法本领域周知，示例性的方法包括采集脂肪组织、分离间充质干细胞、纯化、培养、扩增。脂肪组织可以采自腹部或任何含有脂肪组织的部位。在脂肪中加入组织消化液进行消化。组织消化液例如α-MEM基础培养基+2％PS+10％KOSA+1％胶原酶。消化优选在37℃进行。之后将细胞进行离心分离和培养，培养中根据需要更换培养基。当细胞汇合度达到一定标准(例如80％)后可传代。传代中根据需要观察细胞形态及生长情况。上述方法中所用的试剂本领域周知，均为本领域常用试剂。制备好的间充质细胞可经冻存备用，通常在间充质细胞至对数生长晚期时进行冻存。示例性步骤包括消化、加入冻存液后液氮冻存。更具体的方法参见实施例。
富血小板血浆的制备方法本领域周知，示例性的方法包括采集血液(例如静脉血)，与抗凝剂混合后静置并离心，之后分离得到透明液体层富血小板血浆。更具体的方法参见实施例。
干细胞组合物的制备可包括将间充质干细胞与人富血小板血浆混匀的步骤。间充质干细胞与人富血小板血浆的混合比例可为每mL富血小板血浆混合(0.2-2)×107个间充质干细胞。例如1×107个间充质干细胞和5mL富血小板血浆混合；3×107个间充质干细胞和4mL富血小板血浆混合；5×107个间充质干细胞和8mL富血小板血浆混合；10×107个间充质干细胞和7mL富血小板血浆混合。
干细胞组合物的施用方式不受限制，例如涂覆、注射。为了提高制剂效果，可以采用注射(优选微针注射)的方式给予。
本发明的干细胞组合物可与干细胞输注组合物联用。所述干细胞输注组合物可以任何方式给予，例如静脉输注。干细胞组合物与干细胞输注可同时给予或顺序给予，只要在治疗期间给予的总量达到所示量即可。示例性的间充质干细胞输注组合物含有间充质干细胞和药学上可接受的辅料，任选还含有人血白蛋白。例如每0.5-5*10^8个间充质干细胞与含1g人血白蛋白的人血白蛋白生理盐水混匀(例如100ml的1％人血白蛋白生理盐水)，作为干细胞输注制剂。
本领域知晓干细胞输注组合物的制备方法，示例性制备方法包括：(S1)将人血白蛋白和生理盐水混匀得到人血白蛋白生理盐水混合物；(S2)将间充质干细胞与人血白蛋白生理盐水混合物混匀，即制备得到干细胞输注组合物。
应当理解，本文各种组合物中的辅料并不限于包含生理盐水的辅料，本领域技术人员可以根据需要，选择任意适用的辅料来完成本发明，且均在本发明的保护范围之内。
本领域人员应理解，在得知了本发明干细胞组合物和干细胞输注组合物的构成以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的组合物，这些方法均包含在本发明中。
干细胞组合物与干细胞输注组合物可制备成药盒，其中所述干细胞组合物与干细胞输注组合物或其组分也可储存在适当的容器，并置于试剂盒或药盒中。所述试剂盒或药盒还包括任选的施用所述组合物所需的其他物品，和任选的说明书。所述其他物品例如是使用或施用各种剂型的组合物所需的量具、容器例如注射器等。所述说明书用于指导所述使用或施用过程。
方法和用途
如上所述，头部给予本文所述的含间充质干细胞和富血小板血浆(PRP)的干细胞组合物可以显著改善脱发。
因此，本发明提供一种提高毛囊营养供给、预防或治疗脱发的方法，包括向有需要的对象：(1)头部给予有效量的本文所述的干细胞组合物或药物组合物，和任选地，(2)给予有效量的本文所述的干细胞输注组合物。本文所述脱发包括但不限于雄性激素脱发。本文中，“个体”、“对象”或“患者”指哺乳动物，尤其指人。
具体而言，“有效量”指的是对人或者动物能够产生治疗功能的，并且能够被动物和人所接受的注射量。该有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。可调节剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。在优选实施方案中，干细胞组合物的用量为0.5-10mL/次，优选为1-5mL/次。在优选实施方案中，干细胞输注组合物的用量为：以间充质干细胞数量计，(0.5-5)×108个间充质干细胞/次。
本发明中组合物的给药方式可以包括但是并不限制于皮下注射、经皮注射、植入、局部给药、肌肉注射、缓释给药和口服等。本领域技术人员知晓在不同给药方式、剂量、给药部位等情况下将药物给予对象所需的其他试剂。例如敷料、溶剂(如水)等。
干细胞组合物可通过局部给药以强化局部效果，并且将物质直接施用于希望发挥其作用的地方。局部给药的示例可包括经表皮(施用于皮肤上)，例如过敏测试或一般局部麻醉，吸入，灌肠，以及通过体内的粘膜的那些。在优选实施方案中，干细胞组合物通过头部注射特别是微针注射(例如2.5mm的34G号针头)给予。
干细胞输注组合物可通过全身给予。本文所用术语“全身给予”是指任何合适的给药方法，其可全身递送本发明的组合物。在一个实施方式中，全身性递送可选自口服给药、胃肠外给药、鼻内给药、吸入给药、舌下给药、直肠给药和透皮给药。任何给药途径都适用于本发明干细胞输注组合物。在一个实施方式中，可通过静脉注射向对象给予干细胞输注组合物。在另一个实施方式中，干细胞输注组合物可通过任何其他合适的全身性递送，如口服、胃肠道外、鼻内、舌下、直肠或经皮给药给予对象。在另一个实施方式中，干细胞输注组合物可通过例如吸入，经鼻腔系统或口腔给予对象。
本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。
给药频率将取决于所用组合物中有效成分的药物动力学参数。临床医生典型地施用组合物直到达到实现所需效果的剂量。组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
在一个或多个实施方案中，每隔一段时间给予一次本文所述干细胞组合物或干细胞输注组合物，给予周期为1-6个月，具体周期视不同的患者情况而定。优选的，间隔时间例如可以为2周、3周或一个月；最佳的，间隔时间为1个月。在本发明的一些优选实施例中，每次注射干细胞组合物的一周内注射干细胞输注组合物进行联合治疗。在本发明的一些优选实施例中，每次注射干细胞输注组合物的一周内注射干细胞组合物进行联合治疗。最佳的，两者间隔3天内进行联合治疗。应当理解，本发明中干细胞组合物和干细胞输注组合物的使用顺序不受限制，优选的，联合治疗中，先进行干细胞输注组合物的使用再进行干细胞组合物的使用。
此外，本发明还提供本文所述干细胞组合物和/或干细胞输注组合物在提高毛囊营养供给、预防和治疗脱发中的用途，和制备提高毛囊营养供给、预防和治疗脱发的产品中的用途。所述产品可以是药物组合物或药盒。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文具体提及的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文用于所有目的，包括描述和公开所述出版物报道的可与本发明关联使用的化学物质、设备、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开内容。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
I.实验步骤
1.细胞获取和培养
选取腰腹部，实施局部麻醉，进行脂肪采集。将得到的糜状脂肪放在无菌离心管中转移至实验室。
生物安全柜消毒后，在脂肪中加入3倍体积的组织消化液，4℃消化过夜。组织消化液：α-MEM基础培养基+1％胶原酶；
第二天加入10ml-30ml组织消化液，在37℃水浴锅孵育5-20min，37℃、低速摇床振荡0.5-3h，最后放入离心机，1200rpm离心10min，传代至1-2个T75；1-2天后换液继续培养。
4-5天后，观察生长密度，当汇合度达到80％以上，开始传代：
(1)观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌。
(2)弃上清：细胞生长融合达70％-90％时，吸出培养基。
(3)消化：加入适量胶原酶，轻轻晃动培养瓶让所有细胞接触到消化酶，放置1～2min,，轻轻拍打培养瓶侧壁促使细胞脱壁。
(4)终止：加入5倍消化酶体积的培养基终止消化。
(5)离心：将含消化酶的细胞混合液转移至15ml离心管，252g，离心3-5min。
(6)吹悬：细胞离心后弃上清。加入3ml培养液轻轻吹打混匀，吹打成单细胞悬液后进行细胞计数和活率检测。按1：3比例传代接种于新培养瓶。根据培养瓶大小加入适量的培养基。
(7)标记培养：标记好细胞名，代数，时间，所属人员名等后，将培养瓶平放，置于37℃培养箱中培养。直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。
2.细胞冻存
(1)培养细胞至对数生长晚期，显微镜观察其外观、形态、有无污染等，收集培养上清以备后续检测。在冻存前检测有无支原体污染，取状态良好的细胞进行冻存操作。
(2)用消化酶消化并用完全培养基终止消化，进行细胞计数；离心，弃上清。
(3)加入细胞冻存液(即用型细胞冻存液，康宁，货号88-701-CB。)，重悬细胞，按照5*106-107/管的量计算冻存管数，并添加相应体积的冻存液(冻存液1ml/管)，快速吹打混匀。
(4)细胞分装：按照1ml的混合液分装至每个冻存管中。
(5)标记冻存管：打印液氮标签，细胞系名称，冻存密度，代次，冻存人，冻存时间。
(6)将含细胞的冻存管放入程序性降温盒，先－80℃放置过夜，然后再转移至液氮中存放。
(7)取(1)中收集的培养上清，采用试剂盒Human VEGF Quantikine ELISA Kit(品牌R&D，货号DVE00)，按照试剂盒说明书进行ELISA检测(检测细胞上清中VEGF表达量)。得到结果如下：
| 细胞来源 | 细胞上清中VEGF表达量(pg/ml) |
| 志愿者1 | 2270 |
| 志愿者2 | 2174 |
| 志愿者3 | 2463 |
| 志愿者4 | 2354 |
| 志愿者5 | 2070 |
3.富血小板血浆PRP采集
(1)采用采血管抽取静脉血，颠倒混匀8-10次，使抗凝剂(BD Vacutainer CPT货号REF 362761)与血液混匀。标记信息。
(2)室温下垂直放置，转移至实验室。2h内进行离心操作最佳。
(3)离心前，颠倒8-10次，重新混匀血样。室温下，水平离心机转子，1500g-1700g离心20min，选择升速5，降速0。
(4)离心结束后，取出至生物安全柜。用70％酒精擦拭消毒管身。准备5ml注射器，80mm长针头。
(5)将长针头注射器，垂直扎进PRP管橡皮塞，针头眼置于白膜层边界线，抽吸白膜层上方的透明液体层PRP。
4.头皮制剂施用
(1)生物安全柜UV灭菌，将合格入库的细胞进行复苏、生理盐水洗涤，制备头皮用细胞制剂：收获的间充质干细胞与人富血小板血浆按照(0.2-2)×107个间充质干细胞/mL富血小板血浆的比例混匀，各制剂具体用量参见表1。
(2)将房间进行消杀处理，治疗前清洗头皮及头发，吹干。
(3)采用苯扎氯铵消毒液进行头皮局部消毒，采用微针注射，2.5mm，1-2mm间隔，注射结束后，用无菌纱布及冰镇生理盐水进行注射部位擦拭。
(备注：微针是一种针头，联用普通的1ml医用一次性注射器。2.5mm，34G是针头型号，品牌是BD)
(4)注射后24h不能洗头。保持清洁，勿沾水，防污染，磕碰；使用生理盐水清洁棉片擦拭之后，前三天早晚各一次。第三天开始可以洗头，建议使用无硅油、无刺激的婴幼儿洗发水(例如：贝亲婴幼儿洗发水)，不可抓头皮；
(5)操作后3天内不得进食海鲜等容易诱发过敏的食物，1周内禁食辛辣刺激的食物以及牛羊肉等发物，2周内不得喝酒。操作后避免大量出汗，2周内不要蒸桑拿、泡温泉；操作后3天内不要服用阿司匹林或其他类似抗凝血药物。
(6)一个月后可进行第二次头皮注射；每次注射治疗间隔1个月。
5.回输制剂施用
(1)生物安全柜UV灭菌，将合格入库的细胞进行复苏、生理盐水洗涤，制备回输用细胞制剂：收获的每0.5-5*108个间充质干细胞与100mL的浓度为1％(即每100ml的生理盐水中含有1g人血白蛋白)的人血白蛋白生理盐水混匀，各制剂具体用量参见表2。
人血白蛋白：品牌：Baxter，人血白蛋白10g(20％，50ml/瓶，进口药品注册证号：S20080046)
(2)头皮注射一周内，局部消毒并静脉输液。
表1头皮制剂的组分比例
表2回输制剂的组分比例
II.实验结果
图1-3为3例病例接受头皮制剂和回输制剂联合进治疗。
图1为志愿者01(男，30岁，身高165cm，体重65kg)，接受头皮制剂2联合回输制剂1治疗，3个疗程，三个月后效果图。
图2为志愿者02(男，40岁，身高168cm，体重69kg)，接受头皮制剂3联合回输制剂2治疗，3个疗程，三个月后效果图。
图3为志愿者03(男，36岁，身高170cm，体重80kg)，接受头皮制剂3联合回输制剂3治疗，2个疗程，两个月后效果图。
以上志愿者的联合疗法一个疗程包括静脉回输干细胞输注组合物，3天后在头部脱发部位注射一次干细胞组合物。疗程间隔时间1个月。
头皮制剂采用34G，2.5mm针头，5-10针/cm2，约10-20ul/针，手针给药。为了保证细胞活性，治疗在半小时内完成，注射直径在10cm左右，集中在脱发较突出区域。
总体而言，志愿者01，02和03的治疗效果如下：注射两周后，头皮干燥，头发出油现象得到改善，洗头掉发量明显减少；注射两个月后，可以看到全头毛发变得粗黑，头发光泽感变好；三个月以后，可以看到新发生长。
图4和5为2例病例1个周期的改善对比，其仅接受头皮制剂治疗。
图4为志愿者04(男，30岁，身高165cm，体重68kg)，头皮制剂1治疗一个月后效果图.
图5为志愿者05(男，50岁，身高182cm，体重75kg)，头皮制剂4治疗两个月后效果图。
志愿者04头皮仅注射一次头皮制剂1，志愿者05头皮注射2次头皮制剂4，每个月注射一次，一共注射2次。
总体而言，志愿者04和05的治疗效果如下：注射一个月后，志愿者局部头皮出油皮屑改善；注射两个月后，可以看到局部毛发变粗，少量新发生长。但改善程度不如联合疗法。
可以看出，体内回输ADSC(脂肪间充质干细胞)，同时分泌多种细胞因子和生长因子，可以全身性调节体内炎性微环境，减少炎症和组织细胞的凋亡，促进内源性组织器官祖细胞的增殖，从而达到修复组织器官的左右。反应在头皮局部能够调节毛囊祖细胞向毛囊细胞的分化，促进毛囊周围新生血管，修复全头皮毛囊微环境。这些因素在各种脱发情况中都很重要。单一微针头皮注射治疗方案，受局部给药区域限制，只有给药区域毛囊得到调节及修复，体内代谢并没有得到综合改善。因此，联用体内回输的治疗方案比单一皮下治疗更具优势。
Claims (10)
1.一种干细胞组合物，包含间充质干细胞和富血小板血浆，所述间充质干细胞的浓度为：(0.2-2)×107个间充质干细胞/mL富血小板血浆，
优选地，所述间充质干细胞的浓度为：(0.4-1)×107个间充质干细胞/mL富血小板血浆。
2.如权利要求1所述的干细胞组合物，其特征在于，所述间充质干细胞的培养上清中VEGF表达量在2000pg/ml以上和/或所述间充质干细胞是源于脂肪组织的间充质干细胞，
优选的，所述间充质干细胞来自自体的脂肪组织。
3.权利要求1或2所述的干细胞组合物的制备方法，包括以(0.2-2)×107个间充质干细胞/mL富血小板血浆的比例混合间充质干细胞和富血小板血浆的步骤。
4.一种药物组合物，包含权利要求1或2所述的干细胞组合物和药学上可接受的辅料。
5.一种药盒，包含权利要求1或2所述的干细胞组合物或权利要求4所述的药物组合物；和干细胞输注组合物。
6.如权利要求5所述的药盒，其特征在于，所述干细胞输注组合物含有间充质干细胞和药学上可接受的辅料。
7.如权利要求6所述的药盒，其特征在于，所述干细胞输注组合物中还含有人血白蛋白，优选地，间充质干细胞与人血白蛋白的比例为(0.5-5)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白，优选为(1-2)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白；
优选地，所述药学上可接受的辅料为生理盐水，所述干细胞输注组合物中每100mL生理盐水含有1g人血白蛋白。
8.权利要求1或2所述的干细胞组合物或权利要求4所述的药物组合物在制备提高毛囊营养供给、预防和治疗脱发的药物或药盒中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，
所述脱发是雄性激素脱发，和/或
所述干细胞组合物或所述药物组合物用于头部给予，例如头部注射，优选微针注射；优选地，所述干细胞组合物的用量为0.5-10mL/次，优选为1-5mL/次。
10.如权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述干细胞组合物或药物组合物与干细胞输注组合物联用，
优选地，
所述干细胞输注组合物通过全身给予，和/或
所述干细胞输注组合物含有间充质干细胞和药学上可接受的辅料，任选还含有人血白蛋白，和/或
所述干细胞输注组合物中，间充质干细胞与人血白蛋白的比例为(0.5-5)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白，优选为(1-2)×108个间充质干细胞：1g人血白蛋白；优选地，所述药学上可接受的辅料为生理盐水，所述干细胞输注组合物中每100mL生理盐水含有1g人血白蛋白。
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