CN115697355A - 用抗TGF-β的NK细胞克服免疫抑制 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包含可溶性或膜结合的TGF‑β的工程饲养细胞，以及它们在产生对TGF‑β有抗性的NK细胞中的使用方法，以及所述生成的TGF‑β抗性NK细胞用于治疗癌症的用途。

Description

用抗TGF-β的NK细胞克服免疫抑制

本申请要求于2020年4月30日提交的美国临时专利申请号63/018,108的权益，该临时专利申请全文以引用方式并入本文。

I.背景技术

1.NK细胞在抗癌疗法中的使用正在增加。然而，研究已表明，癌症分泌的TGF-β可降低NK细胞的杀伤作用。先前解决杀伤力下降问题的尝试包括使用TGF-β抑制剂；然而，TGF-β抑制剂的使用可引起全身性的不良副作用。需要可用于在存在TGF-β的情况下保持NK细胞的杀伤作用(即，TGF-β抗性NK细胞)的新试剂和方法。

II.发明内容

2.公开了与工程饲养细胞相关的方法和组合物以及使用所述饲养细胞来生成抵抗TGF-β的NK细胞的用途。

3.在一个方面，本文公开了工程饲养细胞，这些工程饲养细胞经过修饰以表达可溶性或膜结合的TGF-β。例如，TGF-β(可溶性或膜结合的)可以可操作地连接至组成型或诱导型启动子，该组成型或诱导型启动子包括但不限于CMV或EF1A启动子。

4.本文还公开了任何前述方面的工程饲养细胞，这些工程饲养细胞在其细胞表面上还包含至少一种附加NK细胞效应剂，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂是细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂(诸如例如，NK细胞效应剂包括但不限于4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、MICA、LFA-1、2B4、CCR7、OX40L、UBLP2、BCM1/SLAMF2、NKG2D激动剂、CD155、CD112、Jagged1、Jagged2、Delta-1、Pref-1、DNER、Jedi、SOM-11、无翅基因、CCN3、MAGP2、MAGP1、TSP2、YB-1、EGFL7、CCR7、DAP12和DAP10、Notch配体、NKp46激动剂、NKp44激动剂、NKp30激动剂、其他NCR激动剂、CD16激动剂)。在一个方面，所述至少一种附加NK细胞效应剂包括IL-21、4-1BBL、IL-15、IL-21和4-1BBL、IL-21和IL-15、或IL-15和4-1BBL。

5.在一个方面，本文公开了任何前述方面的工程饲养细胞，其中饲养细胞包括PBMC、RPMI8866、HFWT、K562细胞、EBV-LCL、用膜结合的IL-21转染的NK细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞)、用膜结合的4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞)、用膜结合的IL-15和4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KILC.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞)、或用膜结合的IL-21和4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞)。

6.本文还公开了源自任何前述方面的工程饲养细胞的质膜颗粒或外来体。在一些情况下，这些颗粒或外来体可通过氮空化获得。

7.在一个方面，本文公开了生成TGF-β抗性NK细胞的方法，这些方法包括在存在任何前述权利要求的工程饲养细胞、质膜颗粒或外来体的情况下温育NK细胞。例如，本文公开了生成TGF-β抗性NK细胞的方法，这些方法包括在存在已经过工程改造以表达TGF-β的饲养细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞、EBV-LCL、用膜结合的IL-21转染的NK细胞、用膜结合的4-1BBL转染的NK细胞、用膜结合的IL-15和4-1BBL转染的NK细胞、或用膜结合的IL-21和4-1BBL转染的NK细胞)的情况下温育NK细胞，或在存在源自所述饲养细胞的质膜颗粒或外来体的情况下温育NK细胞。

8.本文还公开了任何前述方面的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中饲养细胞在其细胞表面上还包含至少一种附加NK细胞效应剂，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂是细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂(诸如例如，NK细胞效应剂包括但不限于4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、MICA、LFA-1、2B4、CCR7、OX40L、UBLP2、BCM1/SLAMF2、NKG2D激动剂、CD155、CD112、Jagged1、Jagged2、Delta-1、Pref-1、DNER、Jedi、SOM-11、无翅基因、CCN3、MAGP2、MAGP1、TSP2、YB-1、EGFL7、CCR7、DAP12和DAP10、Notch配体、NKp46激动剂、NKp44激动剂、NKp30激动剂、其他NCR激动剂、CD16激动剂)。在一个方面，所述至少一种附加NK细胞效应剂包括IL-21、4-1BBL、IL-15、IL-21和4-1BBL、IL-21和IL-15、或IL-15和4-1BBL。

9.在一个方面，本文公开了任何前述方面的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中NK细胞包括记忆样NK细胞，诸如NKG2C⁺、CD56^bright NK细胞、CD56^dim NK细胞、外周NK细胞、NK T细胞或肿瘤浸润性NK细胞(包括但不限于获自细胞系或获自供体来源(诸如例如，自体供体、同种异体供体或同基因供体)的NK细胞)。

10.本文还公开了任何前述方面的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中NK细胞在存在工程饲养细胞、质膜颗粒或外来体的情况下温育至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、45天或60天。

11.在一个方面，本文公开了通过任何前述方面的方法产生的TGF-β抗性NK细胞。

12.本文还公开了治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防受试者中的癌症和/或转移的方法，这些方法包括向受试者施用任何前述方面的TGF-β抗性NK细胞。例如，本文公开了用TGF-β抗性NK细胞治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防受试者中的癌症和/或转移(例如，实体瘤)的方法，这些方法包括获得NK细胞；在存在经工程改造以表达TGF-β的饲养细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、HFWT、K562细胞、EBV-LCL、用膜结合的IL-21转染的NK细胞、用膜结合的4-1BBL转染的NK细胞、用膜结合的IL-15和4-1BBL转染的NK细胞、或用膜结合的IL-21和4-1BBL转染的NK细胞)的情况下或在存在源自所述饲养细胞的质膜颗粒或外来体的情况下培养NK细胞，从而产生TGF-β抗性NK细胞；以及向受试者施用TGF-β抗性NK细胞。本文还公开了本发明的TGF-β抗性NK细胞用作药物，优选地在治疗受试者中的癌症的方法中使用。例如，本文公开了TGF-β抗性NK细胞在治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防受试者中的癌症和/或转移或实体瘤的方法中使用；其中所述TGF-β抗性NK细胞可通过本发明的生成TGF-β抗性NK细胞的方法获得，优选地该方法包括：获得NK细胞；在存在经工程改造以表达TGF-β的饲养细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞、EBV-LCL或NK细胞)的情况下培养NK细胞，从而生成TGF-β抗性NK细胞，或在存在源自所述饲养细胞的质膜颗粒或外来体的情况下培养NK细胞，从而生成TGF-β抗性NK细胞。优选地，饲养细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞、EBV-LCL或NK细胞)(i)用膜结合的IL-21转染，(ii)用膜结合的4-1BBL转染，(iii)用膜结合的IL-15和4-1BBL转染，或(iv)用膜结合的IL-21和4-1BBL转染。本文还公开了本发明的TGF-β抗性NK细胞用于制造用于治疗受试者中的癌症的药物的用途。例如，本文公开了TGF-β抗性NK细胞用于制造用于治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防受试者中的癌症和/或转移或实体瘤的药物的用途；其中所述TGF-β抗性NK细胞可通过本发明的生成TGF-β抗性NK细胞的方法获得，优选地该方法包括以下步骤：获得NK细胞；在存在经工程改造以表达TGF-β的饲养细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞、EBV-LCL或NK细胞)的情况下培养NK细胞，从而生成TGF-β抗性NK细胞，或在存在源自所述饲养细胞的质膜颗粒或外来体的情况下培养NK细胞，从而生成TGF-β抗性NK细胞。优选地，饲养细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞、EBV-LCL或NK细胞)(i)用膜结合的IL-21转染，(ii)用膜结合的4-1BBL转染，(iii)用膜结合的IL-15和4-1BBL转染，或(iv)用膜结合的IL-21和4-1BBL转染。

13.在一个方面，本文公开了任何前述方面的治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防癌症和/或转移的方法，其中NK细胞是记忆样NK细胞，诸如NKG2C⁺、CD56^bright NK细胞、CD56^dim NK细胞、外周NK细胞、NK T细胞或肿瘤浸润性NK细胞(包括但不限于获自细胞系或获自供体来源(诸如例如，自体供体、同种异体供体或同基因供体)的NK细胞)。

14.本文还公开了任何前述方面的治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防癌症和/或转移的方法，其中饲养细胞在其细胞表面上还包含至少一种附加NK细胞效应剂，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂是细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂(诸如例如，NK细胞效应剂包括但不限于4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、MICA、LFA-1、2B4、CCR7、OX40L、UBLP2、BCM1/SLAMF2、NKG2D激动剂、CD155、CD112、Jagged1、Jagged2、Delta-1、Pref-1、DNER、Jedi、SOM-11、无翅基因、CCN3、MAGP2、MAGP1、TSP2、YB-1、EGFL7、CCR7、DAP12和DAP10、Notch配体、NKp46激动剂、NKp44激动剂、NKp30激动剂、其他NCR激动剂、CD16激动剂)。在一个方面，所述至少一种附加NK细胞效应剂包括IL-21、4-1BBL、IL-15、IL-21和4-1BBL、IL-21和IL-15、或IL-15和4-1BBL。优选地，TGF-β是膜结合的。优选地，所述至少一种附加NK细胞效应剂是膜结合的NK细胞效应剂。

15.在一个方面，本文公开了任何前述方面的治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防癌症和/或转移或实体瘤的方法，其中NK细胞在存在工程饲养细胞、质膜颗粒或外来体的情况下温育至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、45天或60天。

III.附图说明

16.并入本说明书中并构成其一部分的附图示出了若干实施方案，并与说明书一起示出本发明所公开的组合物和方法。

17.图1A和图1B显示了示出表达人转化生长因子β-1(hTGFβ)的慢病毒载体的示意图。图1A显示了膜结合的TGFβ(mbTGFb)，人TGFβmRNA(1170bp)在CMV启动子的控制下与CD4跨膜区和IgG4结构域融合并克隆到慢病毒载体中。图1B显示了通过在EF1A启动子的控制下克隆人TGFβmRNA并使用CMV启动子表达mcherry蛋白来生成Mcherry-TGFβ(mc-TGFB)载体。

18.图2显示了示出细胞中GFP表达的荧光图像。子图A-C显示了用表达GFP的慢病毒感染的K562细胞克隆(CXT002)以所指示感染复数(MOI)感染后48小时的图像。

19.图3A和图3B显示了示出TGFβ表达的FACS分析。K562细胞克隆(CSTX002)用表达膜结合的TGFβ(mbTGFβ)或mcherry TGFβ(mc-TGFβ)的慢病毒以所指示感染复数(MOI)感染。感染后5天收集细胞并用人抗TGFB抗体染色。图3A显示了过表达膜结合的TGFβ(mbTGFβ)的细胞。图3B显示了过表达mcherry TGFβ(mc-TGFβ)的细胞。

20.图4A和图4B显示了示出用于对mbTGFb或mc-TGFB阳性细胞进行分选的门控策略的散点图。将单细胞克隆培养10天-14天。图4A显示了mbTGFβ细胞用抗TGFβ抗体染色。收集APC阳性细胞。图4B显示了使用荧光标记物对mcherry TGFβ阳性细胞进行分选。

21.图5A和图5B显示了示出TGFβ的表达的定量实时PCR(RT-PCR)。从单细胞克隆中分离RNA，并使用RT-PCR确定TGF转录物的水平。结果作为相对于未转染的对照细胞的倍数变化呈现。用膜结合的TGFβ(mb TGFβ)(5A)或mcherrry TGFβ(TGFβ)(5B)感染的细胞中的TGFβ水平。

22.图6显示了示出人TGFβ的水平的ELISA。将从mbTGFβ和mc-TGFβ细胞中分选的单细胞克隆(0.5×10^6)在96孔板中培养。16小时后收集上清液，并使用人TGFβ1ELISA试剂盒确定TGFβ1的水平。

23.图7显示了示出用TGFβ处理的NK细胞中的Smad3表达的免疫印迹。从正常供体leukopak中分离的NK细胞用辐照的正常饲养细胞CSTX0002(对照)、可溶性TGFβ(s TGFβ)(10ng/mL)或用过表达TGFβ的饲养细胞系(mcC10或MB15)扩增两周的时间段。

24.图8A和图8B显示了针对肿瘤细胞的标准NK细胞细胞毒性测定法。来自正常供体的外周血的NK细胞与钙黄绿素标记的肿瘤以5:1的效应子与靶标比率(E:T)共培养4小时。使用微板读数器测量上清液中的钙黄绿素释放，并使用上清液中的钙黄绿素释放来确定平均特异性裂解。NK细胞与人骨肉瘤细胞HOB(8A)、人髓母细胞瘤细胞DAOY(8B)共培养。采用两因素ANOVA与Holm-Sidak多重比较检验来确定显著性(*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001)。

IV.具体实施方式

25.在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另外指明，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或除非另外指明，否则不限于特定的试剂，因此当然可能会改变。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。

A.定义

26.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的术语中的许多术语的一般定义：Singleton等人，《Dictionary of Microbiology and MolecularBiology》(第2版，1994年)；《The Cambridge Dictionary of Science and Technology》(Walker编辑，1988年)；《The Glossary of Genetics》，第5版，R.Rieger等人(编辑)，Springer Verlag(1991年)；和Hale&Marham，《The Harper Collins Dictionary ofBiology》(1991年)。如本文所用，除非另外指明，否则以下术语具有赋予它们的含义。

27.在介绍本公开或其优选实施方案的要素时，冠词“一种”、“一个”、“该”和“所述”旨在表示要素中的一个或多个要素。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在具有包容性，并表示可能存在除所列元素之外的附加元素。

28.范围可在本文中表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示此类范围时，另一个实施方案包括从该一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，特定值形成另一个实施方案。还应当理解，这些范围中的每个范围的端点无论是相对于另一端点还是独立于另一端点都是重要的。还应当理解，本文公开了多个值，并且每个值在本文中除了公开为值本身之外，也公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“约10”。还应当理解，当公开值时，也公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”和值之间的可能范围，如本领域技术人员适当地理解的那样。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应当理解，在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，并且该数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应当理解，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15，以及在10和15之间。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。

29.如本文所用，术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及没有发生的实例。

30.如本文所用，“N末端侧”或“氨基末端”是指肽、多肽或蛋白质的方向性并且可能不表示N末端。在一些方面，在讨论嵌合或融合肽、多肽或蛋白质的情况下，N末端侧可仅指嵌合或融合肽、多肽或蛋白质的组分，而不是整个结构。例如，在讨论Fc结构域并且Fc结构域被描述为与其面向细胞内的氨基末端或N末端侧融合的情况下，本文设想的是嵌合或融合肽、多肽或蛋白质，其中信号锚位于嵌合或融合构建体的N末端，并实际上横跨细胞膜。因此，在这样的嵌合体中，跨膜锚附接至Fc结构域的氨基末端侧，并且Fc结构域的方向性使得N末端侧面向细胞，这相对于典型B细胞上的Fc结构域是倒置的，典型B细胞上的Fc结构域的羧基端部通常横跨细胞膜并且氨基末端延伸至细胞外基质。

31.术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。

32.如本文所用，术语“序列同一性”指示两条基本上相等长度的序列之间同一性程度的定量量度。两条序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是两条比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman，《Advances in Applied Mathematics》，第2卷：第482-489页(1981年)的局部同源性算法提供。该算法可通过使用由Dayhoff开发(《Atlas of Protein Sequences andStructure》，M.O.Dayhoff编辑，增刊5，第3卷：第353-358页，National BiomedicalResearch Foundation,Washington,D.C.,USA)并由Gribskov(《Nucl.Acids Res.》，第14卷第6期：第6745-6763页(1986年)归一化的评分矩阵应用于氨基酸序列。该算法的确定序列的同一性百分比的示例性具体实施由Genetics Computer Group(Madison,Wis.)在“BestFit”工具应用程序中提供。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其他合适的程序在本领域中通常是已知的，例如，另一种比对程序是以默认参数使用的BLAST。例如，可使用采用以下默认参数的BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50条序列；排序方式＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS平移+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详细信息可见于GenBank网站。通常，取代是保守氨基酸取代，仅限于以下组成员内的交换：组1：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；组2：丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸；组3：脯氨酸；组4：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；组5：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。优选地，在要比较的序列的全长上计算序列同一性百分比。

33.用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。通常，此类技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。也可按这种方式确定和比较基因组序列。通常，“同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸分别对应。可通过确定两条或多条序列(多核苷酸或氨基酸)的同一性百分比来比较它们。

34.由于在不脱离本发明范围的情况下可以对上述细胞和方法进行各种改变，因此旨在以上描述和以下给出的示例中包含的所有内容都应解释为说明性的，而不具有限制意义。

35.“增加”可以指导致更大量的症状、疾病、组合物、病症或活性的任何变化。增加可以是病症、症状、活性、组合物相对于对照以统计上显著量的任何单独、中值或平均增加。因此，增加可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％增加，只要增加是统计上显著的。

36.“减少”可以指导致更小量的症状、疾病、组合物、病症或活性的任何变化。当含有某物质的基因产物的遗传输出相对于不含该物质的基因产物的输出更少时，该物质也被理解为减少基因的遗传输出。又例如，减少可以是障碍的症状改变，使得症状比先前观察到的要少。减少可以是病症、症状、活性、组合物相对于对照以统计上显著量的任何单独、中值或平均减少。因此，减少可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％减少，只要减少是统计上显著的。

37.“抑制(Inhibit/inhibiting/inhibition)”意指活性、应答、病症、疾病或其他生物学参数下降。这可包括但不限于活性、应答、病症或疾病的完全消融。这还可包括例如与天然或对照水平相比，活性、应答、病症或疾病降低10％。因此，降低可以是与天然或对照水平相比，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于其间的任何量的降低。

38.所谓的“降低(动词)”或该词的其他形式诸如动名词或名词形式意指事件或特征(例如，肿瘤生长)变少。应当理解，这通常与某一标准或预期值有关，换句话讲，它是相对的，但并不总是需要参考标准或相对值。例如，“降低肿瘤生长”意指降低肿瘤相对于标准或对照的生长速率。

39.所谓的“预防(动词)”或该词的其他形式诸如动名词或名词形式意指停止特定事件或特征，稳定或延迟特定事件或特征的发展或进展，或最大程度减少特定事件或特征发生的机会。“预防”不需要与对照进行比较，因为它通常比例如“降低”更绝对。如本文所用，一些情况可降低但不能预防，但是一些情况既可降低也能预防。同样，一些情况可预防但不能降低，但是一些情况既可预防也能降低。应当理解，在使用“降低”或“预防”的情况下，除非另外指明，否则也明确公开了另一个词的使用。

40.术语“受试者”是指作为施用或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。在一个方面，受试者可以是人、非人灵长类动物、牛、马、猪、犬科动物或猫科动物。受试者也可以是豚鼠、大鼠、仓鼠、兔、小鼠或鼹鼠。因此，受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”是指正接受临床医生例如医师治疗的受试者。

41.术语“治疗有效”是指所用组合物的量是足以改善疾病或障碍的一种或多种原因或症状的量。这种改善只需要减少或改变，不一定需要消除。

42.术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理病症或障碍的患者的医疗管理。该术语包括积极治疗，即，专门针对疾病、病理病症或障碍的改善的治疗，并且还包括因果治疗，即针对相关疾病、病理病症或障碍原因的消除的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即，旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理病症或障碍的治疗；预防性治疗，即旨在最大程度减少或部分或完全抑制相关疾病、病理病症或障碍的发展的治疗；和支持性治疗，即用于对针对相关疾病、病理病症或障碍的改善的另一种特定疗法进行补充的治疗。

43.向受试者“施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。施用可通过任何合适的途径进行，包括口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、经由植入型药盒、肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹膜内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行施用”、“联合施用”、“同时施用”或“同时地施用”意指化合物在同一时间点施用或基本上彼此紧接着施用。在化合物基本上彼此紧接着施用的情况下，这两种化合物的施用时间足够接近，使得所观察到的结果与当化合物在同一时间点施用时所获得的结果没有区别。“全身施用”是指经由将药剂引入或递送至受试者身体的广泛区域(例如，大于身体的50％)的途径，例如通过进入循环系统或淋巴系统的入口向受试者引入或递送药剂。相比之下，“局部施用”是指经由将药剂引入或递送至施用点的区域或紧邻施用点的区域的途径将药剂引入或递送至受试者，并且不以治疗上显著量全身性地引入药剂。例如，局部施用的药剂在施用点的局部附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分检测不到或检测到的量可忽略不计。施用包括自我施用和经他人施用。

44.如本文所用，“治疗(Treat/treating/treatment)”及其语法变型包括旨在或意在部分或完全预防、延迟、治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进、稳定、减缓疾病或病症的症状、或疾病或病症的根本原因和/或降低一种或多种疾病或病症的强度或频率的组合物的施用。根据本发明的治疗可预防性地(preventively/prophylactically)、姑息性地或治疗性地应用。在发病之前(例如，在明显的癌症迹象之前)、在早期发病期间(例如，在癌症的初始迹象和症状时)或在确诊癌症的发展之后，向受试者施用预防性治疗。预防性施用可在疾病或感染的症状出现前的数天至数年内进行。

45.在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容据此通过引用方式并入本申请，以便更全面地描述其所属的现有技术。所公开的参考文献也因其中所包含的材料单独且具体地通过引用方式并入本文，在依赖该参考文献的句子中对该材料进行了讨论。

B.组合物

46.公开了用于制备本发明所公开的组合物的组分以及在本文公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，尽管不能明确公开这些化合物的各种单独和集合的组合和排列的具体参考，但是在此具体考虑和描述了每种材料。例如，如果公开和讨论了特定的表达TGF-β的工程饲养细胞，并且讨论了可对包括该表达TGF-β的工程饲养细胞的许多分子进行的许多修饰，则特别考虑的是表达TGF-β的工程饲养细胞的每一种组合和排列以及可能的修饰，除非有相反的说明。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并且公开了组合分子的示例A-D，那么即使没有单独列举每一个分子，但每一个分子都是单独和共同考虑含义的组合，即认为A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F是公开的。同样，也公开了这些的任何子集或组合。因此，例如，将认为A-E、B-F和C-E的子集是公开的。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本发明所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有多种可执行的附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每个附加步骤都可用本发明所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来执行。

47.NK细胞在抗肿瘤疗法中的使用正在增加。然而，研究已表明，癌症分泌的TGF-β会防御NK细胞的杀伤作用。TGF-β的分泌导致杀伤力下降。先前解决杀伤力下降问题的尝试包括使用TGF-β抑制剂；然而，TGF-β抑制剂的使用可引起全身性的不良副作用。另选地，可在NK细胞扩增期间使用临床级TGF-β，但由于需要过多的大量本已经很昂贵的试剂(即TGF-β)以观察任何效果，因此临床级TGF-β的使用既费力又极其昂贵。为了满足对TGF-β抗性NK细胞的需求并避免TGF-β抑制或可溶性TGF-β培养补充剂的不足，本文公开了已经过修饰以表达可溶性或膜结合的TGF-β的工程饲养细胞。

48.本文还公开了工程饲养细胞，这些工程饲养细胞在其细胞表面上还包含至少一种附加NK细胞效应剂，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂是细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂(诸如例如，NK细胞效应剂包括但不限于4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、MICA、LFA-1、2B4、CCR7、OX40L、UBLP2、BCM1/SLAMF2、NKG2D激动剂、CD155、CD112、Jagged1、Jagged2、Delta-1、Pref-1、DNER、Jedi、SOM-11、无翅基因、CCN3、MAGP2、MAGP1、TSP2、YB-1、EGFL7、CCR7、DAP12和DAP10、Notch配体、NKp46激动剂、NKp44激动剂、NKp30激动剂、其他NCR激动剂、CD16激动剂)。在一个方面，所述至少一种附加NK细胞效应剂包括IL-21、4-1BBL、IL-15、IL-21和4-1BBL、IL-21和IL-15、或IL-15和4-1BBL。优选地，所述至少一种附加NK细胞效应剂是膜结合的NK细胞效应剂。

49.应当理解并且在本文中设想，饲养细胞可来源于任何可扩增和/或活化NK细胞的饲养细胞来源。例如，饲养细胞包括PBMC、RPMI8866、HFWT、K562细胞、EBV-LCL、用膜结合的IL-21转染的NK细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞)、用膜结合的4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞)、用膜结合的IL-15和4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞)、或用膜结合的IL-21和4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS、HFWT、K562细胞)。

50.此外，本文还公开了源自本文公开的工程饲养细胞中的任何工程饲养细胞或通过本文公开的方法制备的质膜颗粒或外来体。

1.将组合物递送至细胞

51.有许多组合物和方法可用于在体外或体内将核酸递送至细胞。这些方法和组合物主要可分成两类：基于病毒的递送体系和非基于病毒的递送体系。例如，核酸可通过许多直接递送体系诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒递送，或经由遗传物质在细胞或载体诸如阳离子脂质体中的转移递送。合适的转染手段包括病毒载体、化学转染子或物理-机械方法诸如电穿孔和DNA的直接扩散，并由例如Wolff,J.A.等人，《Science》，第247卷，第1465-1468页(1990年)和Wolff,J.A.，《Nature》，第352卷，第815-818页(1991年)描述。此类方法在本领域中是众所周知的并且很容易适用于与本文所述的组合物和方法一起使用。在某些情况下，这些方法将被修改为专门用于大DNA分子。此外，这些方法可通过使用载体的靶向特征来靶向某些疾病和细胞群体。

52.利用核酸内切酶核糖核蛋白复合物(诸如例如，Cas9/RNP)对饲养细胞进行重新编程(即，工程改造或修饰)。

53.核酸内切酶/RNP(例如，Cas9/RNP)由三种组分组成，即与CRISPR基因座复合的重组核酸内切酶蛋白(例如，Cas9核酸内切酶)。与CRISPR基因座复合的核酸内切酶可被称为CRISPR/Cas向导RNA。CRISPR基因座包括合成的单链向导RNA(gRNA)，该合成的单链向导RNA(gRNA)由可与靶序列复合的互补重复RNA(crRNA)和反式互补重复RNA(tracrRNA)杂交的RNA组成。因此，CRISPR/Cas向导RNA与细胞的基因组DNA内的靶序列杂交。在一些情况下，2类CRISPR/Cas核酸内切酶是II型CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，2类CRISPR/Cas核酸内切酶是Cas9多肽，并且对应的CRISPR/Cas向导RNA是Cas9向导RNA。与外源DNA依赖性方法相比，这些Cas9/RNP因作为功能性复合物递送而能够以更高的效率切割基因组靶标。此外，从细胞中快速清除Cas9/RNP可减少脱靶效应，诸如诱导细胞凋亡。因此，在一个方面，本文公开了遗传修饰NK细胞的方法，这些方法包括获得专门针对NK细胞中的靶DNA序列的向导RNA(gRNA)；以及b)将包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物转导(例如，经由电穿孔引入)靶NK细胞中，该对应CRISPR/Cas向导RNA与饲养细胞的基因组DNA内的靶序列杂交。

a)基于核酸的递送体系

54.转移载体可以是用于将基因递送到细胞中的任何核苷酸构造(例如，质粒)，或作为递送基因的一般策略的一部分，例如，作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分(Ram等人，《Cancer Res.》，第53卷：第83-88页(1993年))。

55.如本文所用，质粒或病毒载体是在不降解的情况下将本发明所公开的核酸诸如TGF-β传送到细胞中的媒介，并且包括启动子，该启动子在其被递送到的细胞中产生基因表达。病毒载体是例如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经元营养病毒、辛德毕斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的这些病毒。还优选的是共享

这些病毒的特性的任何病毒家族，这些特性使它们适合用作载体。逆转录病毒包括鼠莫洛尼白血病病毒MMLV和表达MMLV作为载体的所需特性的逆转录病毒。与其他病毒载体相比，逆转录病毒载体能够携带更大的遗传有效载荷，即转基因或标记基因，因此是常用的载体。然而，它们不可用于非增殖细胞中。腺病毒载体相对稳定且易于加工，具有高滴度，可以气溶胶制剂的形式递送，并且可转染非分裂细胞。痘病毒载体很大并具有若干用于插入基因的位点，它们是热稳定的并可在室温下储存。一个优选的实施方案是一种病毒载体，该病毒载体已经过工程改造以便抑制由病毒抗原引发的宿主生物体的免疫应答。这种类型的优选载体将携带白细胞介素8或10的编码区。

56.与将基因引入到细胞中的化学或物理方法相比，病毒载体可具有更高的交易能力(引入基因的能力)。通常，病毒载体含有非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶III转录物、复制和包装所必需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当作为载体进行工程改造时，病毒的早期基因中的一个或多个早期基因通常会去除，并且基因或基因/启动子盒被插入到病毒基因组中以代替所去除的病毒DNA。这种类型的构建体可携带多达约8kb的外源遗传物质。所去除的早期基因的必要功能通常由已经过工程改造以反式表达早期基因的基因产物的细胞系提供。

(1)逆转录病毒载体

57.逆转录病毒是属于逆转录病毒病毒科的动物病毒，包括任何类型、亚科、属或嗜性。

58.逆转录病毒实质上是已包裹着核酸货物的包装。核酸货物带有包装信号，该包装信号确保所复制的子代分子将被有效地包装在包装衣壳内。除包装信号之外，还有许多以顺式复制和包装所复制的病毒所需的分子。通常，逆转录病毒基因组含有参与蛋白质衣壳形成的gag、pol和env基因。正是通常被外源DNA替代的gag、pol和env基因将被转移至靶细胞中。逆转录病毒载体通常含有用于掺入到包装衣壳的包装信号、指示gag转录单元起始的序列、逆转录所必需的元件(包括用以结合逆转录的tRNA引物的引物结合位点)、在DNA合成期间引导RNA链的切换的末端重复序列、充当用于合成DNA合成的第二链的引发位点的富含嘌呤的序列5'至3'LTR，以及靠近LTR的端部的允许插入逆转录病毒的DNA状态以插入到宿主基因组中的特定序列。去除gag、pol和env基因允许将大约8kb的外源序列插入到病毒基因组中，被逆转录，并在复制后包装成新的逆转录病毒颗粒。取决于每种转录物的大小，该量的核酸足以递送一种至多种基因。优选的是在插入片段中包括阳性或阴性选择性标记连同其他基因。

59.由于已经去除大多数逆转录病毒载体中的复制机器和包装蛋白(gag、pol和env)，因此通常通过将它们放入包装细胞系中来生成载体。包装细胞系是已经用含有复制和包装机器但不含任何包装信号的逆转录病毒转染或转化的细胞系。当携带所选DNA的载体被转染到这些细胞系中时，含有感兴趣基因的载体通过由辅助细胞以顺式提供的机器被复制并包装成新的逆转录病毒颗粒。机器的基因组未被包装，因为它们不含必要的信号。在一个方面，编码TGF-b的核酸可经由慢病毒载体递送。

(2)腺病毒载体

60.已经描述了复制缺陷型腺病毒的构建(Berkner等人，《J.Virology》，第61卷：第1213-1220页(1987年)；Massie等人，《Mol.Cell.Biol.》，第6卷：第2872-2883页(1986年)；Haj-Ahmad等人，《J.Virology》，第57卷：第267-274页(1986年)；Davidson等人，《J.Virology》，第61卷：第1226-1239页(1987年)；Zhang，“Generation andidentification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfectionand PCR analysis”，《BioTechniques》，第15卷：第868-872页(1993年))。使用这些病毒作为载体的有益效果是它们可传播到其他细胞类型的程度受到限制，因为它们可在初始感染的细胞内复制，但不能形成新的感染性病毒颗粒。已证实重组腺病毒在直接体内递送至气道上皮、肝细胞、血管内皮、CNS实质和许多其他组织部位后实现高效基因转移(Morsy，《J.Clin.Invest.》，第92卷：第1580-1586页(1993年)；Kirshenbaum，《J.Clin.Invest.》，第92卷：第381-387页(1993年)；Roessler，《J.Clin.Invest.》，第92卷：第1085-1092页(1993年)；Moullier，《Nature Genetics》，第4卷：第154-159页(1993年)；La Salle，《Science》，第259卷：第988-990页(1993年)；Gomez-Foix，《J.Biol.Chem.》，第267卷：第25129-25134页(1992年)；Rich，《Human Gene Therapy》，第4卷：第461-476页(1993年)；Zabner，《NatureGenetics》，第6卷：第75-83页(1994年)；Guzman，《Circulation Research》，第73卷：第1201-1207页(1993年)；Bout，《Human Gene Therapy》，第5卷：第3-10页(1994年)；Zabner，《Cell》，第75卷：第207-216页(1993年)；Caillaud，《Eur.J.Neuroscience》，第5卷：第1287-1291页(1993年)；和Ragot，《J.Gen.Virology》，第74卷：第501-507页(1993年))。重组腺病毒通过与特定细胞表面受体结合来实现基因转导，然后病毒通过受体介导的内吞作用以与野生型或复制缺陷型腺病毒相同的方式被内化(Chardonnet和Dales，《Virology》，第40卷：第462-477页(1970年)；Brown和Burlingham，《J.Virology》，第12卷：第386-396页(1973年)；Svensson和Persson，《J.Virology》，第55卷：第442-449页(1985年)；Seth等人，《J.Virol.》，第51卷：第650-655页(1984年)；Seth等人，《Mol.Cell.Biol.》，第4卷：第1528-1533页(1984年)；Varga等人，《J.Virology》，第65卷：第6061-6070页(1991年)；Wickham等人，《Cell》，第73卷：第309-319页(1993年))。

61.病毒载体可以是基于已去除E1基因的腺病毒的载体，并且这些病毒体在细胞系诸如人293细胞系中生成。在另一个优选的实施方案中，E1和E3两种基因都从腺病毒基因组中去除。

(3)腺相关病毒载体

62.另一种类型的病毒载体基于腺相关病毒(AAV)。这种缺陷型细小病毒是一种优选的载体，因为它可感染许多细胞类型并且对人没有致病性。AAV类型载体可传送约4kb至5kb，并且已知野生型AAV可(诸如例如在AAV整合位点1(AAVS1))稳定地插入到19号染色体中。含有此位点特异性整合特性的载体是优选的。所用的AAV可源自任何AAV血清型，包括但不限于AAC1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和重组AAV(rAAV，例如AAV-Rh74)和/或合成AAV(诸如例如AAV-DJ、Anc80)。AAV血清型可基于细胞或组织嗜性选择。在所公开的组合物和方法中使用的AAV载体可以是单链(SS)或自互补(SC)的。

63.在另一种类型的AAV病毒中，AAV含有一对反向末端重复序列(ITR)，这对反向末端重复序列位于至少一个盒的两侧，该至少一个盒含有与异源基因可操作地连接的引导细胞特异性表达的启动子。本上下文中的异源是指非AAV或B19细小病毒固有的任何核苷酸序列或基因。

64.通常，AAV和B19编码区已被删除，从而产生安全、无细胞毒性的载体。AAV ITR或其修饰赋予感染性和位点特异性整合，但不赋予细胞毒性，并且启动子引导细胞特异性表达。

65.因此，本发明所公开的载体提供了能够整合到哺乳动物染色体中而无显著毒性的DNA分子。

66.病毒和逆转录病毒中插入的基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助控制所需基因产物的表达。启动子通常是当关于转录起始位点处于相对固定的位置时起作用的一条或多条DNA序列。启动子含有RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可能含有上游元件和应答元件。

67.应当理解并且在本文中设想AAV的包装容量是有限的。克服AAV载体的装载容量有限的一种方法是通过使用2个载体，其中转基因在两个质粒之间分开，并使用3'剪接供体和5'剪接受体将转基因的两个节段接合成单个全长转基因。另选地，可使两个转基因具有大量重叠，并且同源重组将两个片段接合成全长转录物。

2.表达体系

68.被递送至细胞的核酸通常含有表达控制体系。例如，病毒和逆转录病毒体系中插入的基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助控制所需基因产物的表达。启动子通常是当关于转录起始位点处于相对固定的位置时起作用的一条或多条DNA序列。启动子含有RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可能含有上游元件和应答元件。用于产生本发明所公开的表达TGF-β(可溶性的或膜结合的)的饲养细胞的启动子可以是组成型的或诱导型的。

a)病毒启动子和增强子

69.来自哺乳动物宿主细胞中的载体的控制转录的优选启动子可从各种来源，例如诸如以下病毒的基因组获得：多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、-B型肝炎病毒并最优选巨细胞病毒，或获自异源哺乳动物启动子，例如β肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40限制性片段方便地获得，该片段还含有SV40病毒复制起点(Fiers等人，《Nature》，第273卷：第113页(1978年))。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为HindIII E限制性片段方便地获得(Greenway,P.J.等人，《Gene》，第18卷：第355-360页(1982年))。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子也可用于本文。在一个方面，TGF-bmRNA可在EF1A启动子或CMV启动子的控制下表达。

70.增强子通常是指在距转录起始位点不固定距离处起作用的DNA序列并且可以是转录单元的5'(Laimins,L.等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.》，第78卷：第993页(1981年))或3'(Lusky,M.L.等人，《Mol.Cell Bio.》，第3卷：第1108页(1983年))。此外，增强子可位于内含子内(Banerji,J.L.等人，《Cell》，第33卷：第729页(1983年))以及位于编码序列本身内(Osborne,T.F.等人，《Mol.Cell Bio.》，第4卷：第1293页(1984年))。它们的长度通常在10bp至300bp之间，并且它们以顺式起作用。增强子的功能是增加附近启动子的转录。增强子通常还含有介导转录调节的应答元件。启动子还可含有介导转录调节的应答元件。增强子通常决定基因表达的调节。虽然现在已知许多来自哺乳动物基因的增强子序列(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、-胎蛋白和胰岛素)，但通常人们将使用来自真核细胞病毒的增强子进行一般表达。优选的示例是复制起点后侧上的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、腺病毒增强子和复制起点后侧上的多瘤增强子。

71.启动子和/或增强子可通过触发其功能的光或特定化学事件来特异性活化。体系可通过诸如四环素和地塞米松等试剂来调节。还有方法可通过暴露于辐射(诸如γ辐射)或烷基化化疗药物来增强病毒载体基因表达。

72.在某些实施方案中，启动子和/或增强子区可充当组成型启动子和/或增强子以最大程度增强要转录的转录单元区的表达。在某些构建体中，启动子和/或增强子区在所有真核细胞类型中都具有活性，即使它仅在特定时间在特定类型的细胞中表达。这种类型的优选启动子是CMV启动子(650个碱基)。其他优选的启动子是SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和逆转录病毒载体LTR。

73.已表明，所有特异性调节元件都可被克隆并用于构建在特定细胞类型(诸如黑素瘤细胞)中选择性表达的表达载体。胶质纤维醋酸蛋白(GFAP)启动子已被用于在胶质细胞来源的细胞中选择性地表达基因。

74.真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载体也可含有可能影响mRNA表达的转录的终止所必需的序列。这些区被转录为编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段。3'非翻译区还包含转录终止位点。优选的是转录单元还含有多腺苷酸化区。该区的一个有益效果是它增加了转录单元像mRNA一样被加工和传送的可能性。表达构建体中多聚腺苷酸化信号的识别和使用已经得到公认。优选的是在转基因构建体中使用同源多聚腺苷酸化信号。在某些转录单元中，多腺苷酸化区源自SV40早期多腺苷酸化信号并由约400个碱基组成。还优选的是，转录单元含有单独的或与上述序列组合的其他标准序列以提高构建体的表达或稳定性。

b)标记物

75.病毒载体可包含编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定基因是否已被递送至细胞并且是否在递送后就被表达。优选的标记基因是编码β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白的大肠杆菌(E.Coli)lacZ基因。

76.在一些实施方案中，标记物可以是选择性标记物。适用于哺乳动物细胞的选择性标记物的示例是二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。当此类选择性标记物成功地转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果置于选择性压力下，转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。存在两种广泛使用的不同类别的选择性方案。第一类别是基于细胞的新陈代谢和使用缺乏独立于补充培养基而生长的能力的突变细胞系。两个示例是：CHO DHFR-细胞和小鼠LTK-细胞。这些细胞缺乏在不添加诸如胸苷或次黄嘌呤之类的营养物质的情况下生长的能力。由于这些细胞缺乏完整核苷酸合成途径所必需的某些基因，因此除非在补充培养基中提供缺失的核苷酸，否则它们无法存活。补充培养基的另选方式是将完整的DHFR或TK基因引入到缺乏相应基因的细胞中，从而改变它们的生长要求。未用DHFR或TK基因转化的各个细胞将无法在未-补充的培养基中存活。

77.第二类别是显性选择，显性选择是指用于任何细胞类型的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。那些具有新型基因的细胞将表达可传递耐药性的蛋白质，并将在选择下存活。这种显性选择的示例使用药物新霉素(Southern P.和Berg,P.，《J.Molec.Appl.Genet.》第1卷：第327页(1982年))、霉酚酸(Mulligan,R.C.和Berg,P.，《Science》，第209卷：第1422页(1980年))或潮霉素(Sugden,B.等人，《Mol.Cell.Biol.》，第5卷：第410-413页(1985年))。这三个示例分别使用真核细胞控制下的细菌基因来传递对适当药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他药物包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。

3.药物载体/药物产品的递送

78.如上所述，组合物也可在药学上可接受的载体中在体内施用。所谓的“药学上可接受的”意指材料不是生物学上不期望的或以其他方式不期望的，即该材料可连同核酸或载体施用于受试者，而不会引起任何不期望的生物效应或以有害方式与包含它的药物组合物的其他组分中的任何组分相互作用。如本领域技术人员所熟知的，将载体自然地选择成最大程度降低活性成分的任何降解并且最大程度减少受试者中的任何不良副作用，如本领域技术人员所熟知的。

79.组合物可口服、肠胃外(例如，静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、透皮、体外、局部等施用，包括局部鼻内施用或通过吸入剂施用。如本文所用，“局部鼻内施用”意指通过一个或两个鼻孔将组合物递送到鼻和鼻道中，并且可包括通过喷雾机制或液滴机制，或通过核酸或载体的气雾吸入来递送。通过吸入剂施用组合物可以是通过鼻或口经由喷雾或液滴机制递送。也可经由插管直接递送至呼吸系统的任何区域(例如肺)。所需组合物的确切量因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况、所治疗的过敏性障碍的严重程度、所用的特定核酸或载体、其施用方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。然而，考虑到本文的教导，合适的量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。

80.如果使用，组合物的肠胃外施用通常以注射为特征。可将注射剂制备成常规形式，作为液体溶液或混悬剂、适合在注射前将混悬剂溶解在液体中的固体形式，或者作为乳剂。最近修订的肠胃外施用方法涉及使用缓释或缓效系统以便保持恒定剂量。参见例如美国专利3,610,795，其通过引用方式并入本文。

81.材料可为溶液、混悬剂形式(例如，掺入微粒、脂质体或细胞中)。这些可经由抗体、受体或受体配体靶向特定的细胞类型。以下参考文献是使用该技术使特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Senter等人，《Bioconjugate Chem.》，第2卷：第447-451页(1991年)；Bagshawe,K.D.，《Br.J.Cancer》，第60卷：第275-281页(1989年)；Bagshawe等人，《Br.J.Cancer》，第58卷：第700-703页(1988年)；Senter等人，《Bioconjugate Chem.》，第4卷：第3-9页(1993年)；Battelli等人，《Cancer Immunol.Immunother.》，第35卷：第421-425页(1992年)；Pietersz和McKenzie，《Immunolog.Reviews》，第129卷：第57-80页(1992年)和Roffler等人，《Biochem.Pharmacol》，H第42卷：第2062-2065页(1991年))。溶媒诸如“stealth”和其他抗体偶联脂质体(包括脂质介导的药物靶向结肠癌)、受体介导的通过细胞特异性配体靶向DNA、淋巴细胞引导的肿瘤靶向以及小鼠神经胶瘤细胞的体内高度特异性治疗逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用该技术使特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Hughes等人，《Cancer Research》，第49卷：第6214-6220页(1989年)；和Litzinger和Huang，《Biochimica et Biophysica Acta》，第1104卷：第179-187页(1992年))。一般来讲，受体参与组成型或配体诱导的内吞途径。这些受体聚集在披网格蛋白小窝中，经由披网格蛋白小泡进入细胞，通过酸化的核内体，在该核内体中受体被分选，然后循环至细胞表面，储存在细胞内，或者在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，诸如营养物质吸收、活化蛋白质的去除、大分子的清除、病毒和毒素的伺机进入、配体的解离和降解以及受体水平调节。许多受体遵循多于一条细胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体效价和配体浓度。已经综述受体介导的内吞的分子和细胞机制(Brown和Greene，《DNA and CellBiology》，第10卷第6期：第399-409页(1991年))。

a)药学上可接受的载体

82.组合物(包括抗体)可在治疗上与药学上可接受的载体组合使用。

83.《Remington:The Science and Practice of Pharmacy》(第19版)，A.R.Gennaro编辑，Mack Publishing Company,Easton,PA，1995年中描述了合适的载体及其制剂。通常，在制剂中使用适量的药学上可接受的盐以使制剂等渗。药学上可接受的载体的示例包括但不限于盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选地为约5至约8，并且更优选地为约7至约7.5。其他载体包括缓释制剂，诸如含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，这些基质是成形制品，例如膜、脂质体或微粒的形式。对本领域技术人员来说将显而易见的是，某些载体可能更优选，这取决于例如施用途径和所施用组合物的浓度。

84.药物载体是本领域技术人员已知的。这些载体中最典型的将是用于向人施用药物的标准载体，包括溶液，诸如无菌水、盐水和处于生理pH的缓冲溶液。组合物可肌内或皮下施用。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。

85.除了选择的分子之外，药物组合物可包含载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包含一种或多种活性成分，诸如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。

86.药物组合物可以多种方式施用，这取决于需要局部治疗还是全身治疗和要治疗的区域。施用可以是局部(包括眼部、阴道、直肠、鼻内)、口服、通过吸入施用，或肠胃外施用，例如通过静脉内滴注、皮下、腹膜内或肌内注射。本发明所公开的抗体可静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或透皮施用。

87.用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬剂和乳剂。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内溶媒包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如基于林格氏葡萄糖的补充剂等。也可存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

88.用于局部施用的制剂可包括膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和散剂。常规的药物载体，水性、粉末状或油性基质，增稠剂等可能是必要的或期望的。

89.用于口服施用的组合物包括散剂或颗粒、水或非水介质中的混悬剂或溶液、胶囊剂、袋剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是期望的。

90.组合物中的一些组合物可潜在地作为药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐施用，该酸加成盐或碱加成盐通过与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸和有机酸诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸反应形成，或通过与无机碱诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾和有机碱诸如单烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳基胺以及取代的乙醇胺反应形成。

b)治疗用途

91.可凭经验确定用于施用组合物的有效剂量和时间表，并且作出这样的决定在本领域的技术范围内。用于施用组合物的剂量范围是大到足以产生影响障碍的症状的所需效果的那些。剂量不应大到引起不良的副作用，诸如不希望的交联反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、状况、性别和疾病程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可由本领域技术人员确定。在出现任何禁忌症的情况下，剂量可由个体医师调整。剂量可变化，并且可以每天一次或多次剂量给药来施用，持续一天或几天。在文献中可找到给定类别药品的适当剂量的指南。例如，在关于抗体的治疗用途的文献中可找到关于选择抗体的适当剂量的指南，例如，《Handbook of Monoclonal Antibodies》，Ferrone等人编辑，Noges Publications,Park Ridge,N.J.(1985年)，第22章第303-357页；Smith等人，《Antibodies in Human Diagnosis and Therapy》，Haber等人编辑，Raven Press,NewYork(1977年)，第365-389页。单独使用的抗体的典型日剂量范围可以是每天约1μg/kg至高达100mg/kg体重或更多，这取决于以上提及的因素。

C.产生TGF-β抗性NK细胞的方法

92.如通篇所述，本发明所公开的饲养细胞的主要目的是产生对TGF-β有抗性的NK细胞。因此，在一个方面，本文公开了生成TGF-β抗性NK细胞的方法，这些方法包括在存在本文所公开的工程饲养细胞、质膜颗粒或外来体的情况下温育NK细胞。例如，本文公开了生成TGF-β抗性NK细胞的方法，这些方法包括在存在已经过工程改造以表达TGF-β的饲养细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、HFWT、K562细胞、EBV-LCL、用膜结合的IL-21转染的NK细胞(包括但不限于NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS)、用膜结合的4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK3.3、NK-YS)、用膜结合的IL-15和4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK3.3、NK-YS)或用膜结合的IL-21和4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS)的情况下温育NK细胞，或在存在源自所述饲养细胞的质膜颗粒或外来体的情况下温育NK细胞。优选地，由饲养细胞表达的TGF-β是膜结合的。

93.在一个方面，本文公开了生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中饲养细胞在其细胞表面上包含至少一种附加NK细胞效应剂，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂是细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂(诸如例如，NK细胞效应剂包括但不限于4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、MICA、LFA-1、2B4、CCR7、OX40L、UBLP2、BCM1/SLAMF2、NKG2D激动剂、CD155、CD112、Jagged1、Jagged2、Delta-1、Pref-1、DNER、Jedi、SOM-11、无翅基因、CCN3、MAGP2、MAGP1、TSP2、YB-1、EGFL7、CCR7、DAP12和DAP10、Notch配体、NKp46激动剂、NKp44激动剂、NKp30激动剂、其他NCR激动剂、CD16激动剂)。在一个方面，所述26至少一种附加NK细胞效应剂包括IL-21、4-1BBL、IL-15、IL-21和4-1BBL、IL-21和IL-15、或IL-15和4-1BBL。优选地，所述至少一种附加NK细胞效应剂是膜结合的NK细胞效应剂。

94.应当理解并在本文中设想，本文所公开的生成TGF-β抗性NK细胞的方法可用于需要抗TGF-β的任何NK细胞(外源性或内源性的)。因此，本文公开了生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中NK细胞包括记忆样NK细胞，诸如NKG2C⁺、CD56^bright NK细胞、CD56^dim NK细胞、外周NK细胞、NK T细胞或肿瘤浸润性NK细胞(包括但不限于获自细胞系或获自供体来源(诸如例如，自体供体、同种异体供体或同基因供体)的NK细胞)。

95.为了生成TGF-β抗性NK细胞，NK细胞必须暴露于表达TGF-β(在其膜上或可溶性的)的饲养细胞、外来体或质膜颗粒一段时间以赋予抗性。因此，在一个方面，本文公开了生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中NK细胞在存在工程饲养细胞、质膜颗粒或外来体的情况下温育至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、45天或60天。进一步应当理解并在本文中设想，在暴露于源自所述饲养细胞的工程饲养细胞或质膜颗粒或外来体之后可将NK细胞培养附加的时间段。在一个方面，NK细胞可与源自所述饲养细胞的工程饲养细胞或质膜颗粒或外来体接触介于7天至21天之间，优选介于7天至14天之间的时间段。

96.如通篇所述，本发明所公开的方法生成TGF-β抗性的NK细胞。因此，在一个方面，本文公开了通过本文公开的生成TGF-β抗性NK细胞的方法产生的TGF-β抗性NK细胞。

97.在一些情况下，源自工程饲养细胞的质膜颗粒或外来体可通过氮空化获得。

98.通常，将细胞保持在适合细胞生长和/或维持的条件下。合适的细胞培养条件是本领域中众所周知的并且描述于例如Santiago等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》，2008年，第105卷：第5809-5814页；Moehle等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》，2007年，第104卷：第3055-3060页；Urnov等人，《Nature》，2005年，第435卷：第646-651页；和Lombardo等人，《Nat.Biotechnol.》，2007年，第25卷：第1298-1306页中。本领域技术人员应认识到，用于培养细胞的方法是本领域已知的并且可以并将根据细胞类型而变化。在所有情况下，都可使用常规优化来确定用于特定细胞类型的最佳技术。

D.治疗癌症的方法

99.本发明所公开的组合物可用于治疗其中发生不受控制的细胞增殖的任何疾病，诸如癌症。因此，本文公开了治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防受试者中的癌症和/或转移的方法，这些方法包括向受试者施用本文公开的TGF-β抗性NK细胞。例如，本文公开了用TGF-β抗性NK细胞治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防受试者中的癌症和/或转移(诸如例如，实体瘤)的方法，这些方法包括：获得NK细胞；在存在经工程改造以表达TGF-β的饲养细胞(包括但不限于PBMC、RPMI8866、HFWT、K562细胞、EBV-LCL、用膜结合的IL-21转染的NK细胞(包括但不限于NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS)、用膜结合的4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KILC.2、NK 3.3、NK-YS)、用膜结合的IL-15和4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS)或用膜结合的IL-21和4-1BBL转染的NK细胞(包括但不限于NK-92、NK-92MI、NK-YTS、NK、NKL、KIL、KIL C.2、NK 3.3、NK-YS))的情况下，或在存在源自所述饲养细胞的质膜颗粒或外来体的情况下培养细胞，从而产生TGF-β抗性NK细胞；以及向受试者施用TGF-β抗性NK细胞。优选地，由饲养细胞表达的TGF-β是膜结合的。

100.应当理解并在本文中设想，饲养细胞可用于本发明所公开的治疗方法中，不仅实现TGF-β抗性而且还活化和/或扩增外源性NK细胞群体(诸如例如，记忆样NK细胞，诸如NKG2C⁺、CD56^bright NK细胞、CD56^dim NK细胞、外周NK细胞、NK T细胞或肿瘤浸润性NK细胞)，但是可用于使内源性NK细胞群体具有TGF-β抗性和/或活化和/或扩增内源性NK细胞群体(诸如例如，记忆样NK细胞，诸如NKG2C⁺、CD56^bright NK细胞、CD56^dim NK细胞、外周NK细胞、NKT细胞或肿瘤浸润性NK细胞)。可用于治疗癌症的方法中的NK细胞可包括来自供体或NK细胞系的任何NK细胞。在一个方面，本文公开了治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防癌症和/或转移的方法，其中NK细胞是记忆样NK细胞，诸如NKG2C⁺、CD56^bright NK细胞、CD56^dim NK细胞、外周NK细胞、NK T细胞或肿瘤浸润性NK细胞(包括但不限于获自细胞系或获自供体来源(诸如例如，自体供体、同种异体供体或同基因供体)的NK细胞)。在一个方面，NK细胞可以是内源性NK细胞，其通过暴露于工程饲养细胞和/或源自本文公开的所述饲养细胞的质膜颗粒或外来体而在体内产生抗性。

101.用于本发明所公开的治疗方法中的饲养细胞、质膜颗粒和/或外来体还可包含附加的效应剂以扩增和/或活化NK细胞。因此，在一个方面，本文公开了治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防癌症和/或转移的方法，其中饲养细胞在其细胞表面上还包含至少一种附加NK细胞效应剂，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂是细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂(诸如例如，NK细胞效应剂包括但不限于4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、MICA、LFA-1、2B4、CCR7、OX40L、UBLP2、BCM1/SLAMF2、NKG2D激动剂、CD155、CD112、Jagged1、Jagged2、Delta-1、Pref-1、DNER、Jedi、SOM-11、无翅基因、CCN3、MAGP2、MAGP1、TSP2、YB-1、EGFL7、CCR7、DAP12和DAP10、Notch配体、NKp46激动剂、NKp44激动剂、NKp30激动剂、其他NCR激动剂、CD16激动剂)。在一个方面，所述至少一种附加NK细胞效应剂包括IL-21、4-1BBL、IL-15、IL-21和4-1BBL、IL-21和IL-15、或IL-15和4-1BBL。优选地，所述细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂是人细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂。优选地，所述至少一种附加NK细胞效应剂是膜结合的NK细胞效应剂。

102.在一个方面，本文公开了治疗、抑制、减少、降低、改善和/或预防癌症和/或转移的方法，其中NK细胞在存在工程饲养细胞、质膜颗粒或外来体的情况下温育至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、45天或60天。

103.本发明所公开的组合物可用于治疗其中发生不受控制的细胞增殖的任何疾病，诸如癌症。本发明所公开的组合物可用于治疗的癌症的代表性但非限制性列表如下：淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；T细胞淋巴瘤；蕈样肉芽肿；霍奇金病；髓性白血病；膀胱癌；脑癌；神经系统癌；头颈癌；头颈的鳞状上皮细胞癌；肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌；神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤；卵巢癌；皮肤癌；肝癌；黑素瘤；口、咽、喉和肺的鳞状上皮细胞癌；宫颈癌；卵巢颈癌；乳腺癌和上皮癌；肾癌；泌尿系统癌；肺癌；食道癌；头颈部癌；大肠癌；造血系统肿瘤；睾丸癌；结肠癌；直肠癌；前列腺癌；或胰腺癌。

E.实施例

104.提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且以下实施例旨在纯粹作为示例并且不旨在限制本公开。已努力确保数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑一些错误和偏差。除非另外指定，否则份数是重量份数，温度单位为℃或处于环境温度，并且压力处于或接近大气压。

1.实施例1：生成由表达mbIL21、CD137L的K562和分泌形式或mbTGFβ组成的遗传修饰的饲养细胞克隆。

105.通过用表达作为膜结合的突变蛋白(mbTGFβ)或天然分泌形式的TGFβ1的慢病毒载体转导基于K562的饲养细胞克隆CSTX002来生成过表达人TGFβ1的多个饲养细胞系。CSTX002克隆表达细胞因子IL-21和共刺激分子4-1BBL(CD137)的膜结合的突变蛋白。简而言之，在人CMV启动子的调节控制下使用与CD4跨膜区和IgG4(F_C)柄融合的人TGFβ1模拟生成人mbTGFβ1融合构建体。然后构建体进行密码子优化和序列同源性验证。类似地，在人延长因子-1(EF1A)启动子的控制下使用人TGFβ生成双顺反子mc-TGFβ载体，并在CMV启动子的控制下独立表达荧光蛋白mcherry。示出两种构建体(mbTGFβ和mc-TGFβ)设计的详细矢量图如图1所示。两种构建体都被克隆到用于生成高滴度慢病毒的第3代慢病毒体系中。

106.由于慢病毒转导效率可能因细胞系而异，并且CSTX002的初始转导使用编码绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒，因此使用编码GFP的对照慢病毒，在三个不同的病毒滴度(感染复数(MOI)为5、10、20)下验证对重复感染的易感性(图2)。在转染后48小时，在每种条件下都观察到良好的GFP表达。在MOI 5、10和20下CSTX002的感染处于TGFβ载体之前，并在感染后5天用人TGFβ1抗体(Biolegend目录号349615)对转导的细胞染色(图3)。对于用任一载体(mbTGFβ或mc-TGFβ)感染的细胞，在20MOI下观察到TGFβ的最佳表达，因此所有后续实验均使用20MOI进行。为了生成过表达mbTGFβ或mc-TGFβ的克隆，用如上所述的两种病毒感染CSTX002。感染后，将细胞培养4天-5天。mbTGFβ细胞用TGFβ1抗体染色，并使用BD分选软件程序在BD Influx上分选。阳性细胞被直接分选到96孔板中。使用绿色激光(561nm)分选mc-TGFβ阳性细胞以收集mcherry阳性细胞。从96孔板收集单细胞克隆，并使用FACS确定mbTGFβ或mc-TGFβ的表达(图4)。此外，使用hTGFβ1TaqMan引物，使用定量实时PCR(RT-PCR)确定mRNA表达。与未转染的细胞对照相比，mc-TGFβ细胞中TGFβmRNA表达增加了5-20倍，并且mbTGFβ细胞中表达增加了50-400倍(图5)。

2.实施例2：证实NK细胞在这些新型饲养细胞上的增殖导致TGFβ抗性NK细胞，并描述这些抗性细胞的特征。

107.然后确定用mbTGFβ和mc-TGFβ转导的新饲养细胞是否分泌完整的TGFβ。温育16小时后，将mbTGFβ和mc-TGFβ细胞接种在96孔板中，收集上清液并储存在-80℃下。使用TGFβ1ELISA试剂盒(R&D目录号DB100B)确定TGFβ1的水平。发现来自两种表达载体的所有克隆都分泌TGFβ。mc-TGFβ细胞的水平为约5000pg/mL，并且mbTGFβ细胞的水平在10,000pg/mL-15,000pg/mL的范围内(图6)。

108.TGFβ是一种免疫抑制分子，通过下游靶标Smad2/Smad3的活化来减弱NK细胞的抗肿瘤功能。在用CSTX002扩增NK细胞期间添加可溶性TGFβ1导致NK细胞中Smad3表达的显著降低，这使得它们分泌过多细胞因子并且对TGFβ1信号转导不太敏感。为了确定新转导的克隆是否可诱导NK细胞发生类似的重塑，使用正常CSTX002、含有可溶性TGFβ1的CSTX002或表达TGFβ1的新CSTX002来扩增来自3名健康供体的NK细胞。简而言之，以100格雷(Gy)照射饲养细胞，并且在存在低剂量IL-2(50IU/mL)的情况下使用经照射的饲养细胞将从健康献血者的PBMC中分离的NK细胞扩增两周。观察到用mbTGFβ和mc-TGFβ饲养细胞扩增的NK细胞中Smad3表达水平的类似降低(图7)。

109.然后确定用mbTGFβ和mc-TGFβ转导的饲养细胞扩增的NK细胞在功能上是否与用可溶性TGFβ和CSTX002培养的那些相似。扩增后，将NK细胞与负载钙黄绿素的HOS(骨肉瘤)或DAOY(髓母细胞瘤)靶细胞以5:1的比例共培养4小时。钙黄绿素释放用于确定平均细胞裂解百分比。用10ng/mL可溶性人TGFβ1(sTGFβ)处理的NK用作阳性对照。如图8所示，与用对照饲养细胞扩增的NK细胞相比，用饲养细胞mbTGFβ、mc-TGFβ培养或在存在可溶性TGFβ的情况下扩增的NK细胞已显著降低裂解靶肿瘤细胞HOS和DAOY的能力。这与TGFβ印记的NK细胞一致。

Claims (30)

1.一种工程饲养细胞，所述工程饲养细胞已经过修饰以表达可溶性或膜结合的TGF-β。

2.根据权利要求1所述的工程饲养细胞，其中TGF-β由诱导型或组成型启动子表达。

3.根据权利要求1或2所述的工程饲养细胞，其中所述饲养细胞包括白血病K562细胞。

4.根据权利要求1或2所述的工程饲养细胞，其中所述饲养细胞包括NK细胞。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的工程饲养细胞，所述工程饲养细胞在其细胞表面上还包含至少一种附加NK细胞效应剂，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂是细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂。

6.根据权利要求5所述的工程饲养细胞，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂选自4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、MICA、LFA-1、2B4、CCR7、OX40L、UBLP2、BCM1/SLAMF2、NKG2D激动剂、CD155、CD112、Jagged1、Jagged2、Delta-1、Pref-1、DNER、Jedi、SOM-11、无翅基因、CCN3、MAGP2、MAGP1、TSP2、YB-1、EGFL7、CCR7、DAP12和DAP10、Notch配体、NKp46激动剂、NKp44激动剂、NKp30激动剂、其他NCR激动剂、CD16激动剂。

7.根据权利要求5所述的工程饲养细胞，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂包括IL-21、4-1BBL、IL-15、IL-21和4-1BBL、IL-21和IL-15、或IL-15和4-1BBL。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的工程饲养细胞，其中所述饲养细胞包括PBMC、RPMI8866、HFWT、K562细胞、EBV-LCL、用膜结合的IL-21转染的NK细胞、用膜结合的4-1BBL转染的NK细胞、用膜结合的IL-15和4-1BBL转染的NK细胞、或用膜结合的IL-21和4-1BBL转染的NK细胞。

9.一种质膜颗粒或外来体，所述质膜颗粒或外来体源自根据权利要求1至8中任一项所述的工程饲养细胞。

10.一种生成TGF-β抗性NK细胞的方法，所述方法包括在存在根据权利要求1至8中任一项所述的工程饲养细胞或根据权利要求9所述的外来体或质膜颗粒的情况下温育NK细胞。

11.一种生成TGF-β抗性NK细胞的方法，所述方法包括在存在已经过工程改造以表达TGF-β的饲养细胞的情况下温育NK细胞，或在存在源自所述饲养细胞的质膜颗粒或外来体的情况下温育NK细胞。

12.根据权利要求11所述的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中所述饲养细胞包括PBMC、RPMI8866、HFWT、K562细胞、EBV-LCL、用膜结合的IL-21转染的NK细胞、用膜结合的4-1BBL转染的NK细胞、用膜结合的IL-15和4-1BBL转染的NK细胞、或用膜结合的IL-21和4-1BBL转染的NK细胞。

13.根据权利要求11或12所述的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中所述饲养细胞在其细胞表面上还包含至少一种附加NK细胞效应剂，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂是细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂。

14.根据权利要求13所述的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂选自4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、MICA、LFA-1、2B4、CCR7、OX40L、UBLP2、BCM1/SLAMF2、NKG2D激动剂、CD155、CD112、Jagged1、Jagged2、Delta-1、Pref-1、DNER、Jedi、SOM-11、无翅基因、CCN3、MAGP2、MAGP1、TSP2、YB-1、EGFL7、CCR7、DAP12和DAP10、Notch配体、NKp46激动剂、NKp44激动剂、NKp30激动剂、其他NCR激动剂、CD16激动剂。

15.根据权利要求14所述的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂包括IL-21、4-1BBL、IL-15、IL-21和4-1BBL、IL-21和IL-15、或IL-15和4-1BBL。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中所述NK细胞包括记忆样NK细胞，诸如NKG2C⁺、CD56^bright NK细胞、CD56^dim NK细胞、外周NK细胞和NK T细胞、肿瘤浸润性NK细胞。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中所述NK细胞获自供体受试者。

18.根据权利要求11至16中任一项所述的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中所述NK细胞获自自体供体、同种异体供体或同基因供体。

19.根据权利要求11至18中任一项所述的生成TGF-β抗性NK细胞的方法，其中所述NK细胞在存在所述工程饲养细胞、质膜颗粒或外来体的情况下温育至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、45天或60天。

20.一种TGF-β抗性NK细胞，所述TGF-β抗性NK细胞通过根据权利要求10至19中任一项所述的方法产生。

21.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括所述受试者施用根据权利要求20所述的TGF-β抗性NK细胞。

22.一种用TGF-β抗性NK细胞治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括：获得NK细胞；在存在经工程改造以表达TGF-β的饲养细胞的情况下，或在存在源自所述饲养细胞的质膜颗粒或外来体的情况下培养所述细胞，从而产生TGF-β抗性NK细胞；以及向所述受试者施用所述TGF-β抗性NK细胞。

23.根据权利要求22所述的治疗癌症的方法，其中所述NK细胞是记忆样NK细胞，诸如NKG2C⁺、CD56^bright NK细胞、CD56^dim NK细胞、外周NK细胞和NK T细胞、肿瘤浸润性NK细胞。

24.根据权利要求22或23所述的治疗癌症的方法，其中所述NK细胞获自供体受试者。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的治疗癌症的方法，其中所述NK细胞获自自体供体、同种异体供体或同基因供体。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的治疗癌症的方法，其中所述饲养细胞包括PBMC、RPMI8866、HFWT、K562细胞、EBV-LCL、用膜结合的IL-21转染的NK细胞、用膜结合的4-1BBL转染的NK细胞、用膜结合的IL-15和4-1BBL转染的NK细胞、或用膜结合的IL-21和4-1BBL转染的NK细胞。

27.根据权利要求22至26中任一项所述的治疗癌症的方法，其中所述饲养细胞在其细胞表面上还包含至少一种附加NK细胞效应剂，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂是细胞因子、粘附分子或NK细胞活化剂。

28.根据权利要求27所述的治疗癌症的方法，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂选自4-1BBL、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、MICA、LFA-1、2B4、CCR7、OX40L、UBLP2、BCM1/SLAMF2、NKG2D激动剂、CD155、CD112、Jagged1、Jagged2、Delta-1、Pref-1、DNER、Jedi、SOM-11、无翅基因、CCN3、MAGP2、MAGP1、TSP2、YB-1、EGFL7、CCR7、DAP12和DAP10、Notch配体、NKp46激动剂、NKp44激动剂、NKp30激动剂、其他NCR激动剂、CD16激动剂。

29.根据权利要求28所述的治疗实体瘤的方法，其中所述至少一种附加NK细胞效应剂包括IL-21、4-1BBL、IL-15、IL-21和4-1BBL、IL-21和IL-15、或IL-15和4-1BBL。

30.根据权利要求22至29中任一项所述的治疗癌症的方法，其中所述NK细胞在存在所述工程饲养细胞、质膜颗粒或外来体的情况下温育至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、45天或60天。

Images